JPS60262598A - 水性試験試料中のエタノールの存在を測定するための試験具及びその製造方法 - Google Patents
水性試験試料中のエタノールの存在を測定するための試験具及びその製造方法Info
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- JPS60262598A JPS60262598A JP60118980A JP11898085A JPS60262598A JP S60262598 A JPS60262598 A JP S60262598A JP 60118980 A JP60118980 A JP 60118980A JP 11898085 A JP11898085 A JP 11898085A JP S60262598 A JPS60262598 A JP S60262598A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に固体状態の試薬片（固体状試験具）に
よる、水性試験試料中の分析対象物の測定に関する。更
に詳しくは、本発明は、水性試験試料中のエタノールの
測定に有用である固体状態の試験具に関する。血液、尿
又は唾液等の体液試料が特に重要である。
よる、水性試験試料中の分析対象物の測定に関する。更
に詳しくは、本発明は、水性試験試料中のエタノールの
測定に有用である固体状態の試験具に関する。血液、尿
又は唾液等の体液試料が特に重要である。
エタノール検査は、産業上、医学上及び法律施行におい
て有用である。産業上において、エタノールの存在濃度
は、発酵の進行度または溶媒純度の測定に使用すること
ができる。更に、適切なエタノール濃度であるかどうか
、測定するためにアルコール性飲料及び薬物を試験しな
ければならない。医学上においては、血流中のエタノー
ルの存在及び濃度を用いて、運動機能の損失または生命
を脅かす昏睡等の起りうる原因の中から判別診断を行う
助けとすることができる。血中エタノールの測定は、問
題のある酒飲、み及びアルコール中毒と診断された人々
についてコンプライアンスプログラム（ｃｏｍｐｌｉａ
ｎｃｅ ｐｒｏｇｒａｍ）としても、使用す亭 ることができる。法律上は、血流中のエタノール濃度は
、機械操作をするため、あるいは自動車または他の乗り
物を運転するための適合性の客観的なじるしとして使用
される。簡単、迅速で、かつ、便利な血中アルコールの
測定方法が、法律施行の面から特に重要である。
て有用である。産業上において、エタノールの存在濃度
は、発酵の進行度または溶媒純度の測定に使用すること
ができる。更に、適切なエタノール濃度であるかどうか
、測定するためにアルコール性飲料及び薬物を試験しな
ければならない。医学上においては、血流中のエタノー
ルの存在及び濃度を用いて、運動機能の損失または生命
を脅かす昏睡等の起りうる原因の中から判別診断を行う
助けとすることができる。血中エタノールの測定は、問
題のある酒飲、み及びアルコール中毒と診断された人々
についてコンプライアンスプログラム（ｃｏｍｐｌｉａ
ｎｃｅ ｐｒｏｇｒａｍ）としても、使用す亭 ることができる。法律上は、血流中のエタノール濃度は
、機械操作をするため、あるいは自動車または他の乗り
物を運転するための適合性の客観的なじるしとして使用
される。簡単、迅速で、かつ、便利な血中アルコールの
測定方法が、法律施行の面から特に重要である。
１、 エタノール分析
エタノール検査について、重要性及び広範囲にわたる用
途があるが、エタノール検査には、多くの分析方法が利
用できるということは、驚くことではない。エタノール
検査は、ポテンシオメータ−による測定、赤外線分光器
、またはガスクロマトグラフィーによって、器械的に、
行なうことができる。更に、酵素及び非酵素溶液分析の
両方ともが利用できる。非酵素分析は、エタノールとの
反応により色が変化する。過マンガン酸塩及びニクロム
酸塩等の強酸化剤を使用する。しかし、残念ながら、強
酸化剤の非特異性のため、強酸化剤は、多くの他の酸化
可能な物質とも反応し、誤った高い結果を生じることに
なる。酵素分析は、一般にアルコールデヒドロゲナーゼ
あるいはアルコールオキシダーゼの使用による。これら
の分析は、分析対象物の定量分析を容易にするために酵
素の競合阻害物質をも利用することが多い。（例えば、
米国特許第 ３，１１７７．９４４号参照）。
途があるが、エタノール検査には、多くの分析方法が利
用できるということは、驚くことではない。エタノール
検査は、ポテンシオメータ−による測定、赤外線分光器
、またはガスクロマトグラフィーによって、器械的に、
行なうことができる。更に、酵素及び非酵素溶液分析の
両方ともが利用できる。非酵素分析は、エタノールとの
反応により色が変化する。過マンガン酸塩及びニクロム
酸塩等の強酸化剤を使用する。しかし、残念ながら、強
酸化剤の非特異性のため、強酸化剤は、多くの他の酸化
可能な物質とも反応し、誤った高い結果を生じることに
なる。酵素分析は、一般にアルコールデヒドロゲナーゼ
あるいはアルコールオキシダーゼの使用による。これら
の分析は、分析対象物の定量分析を容易にするために酵
素の競合阻害物質をも利用することが多い。（例えば、
米国特許第 ３，１１７７．９４４号参照）。
エタノールに対するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤ
Ｈ）の酵素反応は次のとおり進行する。
Ｈ）の酵素反応は次のとおり進行する。
エタノール アセトアルデヒド
ＤＨ
＋ ＋
ニコチンアデニン 還元型ＮＡＤ
ジヌクレオチド （ＮＡＤＨ）
（ＮＡＤ）
還元型ニコチンデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を次
に紫外線分光器により直接測定することができ、あるい
は上記反応は、スペクトルの可視領域においてエタノー
ルのＮＡＤＨへの変換を追跡できる第２の酵素反応と対
にすることができる。
に紫外線分光器により直接測定することができ、あるい
は上記反応は、スペクトルの可視領域においてエタノー
ルのＮＡＤＨへの変換を追跡できる第２の酵素反応と対
にすることができる。
上記反応の平衡は、エタノール方向に強く片寄っている
ので、アセトアルデヒド−トラッピング試薬をＮＡＤＨ
の生成方向に反応を進行させる手段として使用すること
が多い。（例えば、米国特許第３，９２８．７３Ｅ１号
参照）「アルコール分析；クリニカル・ラボラトリ−・
アスペツク、パートＩＩ Ｊケイ、エム、ドウボウスキ
ー、ラポラトりｍ−マネージメント、（”Ａｌｃｏｈｏ
ｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｃｌ１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ａｓｐｅｃｔｓ、 ＰａｒｔｌＴ ” 、
Ｋ、Ｍ、Ｄｕｂｏｗｓｋｉ。
ので、アセトアルデヒド−トラッピング試薬をＮＡＤＨ
の生成方向に反応を進行させる手段として使用すること
が多い。（例えば、米国特許第３，９２８．７３Ｅ１号
参照）「アルコール分析；クリニカル・ラボラトリ−・
アスペツク、パートＩＩ Ｊケイ、エム、ドウボウスキ
ー、ラポラトりｍ−マネージメント、（”Ａｌｃｏｈｏ
ｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｃｌ１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ａｓｐｅｃｔｓ、 ＰａｒｔｌＴ ” 、
Ｋ、Ｍ、Ｄｕｂｏｗｓｋｉ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ）、
１９８２年４月、３３頁には、血中アルコールの測定の
ための酵素（ＡＤＨ）による酸化方法について主な特徴
が表にされている。その表には、上記反応に基づく分析
は、アセトアルデヒドトラッピング試薬として、セミカ
ルバジドの使用により促進することができるということ
が、開示されている。生成されたＮ Ａ Ｄ ＩＩは、
次にジアホラーゼ及びイオドニトロテトラゾリウムクロ
リドを用いて着色した最終生成物（ホルマザン）を形成
することにより測定することができる。
１９８２年４月、３３頁には、血中アルコールの測定の
ための酵素（ＡＤＨ）による酸化方法について主な特徴
が表にされている。その表には、上記反応に基づく分析
は、アセトアルデヒドトラッピング試薬として、セミカ
ルバジドの使用により促進することができるということ
が、開示されている。生成されたＮ Ａ Ｄ ＩＩは、
次にジアホラーゼ及びイオドニトロテトラゾリウムクロ
リドを用いて着色した最終生成物（ホルマザン）を形成
することにより測定することができる。
他の方法では、アセトアルデヒド−トラッピング試薬の
必要性がないことが判明している。英国特許第１，３５
１，５４７号には、試料、ＮＡＤ 、ジアホラーゼ及び
緩衝液と接触させると、定量的な色度１ 応答を与える量の、アルコールデヒドロゲナーゼ及び特
定のテトラゾリウム塩を含む水性溶液で試料を試験する
方法が、記載されている。その特許は、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ及びテトラゾリウム塩からなる安定な凍結
乾燥組成物を開示しており、かつアルブミンまたはゼラ
チン及び抗オキシダント（例えば、還元型メルカプタン
）等の付加成分が、さらに反応を安定化させ、その結果
、アルデヒド−トラッピング試薬は必要どされないとい
うことが示されている。
必要性がないことが判明している。英国特許第１，３５
１，５４７号には、試料、ＮＡＤ 、ジアホラーゼ及び
緩衝液と接触させると、定量的な色度１ 応答を与える量の、アルコールデヒドロゲナーゼ及び特
定のテトラゾリウム塩を含む水性溶液で試料を試験する
方法が、記載されている。その特許は、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ及びテトラゾリウム塩からなる安定な凍結
乾燥組成物を開示しており、かつアルブミンまたはゼラ
チン及び抗オキシダント（例えば、還元型メルカプタン
）等の付加成分が、さらに反応を安定化させ、その結果
、アルデヒド−トラッピング試薬は必要どされないとい
うことが示されている。
他の酵素経路はアルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ）を使
用し、次のとおり進行する： ＡＯＤ エタノール＋０２ ←−−ア七トアルデヒド＋Ｈ２Ｏ２
この反応は、ペルオキシダーゼ及び発色性指示薬の付加
によってスペクトルの可視領域中で、過酸２ 化水素の測定が可能である第２酵素反応と対にすること
ができる。アルコールオキシダーゼの分析に使用される
液体反応のこのシリーズは、フィリップス・ケミカル舎
カンパニー（ＰｈｉｌｌｉｐｓＣｈｅｍｉｃａｌ Ｇｏ
、）によりバイオケミカルズ・テクニカル・インフォメ
ーション・プルティン・オン・アルコール・オキシダー
ゼ（２３７８５Ｅ）（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＴｅｃ
ｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔ
ｉｎ ｏｎ Ａｌｃｏｈｏｌｏｌｉｄａｓｅ）中に公表
されている。
用し、次のとおり進行する： ＡＯＤ エタノール＋０２ ←−−ア七トアルデヒド＋Ｈ２Ｏ２
この反応は、ペルオキシダーゼ及び発色性指示薬の付加
によってスペクトルの可視領域中で、過酸２ 化水素の測定が可能である第２酵素反応と対にすること
ができる。アルコールオキシダーゼの分析に使用される
液体反応のこのシリーズは、フィリップス・ケミカル舎
カンパニー（ＰｈｉｌｌｉｐｓＣｈｅｍｉｃａｌ Ｇｏ
、）によりバイオケミカルズ・テクニカル・インフォメ
ーション・プルティン・オン・アルコール・オキシダー
ゼ（２３７８５Ｅ）（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＴｅｃ
ｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔ
ｉｎ ｏｎ Ａｌｃｏｈｏｌｏｌｉｄａｓｅ）中に公表
されている。
米国特許第４，４３０，４２７号において、アルコール
オキシダーゼによって変換されるメタノールの変換速度
に対するアジ化ナトリウムによる阻害は、溶存酵素を厳
密に調べて、溶液中の酵素消費を追跡することにより測
定される。
オキシダーゼによって変換されるメタノールの変換速度
に対するアジ化ナトリウムによる阻害は、溶存酵素を厳
密に調べて、溶液中の酵素消費を追跡することにより測
定される。
２、試薬片の形態
アルコールデヒドロゲナーゼの測定用の溶液分析組成物
は固体状真上に包含させうることが示唆されている。例
えば譲受人に一般譲渡された米国特許第４．３１ａ４，
４４４号を参照すると、分析対象物が、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ等のデヒドロゲナーゼと反応してＮＡＤＨ
を生成する分析対象物測定について記述されている。Ｎ
ＡＤＨは、次いで、アンカップラー及びペルオキシダー
ゼを用いて呈色させて測定される。その特許は上記の系
を固体状具に包含させることができることを示唆してい
る。しかしながら試験具にアルコールオキシダーゼ溶液
分析をいかにして組み込むかの公知情報については発明
者は全く気づいていない。
は固体状真上に包含させうることが示唆されている。例
えば譲受人に一般譲渡された米国特許第４．３１ａ４，
４４４号を参照すると、分析対象物が、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ等のデヒドロゲナーゼと反応してＮＡＤＨ
を生成する分析対象物測定について記述されている。Ｎ
ＡＤＨは、次いで、アンカップラー及びペルオキシダー
ゼを用いて呈色させて測定される。その特許は上記の系
を固体状具に包含させることができることを示唆してい
る。しかしながら試験具にアルコールオキシダーゼ溶液
分析をいかにして組み込むかの公知情報については発明
者は全く気づいていない。
本発明は、水性試料中のエタノールの測定のための試験
具、その調整方法及びその使用方法に関する。試験具は
、アルコールオキシダーゼ、過酸化物活性化物質、及び
検出可能な色度応答をなすことができる発色性指示薬系
を包含せしめた支持体マトリックスより構成され、該発
色性指示薬系は実質的に還元（無色）型であり、該アル
コールオキシダーゼは、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの
エタノールについて５分未満で色度応答を提供するに十
分な量存在する。アジ化物を更に包含させると、その測
定具は、エタノール含量の定量測定に使用することがで
きる。水性試験試料中のエタノールの測定用の、支持体
マトリックスに包含されたアルコールオキシダーゼ過酸
化物活性化物質及び適当な発色性指示薬の使用もまた本
発明の１部分とみなされる。
具、その調整方法及びその使用方法に関する。試験具は
、アルコールオキシダーゼ、過酸化物活性化物質、及び
検出可能な色度応答をなすことができる発色性指示薬系
を包含せしめた支持体マトリックスより構成され、該発
色性指示薬系は実質的に還元（無色）型であり、該アル
コールオキシダーゼは、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの
エタノールについて５分未満で色度応答を提供するに十
分な量存在する。アジ化物を更に包含させると、その測
定具は、エタノール含量の定量測定に使用することがで
きる。水性試験試料中のエタノールの測定用の、支持体
マトリックスに包含されたアルコールオキシダーゼ過酸
化物活性化物質及び適当な発色性指示薬の使用もまた本
発明の１部分とみなされる。
使用に際しては、水性試験試料を試験具と接触させる。
次いで、１００ｍｇ／ｄＬのエタノールの存在及び／又
は試験試料中のエタノール濃度を、約５分未満で生じる
検出可能な色度応答の観察によって測定する。
は試験試料中のエタノール濃度を、約５分未満で生じる
検出可能な色度応答の観察によって測定する。
本発明の試験具によれば、水性試料中の少なくとも１０
０ｍｇ／ｄＬのエタノールを検出するために十分な感度
を与えるために使用された高濃度の溶液分析成分が、支
持体マトリックスに単に混合されている時に見られるよ
うな、誤って陽性の結果を与えるという問題点が克服さ
れる。この試験具は、迅速な結果すなわち５分未満で形
成される十分な検出可能な応答を与える。この試験具は
、通常の乾燥技術により調製され、凍結乾燥を必要とし
ない。
０ｍｇ／ｄＬのエタノールを検出するために十分な感度
を与えるために使用された高濃度の溶液分析成分が、支
持体マトリックスに単に混合されている時に見られるよ
うな、誤って陽性の結果を与えるという問題点が克服さ
れる。この試験具は、迅速な結果すなわち５分未満で形
成される十分な検出可能な応答を与える。この試験具は
、通常の乾燥技術により調製され、凍結乾燥を必要とし
ない。
溶液分析の試薬濃度は、通常は、固体状試験具に組み込
まれた時に、感度のよい分析を与えるためには、低すぎ
る。それ故に、支持体マトリックスに組み込まれた試薬
濃度は、上昇させなければならず、もちろん最終的な乾
燥固体状態の試験具における濃度は、更に高い。この濃
度変化それ自身は、固体状試験具申の成分の相互反応及
び安定性における相異に関連した特有の問題を引きおこ
す。これらの問題は、酵素が含有される時、特に大きな
ものとなる。
まれた時に、感度のよい分析を与えるためには、低すぎ
る。それ故に、支持体マトリックスに組み込まれた試薬
濃度は、上昇させなければならず、もちろん最終的な乾
燥固体状態の試験具における濃度は、更に高い。この濃
度変化それ自身は、固体状試験具申の成分の相互反応及
び安定性における相異に関連した特有の問題を引きおこ
す。これらの問題は、酵素が含有される時、特に大きな
ものとなる。
アルコールオキシダーゼに基づくエタノール試験の場合
、直接、支持体マトリックスに溶液分析の試薬濃度を包
含せしめると、満足すべき感度を持った試験具が得られ
ない。要求される感度は、試験具の使用目的により様々
でありうる。コンプライアンスプログラム（ｃｏｍｐｌ
ｉａｎｃｅ ｐτｏｇｙａｍ）につガ いて、血中エタノールの非常に低い濃度、２５〜５０ｍ
ｇ／ｄＬ（１デシリットル当りのミリグラム）は、ノン
コンプライアンス（ｎｏｎｃＯ層ｐｌｉａｎｃｅ）示す
だろ５ う。法律の施行のためには、エタノール検査は、法律上
の設定限度の感度でなければならず、米国では、通常血
中エタノールが約１００＋ａｇ／ｄＬである。
、直接、支持体マトリックスに溶液分析の試薬濃度を包
含せしめると、満足すべき感度を持った試験具が得られ
ない。要求される感度は、試験具の使用目的により様々
でありうる。コンプライアンスプログラム（ｃｏｍｐｌ
ｉａｎｃｅ ｐτｏｇｙａｍ）につガ いて、血中エタノールの非常に低い濃度、２５〜５０ｍ
ｇ／ｄＬ（１デシリットル当りのミリグラム）は、ノン
コンプライアンス（ｎｏｎｃＯ層ｐｌｉａｎｃｅ）示す
だろ５ う。法律の施行のためには、エタノール検査は、法律上
の設定限度の感度でなければならず、米国では、通常血
中エタノールが約１００＋ａｇ／ｄＬである。
ここで用いられた実験法は、水性液体試料中の少なくと
も１００ｍｇ／ｄＬのエタノールに対して、約５分未満
で、色度測定応答をする感度を必要とした。
も１００ｍｇ／ｄＬのエタノールに対して、約５分未満
で、色度測定応答をする感度を必要とした。
好ましい試験具は、約１〜２分で、最も好ましくは、１
分かそれ未満で、１００ｍｇ／ｄＬのエタノールの存在
を示すことができる。
分かそれ未満で、１００ｍｇ／ｄＬのエタノールの存在
を示すことができる。
上述したような、必要な感度を与えるために、溶液分析
試薬濃度が高められ、支持体マトリックスに包含させ、
ついで乾燥した場合、指示薬はエタノールを含有する水
性試験試料と接触する以前でさえ、実質的に酸化形態（
すなわち着色）である。言い換えれば、このようにして
調製された試ＭＡは、エタノールについて瞬間的及び遍
在した偽陽゛性試験を与える。ノンコンプライアンス（
ｎｏｎｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）についての誤った指標値
は、問題のある酒飲をリハビリするための、プログラム
能力に深刻な損害を与える。もちろん、法律限度を超６ える血中アルコール濃度を示す偽陽性試験は、ドライバ
ーにとって特に深刻な結果をもたらすことになるだろう
。
試薬濃度が高められ、支持体マトリックスに包含させ、
ついで乾燥した場合、指示薬はエタノールを含有する水
性試験試料と接触する以前でさえ、実質的に酸化形態（
すなわち着色）である。言い換えれば、このようにして
調製された試ＭＡは、エタノールについて瞬間的及び遍
在した偽陽゛性試験を与える。ノンコンプライアンス（
ｎｏｎｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）についての誤った指標値
は、問題のある酒飲をリハビリするための、プログラム
能力に深刻な損害を与える。もちろん、法律限度を超６ える血中アルコール濃度を示す偽陽性試験は、ドライバ
ーにとって特に深刻な結果をもたらすことになるだろう
。
偽陽性の問題は、希釈溶液分析においては起らす又、多
分ブランク（すなわち、試験組成物の未反応部分との比
較）の使用によって打ち消される。この問題は、また、
アルコールオキシダーゼに特有なもののようでグルコー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ及ぶガラクトースオキシダーゼ等の他の酵素オキシ
ダーゼは、感度の良い乾燥固体状試験具を得るために要
求される高濃度の中で、使用されるので偽陽性応答は高
い値を示さない。
分ブランク（すなわち、試験組成物の未反応部分との比
較）の使用によって打ち消される。この問題は、また、
アルコールオキシダーゼに特有なもののようでグルコー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ及ぶガラクトースオキシダーゼ等の他の酵素オキシ
ダーゼは、感度の良い乾燥固体状試験具を得るために要
求される高濃度の中で、使用されるので偽陽性応答は高
い値を示さない。
本発明は、試薬片の形態において見られる偽陽性問題を
特定の包含操作の使用、あるいは試験組成物へのアジ化
物の付加により解決する。
特定の包含操作の使用、あるいは試験組成物へのアジ化
物の付加により解決する。
本発明者は、用いた試薬中の低分子量の第１級アルコー
ルの遍在が偽陽性問題に寄与しているという前提を推定
しているが、彼らの発明はそれを基としている訳ではな
い。更に、アルコールオキシダーゼが酵素自身のセリン
残基の第１水酸基と反応するかもしれないという、他の
オキシダーゼ酵素においては未知の自動酸化工程につい
てのいくつかの証拠がある。
ルの遍在が偽陽性問題に寄与しているという前提を推定
しているが、彼らの発明はそれを基としている訳ではな
い。更に、アルコールオキシダーゼが酵素自身のセリン
残基の第１水酸基と反応するかもしれないという、他の
オキシダーゼ酵素においては未知の自動酸化工程につい
てのいくつかの証拠がある。
溶液分析組成物が高濃度で支持体マトリックスに組み込
まれて、固体状試験具を製造する際に見られる偽陽性問
題を取り除くために２つの方法が使用されている。１つ
の方法は１発色性指示薬系が、１対の指示薬成分から構
成されている時に使用される。この場合、成分は、過酸
化物活性化物質及びアルコールオキシダーゼと共に、支
持体マトリックスに組み込まれ、含浸された支持体を、
第２発色性成分を組み込む前に乾燥する。
まれて、固体状試験具を製造する際に見られる偽陽性問
題を取り除くために２つの方法が使用されている。１つ
の方法は１発色性指示薬系が、１対の指示薬成分から構
成されている時に使用される。この場合、成分は、過酸
化物活性化物質及びアルコールオキシダーゼと共に、支
持体マトリックスに組み込まれ、含浸された支持体を、
第２発色性成分を組み込む前に乾燥する。
偽陽性の問題を除去する第２の方法は、アジ化ナトリウ
ム等のアジ化物の付加である。このアジ化物は、競合的
な防止剤として働いて、高濃度でのエタノールの定量分
析を可能にする一方、このアジ化物は又、偽陽性問題の
一因となっている自己破壊傾向から酵素を保護するとい
うことが推測される。アジ化物の付加は、発明者が知っ
ている９ 限りでは、少なくとも１００■ｇ／ｄＬのエタノールを
感知できる固体状試験具を製造するための最もよい型で
あり、そして、なお、指示薬系の発色性成分は実質的に
還元型（すなわち、偽陽性応答をしない）である。アジ
化物の付加は、特殊な組み込み技術を利用した時にも好
ましい。
ム等のアジ化物の付加である。このアジ化物は、競合的
な防止剤として働いて、高濃度でのエタノールの定量分
析を可能にする一方、このアジ化物は又、偽陽性問題の
一因となっている自己破壊傾向から酵素を保護するとい
うことが推測される。アジ化物の付加は、発明者が知っ
ている９ 限りでは、少なくとも１００■ｇ／ｄＬのエタノールを
感知できる固体状試験具を製造するための最もよい型で
あり、そして、なお、指示薬系の発色性成分は実質的に
還元型（すなわち、偽陽性応答をしない）である。アジ
化物の付加は、特殊な組み込み技術を利用した時にも好
ましい。
Ａ 試験成分
アルコールオキシダーゼ活性を示す調製物は、菌類及び
酵母の種を含む様々な原料から得られる。ピチア型（Ｐ
ｉｃｈｉａ−Ｔｙｐｅ）酵母から得られた調製物は、ア
ルコールオキシダーゼの好ましい原料である。このよう
な酵母原料は、参考のためにここに包含される米国特許
第４，４３０，４２７号において、列挙されている。用
いられるこのアルコールオキシダーゼ調製物は、エタノ
ール及びメタノール、１−プロパツール等の他の低級第
１級アルコール類と反応する。
酵母の種を含む様々な原料から得られる。ピチア型（Ｐ
ｉｃｈｉａ−Ｔｙｐｅ）酵母から得られた調製物は、ア
ルコールオキシダーゼの好ましい原料である。このよう
な酵母原料は、参考のためにここに包含される米国特許
第４，４３０，４２７号において、列挙されている。用
いられるこのアルコールオキシダーゼ調製物は、エタノ
ール及びメタノール、１−プロパツール等の他の低級第
１級アルコール類と反応する。
本発明において有用な過酸化物活性化物質は、種々の有
機及び無機原料から選ぶことができる。
機及び無機原料から選ぶことができる。
セイヨウワサビペルオキシダーゼあるいはポテト０
ペルオキシダーゼ等の植物性ペルオキシダーゼを使用す
ることができる。満足度は低いとはいえ、更に、ヘミン
及びヘミン誘導体並びにヘモグロビン類及びヘマチンを
使用することができる。
ることができる。満足度は低いとはいえ、更に、ヘミン
及びヘミン誘導体並びにヘモグロビン類及びヘマチンを
使用することができる。
発色性指示薬系としては、単一成分でもあるいは１対の
発色性指示薬系を形成する２成分でもよい。３．３’、
５．５′−テトラメチルベンジジン、ｏ−）リジン、２
−アミノ−８−ナフトール−３，６−ジスルホン酸、天
然産品のゴムグアイヤツクあるいはｐ−アニシジン等の
単一発色性成分を使用する際には、偽陽性問題を取り除
くために試験組成物中にアジ化物を含むものが好ましい
。３．３”、５．５”−テトラメチルベンジジン、０−
トリジン及びゴムグアイヤツクは、好ましい単一発色性
指示薬成分である。就中、３，５−ジクロ９−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホン酸（ＤＨ９Ａ） ／ ４−アミ
ノアンチピリン、３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベ
ンゼンスルホン酸／３−メチル−２−ベンゾチアゾリン
ヒドラゾンあるいはｍ−アニシジン／４−アミノアンチ
ピリン等の対になった発色性成分が試験具の調製のため
に使用することができる。発色性対、ＤＨ３Ａ／ ４−
７ミノアンチビリンが好ましい対の指示薬系である。
発色性指示薬系を形成する２成分でもよい。３．３’、
５．５′−テトラメチルベンジジン、ｏ−）リジン、２
−アミノ−８−ナフトール−３，６−ジスルホン酸、天
然産品のゴムグアイヤツクあるいはｐ−アニシジン等の
単一発色性成分を使用する際には、偽陽性問題を取り除
くために試験組成物中にアジ化物を含むものが好ましい
。３．３”、５．５”−テトラメチルベンジジン、０−
トリジン及びゴムグアイヤツクは、好ましい単一発色性
指示薬成分である。就中、３，５−ジクロ９−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホン酸（ＤＨ９Ａ） ／ ４−アミ
ノアンチピリン、３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベ
ンゼンスルホン酸／３−メチル−２−ベンゾチアゾリン
ヒドラゾンあるいはｍ−アニシジン／４−アミノアンチ
ピリン等の対になった発色性成分が試験具の調製のため
に使用することができる。発色性対、ＤＨ３Ａ／ ４−
７ミノアンチビリンが好ましい対の指示薬系である。
発色性指示薬系の選択は、約５分未満で水性試験試料中
゛の１００ｍｇ／ｄＬのエタノールの存在に対する色度
測定応答についての前述に基準を満たすための、試験具
の能力に影響することもある。ここにおける開示により
、十分に感度の良い指示薬系の選択は、その技術の属す
る分野における通常の知識を有するものによりなされる
ことができる。
゛の１００ｍｇ／ｄＬのエタノールの存在に対する色度
測定応答についての前述に基準を満たすための、試験具
の能力に影響することもある。ここにおける開示により
、十分に感度の良い指示薬系の選択は、その技術の属す
る分野における通常の知識を有するものによりなされる
ことができる。
好ましいアジ化物類は、金属塩アジ化物類、特に爆発性
のない電気的に陽性な金属アジ化物類である。特に好ま
しくは、アジ化リチウム、アジ化ナトリウム、アジ化カ
リウム及び同種のもの等のメンデレーエフの周期表のＩ
Ａ族から選ばれた金属アジ化物類である。これらのうち
、アジ化ナトリウムは、最も容易に商業的に入手可能で
あることが判明した。
のない電気的に陽性な金属アジ化物類である。特に好ま
しくは、アジ化リチウム、アジ化ナトリウム、アジ化カ
リウム及び同種のもの等のメンデレーエフの周期表のＩ
Ａ族から選ばれた金属アジ化物類である。これらのうち
、アジ化ナトリウムは、最も容易に商業的に入手可能で
あることが判明した。
アルコールオキシダーゼの最適ｐＨは、ＰＨ７，５付近
である。それ故に、全ての水性試験試料で必要ではない
が、緩衝液を試験具の中に組み込むことが好ましい。も
しも、試験具が、試料のｐ■が低い４〜５程度である尿
等の体液に用いるために配合されているならばこのこと
は、特に真実である。
である。それ故に、全ての水性試験試料で必要ではない
が、緩衝液を試験具の中に組み込むことが好ましい。も
しも、試験具が、試料のｐ■が低い４〜５程度である尿
等の体液に用いるために配合されているならばこのこと
は、特に真実である。
本発明では、５．０〜８．０の範囲のｐ）ｌに調製でき
るものであれば、どんな緩衝液でも使用することができ
る。有用な緩衝液はリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリ
ウム並びにトリス（ヒドロキシメチルｌ）アミノメタン
及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタングルタ
メートを含む。他の緩衝液は、この明細書において、そ
の技術の属する分野の通常の知識を有するものが、容易
に選択できる。
るものであれば、どんな緩衝液でも使用することができ
る。有用な緩衝液はリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリ
ウム並びにトリス（ヒドロキシメチルｌ）アミノメタン
及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタングルタ
メートを含む。他の緩衝液は、この明細書において、そ
の技術の属する分野の通常の知識を有するものが、容易
に選択できる。
湿潤物質及び色素あるいは貯蔵寿命安定剤等の付加成分
は、それらがエタノールとアルコールオキシダーゼあ・
るいは発生した過酸化物と過酸化物活性化物質との酵素
反応を阻害しない限りは包含せしめることができる。適
当な湿潤剤としては、ポリビニルピロリドン等のポリマ
ー及び表面活性３ 剤等を挙げることができる。ポリエトキシ化された脂肪
アルコール（登録商標 Ｅｍｕｌｐｈｏｒ■ＯＮ ８７
０として、ニューヨーク州、ニューヨークのＧＡＦ社か
ら入手）も使用することができる。ジオクチルナトリウ
ムスルホスクシネート（登録商標Ａｅｒｏｓｏｌ■ＯＴ
として、ウィスコンシン州、ミルウォーキー（７）Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌ Ｃｏ、、から入手
）は、表面活性剤としても及び色素安定剤としても作用
する。貯蔵寿命安定剤として、ソルビトール及びトリス
（ヒドロキシメチル）アミンメタングルタメートを挙げ
ることができ、特にソルビトールが好ましい。
は、それらがエタノールとアルコールオキシダーゼあ・
るいは発生した過酸化物と過酸化物活性化物質との酵素
反応を阻害しない限りは包含せしめることができる。適
当な湿潤剤としては、ポリビニルピロリドン等のポリマ
ー及び表面活性３ 剤等を挙げることができる。ポリエトキシ化された脂肪
アルコール（登録商標 Ｅｍｕｌｐｈｏｒ■ＯＮ ８７
０として、ニューヨーク州、ニューヨークのＧＡＦ社か
ら入手）も使用することができる。ジオクチルナトリウ
ムスルホスクシネート（登録商標Ａｅｒｏｓｏｌ■ＯＴ
として、ウィスコンシン州、ミルウォーキー（７）Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌ Ｃｏ、、から入手
）は、表面活性剤としても及び色素安定剤としても作用
する。貯蔵寿命安定剤として、ソルビトール及びトリス
（ヒドロキシメチル）アミンメタングルタメートを挙げ
ることができ、特にソルビトールが好ましい。
支持体マトリックスは、試験組成物の成分を包含せしめ
ることができるものであれば、どんな物質でもよい。従
ってマトリックスとしては、溶液分析用の試薬片に利用
された様な、多くの公知の形態をとることができる。例
えば、米国特許第３．８４６，２４７号は、フェルト、
多孔性セラミック片及び纒まれたあるいはマット状にさ
れたガラスファイバーの使用を教示している。紙の代替
物と４ して、米国特許第３，５２２，９２８号は、木の棒、布
、スポンジ材料及び粘土質物質の使用を教示している。
ることができるものであれば、どんな物質でもよい。従
ってマトリックスとしては、溶液分析用の試薬片に利用
された様な、多くの公知の形態をとることができる。例
えば、米国特許第３．８４６，２４７号は、フェルト、
多孔性セラミック片及び纒まれたあるいはマット状にさ
れたガラスファイバーの使用を教示している。紙の代替
物と４ して、米国特許第３，５２２，９２８号は、木の棒、布
、スポンジ材料及び粘土質物質の使用を教示している。
フランス特許第２，１７０．Ｈ７号は、５０％以上のポ
リアミドファイバーを含む支持体マトリックスの使用を
教示している。支持体マトリックスへの他の取り組み方
が、米国特許第４，０４８，５１３号に開示されており
、その中では、適当な支持体マトリックスの上に試薬を
印刷するという概念を採用している。米国特許第４，０
４８，５１４号は、反応体系に試薬を含有するフィラメ
ントの織込み又は編み込みを開示している。
リアミドファイバーを含む支持体マトリックスの使用を
教示している。支持体マトリックスへの他の取り組み方
が、米国特許第４，０４８，５１３号に開示されており
、その中では、適当な支持体マトリックスの上に試薬を
印刷するという概念を採用している。米国特許第４，０
４８，５１４号は、反応体系に試薬を含有するフィラメ
ントの織込み又は編み込みを開示している。
それ故に、本発明の試験具の製造においては、他の物と
同様に、全ての上記支持体マトリックスの概念を使用す
ることができることを評価すべきである。、このマトリ
ックスは、水性溶液との接触により破壊されるポリマー
のマイクロカプセルのような、いずれかの成分または全
ての成分を物理的に取り入れる系を含むことができる。
同様に、全ての上記支持体マトリックスの概念を使用す
ることができることを評価すべきである。、このマトリ
ックスは、水性溶液との接触により破壊されるポリマー
のマイクロカプセルのような、いずれかの成分または全
ての成分を物理的に取り入れる系を含むことができる。
例えば、アルコールオキシダーゼ及び発色性指示薬系ま
たは対になっている発色性指示薬の１成分を、溶液と接
触するまで、相互作用なしに、同じ支持体マトリックス
の中で、分離して維持することができる。マトリックス
は、その組成物の成分が、液状あるいは半液状で均質に
混合された系よりなることもでき、これは、後に、硬化
させ、あるいは固めることによって、成分を包含せしめ
ることができる。ミクロポーラスな膜またはポリマーフ
ィルムマトリックスの使用をはじめとする、他のマトリ
ックスの形式が、考えられる。ミクロポーラスな膜は、
前もって形成された膜として利用されるかあるいは相転
写のような技術により調製することができる。適当なポ
リマーフィルムは、スチレン及びブタジェンの８０：４
０の共重合体から形成される様なラテックスポリマー懸
濁液を基礎とする市販のラテックス配合物を用いて製造
することができる。他の天然あるいは合成ポリマーまた
はそれらの混合物もまた使用することができる。そのよ
うなフィルム配合物の例は、参考のためにここに包含さ
れた米国特許第３，８３０，９５７号及び第４．３１２
，８３４号中に、見い出すことができる。
たは対になっている発色性指示薬の１成分を、溶液と接
触するまで、相互作用なしに、同じ支持体マトリックス
の中で、分離して維持することができる。マトリックス
は、その組成物の成分が、液状あるいは半液状で均質に
混合された系よりなることもでき、これは、後に、硬化
させ、あるいは固めることによって、成分を包含せしめ
ることができる。ミクロポーラスな膜またはポリマーフ
ィルムマトリックスの使用をはじめとする、他のマトリ
ックスの形式が、考えられる。ミクロポーラスな膜は、
前もって形成された膜として利用されるかあるいは相転
写のような技術により調製することができる。適当なポ
リマーフィルムは、スチレン及びブタジェンの８０：４
０の共重合体から形成される様なラテックスポリマー懸
濁液を基礎とする市販のラテックス配合物を用いて製造
することができる。他の天然あるいは合成ポリマーまた
はそれらの混合物もまた使用することができる。そのよ
うなフィルム配合物の例は、参考のためにここに包含さ
れた米国特許第３，８３０，９５７号及び第４．３１２
，８３４号中に、見い出すことができる。
現在好ましい方法は、吸水性支持部材例えば、ろ紙に組
成物を含浸せしめ、ついでその含浸マトリックスを支持
部材に固着させることである。全血試料を試験する際に
は、含浸支持体マトリックスを被覆して、過剰の試料を
洗浄又はふき取ることができる。
成物を含浸せしめ、ついでその含浸マトリックスを支持
部材に固着させることである。全血試料を試験する際に
は、含浸支持体マトリックスを被覆して、過剰の試料を
洗浄又はふき取ることができる。
Ｂ、調製方法
好ましくは、その試薬試験片、あるいは試験具は、組み
込み工程間に乾燥を行いながら、支持体マトリックスに
継続的に組み込むことにより調製される。乾燥は、組み
込まれた組成物に有害な影響を生じない、どのような方
法によっても行うことができ、通常は空気炉を用いて行
う。その後、乾燥した紙は裁断され、支持体部材、例え
ば、硬化したまたは半分硬化したポリスチレンフィルム
片の一端に固定することができる。ポリスチレンフィル
ム片上に、ろ紙を固定するには、ＤＯＵＢＬＥＳＴＩＣ
Ｋ ＠として３Ｍ社より市販されているような両面粘着
テープを使用することにより、行うことができる。
込み工程間に乾燥を行いながら、支持体マトリックスに
継続的に組み込むことにより調製される。乾燥は、組み
込まれた組成物に有害な影響を生じない、どのような方
法によっても行うことができ、通常は空気炉を用いて行
う。その後、乾燥した紙は裁断され、支持体部材、例え
ば、硬化したまたは半分硬化したポリスチレンフィルム
片の一端に固定することができる。ポリスチレンフィル
ム片上に、ろ紙を固定するには、ＤＯＵＢＬＥＳＴＩＣ
Ｋ ＠として３Ｍ社より市販されているような両面粘着
テープを使用することにより、行うことができる。
７
以下に、好ましい組み込み方法を示す。
ａ）アルコールオキシダーゼ及びいずれかの残余成分の
組み込み以前に、いずれかの有機溶剤に溶解した単一の
発色性成分を組み込み、ついで完全に乾燥する、 ｂ）第２発色性成分の組み込み以前に、対をなす発色性
指示薬の一成分を、アルコールオキシダーゼを含有する
、支持体マトリックス中に乾燥させながら組み込む、 Ｃ）アルコールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを含
む乾燥した微小孔構造のポリマーフィルムに発色性指示
薬を組み込む方法。
組み込み以前に、いずれかの有機溶剤に溶解した単一の
発色性成分を組み込み、ついで完全に乾燥する、 ｂ）第２発色性成分の組み込み以前に、対をなす発色性
指示薬の一成分を、アルコールオキシダーゼを含有する
、支持体マトリックス中に乾燥させながら組み込む、 Ｃ）アルコールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを含
む乾燥した微小孔構造のポリマーフィルムに発色性指示
薬を組み込む方法。
分離組み込みを使用する場合、その試験片は、ろ紙支持
体マトリックスの白さとは目視的に異なるわずかな着色
を示す。この着色は、水と接触した時、わずかに強くな
る。しかしながら、発色性成分は、還元された（非着色
の）状態で、実質的に残存しており、試験具が、１００
鵬ｇ／ｄＬのエタノールを含む水性試料と接触すると、
約５分未満で有意の色の変化がある。しかしながら、こ
のわずか８ な着色のために、対をなす発色性成分を分離して包含せ
しめる場合でさえ、アルコールオキシダーゼと共にアジ
化物を組み込むことが好ましい。
体マトリックスの白さとは目視的に異なるわずかな着色
を示す。この着色は、水と接触した時、わずかに強くな
る。しかしながら、発色性成分は、還元された（非着色
の）状態で、実質的に残存しており、試験具が、１００
鵬ｇ／ｄＬのエタノールを含む水性試料と接触すると、
約５分未満で有意の色の変化がある。しかしながら、こ
のわずか８ な着色のために、対をなす発色性成分を分離して包含せ
しめる場合でさえ、アルコールオキシダーゼと共にアジ
化物を組み込むことが好ましい。
試験具は、分析成分を、液状あるいは半液状でポリマー
マトリックス中に混ぜ合せ、ついで支持体に塗布するこ
とにより、調製することもできる。そのような操作によ
る実施例も又用意されている。
マトリックス中に混ぜ合せ、ついで支持体に塗布するこ
とにより、調製することもできる。そのような操作によ
る実施例も又用意されている。
組み込みは、支持体マトリックスに、実質的に均質に、
分析組成物を混入せしめることが÷きる、浸漬、散布あ
るいは吹き付は等のいずれの方法によっても、行なうこ
とができる。
分析組成物を混入せしめることが÷きる、浸漬、散布あ
るいは吹き付は等のいずれの方法によっても、行なうこ
とができる。
Ｃ０試験成分の濃度範囲
試験成分の濃度範囲は、エタノールの溶液分析において
必要とされる濃度より実質的に高い。適当な濃度の選択
は、アルコールオキシダーゼとだけでなく（米国特許第
４，４３０，４２７号）ペルオキシダーゼとアジ化物の
明らかな相互作用（アジ化ナトリウムのペルオキシダー
ゼ活性に対する有害な影響、３６．ジェー、クリソ、パ
ソロジー（Ｊ。
必要とされる濃度より実質的に高い。適当な濃度の選択
は、アルコールオキシダーゼとだけでなく（米国特許第
４，４３０，４２７号）ペルオキシダーゼとアジ化物の
明らかな相互作用（アジ化ナトリウムのペルオキシダー
ゼ活性に対する有害な影響、３６．ジェー、クリソ、パ
ソロジー（Ｊ。
Ｃｌ１ｎ、 Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ） １０，１１３８３
）により、さらに複雑になる。さらに適当な濃度は、試
料が尿、唾液または血液かどうかによりわずかに変化す
る。選ばれた指示薬系を用いて十分な感度のエタノール
検査を与えることができる、アルコールオキシダーゼ（
ＡＯＤ）の所望濃度を最初に決定するのが好ましい。要
求されるアルコールオキシダーゼの濃度は、指示薬の感
度に逆に関連している。過剰のペルオキシダーゼを使用
し、ペルオキシダーゼに対するアジ化物の割合は、好ま
しくは重量比で０．４：１以下であり、この量は、ペル
オキシダーゼの必要な活性を阻害することなしに、偽陽
性表示を妨げるために十分である。
）により、さらに複雑になる。さらに適当な濃度は、試
料が尿、唾液または血液かどうかによりわずかに変化す
る。選ばれた指示薬系を用いて十分な感度のエタノール
検査を与えることができる、アルコールオキシダーゼ（
ＡＯＤ）の所望濃度を最初に決定するのが好ましい。要
求されるアルコールオキシダーゼの濃度は、指示薬の感
度に逆に関連している。過剰のペルオキシダーゼを使用
し、ペルオキシダーゼに対するアジ化物の割合は、好ま
しくは重量比で０．４：１以下であり、この量は、ペル
オキシダーゼの必要な活性を阻害することなしに、偽陽
性表示を妨げるために十分である。
次表は、先に規定した感度及び反応時間を有する本発明
の試験具を調製するために使用される試薬溶液中の成分
についての実際の濃度範囲及び好ましい濃度範囲の指針
を与える（ユニットの定義は最初の実施例参照）。
の試験具を調製するために使用される試薬溶液中の成分
についての実際の濃度範囲及び好ましい濃度範囲の指針
を与える（ユニットの定義は最初の実施例参照）。
啄ｊしＬ（」已＃
ＡＯＤ １０〜２５０ １Ｕ／ｍＬ ２０〜１００ Ｉ
Ｉ／ｍＬＰＯ０２４〜３Ｅ１００１Ｕ／ｍＬ ５０〜２
００ ＩＵ／ｍＬアジ化物 ０〜１５ｍＭ ２．５〜５
ＩＩＩＭ尿 夾ｍ渡 奸１しｙ白１度 ＡＯＤ １０〜５００ ＩＵ／ｍＬ ２０〜２００ １
Ｕ／ｍＬＰＯ０２４〜３８００１０／ｍＬ ５０〜２０
０ １０／ｍＬアジ化物 ０〜５．０ｍＭ Ｏ，５〜３
．ＯｍＭ最も好ましくは唾液／血清試験具につい、ての
アルコールオキシダーゼの濃度は、４０〜７０１Ｕ／ｍ
Ｌであり、尿素については５０〜１５０ＩＵ／ｍＬであ
る。どのような場合でも、単一発色性成分あるいは対に
なった発色性成分の各々の濃度は、約０．Ｏ１〜０．２
Ｍ（モル）であり、好ましくは、約０．０２５〜０．
ＩＮである。緩衝液は、約５〜９、好ましくは、約７〜
８のｐＨを示すべきである。これらの濃度範囲及び成分
の相対濃度は、その溶液が水性含浸溶液１ か、またはポリマー懸濁物であるかどうかで変りうる。
Ｉ／ｍＬＰＯ０２４〜３Ｅ１００１Ｕ／ｍＬ ５０〜２
００ ＩＵ／ｍＬアジ化物 ０〜１５ｍＭ ２．５〜５
ＩＩＩＭ尿 夾ｍ渡 奸１しｙ白１度 ＡＯＤ １０〜５００ ＩＵ／ｍＬ ２０〜２００ １
Ｕ／ｍＬＰＯ０２４〜３８００１０／ｍＬ ５０〜２０
０ １０／ｍＬアジ化物 ０〜５．０ｍＭ Ｏ，５〜３
．ＯｍＭ最も好ましくは唾液／血清試験具につい、ての
アルコールオキシダーゼの濃度は、４０〜７０１Ｕ／ｍ
Ｌであり、尿素については５０〜１５０ＩＵ／ｍＬであ
る。どのような場合でも、単一発色性成分あるいは対に
なった発色性成分の各々の濃度は、約０．Ｏ１〜０．２
Ｍ（モル）であり、好ましくは、約０．０２５〜０．
ＩＮである。緩衝液は、約５〜９、好ましくは、約７〜
８のｐＨを示すべきである。これらの濃度範囲及び成分
の相対濃度は、その溶液が水性含浸溶液１ か、またはポリマー懸濁物であるかどうかで変りうる。
Ｄ、使用方法
試験具は、試験試料中に瞬間的に浸漬するか、またはそ
うでなければ、支持体上に試験試料を加え、それにより
１００ｍｇ／ｄＬのエタノールが存在すると検出可能な
呈色がおこることにより有利に使用される。試験試料と
の接触は、ピペット、綿棒あるいはスパチュラによって
も行なうことができる。浸漬は、尿を使用する時、十分
に満足できる接触法であるが、血液試料は１通常は、ピ
ペットによる方法であり、後者の方法は唾液を試験する
際に有用である。
うでなければ、支持体上に試験試料を加え、それにより
１００ｍｇ／ｄＬのエタノールが存在すると検出可能な
呈色がおこることにより有利に使用される。試験試料と
の接触は、ピペット、綿棒あるいはスパチュラによって
も行なうことができる。浸漬は、尿を使用する時、十分
に満足できる接触法であるが、血液試料は１通常は、ピ
ペットによる方法であり、後者の方法は唾液を試験する
際に有用である。
以下の実施例には、本発明を開発する際に実行された実
験が記載されている。実施例は本発明を説明するのに役
立つが、ここに添付された特許請求の範囲によってのみ
定義されるその範囲を制限するものとして意図されたも
のではない。当業者は、望ましいと考えられるような、
組成物並びに成分及び反応パラメータの変更、代替及び
変化を２ 行うことができるであろう。
験が記載されている。実施例は本発明を説明するのに役
立つが、ここに添付された特許請求の範囲によってのみ
定義されるその範囲を制限するものとして意図されたも
のではない。当業者は、望ましいと考えられるような、
組成物並びに成分及び反応パラメータの変更、代替及び
変化を２ 行うことができるであろう。
実施例
アルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ、ＥＣＩ、１，１，３
．１３）は、フィリップス・ケミカル社（Ｐｈｉｌｌｉ
ｐｓ Ｃｈｅｒｒｒ−ｉｃａｌ Ｇｏ、）オクラホマ州
、バードレスビレから入手した。使用したアルコールオ
キシダーゼの活性は、貯蔵溶液の１ミリリットル当りの
国際単位（１０／ｍＬ）で、与えられる。活性の１国際
車位（ＩＵ）は、ｐＨ７，５，２５℃における空気飽和
溶液中の１マイクロモルのアルデヒド及び過酸化水素の
生成を触媒する。用いられたペルオキシダーゼは、マイ
ルレう拳ラボラトリーズ・インコーホレーテッド、カン
カキ、イリノイ州（Ｍ目ｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ。
．１３）は、フィリップス・ケミカル社（Ｐｈｉｌｌｉ
ｐｓ Ｃｈｅｒｒｒ−ｉｃａｌ Ｇｏ、）オクラホマ州
、バードレスビレから入手した。使用したアルコールオ
キシダーゼの活性は、貯蔵溶液の１ミリリットル当りの
国際単位（１０／ｍＬ）で、与えられる。活性の１国際
車位（ＩＵ）は、ｐＨ７，５，２５℃における空気飽和
溶液中の１マイクロモルのアルデヒド及び過酸化水素の
生成を触媒する。用いられたペルオキシダーゼは、マイ
ルレう拳ラボラトリーズ・インコーホレーテッド、カン
カキ、イリノイ州（Ｍ目ｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ。
Ｉｎｃ、 Ｋａｎｋａｋｅｅ、 Ｉ １１．）製の活性
１３０１０／ａｇノセイヨウワサビペルオキシダーゼで
あった。
１３０１０／ａｇノセイヨウワサビペルオキシダーゼで
あった。
Ａｅｒｏｓｏｌ ＠ ＯＴはアルトリ・ンチ争ケミカル
社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｏ、） 、
ウィスコンシン州、ミルウォーキーによりジオクチル拳
ソデイウム スルホスクシネートについて使用されてい
る登録商標である。Ｅｍｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ Ｂ、７
０は、ＧＡＦ、＝ｉミーヨーク、ニューヨークにより用
いられている登録商標である。使用した他の試薬は、市
販品である。
社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｏ、） 、
ウィスコンシン州、ミルウォーキーによりジオクチル拳
ソデイウム スルホスクシネートについて使用されてい
る登録商標である。Ｅｍｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ Ｂ、７
０は、ＧＡＦ、＝ｉミーヨーク、ニューヨークにより用
いられている登録商標である。使用した他の試薬は、市
販品である。
実施例中法の省略形を使用した。
ｄＬ デシリットル
ｍＬ ミ リ リ 、ン ト ル
Ｍ モル
ｍＭ ミリモル
℃ 摂氏
ｍｇ ミリグラム
ＩＵ 国際単位
ＴＭＢ ３．３′、５．５′−テトラメチルベンジジン
ＤＨ９Ａ ３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼン
スルホン酸 ＭＢＴ）！ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラ
ゾン ＰＯＤ ペルオキシダーゼ ＡＯＤ アルコールオキシダーゼ 用いたパーセントは、特に断わられない限りは、水性溶
液の１００ ミリリットル当りのミリグラム重量（Ｗ／
Ｖりを示す。
スルホン酸 ＭＢＴ）！ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラ
ゾン ＰＯＤ ペルオキシダーゼ ＡＯＤ アルコールオキシダーゼ 用いたパーセントは、特に断わられない限りは、水性溶
液の１００ ミリリットル当りのミリグラム重量（Ｗ／
Ｖりを示す。
Ａ： 直接混合溶液化学
バイオケミカルズ・テクニカル会プルチン・オン会アル
コールオキシダーゼ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＴｅｃ
ｈｎｉｎａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｎ Ａｌｃｏｈｏ
ｌ ０ｘｉｄａｓｅ）中に、フィリップス・ケミカル社
（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＣｈｅｍｉｃａｌＧｏ、）によっ
て、記述されているような、固体状試験具に、エタノー
ルについての溶液分析を組み込む試みがなされた。この
分析は、発色性指示薬及びペルオキシダーゼを含む指示
薬系と共に、過酸化物の製造に行う。
コールオキシダーゼ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＴｅｃ
ｈｎｉｎａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｎ Ａｌｃｏｈｏ
ｌ ０ｘｉｄａｓｅ）中に、フィリップス・ケミカル社
（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＣｈｅｍｉｃａｌＧｏ、）によっ
て、記述されているような、固体状試験具に、エタノー
ルについての溶液分析を組み込む試みがなされた。この
分析は、発色性指示薬及びペルオキシダーゼを含む指示
薬系と共に、過酸化物の製造に行う。
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭのろ紙を、フィリ
ップス（ｐｈｉｌｌｉｐｓ）分析において使用したもの
（すなわち、含浸溶液中に５ｒＵ／ｍＬのアルコールオ
キシダーゼ）に、匹敵する酵素濃度の溶液に浸漬し、空
気炉で６０℃で１０分間乾燥した。
ップス（ｐｈｉｌｌｉｐｓ）分析において使用したもの
（すなわち、含浸溶液中に５ｒＵ／ｍＬのアルコールオ
キシダーゼ）に、匹敵する酵素濃度の溶液に浸漬し、空
気炉で６０℃で１０分間乾燥した。
溶液
０−ジアニシジン・ ２ＨＣ文（０，ＩＭリン酸塩緩衡
溶液中、０．００８Ｎ ＰＨ７，５） １０ｍＬＰＯＤ
、１２ｍｇ／ｍＬ Ｏ，００４ｍＬＡＯロ （５００Ｉ
Ｕ／■Ｌ） ０．１ｍＬこのように組み込まれた支持体
は白色だった。
溶液中、０．００８Ｎ ＰＨ７，５） １０ｍＬＰＯＤ
、１２ｍｇ／ｍＬ Ｏ，００４ｍＬＡＯロ （５００Ｉ
Ｕ／■Ｌ） ０．１ｍＬこのように組み込まれた支持体
は白色だった。
しかしながら、１００膳ｇ／ｄＬのエタノールを含む水
性試料と接触した時、はっきりした色の発現はなく、す
なわち、液体分析試薬の直接の組み込みによって得られ
た試験具は、有用な試験具を製造するにはエタノールに
対して、十分な感度を有しない。
性試料と接触した時、はっきりした色の発現はなく、す
なわち、液体分析試薬の直接の組み込みによって得られ
た試験具は、有用な試験具を製造するにはエタノールに
対して、十分な感度を有しない。
より感度の高い試験を行なうために酵素の濃度を高める
ことによって、フィリップス（ｐｈｉｌｌｉＰｓ）の液
体分析に基づいて、試験具を製造する第２の試みがなさ
れた。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭ口紙を、先
に使用した濃度のｌθ倍濃度のアルコールオキシダーゼ
及び１００倍濃濃度ペルオキシダーゼを含む溶液に浸漬
し、ついで空気炉中で６０℃で１０分間乾燥した。
ことによって、フィリップス（ｐｈｉｌｌｉＰｓ）の液
体分析に基づいて、試験具を製造する第２の試みがなさ
れた。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭ口紙を、先
に使用した濃度のｌθ倍濃度のアルコールオキシダーゼ
及び１００倍濃濃度ペルオキシダーゼを含む溶液に浸漬
し、ついで空気炉中で６０℃で１０分間乾燥した。
溶液
０−ジアニシジン−２ＨＣｌ （０，１Ｍリン酸塩溶液
中に０．０８Ｌ ｐＨ７，５） ８．５ｍＬ５ ＰＯＤ、１２ｍｇ／ｍＬ Ｏ，５ｍＬ ＡＯＤ （５００ＩＵ／＋ａＬ） １．ＯｍＬ乾燥支持
体マトリックスは、ブランク（水のみ）又は、 １００
＋ａｇ／ｄＬのエタノールを含む水性試験試料のいずれ
かと接触させると、淡いピンク色を発現した。エタノー
ル濃度Ｏ及び１００ｍｇ／ｄＬの間では、はとんど差異
が認められなかった。それ故に、このように調製された
試験具は、エタノールに対して、まだ十分な感度を有し
ない。０−ジアニシジンは、５分未満で色度測定の応答
を展開する１００ｍｇ／ｄＬのエタノールについての試
験具を与えるためには不十分な感度の指示薬であると信
じられている。
中に０．０８Ｌ ｐＨ７，５） ８．５ｍＬ５ ＰＯＤ、１２ｍｇ／ｍＬ Ｏ，５ｍＬ ＡＯＤ （５００ＩＵ／＋ａＬ） １．ＯｍＬ乾燥支持
体マトリックスは、ブランク（水のみ）又は、 １００
＋ａｇ／ｄＬのエタノールを含む水性試験試料のいずれ
かと接触させると、淡いピンク色を発現した。エタノー
ル濃度Ｏ及び１００ｍｇ／ｄＬの間では、はとんど差異
が認められなかった。それ故に、このように調製された
試験具は、エタノールに対して、まだ十分な感度を有し
ない。０−ジアニシジンは、５分未満で色度測定の応答
を展開する１００ｍｇ／ｄＬのエタノールについての試
験具を与えるためには不十分な感度の指示薬であると信
じられている。
同様の感度の欠乏は、エタノールにアルコールオキシダ
ーゼを作用させて得られるアルデヒドを追跡するフィリ
ップス（ｐｈ ｉ Ｉ ｌ １ｐｓ）の分析の際見られ
た。試験具は、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ３ＭＭ
ろ紙を下記の溶液１または溶液２の中へ浸漬することに
よって調製された。各々のタイプは空気炉６０℃で１０
分間乾燥させた。
ーゼを作用させて得られるアルデヒドを追跡するフィリ
ップス（ｐｈ ｉ Ｉ ｌ １ｐｓ）の分析の際見られ
た。試験具は、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ３ＭＭ
ろ紙を下記の溶液１または溶液２の中へ浸漬することに
よって調製された。各々のタイプは空気炉６０℃で１０
分間乾燥させた。
６
溶液１ 溶液２
ＭＢＴＨ−ＨＣＩ （０，０４％） ２．ＯｍＪＬ ２
．０ｍ１ＡＯＤ（５００ＩＬＩ／ａ＋Ｌ） ０．０５＋
ｗＭ １．ｈｊＬ塩化第二鉄 （０，Ｉ Ｎ ＨＣＪＪ中０．０） ８．０＋ＪＬ １
．０ｔａｌ溶液２において、アルコールオキシダーゼの
濃度は、溶液ｌの濃度に対して２０倍高めた。いずれの
方法で調製された試験具も、１００ｍｇ／ｄＬのエタノ
ールを含む水性試料により接触させた時、反応を示さな
かった。この結果は、フィリップス（ｐｈｉｌｌｉｐｓ
）のアルデヒドに基づく分析は、エタノールの分析溶液
との１時間のインキュベーションが必要とされるので、
予期されないものではなく、これを迅速な浸漬−読み取
り試験に不適切なものとしている。
．０ｍ１ＡＯＤ（５００ＩＬＩ／ａ＋Ｌ） ０．０５＋
ｗＭ １．ｈｊＬ塩化第二鉄 （０，Ｉ Ｎ ＨＣＪＪ中０．０） ８．０＋ＪＬ １
．０ｔａｌ溶液２において、アルコールオキシダーゼの
濃度は、溶液ｌの濃度に対して２０倍高めた。いずれの
方法で調製された試験具も、１００ｍｇ／ｄＬのエタノ
ールを含む水性試料により接触させた時、反応を示さな
かった。この結果は、フィリップス（ｐｈｉｌｌｉｐｓ
）のアルデヒドに基づく分析は、エタノールの分析溶液
との１時間のインキュベーションが必要とされるので、
予期されないものではなく、これを迅速な浸漬−読み取
り試験に不適切なものとしている。
Ｂ：溶液分析試薬濃度を高めて、高感度試験を製造した
場合に発生する偽陽性 Ａ部で製造された試験具のエタノール１００■ｇ／ｄＬ
に対する感度の悪さは、溶液分析で使用された指示薬で
ある０−ジアニシンのためであると考えられたので、さ
らに２つの実験を行なった。第１の実験（Ｉ）において
は、０−ジシアニジン及びアルコールオキシダーゼの°
濃度をさらに高め、第２の実験（ＩＩ ）においては、
より感度の良い指示薬である３、３′、５．５’−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢ）に代えた。
場合に発生する偽陽性 Ａ部で製造された試験具のエタノール１００■ｇ／ｄＬ
に対する感度の悪さは、溶液分析で使用された指示薬で
ある０−ジアニシンのためであると考えられたので、さ
らに２つの実験を行なった。第１の実験（Ｉ）において
は、０−ジシアニジン及びアルコールオキシダーゼの°
濃度をさらに高め、第２の実験（ＩＩ ）においては、
より感度の良い指示薬である３、３′、５．５’−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢ）に代えた。
■。
０−ジシアニジン・２ＩＣ党 ４５ｍ１（０，ＩＮ ！
Ｊ ７酸塩中−ｒＯ，ＩＸ、 ｐＨ７，５）ＰＯＤ （
１２ｍｇ／鵬文 ） ０．５ｉ文ＡＯＤ （２５０１Ｕ
／ｍｊＬ ） ５．Ｏｉ文ＩＩ 。
Ｊ ７酸塩中−ｒＯ，ＩＸ、 ｐＨ７，５）ＰＯＤ （
１２ｍｇ／鵬文 ） ０．５ｉ文ＡＯＤ （２５０１Ｕ
／ｍｊＬ ） ５．Ｏｉ文ＩＩ 。
第１浸漬
０．０５Ｍ ＴＭＢ
トルエン中 Ａｅｒｏｓｏｌ（ＩＩ） ０．Ｔ。
第２浸漬
０．１ リン酸塩、ＰＩ（７，５４，５ｍ見ＰＯＤ （
１２＋ｇ／ｍＪ１ ） ０．５＋ＪＩＡＯＤ （５００
ＩＵ／ｗ文） １．０ｍ立木 ４．０ａ１ ９ 組成物工は、浸漬によってワットマン （Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭろ紙の上に組み込まれた。ろ
紙は、直ちに淡褐色に変わったが、この色はエタノール
、の存在を示すものであろう。含浸ろ紙は、空気炉中で
、６０℃で１５分間乾燥した。その褐色は、発現しつづ
け、時間とともに、更に強くなった。乾燥ろ紙を、エタ
ノール１００ｍｇ／ｄＬを含む水性試料と接触させると
、５分未満でその色は、偽陽性色とははっきりと異なっ
た。それ故に、その紙片は、十分な感度を示したが、し
かし、それらの偽陽性反応のために、それらの紙片は使
用するのには不適当となった。
１２＋ｇ／ｍＪ１ ） ０．５＋ＪＩＡＯＤ （５００
ＩＵ／ｗ文） １．０ｍ立木 ４．０ａ１ ９ 組成物工は、浸漬によってワットマン （Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭろ紙の上に組み込まれた。ろ
紙は、直ちに淡褐色に変わったが、この色はエタノール
、の存在を示すものであろう。含浸ろ紙は、空気炉中で
、６０℃で１５分間乾燥した。その褐色は、発現しつづ
け、時間とともに、更に強くなった。乾燥ろ紙を、エタ
ノール１００ｍｇ／ｄＬを含む水性試料と接触させると
、５分未満でその色は、偽陽性色とははっきりと異なっ
た。それ故に、その紙片は、十分な感度を示したが、し
かし、それらの偽陽性反応のために、それらの紙片は使
用するのには不適当となった。
組成物ＩＩは２段階浸漬によってワットマン（Ｗｈａｔ
ｍａｎ） ３ Ｍにろ紙中に組み込まれたが、浸漬と浸
漬の間には空気炉での乾燥を行った。このろ紙は、ＴＭ
Ｂ、 Ａｅｒｏｓｏｌｏ ０．Ｔｏ、トルエン溶液に、
まず浸漬しついで６０℃で３分間乾燥した。アルコール
オキシダーゼを含む第２溶液に浸漬した後、こ １の試
験片は濃い青色を発現した。色の濃さは、乾燥により、
いく分派じたが、しかし、乾燥した、０ ２回浸漬したろ紙は、依然として強い青緑色だった。そ
の紙片は、１００ｍｇ／ｄ、Ｌのエタノールを含む水性
試料と接触させた時、５分未満で、はっきりとした色の
変化を示したが、非接触の紙片において見られる偽陽性
色のために、この配合物は使用するのに不適当なものと
なった。
ｍａｎ） ３ Ｍにろ紙中に組み込まれたが、浸漬と浸
漬の間には空気炉での乾燥を行った。このろ紙は、ＴＭ
Ｂ、 Ａｅｒｏｓｏｌｏ ０．Ｔｏ、トルエン溶液に、
まず浸漬しついで６０℃で３分間乾燥した。アルコール
オキシダーゼを含む第２溶液に浸漬した後、こ １の試
験片は濃い青色を発現した。色の濃さは、乾燥により、
いく分派じたが、しかし、乾燥した、０ ２回浸漬したろ紙は、依然として強い青緑色だった。そ
の紙片は、１００ｍｇ／ｄ、Ｌのエタノールを含む水性
試料と接触させた時、５分未満で、はっきりとした色の
変化を示したが、非接触の紙片において見られる偽陽性
色のために、この配合物は使用するのに不適当なものと
なった。
両方の紙片配合物は、水と接触した時、僅かな色増加も
示した。
示した。
Ｃ：単一発色性成分
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭろ紙を、アジ化物
、ペルオキシダーゼ、及び発色性指示薬系として、３．
３”、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を
含む試験組成物で包含せしめた。発色性指示薬のＴＭＢ
は、０．５Ｘ ＡｅｒｏｓｏｌｏＤ Ｏ，Ｔ、を含むＴ
ＭＢのトルエン溶液の中に、ろ紙を浸漬することによっ
てまず、組み込まれた。このろ紙は、次いで１０分間６
０℃で空気炉中にて乾燥した。乾燥ろ紙は次いで、下記
の成分を含有する溶液に浸漬した。
、ペルオキシダーゼ、及び発色性指示薬系として、３．
３”、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を
含む試験組成物で包含せしめた。発色性指示薬のＴＭＢ
は、０．５Ｘ ＡｅｒｏｓｏｌｏＤ Ｏ，Ｔ、を含むＴ
ＭＢのトルエン溶液の中に、ろ紙を浸漬することによっ
てまず、組み込まれた。このろ紙は、次いで１０分間６
０℃で空気炉中にて乾燥した。乾燥ろ紙は次いで、下記
の成分を含有する溶液に浸漬した。
ポリビニルピロリドン （ＩＣ−３０） ２．ＯｍＬ１
５％水溶液 Ｅｍｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ ８７０ ２．ＯｍＬ５ｚ水
溶液 リン酸塩緩衝液 ２．０＋ａＬ Ｏ，５Ｍ、 ｐＨ８，５ 水 ２．２５ｍＬ アジ化ナトリウム、０．０３Ｍ Ｏ，２５ｍＬＰＯＤ、
１２ｍｇ／ｍＬ Ｏ，５ｍＬＡＯＤ、４００ＩＵ／腸
Ｌ １．Ｏｉ＋Ｌ２度組み込まれたろ紙を、８０℃で１
５分間乾燥した。このろ紙は、エタノールを含む試料と
接触する以前は、無色（偽陽性）を示した。
５％水溶液 Ｅｍｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ ８７０ ２．ＯｍＬ５ｚ水
溶液 リン酸塩緩衝液 ２．０＋ａＬ Ｏ，５Ｍ、 ｐＨ８，５ 水 ２．２５ｍＬ アジ化ナトリウム、０．０３Ｍ Ｏ，２５ｍＬＰＯＤ、
１２ｍｇ／ｍＬ Ｏ，５ｍＬＡＯＤ、４００ＩＵ／腸
Ｌ １．Ｏｉ＋Ｌ２度組み込まれたろ紙を、８０℃で１
５分間乾燥した。このろ紙は、エタノールを含む試料と
接触する以前は、無色（偽陽性）を示した。
２度乾燥し、組み込まれたろ紙を、（０，５ＸＯ，５ｃ
ｍ片）ポリスチレン等の硬い非反応性材料を用いて形成
された支持部材に固着させた。
ｍ片）ポリスチレン等の硬い非反応性材料を用いて形成
された支持部材に固着させた。
が、この支持部材は次に把手として役立つ。
水性試料中の少なくとも１００ｍｇ／ｄＬのエタノール
に対して感度の良い試験具を調製するためには、この配
合物は発明者が知る限りでは、最もよい型である。この
試験具は、１〜２分で検出可能な色度測定の応答を与え
る感度で反応する。
に対して感度の良い試験具を調製するためには、この配
合物は発明者が知る限りでは、最もよい型である。この
試験具は、１〜２分で検出可能な色度測定の応答を与え
る感度で反応する。
Ｄ：アジ化物を含まない試験測定具
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ３１ ＥＴろ紙は、第
１に、ペルオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ及び
１対の発色性指示薬の１成分を含有する溶液に浸漬し、
ついで空気炉中にて６０°Ｃで１５分間乾燥した。
１に、ペルオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ及び
１対の発色性指示薬の１成分を含有する溶液に浸漬し、
ついで空気炉中にて６０°Ｃで１５分間乾燥した。
溶ＪｆＬｉ
ＰＱＤ （１，０Ｍリン酸ナトリウム中に３ｍｇ／ｍＬ
、ｐＨ７，５）４、ＯｍＬ Ｅｍｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ ８７０ （５％水溶液）
４．ＯｍＬＡＯＤ （８５０１Ｕ／ｍＬ） ３．５ｍＬ
ＤＨ５Ａ （０，２Ｍ水溶液） ２．ＯｍＬ水 ｆｉ、
５ｍＬ 溶ＪＬ名 ４−アミノアンチピリン、 ０．０２Ｍ ）ルエン溶液
アジ化物の添付なしに、試験具を調製すると、そのろ紙
は、わずかな着色を示す。しかしながら、その成分は、
最終的な具申に、還元された（非着色の）型で、実質的
に残存し、その具は、水性試料中の少なくとも１００ｍ
ｇ／ｄＬのエタノールに３ 対して敏感であり、そして、上記試料と接触した時、そ
の具は、１〜２分で検出可能な色度測定の応答を示す。
、ｐＨ７，５）４、ＯｍＬ Ｅｍｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ ８７０ （５％水溶液）
４．ＯｍＬＡＯＤ （８５０１Ｕ／ｍＬ） ３．５ｍＬ
ＤＨ５Ａ （０，２Ｍ水溶液） ２．ＯｍＬ水 ｆｉ、
５ｍＬ 溶ＪＬ名 ４−アミノアンチピリン、 ０．０２Ｍ ）ルエン溶液
アジ化物の添付なしに、試験具を調製すると、そのろ紙
は、わずかな着色を示す。しかしながら、その成分は、
最終的な具申に、還元された（非着色の）型で、実質的
に残存し、その具は、水性試料中の少なくとも１００ｍ
ｇ／ｄＬのエタノールに３ 対して敏感であり、そして、上記試料と接触した時、そ
の具は、１〜２分で検出可能な色度測定の応答を示す。
そのような具は、特に、エタノールの存在を強い「陽性
」色によって示す、エタノールについての、推定試験に
適当である。
」色によって示す、エタノールについての、推定試験に
適当である。
Ｅ：発色性成分とアジ化物の分離
固相のエタノール具は、Ｄ部で示されたように製造する
ことができるが、分離して包含を行うことができる対に
なった発色性の指示薬を使用する時でさえ、アジ化物を
含むことが好ましい。
ことができるが、分離して包含を行うことができる対に
なった発色性の指示薬を使用する時でさえ、アジ化物を
含むことが好ましい。
ワット？ ７ （Ｗｈａｔｍａｎ） ３１ ＥＴろ紙を
、アジ化すトリウムを含む溶液ｌに浸漬し、ついで空気
炉にて、５０°Ｃで１５分間乾燥した。乾燥ろ紙を、次
に第２溶液に浸漬し、ついで乾燥した。１度乾燥され、
包含されたろ紙を裁断し、便利な把手のための細長いプ
ラスチックハンドルを用いて形成された支持部材の一端
に固着した。
、アジ化すトリウムを含む溶液ｌに浸漬し、ついで空気
炉にて、５０°Ｃで１５分間乾燥した。乾燥ろ紙を、次
に第２溶液に浸漬し、ついで乾燥した。１度乾燥され、
包含されたろ紙を裁断し、便利な把手のための細長いプ
ラスチックハンドルを用いて形成された支持部材の一端
に固着した。
１亘」
ポリビニルピロリドン ２．ＯｍＬ
（１５寛水溶液）
４
ＰＯＤ Ｏ，５ｍＬ
（１，０Ｍリン酸ナトリウム中
１２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７，５）
Ｅｍｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ ８７０ ２．ＯｍＬ（５χ
水溶液） ＡＯＤ ３．ＯｍＬ （８００１Ｕ／１ＩＬ） ＤＨＳＡ （０，ＩＮ） ２．０＋１Ｌアジ化ナトリウ
ム ９．５ｍＬ （０，０２Ｍ水溶液） １亘」 ０．０２Ｍ ＭＢＴＨ塩基のトルエン溶液この方法で調
製された具は、エタノールを含む試料と接触する以前に
は、実質的に無色であり、推定試験または試料中に存在
するエタノールの定量のどちらにも使用することができ
る。
水溶液） ＡＯＤ ３．ＯｍＬ （８００１Ｕ／１ＩＬ） ＤＨＳＡ （０，ＩＮ） ２．０＋１Ｌアジ化ナトリウ
ム ９．５ｍＬ （０，０２Ｍ水溶液） １亘」 ０．０２Ｍ ＭＢＴＨ塩基のトルエン溶液この方法で調
製された具は、エタノールを含む試料と接触する以前に
は、実質的に無色であり、推定試験または試料中に存在
するエタノールの定量のどちらにも使用することができ
る。
Ｆ：ポリマーフィルム支持体マトリックス特定の特質を
有する試験具は、下記に示したフィルム配合物を使用し
、支持体マトリックスとしてポリマーフィルムを使用し
て製造することもできる。
有する試験具は、下記に示したフィルム配合物を使用し
、支持体マトリックスとしてポリマーフィルムを使用し
て製造することもできる。
第１層
ラテックス ２．ＯｍＬ
ＴＭＢ ・２ＨＣｆ１．１５？＋ｎｇ
Ａｖｉｃｅｌ ＲＣ５９１−Ｆ ３ｇｍ水 １１．０＋
１Ｌ 第２層 ０．５Ｍリン酸塩、ＰＨ７，５２，０ｍＬＰＯＤ、 １
０ｍｇ／ｍＬ Ｏ，５＋ｓＬアジ化ナトリウム（８園Ｍ
） ０．５ｍＬＥａ＋ｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ ８７０
（３０％） １．０ｍＬラテックス ２．ｈＬ ＡＯり ５００ＩＵ／ｍＬ １．０＋ｗＬ水 ３．ｈＬ Ａｖｉｃｅｌ ＲＣ５１１１ｉＦ ３．Ｏｇｒａこのラ
テック゛スは、ボリサール・インコーホレーテッド、（
Ｐｏｌｙｓａｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、モナコ
１ＰＡから得た５０％の固型物を含むスチレン−ブタジ
ェン（６０：４０） （７）共重合体であるＰｏ１ｙｓ
ａｒ ＸＥ ４８５テある。Ａｖｉｃｅｌ ＲＣ５９１
−Ｆは、エフ・エム・シ−ｅコーポレーションの食品及
び薬品製造部（ＦＭＣＣｏｒｐ、、 Ｆｏｏｄ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＰｒｏｄｕｃｔｓＤ
＋ｖ−＋）ペンシルバニア、フィラデルフィアから得た
微結晶セルロースである。
１Ｌ 第２層 ０．５Ｍリン酸塩、ＰＨ７，５２，０ｍＬＰＯＤ、 １
０ｍｇ／ｍＬ Ｏ，５＋ｓＬアジ化ナトリウム（８園Ｍ
） ０．５ｍＬＥａ＋ｕｌｐｈｏｒ＠ ＯＮ ８７０
（３０％） １．０ｍＬラテックス ２．ｈＬ ＡＯり ５００ＩＵ／ｍＬ １．０＋ｗＬ水 ３．ｈＬ Ａｖｉｃｅｌ ＲＣ５１１１ｉＦ ３．Ｏｇｒａこのラ
テック゛スは、ボリサール・インコーホレーテッド、（
Ｐｏｌｙｓａｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、モナコ
１ＰＡから得た５０％の固型物を含むスチレン−ブタジ
ェン（６０：４０） （７）共重合体であるＰｏ１ｙｓ
ａｒ ＸＥ ４８５テある。Ａｖｉｃｅｌ ＲＣ５９１
−Ｆは、エフ・エム・シ−ｅコーポレーションの食品及
び薬品製造部（ＦＭＣＣｏｒｐ、、 Ｆｏｏｄ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＰｒｏｄｕｃｔｓＤ
＋ｖ−＋）ペンシルバニア、フィラデルフィアから得た
微結晶セルロースである。
このフィルムは、ドクタ一番ブレードを使用し、２層に
塗布する。好ましいフィルム厚は、約２５〜３５ミクロ
ンの乾燥フィルム厚が得られる約３０〜４０ミクロンで
ある。しかしながら、フィルムの厚さは、具の性能に対
しては重大ではない。フィルムは、空気乾燥または空気
炉中にて、８０℃で１０分間乾燥することができる。
塗布する。好ましいフィルム厚は、約２５〜３５ミクロ
ンの乾燥フィルム厚が得られる約３０〜４０ミクロンで
ある。しかしながら、フィルムの厚さは、具の性能に対
しては重大ではない。フィルムは、空気乾燥または空気
炉中にて、８０℃で１０分間乾燥することができる。
Ｇ：支持体マトリックスとしての相転位膜状フィルム
少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのエタノールに敏感な、か
つ５分未満で、色度測定の応答を与える固体状試験具は
、相変換膜状フィルムの使用により調製することもでき
る。
つ５分未満で、色度測定の応答を与える固体状試験具は
、相変換膜状フィルムの使用により調製することもでき
る。
白い親水性膜は、次のようにして調製される：高速でか
き混ぜながら、溶液２を溶液ｌに徐々に加えた。（滴下
法）添加を完了すると「〈もり７ 点」に到達するであろう。よくかき混ぜながら、これに
２．０グラムのＣａｂ−ｏ−、ｓｉｌ をゆっくりと添
加する。
き混ぜながら、溶液２を溶液ｌに徐々に加えた。（滴下
法）添加を完了すると「〈もり７ 点」に到達するであろう。よくかき混ぜながら、これに
２．０グラムのＣａｂ−ｏ−、ｓｉｌ をゆっくりと添
加する。
ドクターブレードを使用し、明澄なＴｒｙｃｉｔｅの支
持部材上に５０ミクロン厚さにその材料を施せ。
持部材上に５０ミクロン厚さにその材料を施せ。
そのフィルムを、７５°Ｃで８〜ｌＯ分間乾燥せよ。
症亘」
酢酸セルロース（粘度４５） １５％ ＋１．５％；ノ
ｋＰ−１４０７−１ｒトン溶液 ３６．０ｇｍ１５Ｘ
（７）ＳＭＡ２８２５Ａ＋ １．５＄（７）ＫＰ−１４
０７セトン溶液 ４ 、０ｇｍ トルエン ２．ｈＬ 症亘」 ツルピトーＪｌ／ （ＢＯＸ） １．８ｍＬアジ化ナト
リウＡ （０，０３Ｎ） １．８ｍＬＥｍｕｌｐｈｏｒ
■ ＯＮ ８７０ （ＩＯＸ） １．０＋ａＬＰＯＤ
（２０ｍｇ／ｄＬ） ０．５ｍＬＡＯＤ （５００１Ｕ
／ｍＬ） １．８ｍＬ２−プロパ／ −ル１３．ＯｍＬ リン酸塩緩衝液ｐＨ７，５，’０．０５Ｎ Ｉｌ、２Ｉ
ＩＬ８ 酢酸セルロース（粘度４５）は、イーストマン・ケミカ
ル・プロタ゛クツ・インコーポレーション（Ｅａｓｔｍ
ａｎｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、 Ｉ
ｎｃ）テネシー州、キンゲスポイントから得ることがで
きる。Ｋｐ−１４０ハ、エフエムシー、コーポレーショ
ン インダストリアル ケミカル グ ル − プ （
ＦＭＣＣｏｒｐ、、 Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ）ペンシルバニア州、フィラデル
フィアから得た可塑剤のトリブトキシホスフェートであ
る。ＳＭＡ ２Ｂ２５ Ａは、アトランティック リッ
チフィールド カンパニー（Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｒｉｃ
ｈｆｉｅｌｄ Ｃｏ、）ペンシルバニア州、フィラデル
フィアからのスチレン−無水マレイン酸共重合体である
。 Ｃａｂ−ｏ−ｓｉｌは、（カポットコーポレーショ
ン（Ｃａｂｏｔ ｃａｒｐ、）マサチューセッツ州、ボ
ストンから得た、溶融シリカ重合体である。
ｋＰ−１４０７−１ｒトン溶液 ３６．０ｇｍ１５Ｘ
（７）ＳＭＡ２８２５Ａ＋ １．５＄（７）ＫＰ−１４
０７セトン溶液 ４ 、０ｇｍ トルエン ２．ｈＬ 症亘」 ツルピトーＪｌ／ （ＢＯＸ） １．８ｍＬアジ化ナト
リウＡ （０，０３Ｎ） １．８ｍＬＥｍｕｌｐｈｏｒ
■ ＯＮ ８７０ （ＩＯＸ） １．０＋ａＬＰＯＤ
（２０ｍｇ／ｄＬ） ０．５ｍＬＡＯＤ （５００１Ｕ
／ｍＬ） １．８ｍＬ２−プロパ／ −ル１３．ＯｍＬ リン酸塩緩衝液ｐＨ７，５，’０．０５Ｎ Ｉｌ、２Ｉ
ＩＬ８ 酢酸セルロース（粘度４５）は、イーストマン・ケミカ
ル・プロタ゛クツ・インコーポレーション（Ｅａｓｔｍ
ａｎｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、 Ｉ
ｎｃ）テネシー州、キンゲスポイントから得ることがで
きる。Ｋｐ−１４０ハ、エフエムシー、コーポレーショ
ン インダストリアル ケミカル グ ル − プ （
ＦＭＣＣｏｒｐ、、 Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ）ペンシルバニア州、フィラデル
フィアから得た可塑剤のトリブトキシホスフェートであ
る。ＳＭＡ ２Ｂ２５ Ａは、アトランティック リッ
チフィールド カンパニー（Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｒｉｃ
ｈｆｉｅｌｄ Ｃｏ、）ペンシルバニア州、フィラデル
フィアからのスチレン−無水マレイン酸共重合体である
。 Ｃａｂ−ｏ−ｓｉｌは、（カポットコーポレーショ
ン（Ｃａｂｏｔ ｃａｒｐ、）マサチューセッツ州、ボ
ストンから得た、溶融シリカ重合体である。
完全に白色の親水性膜に、次に発色性指示薬系を含潰せ
しめる、１つの含浸溶液は、０．５ｚＡｅｒｏｓｏｌ■
ＯＴを含む０．０５Ｍ３ 、３ ” 、 ５ 。
しめる、１つの含浸溶液は、０．５ｚＡｅｒｏｓｏｌ■
ＯＴを含む０．０５Ｍ３ 、３ ” 、 ５ 。
５′、−テトラメチルベンジジントルエン溶液であるだ
ろう。別の含浸溶液は、０．５ｚゴムグアイヤツクのク
ロロホルム（ＣＯＣｌ２）溶液であるだろう。いずれの
溶液も、ｌＯ〜５０フィート／分の速度でフィルム表面
へ、ローラーにより塗布することにより、相変換フィル
ムに含浸させることができる。その湿ったフィルムは、
次いで、溶媒の引火点で乾燥する。
ろう。別の含浸溶液は、０．５ｚゴムグアイヤツクのク
ロロホルム（ＣＯＣｌ２）溶液であるだろう。いずれの
溶液も、ｌＯ〜５０フィート／分の速度でフィルム表面
へ、ローラーにより塗布することにより、相変換フィル
ムに含浸させることができる。その湿ったフィルムは、
次いで、溶媒の引火点で乾燥する。
本発明をある程度の具体性をもって説明してきたが、本
開示は実施によってのみなされたものであり、細目にお
いては数々の変更を、本発明の範囲を逸脱することなし
に行うことができることが理解される。
開示は実施によってのみなされたものであり、細目にお
いては数々の変更を、本発明の範囲を逸脱することなし
に行うことができることが理解される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、水性試験試料中のエタノールの存在を測定するため
の試験具であって、前記試験具が、アルコールオキシダ
ーゼ、過酸化物活性化物質、及び指示薬系の発色性成分
が実質的に還元された型である、検出可能な応答を与え
ることができる発色性指示薬系を包含せしめた支持体マ
トリックスからなり、該アルコールオキシダーゼが約５
分未満で試験試料中のエタノール１００ｍｇ／ｄＬの存
在に対して検出可能な色度測定の応答を与えるために十
分な量存在していることを特徴とする試験具。 ２、アルコールオキシダーゼの存在量が、少なくとも１
０１０／ｍＬのアルコールオキシダーゼを含む溶液を支
持体に包含せしめ、ついで乾燥した結果得られた量であ
る特許請求の範囲第１項記載の試験具。 ３、支持体マトリックスが紙である特許請求の範囲第１
項記載の試験具。 ４、支持体マトリックスに、更に、アジ化物を包含せし
めた特許請求の範囲第１項記載の試験具。 ５、支持体マトリックスに、更に、約５〜９の範囲にｐ
Ｈを調整できる緩衝物質を包含せしめた特許請求の範囲
第１項記載の試験具。 ６、支持体マトリックスに、更に、安定剤を包含せしめ
た特許請求の範囲第１項記載の試験具。 ７、安定剤がソルビトールである特許請求の範囲第６項
記載の試験具。 ８、過酸化物活性化物質がペルオキシダーゼである特許
請求の範囲第１項記載の試験具。 ８、発色性指示薬系がガムグアヤツク、０−）リジン、
３，３′、５．５′−テトラメチルベンジジンまたはそ
れらの混合物から選ばれる単一の発色性成分である特許
請求の範囲第４項記載の試験具。 １０、発色性指示薬系が、３．５−ジクロロ−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホン酸／４−アミノアンチピリン、
３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸
／３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン、ｍ−
アニシジン／４−アミノアンチピリンまたはそれらの混
合物である対になった発色性成分を含む特許請求の範囲
第１項記載の試験具。 １１、支持体マトリックスに更にアジ化物を包含せしめ
た特許請求の範囲第１θ項記載の試験具。 １２、特許請求の範囲第１項記載の試験具の製造法であ
って・ （ａ） 対になった発色性指示薬系の１成分及び有機溶
媒を含む第１混合物を調整する；（ｂ） 過酸化物活性
化物質、並びに発色性指示薬系の残りの成分及びアルコ
ールオキシダーゼの水性第２混合物を調整する； （Ｃ） 第１あるいは第２混合物の１方を支持体マトリ
ックスに包含せしめ、ついで乾燥する；及び （ｄ） 第１あるいは第２混合物のもう一方を支持体に
包含せしめ、ついで乾燥する。 工程よりなることを特徴とする製造法。 １３、水性第２混合物が少なくとも１０１０／ｍＬのア
ルコールオキシダーゼを含む特許請求の範囲第１２項記
載の製造法。 １４、アジ化物を、更に、水性第２混合物中に含ませる
特許請求の範囲第１２項記載の製造法。 １５、約５〜９の範囲にｐＨを調整できる緩衝物質を、
更に、水性第２混合物中に含ませる特許請求の範囲第１
２項記載の製造法。 １Ｂ、安定剤を、更に、水性第２混合物中に含ませる特
許請求の範囲第１２項記載の製造法。 １７、安定剤がソルビトールである特許請求の範囲第１
２項記載の製造法。 ！８．特許請求の範囲第１項記載の試験具の製造法であ
って、 ） （ａ） 発色性成分及びラテックスポリマーの第１混合
物を調整する； （ｂ） 過酸化物活性化物質、アジ化物、アルコールオ
キシダーゼ、発色性指示薬系の残りの成分及びラテック
スポリマーの第２混合物を調整する； （Ｃ） 第１あるいは第２混合物の一方を支持部材上へ
塗布する； （ｄ） 乾燥； （ｅ） 第１あるいは第２混合物のもう一方を支持部材
上へ塗布する、及び （ｄ） 乾燥、 の工程よりなることを特徴とする製造法。 １９、第２混合物が少なくともｌ０ＩＵ／ｍＬのアルコ
ールオキシダーゼを含む特許請求の範囲第１８項記載の
製造法。 ２、特許請求の範囲第１項記載の試験具の製造法であっ
て・ （ａ） アルコールオキシダーゼ及び過酸化物活性化物
質を含む溶液から相転位ポリマーフィルムを調整する； （ｂ） 相転位ポリマーフィルムを、発色性指示薬及び
有機溶媒を含む溶液に含浸させ る、 工程よりなることを特徴とする試験具の製造法。 ２１、相転位ポリマーフィルムを調整するために使用さ
れる溶液が、少なくともｌ０ＩＵ／ｍＬのアルコールオ
キシダーゼを含む特許請求の範囲第２０項記載の製造法
。 ２２、相転位ポリマーフィルムを調整するために使用さ
れる溶液が、更に、アジ化物を含む特許請求の範囲第２
０項記載の製造法。 ２、特許請求の範囲第１０項記載の試験具の製造法であ
って、 （ａ） 有機溶媒中の単一発色性成分の第１混合物を調
整する； （ｂ） 過酸化物活性化物質、アルコールオキシダーゼ
及びアジ化物の水性第２混合物を調整する； （Ｃ） 支持体マトリックスに第１混合物を包含せしめ
、ついで乾燥する弓 並びに （ｄ） 支持体マトリックスに第２混合物を包含せしめ
、ついで乾燥する、 工程よりなることを特徴とする試験具の製造法。 ２４、水性第２混合物が少なくとも１０１０／ｍＬのア
ルコールオキシダーゼを含む特許請求の範囲第２３項記
載の製造法。 ２５、約５〜９の範囲にｐＨに調整できる緩衝物質を、
さらに水性第２混合物に含ませる特許請求の範囲第２３
項記載の製造法。 ２Ｂ、安定剤を、さらに水性第２混合物中に含ませる特
許請求の範囲第２３項記載の製造法。 ２７、安定剤がソルビトールである特許請求の範囲第６
項記載の製造法。 ２８、水性試験試料中のエタノールの存在を測定する方
法であって、試験試料を特許請求の範囲第１項記載の試
験具と接触させついで５分未満で、検出可能な色度測定
の応答を観察することよりなることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/616,732 US4810633A (en) | 1984-06-04 | 1984-06-04 | Enzymatic ethanol test |
| US616732 | 1984-06-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60262598A true JPS60262598A (ja) | 1985-12-25 |
| JPH0586197B2 JPH0586197B2 (ja) | 1993-12-10 |
Family
ID=24470741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60118980A Granted JPS60262598A (ja) | 1984-06-04 | 1985-06-03 | 水性試験試料中のエタノールの存在を測定するための試験具及びその製造方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4810633A (ja) |
| EP (1) | EP0164008B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60262598A (ja) |
| AT (1) | ATE51028T1 (ja) |
| AU (1) | AU560448B2 (ja) |
| CA (1) | CA1254117A (ja) |
| DE (1) | DE3576528D1 (ja) |
| DK (1) | DK249085A (ja) |
| FI (1) | FI852225L (ja) |
| IL (1) | IL75065A (ja) |
| NO (1) | NO852070L (ja) |
| ZA (1) | ZA853430B (ja) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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