JP4017704B2

JP4017704B2 - クレアチニンを検出する方法

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Publication number: JP4017704B2
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Authority: JP
Inventors: コリーン・ケー・メッセンジャー; キャロル・エー・ミラー; メイタク・テレサ・イップ
Original assignee: バイエルコーポレーション
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1997-06-16
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2017-06-16
Also published as: JPH1062412A; EP0814335A3; AU720129B2; DE69719610D1; CA2198957C; EP0814335B1; CA2198957A1; AU2496197A; US5733787A; ES2194137T3; EP0814335A2; DE69719610T2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは、過酸化物による様々な化合物、例えばフェノール類やアミンの酸化を触媒する酵素である。加えて、特定の化合物は、ヒドロぺルオキシドから酸素を遊離させ、この酸素を一定の受容体化合物へと移転することによって、ペルオキシダーゼ酵素に似た方式で働くため、擬ペルオキシダーゼと呼ばれている。すなわち、擬ペルオキシダーゼは、過酸化物と酸化可能な化合物との反応を触媒するか、または他の方法でそれに参加する点が酵素に似ている。擬ペルオキシダーゼは、ヘモグロビンやその誘導体を包含し、過酸化活性物質と考えられている。例えば、グルコースについての尿のアッセイでは、グルコース酸化酵素という酵素が、酸素の存在下で、初めに尿中のグルコースをグルコン酸と過酸化水素とに転換し、その後、アッセイ系に含まれるペルオキシダーゼという酵素が、過酸化水素（ヒドロぺルオキシド）と酸化可能な染料化合物、例えばｏ−トルイジンまたはテトラメチルベンジジンとの相互作用を触媒して、その還元状態では無色である染料を有色にさせ、それによって、検出可能な応答を与える。この有色の応答の程度および強さは、染料の酸化を触媒するのに充分なペルオキシダーゼが存在するならば、グルコースの転換によって生成される過酸化水素の量に正比例する。
【０００３】
同様に、ヘモグロビンまたはその誘導体のような過酸化活性物質は、過酸化水素と酸化可能な染料との相互作用を触媒することができる。そのような相互作用では、過酸化活性物質が、ペルオキシダーゼを模倣し、酸化可能な染料とヒドロぺルオキシドとの相互作用を触媒する。その結果生じる相互作用は、検出可能な応答、例えば色の変化を与え、その際、応答の強さは、過酸化活性物質の濃度を示す。
【０００４】
クレアチニンは、クレアチンがクレアチンリン酸になり、筋収縮のためのエネルギー源として用いられるときの、最終代謝生成物である。生成されたクレアチニンは、腎臓の糸球体によって濾過され、次いで、再吸収されずに尿中に排出される。体液中のクレアチニンの決定は、腎炎や腎不全症のような筋疾患を診断するのに役立つ。尿中のクレアチニンの決定のための、ヤッフェ法として既知の最初の実用的試験は、アルカリ性溶液中でのピクリン酸とクレアチニンとの結合による、赤黄色を帯びた褐色のピクリン酸クレアチニンの形成を伴う。クレアチニン決定のための、より最近の方法は、BenedictおよびBehre によってJ. Biol. Chem.、113: 515 (1936) で報告されたが、これは、アルカリ性媒体中での３，５−ジニトロ安息香酸とクレアチニンとの反応を伴う。これらの反応はそれぞれ、クレアチニンを脱プロトン化して、系が適正に機能できるようにするために、高いpH、すなわち１２〜１３オーダーのそれを必要とする。これらの試薬系で適切な高いpHを保つには、典型的には、アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物のような強塩基性物質を用いる。これらの高いpHレベルで操作することは、試薬系のための担体として、濾紙または多孔性薄膜のような吸収性担体を用いるときは特に、様々な困難を与えるが、それは、アルカリを導入すると、担体は脆くなる傾向があり、担体マトリックス全体へのアルカリの均等な分布を得るのが困難になるからである。その上、試薬を溶液の形態で担体に適用し、溶媒を蒸発させて乾燥残渣を残すとき、乾燥したアルカリは、クレアチニン濃度について調べようとする尿素のような流体に接触したとき、容易に可溶性にならない。
【０００５】
これらのクレアチニン試験を好成績で用いるのに必要な、高いアルカリ度を扱う際に遭遇する困難は、これらの高pH値を必要としない代替的試験の探求へと導いている。一つのそのような試験は、米国特許第５，３７４，５６１号明細書に開示されていて、そこでは、尿試料を、第二銅イオン、ヒドロぺルオキシド、酸素遊離基の存在下で有色応答を与える酸化可能な染料、および擬ペルオキシダーゼに接触させる。この試薬系は、クレアチニン以外の尿成分が第二銅イオンと錯形成するのを防止するためのキレート化剤として、クエン酸塩を含有する。この系では、第二銅イオンとクレアチニンとの間に形成される錯体が、それが酸化還元指示薬を酸化し、それによってこの酸化された酸化還元指示薬の有色形態をとらせることができるため、擬ペルオキシダーゼとして作用するものと思われる。この米国特許第５，３７４，５６１号明細書は、コハク酸を緩衝剤として用いるこの系では好結果を示す。しかし、現在では、コハク酸による緩衝系は、尿を幅広く選択した上でのクレアチニンの決定に用いるには、真に充分ではないことが発見されていて、それは、変動するpHと比重とを有する尿試料に、一定の結果を与えるのに充分な緩衝能を保有しないからである。この系を更に詳述すると、反応性が、反応混合物のpHに非常に敏感である。試験したpHの範囲内、すなわちpH５．４〜７．５では、系の反応性はpHの減少とともに増大する。その上、より低いpHはヘモグロビン干渉を増大させることになるが、それは、ヘモグロビンが、擬ペルオキシダーゼとしても作用し、かつアッセイの結果に正の偏りを生じる可能性があり、ヘモグロビンの活性が、pHの減少とともに増大するからである。したがって、ヘモグロビンの干渉を最小化し、試験液のpHの変動からの影響を軽減するような特定のpH（６．６〜８．０）に、試験系を保つことが非常に重要である。系のpHの制御には、二つの重要な面が存在する。一つは、pKa が作動pHの範囲内にある緩衝剤を有することであり、もう一つは、試験液のpH／ＳＧ（比重）の変動を克服するのに充分な緩衝能を有することである。ＳＧの影響は、尿のＳＧが増大するにつれて、そのイオン強度も増大するため、重要である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、尿中のクレアチニンを測定するための系であって、強アルカリ性の試薬系の維持を必要とせず、高低のpHおよび比重の尿のクレアチニン濃度を正確に決定する系を提供することが、本発明の目的である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、尿中のクレアチニンの濃度を決定する方法であって、Ｃｕ⁺²イオンと、ヒドロぺルオキシドと、擬ペルオキシダーゼの存在下で酸化されたときに検出可能な応答を与える、酸化可能な染料とを含む試薬系に、尿の試験試料を接触させる工程を含む方法に関する。この試薬系は、それに接触した際に、該尿試料のpHを６．６〜８．０の範囲内に保つのに適したpKa を有し、かつそれに充分な量で存在する緩衝剤と、クレアチニンの不在下での染料の酸化を防止するための、第二銅イオンに対するキレート化剤とを更に含む。
【０００８】
前述の米国特許第５，３７４，５６１号明細書に一層充分に説明されているとおり、下記の一組の式が、クエン酸塩のようなキレート化剤、過酸化物、およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のような酸化還元指示薬と組合せた第二銅イオンが尿中のクレアチニンの存在を呈示できることを説明すると考えられる。
【０００９】
１．Ｈ⁺ ＋Ｃｕ⁺²・クエン酸塩イオン＋クレアチニン→Ｃｕ⁺²・クレアチニン＋クエン酸
２．Ｃｕ⁺²・クレアチニン＋ＴＭＢ→Ｃｕ⁺¹・クレアチニン＋ＴＭＢ⁺
３．Ｃｕ⁺¹・クレアチニン＋ＲＯＯＨ→ＲＯ・＋ＯＨ^- ＋Ｃｕ⁺²クレアチニン
【００１０】
反応１は、Ｃｕ⁺²・クレアチニン錯体のその休止状態からの形成を表す。反応２は、ＴＭＢからＣｕ⁺²・クレアチニン錯体への電子１個の移転によってＴＭＢ染料を酸化して、非反応性のＣｕ⁺¹形態を生成することを表す。反応３は、Ｃｕ⁺¹錯体が過酸化物へと電子１個を失ってＣｕ⁺²を再生する、再生段階である。
【００１１】
この系では、第二銅イオン源は、その陰イオンがクレアチニンの比色分析による検出のための反応と不都合に作用し合わない、いかなる可溶性銅塩であってもよい。適切な塩は、銅の硫酸塩、硝酸塩、水酸化物、リン酸塩、ヨウ化物、塩化物、臭化物、酢酸塩またはシュウ酸塩を包含する。その他の第二銅塩も、それらがＣｕ⁺²・クレアチニン錯体の形成を許すならば、用いてよい。その陰イオンが銅イオンと過度に強く結合する塩は、Ｃｕ⁺²／クレアチニン錯体を形成させないであろう。したがって、第二銅イオンとＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＴＰＡとの間に形成されるもののようなＣｕ⁺²錯体は、Ｃｕ⁺²／クレアチニン錯体を形成するのに充分なＣｕ⁺²を遊離させないであろう。クエン酸や硫酸の塩は、最低のブランク反応性を有し、したがって好ましい。クエン酸塩以外のキレート化剤は、クレアチニンと銅（II）との結合定数より低いが、遊離している銅（II）がヒドロぺルオキシド／酸化可能な染料の反応系を酸化するのを妨げるよう、銅と錯形成するのに充分なだけ高い、結合定数を有するＣｕ⁺²錯体をそれが形成するならば、用いてよい。クレアチニンの不在下で染料を酸化する塩は、当然、適切ではない。例えば、２，２′−ビピリジン第二銅のような塩は、クレアチニンの不在下でＴＭＢの顕著な酸化を生じることがあり、したがって、本発明で用いるには不適切である。
【００１２】
典型的には、尿中でのクレアチニンの参照範囲は１．３〜３６mMであるから、第二銅イオンの濃度は５〜８０mMになる。第一銅イオンは、クレアチニンの不在下での染料の酸化によりバックグラウンド干渉を生じる傾向がある。したがって、Ｃｕ⁺¹塩を用いることはできない。
【００１３】
本アッセイ系では、銅イオンの濃度、およびＣｕ⁺²／クエン酸塩イオン錯体の比が非常に重要であるが、それは、それらがこの系の、そのクエン酸耐性の面での性能に影響するからである。クエン酸塩イオンは、このアッセイに顕著な阻害干渉を生じること、また尿は、６mMという多量のクエン酸塩イオンを含有する場合があるため、クエン酸イオンは、クレアチニンと競合して、銅（II）イオンと錯形成することが見出された。Ｃｕ⁺²／クレアチニン錯体は、ＤＢＤＨの存在下でＴＭＢを酸化するが、Ｃｕ⁺²／クエン酸塩イオン錯体は酸化しない。実施例６に組み込まれた表１に示すとおり、配合物Ａ中のＣｕ⁺²とクエン酸塩イオンとの双方の濃度の１６／２７から３０／５０mMへの上昇は、クエン酸干渉耐性を増大させ、それによってクエン酸効果を低下させることが見出された。再び表１を参照すると、クエン酸の阻害効果は、クエン酸塩イオンをそれぞれ１０mMおよび２０mM含有する溶液のための配合物Ａでは、配合物Ｂでの僅か５３．６％および５８．５％と、配合物Ｃでの６６．３％および８６．５％とに比して、１６．３％および１８．６％へと低下した。表２にその結果を要約した、より大規模な研究では、銅の濃度を３０mMに保ち、クエン酸塩イオンの濃度を１００mMに増加すること（クエン酸塩イオン／Ｃｕ比を３．３に増加すること）は、クエン酸効果を２％へと低下させたが、これは、クエン酸耐性の面での大幅な改良である。上記により、本発明を実施する際は、クエン酸塩イオン対Ｃｕ⁺²の比は、０．５〜３．５の範囲内であるのが好適であり、ここで、Ｃｕ⁺²濃度は５〜８０mMであり、クエン酸塩イオンの濃度は３〜２８０mMである。
【００１４】
本発明に用いるのに適した酸化可能な指示薬は、例えば、ベンジジン；ｏ−トリジン；アルキル基が１〜約６個の炭素原子を有する３，３′，５，５′−テトラアルキルベンジジン；ｏ−ジアニシジン；２，７−ジアミノフルオレノン；ビス（Ｎ−エチルキノール−２−オン）アジン；（Ｎ−メチルベンゾチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２−オン）アジンまたはそれらの組合せを包含する。
【００１５】
本発明に用いるのに適したヒドロぺルオキシドは、クメンヒドロぺルオキシド；５−ブチルヒドロぺルオキシド；ジイソプロピルベンゼンヒドロぺルオキシド；１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロぺルオキシド；２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロぺルオキシド；ｐ−メンタンヒドロぺルオキシド；１，４−ジイソプロピルベンゼンモノヒドロぺルオキシド；ｐ−tert−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロぺルオキシド；２−（α−ヒドロぺルオキシイソプロピル）−６−イソプロピルナフタレン；テトラリンヒドロぺルオキシドまたはそれらの組合せを包含する。
【００１６】
米国特許第５，３７４，５６１号明細書は、尿試料をpH７．０に保つためのコハク酸緩衝剤の使用を記載している。この系は、０〜２５０mg／dlのクレアチニン濃度の範囲で、クレアチニン濃度対６６０nmでの反射率のかなり線形の用量／応答曲線を与えるには、充分に作動した。コハク酸緩衝尿は、この実験では充分に作動したが、図１からわかるように、その系は、高比重および低比重の範囲では、一定の結果を与えなかった。しかし、コハク酸は、クレアチニンについて試験する必要がある尿試料のpHおよび比重（ＳＧ）の変動のため、必ずしもすべての状況で適切な緩衝剤ではないことが判明した。それというのも、２５０mMの濃度でのコハク酸は、何らかの尿試料のpHの変動や高いイオン強度に抵抗する緩衝能を保有しないからである。そのような場合の結果は、試薬パッドが、もはや７．０というような望ましいpHに保たれなくなることである。例えば、pH５．６で高いＳＧの尿試料では、反応系のpHは、６．６という望ましい最小値未満に低下することになり、pH８．５で高いＳＧの尿試料では、反応系のpHは、８．０という望ましい最大値より高いレベルに上昇することになると思われる。この問題の解決は、充分な量で与えられたときは、比色分析によるクレアチニン測定の過程で尿試験試料のpHを、６．６〜８．０の範囲のpHに保つ能力を有する緩衝剤を用いることにある。そのような緩衝系を用いることは、試験しようとする尿試料のＳＧに関係なく、一定の結果を与えるが、それは、充分に緩衝された系は、異なるpHを有する他の材料と作用し合うときに、pHの僅かな変化を示すにすぎないからである。弱酸性または弱塩基性群の緩衝能力は、ほぼpH＝pKa ±１の範囲に限定され、pKa に等しいpHで最大効果がある。これは、個々の適用に緩衝剤を選ぶ際の最も重要な要因の一つである。その他の重要な配慮は、例えばイオン強度、反応系との緩衝化合物の融和性、およびその溶解度である。デバイ−ヒュッケルの式によれば、イオン強度は、下記の式に従って「実用pKa 」を算出する際に包含させるべきである：
【００１７】
pKa′＝pKa −（２ｎ−１）〔（０．５＊I^1/2）／（１＋I^1/2）−０．１Ｉ〕
【００１８】
〔式中、Ｉは、溶液のイオン強度＝（１／２）ΣｃＺ² であり、ｃはモル濃度、Ｚは電荷である〕
【００１９】
緩衝能は、溶液の緩衝能力の定量的尺度、すなわち緩衝単位または緩衝値βとして表すことができる。緩衝系のpHをある少しの値だけ変化させるのに必要な、強酸または強塩基の最大の量、すなわちβ_max は、
【００２０】
β_max ＝０．５７６×Ｃ
として与えられる。
【００２１】
式中、Ｃはモル濃度である。したがって、緩衝系が充分な緩衝範囲内にあるならば、緩衝能はその濃度に正比例する。上記の原理によれば、pH７．０で優れた緩衝剤を与えるには、pKa ＝pH±１＝６．０〜８．０である緩衝試薬を用いるべきである。コハク酸は、５．６というpKa を有し、４．６〜６．６の範囲内で優れた緩衝作用を与えるにすぎない。一方、グリセロール−２−リン酸は、６．６５というpKa 値を有する。その優れた緩衝範囲は、５．６５〜７．６５であり、したがって、０．５〜０．７５モルの濃度では、０．２５モルのコハク酸より適切な緩衝剤である。
【００２２】
本発明に用いるのに適した緩衝剤は、典型的には６．６〜８．０、好ましくは６．７〜７．４の範囲内のpKa を有するものである。これは、感度、安定性、ならびに温度変化、アスコルビン酸干渉およびクエン酸塩イオンやヘモグロビンからの干渉に対する耐性の最良の均衡を有するpHを与える。加えて、そのような緩衝系は、大幅に変動し得るpHや比重の値を有する尿試料を検定するときに、正確な結果を与える。この範疇に属する緩衝剤のうち、特に、リン酸塩、グリセロール−２−リン酸塩、マレイン酸、３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、カコジル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、炭酸、４−ヒドロキシメチルイミダゾール、ビス−トリス〔ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ〕−トリス〔（ヒドロキシメチル）メタン〕、オルト亜リン酸、ジメチルアミノエチルアミン、（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）（ＡＤＡ）、ピロリン酸、Ｎ，Ｎ′−ビス（３−スルホプロピル）エチレンジアミン、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）、１，３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕プロパン、エチレンジアミン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、イミダゾール、（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、３，６−エンドメチレン−１，２，３，６−テトラヒドロフタル酸、２，３−ジヒドロキシプロピル−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、４−メチルイミダゾール、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、Ｎ−エチルモルホリン、トリエタノールアミン、モノ−トリス−２−ヒドロキシエチルイミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、トリイソプロピルアミン、５，５−ジエチルバルビツル酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸、グリシルグリシン、リン酸フェニル、リン酸ニトロフェニル、リン酸ナフチル、リン酸ジフェニル、フェニルホスホン酸、アミノエチルホスホン酸、エチルホスホン酸、カルボキシエチルホスホン酸、リン酸エチル、リン酸アミノエチル、グリセロールリン酸、フィチン酸、６−グルコースリン酸および１−グルコースリン酸、またはそれらの組合せがある。緩衝剤の濃度範囲は、典型的には２５０〜１，０００mM、好ましくは３００〜７５０mMである。これらの緩衝剤は、充分量で用いたとき、臨床試験の際に遭遇することが予測されると思われる、尿のＳＧの範囲にわたって、望ましいレベル内に試薬系のpHを保つことになる。
【００２３】
本発明を実施する際は、クレアチニンアッセイは、湿式または乾式（試験片）のいずれかの形式で実施することができる。アッセイを実施するには、試薬系を有する試験片または試薬溶液の利用を介して、尿試験試料を銅塩、例えば硫化第二銅またはクエン酸第二銅、酸化還元染料およびヒドロぺルオキシドと、緩衝系と混合する。試薬片は、吸収性担体を第二銅塩および緩衝剤の水溶液に浸し、担体を乾燥し、次いで染料およびヒドロぺルオキシドの有機溶液にそれを浸した後、乾燥する、慣用の方式で調製する。試験片が製作できる適切な材料は、米国特許第３，８４６，２４７号明細書に記載された、織り上げたか、または編み上げたガラス繊維、フェルトおよび多孔性セラミック片を包含する。米国特許第３，５５２，９２８号明細書に記載された、粘土質物質、木、布およびスポンジ材料も適している。濾紙が好適な材料である。
【００２４】
浸漬水溶液中の第二銅塩の濃度は、通常、５〜８０mMにわたるであろう。用いる緩衝剤がグリセロール−２−リン酸であるときは、浸液中でのその濃度は、尿試験試料に浸したとき望ましいpHを保つと思われる試薬片を与えるために、通常、２５０〜１，０００mMにわたることになる。有機浸液中の酸化還元染料の濃度は、通常、１０〜１５０mMにわたり、３０〜９０mMが好ましいと思われるのに対し、ヒドロぺルオキシドは、濃度が１８〜２７０mMにわたり、５４〜１６２mMが好ましいと思われる。ＤＢＤＨ対ＴＭＢの比は、１．８で最適である。
【００２５】
【実施例】
下記の実施例によって、本発明を実施する方法を更に説明する。
【００２６】
ワットマンＢＰ８７および３MMの濾紙を用いて、水溶液中のクレアチニンを測定する試験片を調製した。二浸液法によってそれらを調製したが、第一の浸液は、緩衝剤、第二銅イオン源としての硫酸銅、およびクエン酸を含有する水溶液であった。溶液は、緩衝試薬、硫酸銅、クエン酸その他の試薬をビーカー内に正確に秤量することによって調製した。水を加えた後、得られた混合物を、磁気攪拌プレート上で環境温度で攪拌して、すべての固体を溶解した。呈色を改善し、系の反応性を高めるために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を５０倍の濃縮液として別個に調製し、緩衝液に加えた。次いで、１０規定と１規定の水酸化ナトリウム溶液を用いて、溶液のpHを望みのレベルに調整した。望みの体積まで水を加え、そこで最終pHを測定かつ記録した。
【００２７】
第二の浸液は、染料としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、およびヒドロぺルオキシドとしてジイソプロピルベンゼンジヒドロぺルオキシド（ＤＢＤＨ）を含有する有機溶液（溶媒としてアセトニトリルまたはエタノール）であった。染料およびヒドロぺルオキシドを、メスフラスコ内に正確に秤量した後、溶媒を加えて混合物を与え、これを磁気攪拌プレート上で環境温度で攪拌して、すべての固体を溶解した。次いで、有機溶媒を規定体積まで充分量加えた。
【００２８】
濾紙片（約２０．３×約５．１cm：８×２インチ）を枠にクランプで固定し、第一の浸液（水溶液）に浸し、対流オーブン内で、５０℃で５分間乾燥した。この手順を第二の浸液（溶媒）で繰り返した。含浸および乾燥の後、密閉した円筒容器内に、該片を乾燥剤ととも保存し、その後、アクリル基材の接着剤、およびポリスチレンの裏張に取り付けた。
【００２９】
異なるＳＧおよびpH値を有する二組の試験液を与えることによって、試験片を評価した。試験液は、尿中に見出される高低のＳＧおよびpH値を模倣するよう設計した。高ＳＧ（ＨＳＧ）液は、ＳＧが１．０２０で、pHが５．６であったのに対して、低ＳＧ（ＬＳＧ）液は、ＳＧが１．００５で、pHが７．２であった。試験液には、それぞれ、５段階のレベル、すなわち０、５０、１００、２００および３００mg／dlのクレアチニンを投与した。
【００３０】
アッセイを実施するため、試験液約０．８mlを試験管に加えた。ＣＬＩＮＩＴＥＫ−１０（登録商標）反射分光光度計の開始ボタンを押すのと同時に、試験片を試験液に浸した。試験液に浸した後、該片をこの計器の読取り卓上に置き、測定された反射率から導かれるＫ／Ｓ値として計器が与える計器の読取り値を、応答シグナルとして記録した。すべての試験液に対して、５回の試験よりなる反復を実施した。
【００３１】
実施例１
試験片の第一の組は、コハク酸を緩衝剤に用いたが、下記の浸液を用いた二重浸漬の手順によって調製した：
【００３２】

【００３３】
ＬＳＧおよびＨＳＧの試験液での評価は、図１に示されるとおり、ＳＧ／pH効果が著しいことを示した。図１では、緩衝系として２５０mMでコハク酸を用いることの結果が示され、顕著なpH／ＳＧ効果が観察された。この効果は、低ＳＧの傾きのＫ／Ｓに対する高ＳＧのそれの比として表される。この場合の比は２．７０であって、pH／ＳＧ効果が１７０％であることを示す。
【００３４】
実施例２
グリセロール−２−リン酸二ナトリウムおよび塩化ナトリウムを緩衝系として用いる、試験片の第二の組を、下記の浸液から調製した：
【００３５】

【００３６】
前記の二重浸漬法によって、試験片を調製し、前記のとおり評価した。この評価の結果を、図２にグラフで示す。図２を参照すると、ＬＳＧの試料に対するＨＳＧの試料の用量応答（Ｋ／Ｓによって示される）の傾きの比は、１．１２である。これは、コハク酸を単一緩衝剤として用いて得られた２．７０という比より好ましいが、それは、より優れた緩衝系を用いることによって、pH／ＳＧ効果が顕著に軽減されたからである。傾きの比は１．１２、すなわちpH／ＳＧ効果は１２％である。
【００３７】
実施例３
下記の浸液を用いて、試験片の第三の組を調製した：
【００３８】

【００３９】
これらの浸液から調製した試験片を用いて得られた用量応答を、図３にグラフで示す。
【００４０】
実施例４
下記の二つの浸液を用いて、試験片の第四の組を調製したが、ここでＭＯＰＳは、７．２というpKa 値を有する３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸である。緩衝試薬のこの組合せを用いることによって、より広範囲のpHを網羅することができる。すなわち、グリセロール−２−リン酸（pKa ６．６５）はpH５．６５〜７．６５を網羅し、ＭＯＰＳはpH６．２〜８．２を網羅して、尿試料中に見出される５．６５〜８．２という全pH範囲を与える。
【００４１】

【００４２】
これらの浸液を用いて製造された片の試験は、pH／ＳＧ効果が僅かであるにすぎない優れた用量応答を得られることを立証した。
【００４３】
実施例５
５回目の実施では、下記の浸液から試験片を調製した：
【００４４】

【００４５】
これらの浸液を用いて調製した片は、プラスドンを含むため、より安定であった。
【００４６】
実施例６
本発明の開発に導いた研究の際に、試験液中のクエン酸塩イオンは、クレアチニン測定法に負の偏りを生じることが発見された。より詳しくは、クエン酸塩イオンはアッセイに、分析対象物（クレアチニン）の回収が真の濃度より低くなるように干渉した。Ｃｕ⁺²／クエン酸塩イオン錯体の濃度を上昇させることは、尿試験試料からのクエン酸塩イオンの干渉に対する耐性を増大させることが見出された。Ａ、ＢおよびＣとして特徴付けた３種類のクレアチニン試薬片配合物について、研究を実施した。研究では、初めに標準曲線を作成し、１００mg／dl（最終濃度としては９５mg／dl）のクレアチニンを含有し、２００mg／dlおよび４００mg／dlのクエン酸溶液（クエン酸溶液のpHは７．２であった）を加えた、低比重（ＬＳＧ）試験液（pH７．２）を四重に検定した。標準曲線から試験液中のクレアチニンの量を決定し、回収率（％）を算出した。配合物Ａ、ＢおよびＣについての結果を表１に示す。より高い銅／クエン酸塩イオン錯体濃度を有する配合物Ａは、最良のクエン酸耐性を示し、Ｂについての４６．４％および４１．５％や、Ｃについての３３．７％および１３．５％に比して、２００．５mg／dlのクエン酸で８３．８％、および４０１mg／dlで８１．４％のクレアチニンを検出した。
【００４７】
【表１】

【００４８】
表１から、クエン酸干渉は、Ｃｕ⁺²およびクエン酸塩イオンの総量を増加させることによって、軽減できることがわかる。
【００４９】
実施例７
様々な濃度の第二銅イオンおよびクエン酸塩イオンを用いて、前記のとおり試験片を調製した。硫酸銅を含有する配合物は、３０〜８０mMに変動したのに対し、クエン酸塩イオン濃度は５０〜１２０mMに変動した。pH／ＳＧ効果を調べた。pH／ＳＧ効果は、クレアチニン濃度の測定に対するpH／ＳＧの干渉、すなわち、Ｃｒ＝クレアチニンとして、
pH／ＳＧ効果＝（ＬＳＧについて観測されたＣｒ濃度−ＨＳＧについて観測されたＣｒ濃度）／ＨＳＧで観測されたＣｒ濃度×１００
である。この研究では、試験片をそれぞれ、０、３０、１００、２００および３００mg／dlのクレアチニンを含有する尿試料で試験し、Ｋ／Ｓの形で活性を表す反射分光光度計で示度を読取ったが、その結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】

【００５１】
表２から、適切な緩衝系を用いることによって、ｐＨ／ＳＧ効果は、１７０％から２０％未満へと大幅に軽減されたことがわかる。配合物Ｈでは、pH／ＳＧ効果は、僅か４％にまで軽減された。
【図面の簡単な説明】
【図１】コハク酸を緩衝剤として用いた場合の、pH／ＳＧ効果を示す。
【図２】グリセロール−２−リン酸二ナトリウムおよび塩化ナトリウムを緩衝剤として用いた場合（pH＝６．８）の、pH／ＳＧ効果を示す。
【図３】グリセロール−２−リン酸二ナトリウムおよび塩化ナトリウムを緩衝剤として用いた場合（pH＝７．１８）の、pH／ＳＧ効果を示す。

Claims

尿中のクレアチニンを検出する方法であって、第二銅イオンと、ヒドロぺルオキシドと、擬ペルオキシダーゼの存在下で酸化されたときに検出可能な応答を与える酸化可能な染料と、６．６〜８．０の範囲のｐＫａを有し、かつ尿試料に接触した際に尿試料のｐＨを６．６〜８．０の範囲内に保つのに十分な量の緩衝剤と、クレアチニンの不在下での染料の酸化を防止するための第二銅イオンに対するキレート化剤と、を含む試薬系に尿試料を接触させる工程を含み、緩衝剤が、グリセロール−２−リン酸塩、３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）、１，３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕プロパン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸、又はそれらの組合せであり、緩衝剤の濃度が２５０〜１，０００ｍＭであることを特徴とする方法。
キレート化剤が、第二銅イオンとＣｕ^＋２錯体を形成し、この錯体がクレアチニンとキレート化剤との結合定数より低いが、第二銅イオンと安定的な錯体を形成するには充分高い結合定数を有する、キレート化剤から選ばれる、請求項１記載の方法。
キレート化剤がクエン酸塩である、請求項１記載の方法。
Ｃｕ^＋２に対するクエン酸塩イオンの比が０．５〜３．５の範囲内であり、Ｃｕ^＋２の濃度が５〜８０ｍＭであり、そしてクエン酸塩イオンの濃度が３〜２８０ｍＭである、請求項３記載の方法。
酸化可能な染料が、ベンジジン、ｏ−トリジン；アルキル基が１〜６個の炭素原子を有する３，３′，５，５′−テトラアルキルベンジジン；ｏ−ジアニシジン；２，７−ジアミノフルオレノン；ビス（Ｎ−エチルキノール−２−オン）アジン；（Ｎ−メチルベンゾチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２−オン）アジン又はそれらの組合せである、請求項１記載の方法。
ヒドロぺルオキシドが、クメンヒドロぺルオキシド、５−ブチルヒドロぺルオキシド、ジイソプロピルベンゼンヒドロぺルオキシド、１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロぺルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロぺルオキシド、ｐ−メンタンヒドロぺルオキシド、１，４−ジイソプロピルベンゼンモノヒドロぺルオキシド、ｐ−ｔ−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロぺルオキシド、２−（α−ヒドロぺルオキシイソプロピル）−６−イソプロピルナフタレン、テトラリンヒドロぺルオキシド又はそれらの組合せである、請求項１記載の方法。
ｐＨを、６．７〜７．４のｐＨに保つ、請求項１記載の方法。
第二銅イオン源が硫酸第二銅である、請求項１記載の方法。
酸化可能な染料が３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）であり、ヒドロぺルオキシドがジイソプロピルベンゼンジヒドロぺルオキシドであり、そしてキレート化剤がクエン酸塩である、請求項１記載の方法。
尿中のクレアチニンの濃度を測定する試験具を製造する方法であって、
（ａ）吸収性担体材料を、第二銅塩と、キレート化剤と、尿試料に接触した際に、乾燥した際の吸収性担体材料中のその濃度及びそのｐＫａによって、尿試料のｐＨを６．６〜８．０の範囲内に保つことができる、６．６〜８．０のｐＫａを有する緩衝剤であって、グリセロール−２−リン酸塩、３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）、１，３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕プロパン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸、又はそれらの組合せである緩衝剤と、の水溶液に接触させ、そして吸収性担体材料を乾燥する工程；ならびに
（ｂ）吸収性担体材料を、酸化可能な染料とヒドロぺルオキシドとの有機溶液に接触させた後、吸収性担体材料を乾燥する工程
を含むことを特徴とする方法。
第二銅塩が硫酸第二銅であり、キレート化剤がクエン酸塩であり、緩衝剤がグリセロール−２−リン酸塩であり、酸化可能な染料が３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンであり、そしてヒドロぺルオキシドがジイソプロピルベンゼンジヒドロぺルオキシドである、請求項１０記載の方法。
水性浸漬溶液中の第二銅イオンの濃度が５〜８０ｍＭであり、キレート化剤の濃度が３〜２８０ｍＭであり、緩衝剤の濃度が２５０〜１，０００ｍＭであり、そしてＣｕ^＋２に対するキレート化剤の比が０．５〜３．５である、請求項１０記載の方法。
請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法で製造することができる、尿中のクレアチニンの測定のための試験片。