JPS59500736A - 凝血の測定およびその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ”３血の測〜およびその試 一丘！Ｌ肢虜二 本発明は、血液の凝固の測定、とくに抗凝固剤ま・たは凝血因子を定量する方法 において使用するハーゲマン（Ｈａｇｅｍａｎ）因子活性化物質に関する。本発 明は、ことに活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験における改良に関 する。

ＡＰＴＴ試験は血液凝固の異常の検出および監視において普通に用いられる。こ のような欠損は、血漿タンパク質の凝血因子のレベルを低下させる遺伝欠損また は自己免疫病から生ずるか、あるいはヘパリンのような抗凝固剤の投与から生ず る。ＡＰＴＴ試験の実施および解駅は、この分野において普通に実施されかつよ く知られている。

このような試験は、ハーゲマン因子９ために「活性化剤」を使用する。ハーゲマ ン因子は、固有の機構を経て凝血を開始するとき参加するタンパク質である。ハ ーゲマン因子の活性化は、凝血を完結する酵素転換の序列を開始する。したがっ て、活性化剤の機能は、凝固すべき試験試料の凝固する能力を測定することがで きるように、前記試料を刺激することである。試料の凝固能力は、所定の終点、 たとえば、粘度、光学ａ度などに到達するのに要する時間により測定される。

ハーゲマン因子を活性化するために多数の物質が知られてＩ／＼るが、商業的規 模に適当な凝血試験において使用して成功をおさめたのｔ士少常にわずかである 。凝固試験において使用された活性化剤の例は、直径２０〜Ｉ／３６０ミリミク ロンのヒユームドシリカ（米国特許第３，８８０，７１４号）およびエラグ酸ナ トリウムの溶液（米国特許第３，４８６，９８１号）を包含する。

現在、凝血機能のために有効な測定法は１種々の欠点をもちやすい。

１つの測定法は１つの面に関して満足すべきものであるか、他の関係において欠 点をもつ。たとえば、水溶性の活性化剤のエラグ酸ナトリウムは、試験使用者に 水溶液で提供されることかでき、かつ活性化剤の再構成または懸濁は不必要であ るので、望ましい。しかしながら、この活性化剤を用いる測定は、日々の精度に おいて望ましくないほどに高い変動計数を示すことがわかった。

米国特許第３，８８０，７１４号中に開示されているヒユームドシリカの活性化 剤は、より満足にはたらくが、使用前にその活性化剤の水溶液を調製しなければ ならないという欠点に悩ませられる。

こうして、本発明の目的は、凝血の測定の性能、とくに臨床研究室における使用 の再現性を改良し、かつとくに測定を実施するための試薬の調製および使用にお いて、測定をより便利に行なうことをできるようにすることを包含する。

一介悪辺ス墨二 本発明の目的は、ハーゲマン因子の活性化剤として、約４〜ｌｏ。

ルｍの平均直径を有する水性のコロイド状に分散したシリカまた。はアルミナ被 覆ソリ力の粒子を使用することによって達成できることが発見された。前記粒子 は（ａ）アルカリ金属ケイ酸塩溶液をイオン交換材料と接触・させて前記ケイ酸 塩溶液からアルカリ金属イオンを除去し、そして（ｂ）イオン交換材料からコロ イド状に分散した粒子を回収することからなる方法によって得られたものである 。

血小板因子活性を有する成分を含む水性懸濁液中にコロイド状に分散された前記 シリカまたはアルミナ被覆シリカの粒子からなる、新規な試薬は、凝血因子の定 量に供給されるにの試薬は、緩衝剤および抗微生物剤を含むことができる。

本　甲の祥細な説 本発明において使用するコロイド状シリカの特定の種は、本発明の主目的の達成 において重要である。すなわち、コロイド状シリカは、凝血の測定を実施するた めのキッドを包含する容器に充填することができ、次いでコロイド分散液から沈 殿または凝集しないで長期間貯蔵することができる安定な水溶液である。従来使 用されてきた活性化剤、たとえば、米国特許第３，８８０，７１３号において使 用されているエーロシル（Ａｅｒｏｓｉｌ）シリカは、このような期間にわたっ てコロイド状分教着中で安定だはなく、こうして乾燥試薬から調製しなければな らない。さらに、このように従来使用されてきた活性化剤は、アルピアゴムのよ うな９％剤の存在を必要とする。本発明のコロイド状シリカの試薬では、このよ うなことはなく、好ましくは懸濁剤は存在しなＩ、＼。

本発明において使用するコロイド状粒子は、米国特許第２　、２４４　。

３２５号の方法によって製造することができ、そしである範囲の粒度で商業的に 入手可能である。約７０ミリミクロンの平均直径の粒子は、約５０ｍ２７ｇより 小さい表面積を示す。これらの粒子は、凝集せず、本質的に球形であり、負に帯 電しており、そしてナトリウムのような反対イオンで安定化される。平均粒子直 径は約４〜ｌｏｏミリミクロンの範囲であることができるが、最良の結果は、約 ５０ミリミクロンを超える直径、好ましくは７０ミリミクロンの直−径を有する 粒子を使用して得られる。４〜１００ミリミクロンの範囲内の粒子の混合物を使 用することができるウ アルミナ被覆シリカ粒子は、シリカのコアよりはむしろアルミナの化学的特性を 示す。アルミナ被覆粒子を使用することが好ましいが、満足すべき結果は、前述 のようにして調製されたコロイド状シリカを用いて、あるいは両者の種類の粒子 を使用して得られる。

コロイド状粒子は、０　、０１〜０　、２’ｆ３ｆｙｗ／　ｖ、好ましくは約０ ，１％ｗ／ｙの粒子濃度の水性分散液で供給される。コロイド状粒子の濃度は、 使用する器具に適合するように変更することができ、そして最適の測定結果を得 るように計算することがで、きる。

試薬は血小板の構成成分をまた含有するであろう。これは凝結の測定において使 用されるよく知られた成分である。それは凝結の開始に要する血小板因子に似た 活性を供給する。哺乳動物の脳のセファリン含有抽出液は、ある時期においてこ の目的のために商業的に入手可能であった。血小板それ自体を使用できるであろ うが、これらの血球は貯蔵に不安定であり　商品として実際的ではない。

試薬は約７〜８のｐＨ１好ましくはｐＨ７，２５±０．０５に緩衝化すべきであ る。好ましい緩衝剤はＮ−２−ヒドロキシルエチル−ピペラジン−Ｎ’　−２− エタンスルホン酸である。

試薬はまた抗微生物剤を含有すべきである。抗微生物剤は、よく知られており、 フェノールおよびアジ化ナトリウムを包含する。これらは開封後の試薬の貯蔵寿 命を延長する。

試薬は懸濁剤を含有してもよい。懸濁剤は活性止剤粒子の懸濁液を均質に維持す るために普通に使用されてきている。それらは凝血の測定において既知の生化学 的活性を発現せず、それらの作用は機械的効果に駆足される。凝血の測定におけ るこのようの物質の使用は、米国特許第３．３９５，２１０号中に開示されてい る。

試薬は、ハーゲマン因子の活性化か測定法の一部分として誘発される測定法、と くに前述のＡＰＴＴ試験およびその実施態様のいなるものにおいても使用するこ とができる。このような試験を実施するとき、本発明におけるコロイド状シリカ の試薬を試験試料およびカルシウムイオン−源と混合し、次いで粘度またはこの 分野において知られている他の手段により決定される凝血の終点に到達するまで 保温する。

−芙痙胴」− Ｎ　Ａ　Ｌ　ＣＯＡ　Ｇ・ルコロイト状シリカを、ナルコ・ケミカル・カンパニ ー（Ｎａｌｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手した。

この製品中のコロイド状粒子は、６０ｍ声の平均粒度および５０ｍ２／ｇの表面 積を有した。ウサギの脳のセファリン、１１．９ｇのＮ−２−ヒドロキシエチル ピペラジン−ＮＺ−２−エタンスルホン酸および１゜５ｇのフェノールを含有す る蒸留水の１０１０２Ｏ中に、コロイド状シリカを約０．１％Ｗ　／　Ｖの粒子 濃度が得られるまで分散させた。この試薬は開封せずに、凝集や他の沈降を起こ さないで、３週間より長い期間、６か月ないし１年まで貯蔵することができ、満 足すべき性能を示した。それはＡＰＴＴ試験において次ぎのように使用した：０ ．１ｍｌの試験血漿をピペットでキュベツトまたは試験管に移した。試薬をかき まぜ、モしてＯ，１ｍｌを試料容器に加えた。この混合物を精確に５分間保温し 、その後３７℃の０．０２５モルの塩化ナトリウムの０．１ｍｌを加えた。試験 試料の凝血時間を記録した。二重反復測定のための一番近い０．１秒に対する平 均の凝血時間を、活性化された部分的トロンボプラスチン時間として報告した。

この測定の日々の（ｄａｙ−ｔｏ−ｄａｙ）再現性および１日内の（ｗｉｔｈｉ ｎ−ｄａｙ）再現性は満足実施例１を反復したが、ただし使用した粒子は７０　 ｍ　ｇの平均直径および５０ｍ２７ｇより小さい表面積を有するナルコ・ケミカ ル・、カンパニーからのアルミナ被覆シリカであった。

この測定の性能を、接触活性化剤としてヒユームドシリカを含有する凍結乾燥し た調製物（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ　１ｃｓ）の再構成したものおよ び活性化剤としてエラグ酸ナトリウムの水溶液（Ｄａｃｉｅ、Ａｃｔｉｎの試薬 ）を使用する商業的に入手可能なＡＰＴＴ試験の性能と比較した。３種類の試験 の実験内（ｗｉ　ｔ　ｈ　ｉ　ｎ−ｒｕｎ）精度を、２種の異なる器具［ＢＢＬ ７（プロメーター（Ｆｉｂｏｒｏｍｅｔ　ｅ　ｒ）およびランサｍ−コアキュレ イター（Ｌｎｃｅｒ　Ｃｏａｇｕｌｙｚｅｒ）に器具］で、各々プールした正常 および異常の凝固対照（ＯＭ　Ｅ　Ｇ　Ａ　＋秒　レベル１およびレベル２の対 照、Ｈｙｌａｎｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａ ｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｒ＋ｃ、）につでの２０（７）連続 測定を実施することにより、比較した。３種の試験の日々の精度を、１０日の各 々に上の対間についての測定を同一器具で反復して実施することにより、比較し た。結果を下表に記載する。

上のデータは、本発明におけるシリカおよびアルミナ被覆コロイド状シリカの改 良された効能を立証する。他の液状試薬と比較するときの、本発明の改良された 活性他剤試薬の日々の実施における変更係数の減少率リカの試薬と比較したとき の好適な結果は、とくに注目に値する。

手続補正書（口先） 昭和５９年２　月２２日 特許庁長官　看　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 ＰＣ’Ｔ／ＵＳ　８３１０　Ｏ６４５ ２、発明の名称 凝血の揃建２よびその丸薬 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代　理　人〒１０７ 住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号６、補正の対象 〔請求の範囲〕 「Ｌ　水、血小板因子を有する物質２よび約４〜１００μｍの平均直径を有する コロイド状シリカまたはコロイド状アルミナ被法シリカの粒子と接触させて前記 ケイ酸塩浴数からアルカリ金属イオンｆ：除去し、そして（ｂ）イオン交換材料 からコロイド状Ｖこ分散した粒子を回収することがら２　粒子が６０〜７０μｍ の平均直径を七する請求の範囲１に記載の試薬。

＆　粒子が約７０μｍの平均直径全ｍしかつｆ）５０ｍ”／？よシ小さい表（社 ）積をゼするアルミナ仮６シリカであるｉＸの範囲１に記載の試薬。

４、辷濁剤を実質的に含有しない請求の範囲１に配車の試薬。

＆　追加的に抗微生物剤２よび媛ｇ＃剤を含む請求の範囲ｌに記載の試薬。

６、水、血小板因子活性をＭする物質および約４〜１００μｍの平均直径を有す るコロイド状シリカまたはコロイド状アルミナ被ｂシリカの塩浴液をイオン交換 材料と按旭させて前記ケイジ塩宕液からアルカリ金属イオｙを除去し、そして（ ｂ）イオン交換材料からコロイド状に分散した粒子を回収することからなる方法 によって得られたものでろり、前記組み合わせ會谷器に入れ、前記容器を密閉し 、そして前記容器を少なくとも約３週間貯蔵することからなる血液中の凝固因子 の…１］定用試桑の製造方法。

７、容器を少なくとも約６週間貯蔵する請求の範囲６に記載の方法。

８、ハーケ゛マン因子が戻触活性化剤で活性化される、Ｉｌ′ｎ液または皿液訴 導体が凝固する能力をＩＩＩ定する方法において、前記接触活性化剤として、約 ４〜１００μｍの平均直径を石するコロイド状シリカまたはコロリケイ酸塩浴液 をイオン交換材料と接層させて前記ケイ＠塩弓液からアルカリ金属イオンを除去 し、そして（ｂ）イオン交換材料からコロイド状に分散した粒子を回収すること からなる方法によって得られたものである方法。

、９０粒子が６０〜７０μｍの平均直径を有する請求の範囲８に記載の方法。

１０　粒子が杓７０μｍの平均［直径を有しがっｉ５０　ｔｎ、２／　ｙより小 さい六面積を有するアルミナ板仮ソリ力である請求の範囲８に記載の方法。」 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ、水、血小板因子活性を有する物質および約４〜１００ｇｍの平均直径を有す るコロイド状シリカまたはコロイド状アルミナ被覆シリカの粒子からなり、前記 粒子は（ａ）アルカリケイ酸塩溶液をイオン交換材料と接触させて前記ケイ酸塩 溶液からアルカリ金属イオンを除去し、そして（ｂ）イオノ交換材料からコロイ ド状に分散した粒子を回収することからなる方法によって得られたものである試 薬。 ２、粒子が６０〜７０ｐｍの平均直径を有する請求の範囲１に記載の試薬。 ３、゛粒子が約７０ＪＬｍの平均直径を有しかつ約５０ｍ２／ｇより小さい表面 積を有するアルミナ被覆シリカである請求の範囲ｌに記載の試薬。 ４、懸濁剤を実質的に含有しない請求の範囲ｌに記載の試薬。 ５、追加的に抗微生物剤および緩衝剤を含む請求の範囲ｌに記載の試薬。 ６、水、血小板因子活性を有する物質および約４〜ｌｏＯｇｍの平均直径を有す るコロイド状シリカまたはコロイド状アルミナ被覆シリカの粒子を組み合わせる ことからなり、前記粒子は（ａ）アルカリケイ酸塩溶液をイオン交換材料と接触 させて前記ケイ酸塩溶液からアルカリ金属イオンを除去し、モして（ｂ＞イオン 交換材料からコロイド状に分散した粒子を回収しすることからなる方法によって 得られたものであり、前記組み合わせを容器に入れ、前記容器を密閉し、そして 前記容器を少なくとも約３週間貯蔵することからなる方法。 ７、容器を少なくとも約６週間貯蔵する請求の範囲６に記載の方法。 ８、ハーゲマン因子が接触活性化剤で活性化される、血液または血液誘導体が凝 固する能力を測定する方法において、前記接触活性化剤として、約４〜１１００ ＩＬの平均直径を有するコロイド状シリカまたはコロイド状アルミナ被覆シリカ の粒子を使用し、前記粒子は（ａ）アルカリケイ酸塩溶液をイオン交換材料と接 触させて前記ケイ酸塩溶液からアルカリ金属イオンを除去し、そして（ｂ）イオ ン交換材料からコロイド状に分散した粒子を回収することからなる方法によって 得られたものである方法。 ９、粒子が６０〜７０ｇｍの平均直径を有する請求の範囲８に記載の方法。 ＩＱ、粒子が約７０ｇｍの平均直径を有しかつ約５０ｍ２７ｇより小さい表面積 を有するアルミナ被覆シリカである請求の範囲８に記載の方法。