JPS5966899A - 過酸化水素定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 □本発明はキサレチンオキシダーゼ′（以下、Ｘ０Ｔ）
と略す・。）による代謝を終末パするプリン代謝経路に
係る代謝物及秒酵呆ア改良された定計□方法に関するも
め□で鬼゛る。ｊらに□本発明１ま□改’１ｉ＋””ｊ
れた色原体が第いた過酸化：水素定噺方法に１νＮ”る
ものであるＯ プリン代ＩＴ路は１Ｆ記の図式に示される様１１代　□
・−一′□副経路である、　　　ｌ：、　’ｌ　’、：
ｌ”ＩＩ　、、ｌｉｌ　’ｌ　　・　、。

□　　　　　　１１　　　　１　　　□　　１アデノシ
ン　　　　　　　　　　　　イノシン　　　　　　　　
　ヒポキサンチン尿酸 グアナーゼはグアニンを脱アミノ化してキサンチンとア
ンモニアに分解する酵素であり、更にキザ□ン：ｆ？は
ＸＯＤにより尿酸とｊ６′５酸化水素に分解される、ア
デノシンデアミナーゼはアテノシイをイノシンとアンモ
エフ５分解する酵素で今り、□イノシンはさらに代謝さ
れキサンチンとなる。

従来、これら経路の代謝物および酵素の臨床診断測定の
例として、キサンチン尿症での尿中キサンチンの測定（
仁科甫啓ら゛、臨床化学シンポジウム、第２０年、１７
８は−ジ、１９８０年）、あるいは肝疾患鑑別における
血清グアナーゼの測定（伊東進も、肝＋１４　、第１６
′巻ＩＯイージー９７５年）、さらに埠疾患での血清ア
デノシンデアミナーゼの測定ヒ、加藤憲二ら、臨床化学
シン７６ウム。

第１８律、１９７ペ一ジ１９７８年）が報偶されフ ている。

このように、プリン代謝Ｕ路の乍素活性および代謝物の
測定のもつ臨床的′ｌ！に義は１１噌しに高まりつつあ
り、従ってこれらの正確な測定法の確立が急がれるとこ
ろである。

これらの測定に用いられる原理としては、グアナーゼの
測定については基質プリンの減少を紫外吸光度測定で測
定する方法’　（Ｆｔｏｕ＋ｂおよびＮｃ＋ｒｒｉｓ＋
Ａｒｃｈ、、　’　Ｂｊ、ｏｃｈｅｒｎ　、、＊　”Ｉ
Ｒ’　２９巻、１２４ｄ−ｕ’ｔ１””９’５０年）、
生成物であるアンモニアを測定する方法（Ｈｌｒｓｃｈ
ｒｅｔｇら、　０ａｎｃｅｒ［ｅｓｚ　ａＴ４２巻、５
２４ページ、１９５２年）、さらには生成物であるキサ
ンチンにＸＯＤを作用させて生じる尿酸を測定するか（
Ｋａｌｃｋａｒ、　Ｊ＝Ｂ＄ｏ１．　Ｃｂｅｍ、＋、　
ＷＥ　１６７．９　ｍ　４’６ｉイージ、１９４７年）
、あるいは過酸化水素を測定する方法（Ｓｕｇｉｕｒａ
ら、　Ｑｈｅｙｎ、　、Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕ１ｘｓ＋第
１ｘｓ＋　４２６−＜、−ジ、１９８１恥が知られてい
る＠また。アデノシンデアミナーゼの測定については、
生成物であるアンモニアを１ｆｌｌｌ定する方法。

（Ｋａｌｃｋａｒ＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、＊　
ｍｌ　６７１ｆ　＋　４４５　　ｄ−ジ、１９４７年）
、７’リンヌクレオシｒホスホリ、ラーゼおよびＸＯＤ
を介在させる。ことによ、り生成物のイノシンを尿１′
、と過醇化水晃吟変換させ、生じた過酸化水素を測定す
る方法（Ｓｕｇｉｕｒａらｒ　にｈｅ１ｍ。

Ｅ？ｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　＋　第２９巻、４２６ペ
ージ、１９８１年）などが知られている。

しかし、アンモニアを測定する方法、基質プリンの州、
少を紫外吸光度グ化で？ｌｌｌ定する方法あるいは生成
物である尿酸を測定する方法では被検検体中の内因性ケ
ンモニア、紫外吸７（物質あるいは尿１！！！の影響を
受けるため、検体ブラジク測定を実施しても、測定結果
が不正確となる揚台がある。

一方、、　Ｘ０ＩＤ□の作用によって生成した過耐イし
水素を測定する方法によれば、実δ１１１された過酸化
水素１ＪＦｙ、量は紫外吸光度測定により求めたｌＪ：
、仰（＆ｊｉ少斯から算出した理論的過酷化水素生成油
よりも低い値を示すこと、さらに反応タイムコースがｉ
Ｃｌ　ｈ　’Ｉ９Ｚを示さないこともあって１．臨床診
断用の１ｌｌｌｆ　足反応系としては満足できるもので
はなかった。その上過酸化水素の検出系においても感襞
１反応ｐＨ１自動酸化及び退色性のずべてめ点で満足で
きる色原体は皆無であった。

本発明者らは、ＸＯＤを終末の酵素として生成する過酸
化水素を検出測定する系において、まず反応系では過酸
化水素を定量的に産生させるべく５また検出系では従来
の色原体が□有する問題点の改−された新しい色原体系
を見い田□すべく疲意検訂を重ねた結果、本発明誉尭成
した。

本発明によ暮改良の７ｉ点は、癲酸化ｉの検出測定系に
おいて、ｘＯＤの反応時ｉＣｘ　’　、ｅ−オキシドデ
スムターゼ（以下、””ＳＯＤと□略す。）□を４（存
させる点にある。こうすることにより過酸化水素が埋１
で生成し談つ酵素反応り□イムコ□−スが面線性を示す
ことが見い出された。

ＸＯＤは、　　　　　　′ キサンチン＋Ｈ２０＋０２→尿酸＋Ｈ具０２．　　　”
（１１あるいは ｈｙＮ＊ｔｙｆｙ＋　２Ｈ’Ｏ＋２０　”ｌ’ｆｉｐ：
＋　２ＨＯ”　（２１で示仝れる反応を触媒する酵素で
あるが、生成物である尿酸は基ηであるキサンチンおる
いはヒボキサンチンと当量生成するのに対し、酸素必還
元体としては過酸化水素お呈びスーパーオキジドアーオ
ンとして産生され、過酸イ１水素とスニ・・−オキシド
アニオンの比はｐＨあるいは基質濃度によって変化する
ことが知られている（Ｆｒｉｃｌｏｖｉｃｈ。

Ｊ’、””Ｂ１０１”＊　Ｃｈ鈷ｎ’１；、’ｌ第２４
５謬、：４０□５瓦ば一１ジ１．□１”　９　’ｒ’　
。

年）。−□ さらに□′逼酸□化水素はスーツξ−♀キシＶアニオン
存在下、　　　　　　　　　　′　　　　□Ｈ’Ｃ）＋
Ｏ・　−訃０’Ｈ−１−ＯＨ＋Ｏ（３ｉで示さオする非
閏素的反応により水ｍｌ基ラうカル弊に変化することパ
知られている（ＯｂｍＯｒｉら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第２　
’ｓ’ｑｑ　’、　３３３−ｓ−ジ。

１９７９ケ）。　１ したがって、Ｘ、ＯＤの介する反応において、単に過酸
イヒ尿素を測娘するだけでは正己（・基質負ひ（″・て
は被検体中の測定目的物質を定恣、したことにならない
。　′　　　　　　　　□　　　　　・そこで、本発明
者らは′ｘＯＤの反応機作あるいはラジカルスカベンジ
ャー等について検討した結果。

ＳＯＤをｋＯＤの反応時に存在させることにより。

過酸化水素が埋＠量生成すること耘よびｆ１￥素反応タ
イムコ−虫が直線性となることを航・出した。

すなわち、　ｓｏＤは ２０・＋２Ｈ４０＋Ｈ’Ｏ”　”　　Ｔ４１２　　　　
　　　　　２　２２ で示される反応により、２モルのスーパーオキシドアニ
オンより１モルの過酸化水素を生成すると考えられてお
り、この反応により過酸化水素は当量生成したことにな
る。さら□に、スーパ−オキシドアニオンの消去により
Ｊツーパーオキシ−アニオン存在下での過酸化水素の消
耗（反応式（３；で示される反応）が防止される□と考
えられ□る。

そのうえ、ＳＯＤを存在させることにより操□作ステッ
プ数を減らすことが可能となる。すなわち、ＸＯＤ反応
におけるスーパーオキシドアニオンの生成割合は踏角が
低濃度であるほど高ぐなる□。したがって、例えばグア
ナーゼおよびＸＯＤの作用によって生成する過酸化水素
を□測定する場合、グアナーゼとＸＯＤを同時反射させ
ると、基質キ′サンチンが低濃度の状態でＸＯＤを反応
させることとなり・スー／ぐ−オキシドアニオン生成′
量が多くなる。これをある程度避けるにはＸＯＤ反応を
別のステップとせざるを得ない。しかし、ｓｏＤを共存
させることにより、　、ＸＯＤ　　を別のステップとじ
て反応させる必要はなくなり、この面からもＳＯＤを共
存□させることは非常に有用であると考えられる。

使用する’ＳＯＤの債は生成するスーパ−オキシドアニ
オンのＴ１１により変更子ることが可ｆｉｉ’：である
が。

ｉ　〜１０　Ｕ　／ｍＣの淵度範囲でよ（、またｐＨＬ
ｔ−’５以上であればよいが、好まし文はｐｉ−（’　
５５〜９　である。またＳＯＤは非常に安定であり、□
３７℃）で１８０□分にも及ぶ長時前反応においても′
効果の減退なく使昇ルうる―さらにＳＯＤを作用させる
反□応系の緩衝液としては酢酸緩衝Ｙ１ｋ、リン酸緩□
衝液、：□ホウ曜″緩衝液、ボウ砂緩衝展あるいはトリ
玄緩別液等の通′畠の酸素反応系に用いらλする緩ｉ血
液を□すべて用いることが七きる。　□ 本発明装よる改良の第２点は、ｘＯＤ′　　によろて生
じた尿酸からさら□に□ウリカーゼによってＡ’ｔ１％
化水素を□生□成させＪこの過し・化水素′本合−′亡
て定拷す゛ることにより一検出感度を向上さ′止る点に
あて）。□従来６過版化水Ｊ′測定系においては、ウリ
カーゼ共存反射系を用□い罰も、過ド化水索の旧！１定
自体が不正値であったｋめ、あまり効果は期待セきなか
ったが；今回ＳＯＤを共存させることによって過醇化水
素の測定精度を上げることに成功し、ウリカーゼ共存反
応系を用いることにより測定感度を増強させろことが可
能と１．［つｆら。すなわち反応式ｉｌ＋及び（２１か
ら理解されるように、尿ｉ’ｉ？から過酸化水素を生成
することにより、式Ｉｌｌの場合１；ｊ　２倍モル、そ
して式（２１の場合は３倍モルの過酸化水素を化学最論
的に正確に生成↓ることができる。これまでＸＯＤをブ
ｉして生成した尿酸の定、、濡を紫外吸光チ１１１定法
により　　　　試みたＰ　（Ｋａｌｃｋａｒ、　Ｊ、Ｒ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ−＋　２１３１６７巻、４６ｉ−２−ジ、１’
９４７年）はあるが、この尿酸を過酸化水素に変換して
測定しに口実用例はない。ＳＯＤを介在さすることによ
り、正しい過百化水ネを測定できるようになったため。

ウリカーゼ共存反応が感度増強の点で実用上大きな意義
を生じることとなった。ｐｉ（６〜９の範囲の反応にお
い℃はウリカーゼは５〜５０ｍＵ／罰の、１度で添加す
ればよい。

本発明による改良の第８点（訃ＸＯＤ　　およびウリカ
ーゼによる前処理法を組むことにより、検体中の尿酸あ
る℃・はキサンチン等内因性物質を消去す←ζ、！″−
，アき１．、シた／〕１つて隼体声検が歪型となや、、
事、あるいは測定の自動分析機への適応が容易になる事
等、実用的、有用性を高めた点にある。

、近〒１．艮シ析臀↑の臨床診断試薬の適ｒ！、」＆チ
その需要面からも鴻太な課；嗅であるが、プリで代ｌ？
ｊ経路に関す、る−禦活性の測定法としては検体盲検系
列の測定を行わ、な゛、゛１自動分析（ト適用させて。

いる報告は見当らケい。それ（・ま：ＩＩＵ検体中の血
清等に含まれる内、因ｌ生のでリン代謝産物等の物質の
濃度とそれらに関する幣素活注の比が大きいため。

事実上検体盲検系列つ測定を無視、し得ないこと、が−
因と考えられる・ この問題点の解決のた。め鋭意ＱルたＰＡ牙Ｊ、；、ｘ
ＯＤおよびウリカーゼによる前処ｑｌ法を組めレキ検体
中のこれら尿酸、キサンチイ等の影響をｌｉｌ　ｉ７で
き、る小が判明只だ。すなわち、前、枠朋系でばｘＯＤ
　Ｏ，５゜〜５０ｍＵ／ｍ６．　ＳＯＤ　２〜２０Ｕ／
ｍｇ、ウリカーゼ５７１００　ｍＵ〜およびカタラ下ゼ
１〜５（ＪＵ／獣を含む第１反応試薬を一体に作用させ
、内因性のキサンチン、ヒボキサンチン、尿酸等を分解
除去した後、カタラーゼ活性を阻止するに十分なアジ化
はｆ賽素１例え、ばグアナーゼ活性測定の際はグアニン
を添加したものを階、素反応スタートとして用いる方法
である。

この方法により、検体の内因性物質、の影響を取り除く
ための検体盲検系例の測定が要らず、測定法の簡略化及
び自動化ができることになり、このことは臨床診断上、
実用価値が高いものと考えられる。

本発明はプリン代謝経路に係る代謝物及び酵素の改良さ
れた定」方法を実施するｋあたり、用いられる過酷化水
素検出系の発色剤としては１本発明の一部を構成する後
述の改良された色原体を用いることができるが、これ以
外の従来から知られているイルオキシダーゼ系発色シス
テム、例えば３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン−ヒ
ドラゾン・塩酸塩（以下、　Ｍ１３ＴＨと略す）とＮ−
エチル。

−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリ
ン（以下、　ＥＨ５−アニリンと略す。）を用いる系ま
たは）４Ｂ’ｒＨとＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホ、イ
ロピル）アニリン（以下、ＥＳ−アニリンと略ず、。、
）を用いる系を使用しても十分本発明の目的を達成する
ことはできる。

さらに本発明は臨床診断試薬の過１ぽ化水素定１ｄ゛方
法の改良をも含むものである。

従来、臨床診断試薬での過酷化水素検出系としては、、
ベル、オキシダーゼを共役酵素として用い、色原体とし
て■　４−アミノアンチ−リンと％ジエチルアニリンあ
るいはＥＨ８−アニリン等のアニ・。

リン誘導体、■　４−アミノアンチ−リンとフエ、。

ノール、あるいは■　ＭＢＴＨと、ジメチルアニリン、
ジエチルアニリン、　ＥＨ８＋−７ニリンアルい（ｊ。

ＥＳ−アニリン等のアニリン誘導体を用いた系が汎用さ
れている、これらについて、■の系は感度が低く％酸沈
側よりも中性側において特に退色ｆｌｕが・。

大きくかつ・感度が低いこと、■の系は可視部短波長側
に吸光、度ピークを持ち、・、被検体由来の色調、の影
響を受けやすく、ナだ感度が■〜■の系の串で最も低い
こと、そして■の系ば発色９口が３〜４と低いため、過
酸化水素を生成さｉる酵素反応とは別の哀テップを組む
必要へ元るミと等□いずれの系も操作上の難点及び′矧
所があり１色原体として満足できるものでは殖い。−□
′□ そこで本発明者らは、従来の過酸化水素検出系の欠点を
改良したｐＨ中性域で使用できかつ感度の良い色原体系
を見い出すため鋭兼検討を重ねた結果、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２”−ヒ□ドロｊシー３−スルホプロヒ０ル）−ｍ
−アニシジン（以下、　Ｅ）（Ｓ−アニシジンと略す。

）するいはＮ］エチル−Ｎ−（３−スルポゾロビルゲー
ｍ−アニンジン（以下ＥＳ−アニシジンと略す。′）′
またはそれらの塩とＭＢＴ）１とのカップリング系が目
的とするφ件を満足誓ることを見い出した。　　　□　
　−−これらのアニリン誘導体とＭＢＴＨとのカップリ
ング系は、特開昭５６−１３３６６０号及び同５７−６
４６６ｏ４明ｉ中“ですでに萌らかＫされているが。

１ （１）　　両明細書では、これらのテニ＋）’−７誘導
体と４−アミノアノチ・ピリンど・の系にっ：いては１
種々のｐＨにおける検討がなされているが、・ＭＢＴＨ
との系について１′！、′、全く検討がなされておらず
。

ＭＢＴＨとの系における至適ｐＨヤニごの明ｇ井がら類
推すしことは不可能である。・　・（Ｉｔ）　　従来・
から知られている、ジメチルアニリン。

ジメチルアニリン等のアニリン誘導体とＭＢＴＨとのカ
ップリング系においてはＪ至適ｐＨは３〜４であ□す・
中性附近では感度・本低くまた退色及び自動酸化が起こ
ることが知られている［Ｃ１１ｎ’１ｃａｌ　Ｃｈｅｉ
ｎｉｓｔｒｙ、　ｌ’Ｌ１１５４（１，９７１）参□照
のこと。〕 等の埋自から、Ｅｌ８−アニシジンまたばＥＳ−アニシ
ジンとＭＢＴＨとの系をｐＨ”５〜６．５で反応させる
と感度・が向上し、さらに退色性や自動酸化の面で□も
□改善が見られるということは全く予測不可能なことで
あったと考えられ机・□□ Ｅ）（Ｓ−アニンジンあるいはＥＳ−アニンジンまたは
それらの塩とＭＢ’ｒＨ□層のがツプリラグ系髪用いて
過酸化水素を発色□さぜると、５７’Ｑｎｍ賄近に吸光
度−一りを示し、ｐＨ５〜６．５における・発色反応で
は自動酸化及び退色は認められず、さ・らにＴ）Ｈ６で
発色強度は、４−アミノ了ンチビリ：ンと【′４・艮−
ジメグ・ルアニリンどの系、を用いた場合・に較べて約
３倍、ま、たｌＥｓ−アニシジンとＭ、ＢＴＨとの系を
ｐＨ３，〜４で用いた場合・に比べ・て、約１．５倍の
発光度を示す。すなわちｐＨ６附近で安定に過酸化水素
を高Ｒ濃度に発色させる・方法としては、今までこの方
法に及ぶものは皆無である。Ｅｌ８−ア冊シジンまたは
Ｅ、Ｓ−アニシジンは、この方法によりｐ・Ｈ５、〜６
．・５での発色に用、いることができるのでカイネテイ
ックアッセイの自動分析器に適用させる・ことか・でき
る。　　　、　　・　　　　　　。

Ｅｌ（Ｓ−アニシジンあるいはＥＳ−アニシジンマタは
それらの塩とＭＢＴＨとのカップリング系を用いた本発
明の過酸化水素定量方法は、ｘＯＤを介するプリン代謝
経路の代謝物及び酵素の測定だ・けでなく、グルコース
オキシダーゼを介在させて、の、グルコースのｂ出足、
あるいはコレステロールオキシダーゼを介在させてのコ
レステロールの測定等、、過酸化水素の検出による臨床
診断用測定であればすべての場合・捉適用できる。

本発明により、グアナーゼ等プリン代謝経路の酵素活性
あるいは代謝物の低値のものも精度よく正確に８１１１
定することが可能になり、さらにこれまで用手法にて検
体ブランク測定の□必要性、反応時間の長さ、操作ステ
ップ数の多さなど繁劇ｔさのみとめられていた測定を短
時間反応の自動分析器へ適応させることをも可能にした
。なお、本発明め過解イヒ水累検出の高感度および正確
さを保持するためには、カフラーゼ明香剤としてアジ化
ナトリウムを過酸化水素の産生糸および発色検出系に存
在□さ奢ることか望ましい。

−以下、実施例をあげて置体的に説明する・但し。

グア□ナーゼ標品のＩＵはグアニジ基質より２５υ反Ｑ
ｒ□１分間□に１μモルのＡ・サンチンを生成する酵素
活性を□いい、ＳＯＤめＩＵはキサンチン、ＸＯＤ’。

フェリサイトクロームＣかも成る反応系において２′５
ｃｐＨ７３８でのフェリサイトクロームＣの５５’Ｏｎ
ｍ”におけ、る１分間あたりの吸光□度低下００２５を
５０％抑制する酵素量をいう。

実施例１ ウサギ肝臓起源のグアナーゼ測定値品Ｏｍ　５．１．０
および２０　ｍＵ７’ｒａｌの液０．　（１５＊ＱＣ第
１試薬としてグアニｙ　０．４５５　ｍＭ、ｘＯＤ　５
，５２　ｍｕ　／ｒｎ１．リン酸２ナトリウム−クエン
酸緩衝液２０＋ｎＭおよびアジ化ナトリウ、ム９０μ９
　／ｍＡから、プよる液１．４５ｍｇ（ｐＨ７，４）を
加え、３７Ｃで３０分反応させた後。

ＭＢＴＨＱ、１　ｍｋ４．　　ＥＨ８−アニソｙ４ｍＭ
、”！ルオキシダーゼ２　Ｕ　７ｍ、ｌ　およびリン酸
２カ涛゛リウムークエン酸緩衝液Ｑ、２Ｍからなる第２
試薬土５　＋ｎＡ　（ｐ）１３．４　’）を加え、３７
Ｃで１０分後、５９９ｎｍでの吸光度を測定した。その
結果得られた検、量線を第１図■に示す。同様にして本
発明の方法として第、ｉ試薬にＳＯＤ　２、Ｉ　Ｕ　／
ｍｌを含有するもの−およびＳＯＤ　２．ＩＵ／ｍｅと
ウリカーゼ２４．１　’ｒｎＵ／ｍｌを含有のものにつ
いて測定して得られた検量線をそれぞれ第１図の■及び
■に示す。図から明らかなように事実上の発色吸光度、
を千■（些べ■は・ｑ・＜なって（・る暫：これ、はＸ
ＰＩ）、反応時（ｑ７−／ｆ−オキシドアニ丼ンの発生
のだぞ）に起甲す、る過酸、化水素の消声ム！ると考え
られ仝。また、■跡■の埋、：論上の２倍ト）発色吸光
度を示しており、Ｓ９Ｄ添加？効果が化学１１′論的な
面からも証明されている。。

実施例２ 実施例１と同様の方法でウサギ肝由来σ）′テ了プ゛７
ゼ竹品ｍ液５ｍＵ／ｍ／＋を用いてグアナーゼ反応タイ
ムコースを測定ｑノこ。ＳＯＤ添加の場合と無添加の場
合につい千得１１．れた結果を第２図■及び■に示す：
。酵素反応タイムコースの直線ｔｊ−ＬはＳＯＤ添加時
の方（■）が優れていることが！らか一〇ある。

／≧１４１．イＨ（≧’ＩＪ　３ 実施例１と同様０方？左で３Ｆ血ｉ’４４°９゛“呈ｉ
１ｊ定を行った。但し、ＳＯＤ添加で１５０分反応さ芝
、検体盲検値との吸光度差とグアナーゼ標品で？検を糾
！かもグアナーゼ活性ｍＵ　／ｍｅ血清を算出した。

その結果、健常ヒト血清ではグアナーゼ活性は（１２〜
０．６　ｍ　Ｕ　７ｍｌ！　　であった。また、　０．
３　・ｒｎＵｙ’ｍｅおよび１．６　ｍＵ／ｍｉのグア
ナーゼ活性の血清検体を各／２００回での同時再現性を
みたところＣ■、値（変動係数）はおのお・の２．６６
％および１．７３％であった。

実施例４ ＠ｉ試梨として、　ＸＱＤ　ｌ　５．、：３　ｍＵ／ｍ
ｅ、ウリカーゼ６８　ｍＵ／＝−／Ｉ＝　　ＳＯＤ　６
、Ｆ３　Ｕ　７ｍ１．、カタラーゼ１７Ｕ／ｍｅおよび
リン酸２ナトリウム−クエン酸緩衝液２０ｍＭからなる
液（ｐＨ７，４）を調製し、第２試薬として、グアニン
０．２　、ｒｎＭアジ化ナドナトリウム４００μ はルオキシダーゼ２　Ｕ．、／ｍｌおよびリン酸２ナト
リウム−クエン酸緩衝液２３ｍＭから成る液（ｐＨ４．
０）を調製した。第１試薬と第２試薬の等景況合物のｐ
Ｈは６となった。ヒト血清１２μｌに第１試薬３５０μ
ｌを添加し、３，、７Ｃで５分間反応後、第２試薬３５
０μ４を添加し、３７′Ｃで反応させ１分および５分後
に主波長５　４　６　ｎｍ．副波長６６、０ｎｍで吸光
度が測定されるようにプログラムした自動分析機（日立
７０５）で測定した。グアナーゼ活性はグアナーゼ標品
についておこなった検量線から求めたｖ１４を用いた。

検体試料として種々の直情検体１１４例についておこな
った結果、実施例１の方法に準じ，グアニン無添加試薬
（基質除外）を用い測定した検体ブランク系列と検体系
列との吸光度差より得た用手法のグアナーゼ測定値と本
実施例での前処理自動化法との相関保針は０，９９であ
った。このことより前処理操作をする事にヨリ。

充分、自動分析器への適用が可能になる事が証明された
。

実施例５ の感度比較 過酸化水垢濃度０〜６０μｍｏｌｅ／ｌの溶液ｏ．ｉ酎
ＫＭＢＴＨ　Ｏ．０５ｍＭ．’ＥＳーアニシジン０．５
ｍＭおよ□びリン酸２ナトリウム−クエン酸ＥＩ　Ｍｉ
液２　０　０　ｍＭからなる液（ｐＨ６，０）を調製し
、その２．８　ｒｒｔｌおよ（Ｊ　Ｒｈ　、ｔ　＊　シ
ダーゼ３０Ｕ／ｍｌの水溶液０．１　ｍｌを同時に加え
、３７Ｃで７分反応させた後の発′魯度合を水を対照に
最大吸収波長である５　７０　ｎｍにて測定し、過酸化
水素検量線（第３図の■参照）を作成した。

同様にして、比較対照として、ＭＢＴＨ０，０５ｍＭ。

ＥＳ−アニシジン０．５　ｍ　Ｍ及びリン酸２ナトリウ
ム−クエン酸緩衝液２００　ｍＭからなる液を］）Ｈ４
，０にＸ１４４し、その２．８　ｍｅと上記のイルオキ
シダーゼ液０．１罰を用い過酸化水素検量線（第３図の
■参照）を作成した。

さらにＭＢＴＨとジメチルアニリンとの系及び４−アミ
ノアンチビリンとジメチルアニリンとの系を用いた従来
法による過酸化水素検出系についても比較した。これら
の試薬濃度は通常用いられる方法Ｉｆ（準じ、使用する
緩衝液は上述の、緩衝液の条件を用いておこない過酸化
水素検出系（第３１＋■及び■参照）を同様にして作成
した。なおＭＢＴＨ−ＥＳアニシジン累以外や測定に用
いたそれぞれの最大吸収波長は、ＩＪＢＴＨ−ジメチル
アニリン系は５９０ｎｍ、４アミノアンチヒ０リンージ
メヂルアニリン−￥−は５５５ｎｒｎであった。

第３図から■で宗されろ本発明７５法の色原体がｔ味方
法の色原体（■及びＣ））及び本発明の色１）Ｗ体をｐ
Ｈ・１．０で用いた！！２合（■）に醇べて、いづね、
もｒｌｌｌＬ・度の高いことは明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はウサギ肝由来のグアーノ−−ゼ標品を用い。 従来法１本発明のＳＯＤ添加法およびＳＯＤとウリカー
ゼとの添加法により作成したグアナーゼ栓用Ｌ１°を示
ずグラフであり、第２し１は同様にウサギ肝由来のグア
ナーゼ標品な用いたー・累反応タイツ、コーー・におけ
ろＳＯＤ　の添加効果を示すグラフであり、第３因は過
酸化水素検］テ１紳による本発明のＪｌ・）酸化水素検
出用色原体と（Ｊｌ謬にのものとのＪ岱度の比較を示す
グラフである。 Ｎ中符号： ■−−−従来法；■−−−３ＯＤ　　添ｖ１１；■−−
−ＳＯＤおよびウリカーゼ添加；■−−−ｉ迫り添加　
■−−−ＳＯＤ　ｊｌ／ｊＦ添加；■−−一本発明の色
原体（ＭＢＴＨ−ＥＳアニシジン系、ｐＨ６）：■−−
一本発明の色原体（ＭＢＴｆ（−ＥＳアニシジン系、ｐ
Ｈ４）：■−−−従来の色原体（ＭＢＴＨ−ジメチルア
ニリン系、ｐＨ４）　：■−−−従来の色原体（４−ア
ミノアンチピリン−ジメチルアニリン系、ｐＨ６）。 （ほか３名） 第　　１　　図 り゛アナー乞゛二ｆ１１・’ｔ　　（ｍｕ／ｍＪ）第、
２図 反動時１ｖｌ（郁） ″′　　　　　　　　坑　　３　　図　　　　：　・適
時化ＡＪ４ｒ（ｆｉ而面）、。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　キサンチンオキシダーゼのｒ「用を介、して、生
   成する浸酸化水素を測定するに際して−スーパーオキシ
   ドブそムターぜをキサンチンオキシダーゼと一緒に反応
   させることを、特徴と、する過酸化水素定量方法。　　
   　　　　　、：　　・・　、　　・２、キサンチンオキ
   シダーゼの作用を介して、生成する。過酸化水素を測定
   するに際して―・スーツξ−オ、キシドデスムターゼ及
   びウリカ、−ゼをキサンチンオキシダーゼと一緒に反応
   させることを特徴とする特許請求の範囲第１′乎記載の
   過酸化水素定量方法。　　　　　　　　・　　　旨・　
   ・　−３、キサンチンオキシダーゼの作用を介し−ｔ％
   生成する過酸化水素を測定するに際して、前処坤系とし
   て検体にカタラーゼ、ウリカーゼ、ス□ニパーオキシド
   デスムターゼ及びキ・サンチンオキシダーゼを含有する
   □試薬を加えｓ”’ｐ’Ｈ６”’８で反応さ、せた後、
   アジ化ナトリウム、ウリカーゼ及びスーぐξ−オキシド
   デ、スムハターゼをキサレチンオキシダーゼと一緒に反
   応、、さすることを特徴どする％ｒｔ、１ｉｉｌ？求の
   範囲第１項記載の過酸化水素定量方法。 ４、過酸化水素発色剤が、３−メチル−２−ベンゾチ、
   ブゾリノンーヒドラゾン・塩酸塙””４ルオキシターゼ
   及びＮ−エチル□−Ｎ　−（２−ヒドロキシ〒３−スル
   ホズロビル）＝’−ｍ−了ニシｉンまたはその塩から成
   るか、あるいは３−メチルニ２−ベンゾチアゾリノンー
   ヒドラゾン・［（Ｆｌｔ３Ｘ、’−ニルオキシダーゼ及
   びＮ−エチル−Ｎ＝（’３−ス彪ポズロビル）−□ｍ−
   ア″二ンゾンまたはそのｊ盆力・ら成り、ｐ・Ｈ５〜□
   ６．ＥＱ発色させることを特徴とする過酸化水素定量方
   法。