JP2005535315A

JP2005535315A - Ａｄａｍｔｓ−１３のフォン・ウイルブランド因子分解プロテアーゼ活性の測定方法

Info

Publication number: JP2005535315A
Application number: JP2004518675A
Authority: JP
Inventors: マルティーナ・ベーム
Original assignee: デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 2002-07-03
Filing date: 2003-07-03
Publication date: 2005-11-24
Also published as: US20050239153A1; WO2004005451A3; WO2004005451A2; EP1520035A2; US7291479B2; DE20213920U1

Abstract

本発明は、被験液にその１ｍＬ当りＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないフォン・ウイルブランド因子（ＶＷＦ）を０.５から５Ｕ混合し、インキュベートした後、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を血小板のＶＷＦ媒介凝集の低下に基づいて測定する、該被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３のＶＷＦ分解活性を測定するための診断方法。

Description

本発明は、血漿および他の液体中の、フォン・ウイルブランド因子を分解するＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定する、診断方法に関する。

血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、古典的な血小板減少症状および微小血管障害、溶血性貧血、神経学的症状、腎機能障害、ならびに発熱が観察される疾患である。ＴＴＰ患者の血漿中には異常に大きなフォン・ウイルブランド因子（ＶＷＦ）の重合体がみられ、富ＶＷＦ性および富血小板性血栓生成の原因と考えられている。内皮細胞が大きな重合体の形態でフォン・ウイルブランド因子を分泌し、これは正常血漿では還元酵素と金属プロテアーゼの組み合わされた作用により分解される。

さらに、先天性または後天性ＴＴＰに罹患している患者では、ＶＷＦをＴｙｒ８４２とＭｅｔ８４３の間のペプチド結合で切断する特異的な金属プロテアーゼの欠損が観察されることが、既に知られている。この金属プロテアーゼは最近ＡＤＡＭＴＳ（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs；トロンボスポンジン・モチーフを有するジスインテグリンおよび金属プロテアーゼ）ファミリーの新しいメンバーとして同定され、ＡＤＡＭＴＳ−１３と名づけられた（文献１〜３）。

以下、ＡＤＡＭＴＳ−１３のＶＷＦ分解プロテアーゼ活性は単にＡＤＡＭＴＳ−１３活性と呼ぶことにする。ＡＤＡＭＴＳ−１３活性は、通常は、低イオン強度の希釈血漿を用い、尿素と塩酸グアニジンで処理したＶＷＦサンプルをインキュベートして測定される。蛋白分解は、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動を用いた多重解析により、または、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動とその後の免疫ブロッテイング、すなわち抗原抗体反応によるセルロース膜上の蛋白質の検出法、を用いた断片の解析によって測定される（文献４、５）。また、ＡＤＡＭＴＳ−１３が関与するフォン・ウイルブランド因子の分解は、ＶＷＦのコラーゲン結合活性を測定法により（ＷＯ−Ａ００／５０９０４）、または特異的な二相性（bilateral）ＥＬＩＳＡ検出法により測定できる（文献６）。緑色蛍光蛋白質でＮ末端を標識した組換え単量体ＶＷＦも、最近、蛋白分解の測定を目的として記載されている（文献７）。

通常の電気泳動方法は、試験の実施が特別な実験機器および必要な技術を要求するために、特別な研究実験施設でのみ行うことができる。一方、ＡＤＡＭＴＳ−１３の蛋白分解活性を検出するためのコラーゲン結合試験（ＷＯ−Ａ００／５０９０４）および特異的なＥＬＩＳＡ（文献６）はＡＤＡＭＴＳ−１３活性の測定を簡略化しているものの、やはり適切な機器や必要なノウハウが自由に使える実験室でなければ行うことができない。さらに、二相性ＥＬＩＳＡ検出法は、商業的に入手できないために限られた実験室でしか利用できない特異的なモノクローナル抗体を必要とする。したがって、ここで示される目的はＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定するための簡便法を開発することである。この新規な方法は血漿および他の体液（例えば、血清および唾液）ならびに他の液体中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を、信頼性をもって適時に定量することを可能にした。これは、どのような通常の臨床凝固検査室でも利用可能であり、どのような特別の実験機器、特別なノウハウ、または商業的に入手できない試薬を必要としない。さらに、この新規な方法は、安い操作費用で多数検体を処理すること（high sample throughput）を達成するために、できるかぎり、自動化凝固機器上での自動化を可能にする。低値のＡＤＡＭＴＳ−１３活性がＴＴＰ以外の疾患でも観察されることがこれまで明らかにされてきたことから（文献８）、そう
した方法はＴＴＰを特徴とする重篤なＡＤＡＭＴＳ−１３欠損症と軽度なＡＤＡＭＴＳ−１３欠損症の識別を可能にする。早期の診断およびそれに続く血漿交換治療法の開始は、原則的にしばしば生命を危機に陥れるＴＴＰ発症をもたらすような臨床的経緯を決定する。この理由により、この新規な方法はＡＤＡＭＴＳ−１３活性を迅速にかつ可能なかぎり広範囲で測定することを可能にした。適時のＡＤＡＭＴＳ−１３活性の測定はまた代替治療の選択肢の存在のために必須である。とりわけ、この方法は、この後に異なった治療可能性（例えば、リツキシマブ（rituximab）または免疫吸着）の可能性があるために、ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する阻害剤を迅速に測定することを可能にし、または、阻害剤の力価（titer）を測定することを可能にする。この方法はまた先天性ＴＴＰと後天性ＴＴＰを識別することを可能にした。これに加えて、日常的に行うことができる迅速なＡＤＡＭＴＳ−１３活性測定は、利用可能性のある組換えＡＤＡＭＴＳ−１３（ＷＯ２４２４４１）を用いるために必須である。この方法は、適時の診断やＴＴＰ患者の治療の監視を可能にするだけではなく、さらにどのような任意の液中のでも、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性の信頼性のある定量化を可能にした。ＡＤＡＭＴＳ−１３はＶＷＦの重要な制御因子（regulator）でありかつその結果として止血における重要な因子であるために、この新規な方法は健常人および異なった疾患に罹っている患者のＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ−１３介在性蛋白分解の重要性に関する広範な研究において適用することが可能であった。

驚くべきことに、ＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ−１３介在性蛋白分解がＶＷＦの血小板凝集能により検出できることが見出された。ＡＤＡＭＴＳ−１３によるＶＷＦの分解は結果的にＶＷＦ多量体を短縮化する。ＶＷＦが血小板を凝集する能力は原則的に多量体の長さによって決められる。ＶＷＦ多量体が大きいほど、血小板を凝集する能力は大きい。本発明の方法において、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定するためにこの関連性が探求された。

したがって、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないフォン・ウイルブランド因子（ＶＷＦ）を１ｍＬ当り０.５から５Ｕ被験液と混合し、インキュベートした後、ＡＤＡＭＴのＡＤＡＭＴＳ−１３のＶＷＦ分解活性を測定するための診断方法に関する。

本発明における用語上、「被験液」とは、血漿、血清、唾液および脳脊髄液のようなあらゆる体液、ならびに、細胞培養上清または細胞抽出液のような他の被験液を意味する。

ＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦ（以下ではＶＷＦ基質とよばれる）を被験液に加える。用いるＶＷＦ基質は、好ましくは、正常血漿での多量体パターンを示す高度に精製された血漿性ＶＷＦであり、かつ内因性ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を含んでいない。しかしながら、いかなるＡＤＡＭＴＳ−１３活性も示さない他の様々なＶＷＦ基質、例えば、組換えＶＷＦ、細胞培養上清からのＶＷＦ、またはＡＤＡＭＴＳ−１３活性が不可逆的に阻害されている血漿性ＶＷＦなどを使用することもできる。

高度に精製された血漿性ＶＷＦの典型的な多量体パターンを図１ａの最初のカラムに示す。続く７個のカラムはＡＤＡＭＴＳ−１３により蛋白分解を受けた結果の、高分子量ＶＷＦ多量体の経時的な消失を示す。このために、それぞれの場合に、図１ａに示すインキュベーション時間（０.５〜２２時間）の後、被験混合物から一定量のサンプルを採取し、反応をＥＤＴＡの添加により停止させた。サンプルは次に、慣用の標準法に従いＳＤＳアガロースゲル電気泳動で分画化され、次いで免疫ブロッテイングにより可視化された。さらに、それぞれの場合に、ＶＷＦの機能的活性を測定するために、対応するインキュベーション時間の後に一定量のサンプルを採取した。このために、ＶＷＦが血液の血小板を凝集する能力をリストセチン（ristocetin）の存在下で測定した；この能力は通常リストセチン補因子（ristocetin cofactor；ＲＣｏ）活性とよばれている。このＲＣｏ活性は、Dade Behring社（マールブルグ、ドイツ）より購入できるＢＣフォン・ウイルブランド試薬を用いて測定できる。こうして測定された対応するサンプルのＲＣｏ活性は、図１ａに示された免疫プロッテイングのカラムの下に記載されている。経時的なＡＤＡＭＴＳ−１３介在の高分子量ＶＷＦの消失はＲＣｏ活性の顕著な消失、すなわち、反応の開始時の３５７％から２２時間のインキュベーション時間の後の１３％までの低下、をもたらす。図１ｂは再びこの経時的な、反応液に加えられたＶＷＦ基質のＲＣｏ活性のＡＤＡＭＴＳ−１３による消失を例示している。

一般的に、本発明の方法における手順では、希釈された被験液、すなわち血漿が、１ｍＬ当り０.５〜５Ｕ、好ましくは１〜３ＵのＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないフォン・ウイルブランド因子（ＶＷＦ）に加えられる。この関連で、被験液は内因性ＶＷＦを無視できるまで、すなわちどのような検出可能な血小板凝集をも生じさせないところまで希釈しなければならない。このＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦおよび希釈被験液は次に一定の十分長い時間、好ましくは０.１〜２４時間、とりわけ好ましくは６〜１５時間、インキュベートされる。利用できる研究結果によれば、このインキュベーション時間は０.５〜６分、好ましくは１〜３分まで短縮することさえも可能なようである。このインキュベーションは便宜上、低いモル濃度の反応緩衝液（例えば、５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸、ｐＨ８）、ならびに、好ましくは二価のカチオン、例えば、Ｂａ²⁺またはＣａ²⁺、および、セリンプロテアーゼインヒビター、例えばＰｅｆａＢｌｏｃＳＣ、ならびに尿素の存在下で達成される。反応液中の二価カチオンの好ましい濃度は５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは７〜９ｍｍｏｌ／Ｌである。反応液中のＰｅｆａＢｌｏｃＳＣの好ましい濃度は０.５〜６.５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０.７５ｍｍｏｌ／Ｌである。反応液中の尿素の好ましい濃度は０.５〜３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１.５ｍｏｌ／Ｌである。適切なインキュベーションの終了時、残存するＶＷＦ基質が血小板を凝集する能力を測定する。これは、例えば、リストセチン補因子活性（リストセチン存在下での、ＶＷＦが介在する血小板の凝集を記載する）によって、好ましくはDade Behring社（マールブルグ、ドイツ）より購入できるＢＣフォン・ウイルブランド試薬を用いて、好ましくは自動化された自動化凝固機器上での測定法で、測定することができる。このために、決められた量の血小板およびリストセチンが反応液に加えられる。被験液中の血液の血小板の好ましい濃度は、１μＬ当り１,０００,０００個から１００,０００個、より好ましくは１μＬ当り５００,０００個から２００,０００個の血小板数である。被験液中のリストセチンの好ましい濃度は０.５〜３ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは１〜２ｍｇ／ｍＬである。リストセチンの存在下で、反応液中のＶＷＦ基質は血小板を凝集させる。生じた凝集は反応液の濁度を減少させる。その結果、光学密度を測定することによりＶＷＦ基質が血小板を凝集させる能力を定量できる。このようにして測定された反応液中に残存するＶＷＦ基質のリストセチン補因子活性は、被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性に依存する。被験液中により多くのＡＤＡＭＴＳ−１３活性が存在すれば、加えられたＶＷＦ基質はより多く分解されかつその血小板を凝集する能力を失う。不活性化された（不活性化されたＡＤＡＭＴＳ−１３の活性である）正常ヒト血漿の異なった量で希釈された、正常ヒト血漿を検量のために用いる。不活性化は、例えば、加熱により達成される。この関連性は図２に示した。Ｘ軸は正常ヒト血漿の異なった希釈（１：２１希釈＝１００％）を示す。Ｙ軸は、９０秒間での吸収（ｍＥ／１.５分）の減少により測定された、リストセチンの存在下での血小板を凝集させる対応するサンプルの能力を示す。正常ヒト血漿の希釈は、被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性の限定された消失をもたらし、１：２１希釈を１００％と定義する。本発明の方法の条件下で、被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３の量が、反応液中の基質のリストセチン補因子活性を決定する。被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性と反応液中のリストセチン補因子活性の相関性は次の式で記載できる：ｙ＝Ａ＋（Ｄ−Ａ）／（１＋ｅ^(B*(c-x)）、（Tecan、バーゼル、スイス、から入手したソフトウエアである、Ｅａｓｙｆｉｔ（バージョン５.１４）を用いて計算される）。ＶＷＦのリストセチン補因子活性の測定は通常血漿で行い（ＤＥ１９９６４１０９Ａ１）、そして、いかなる機器が完備した日常的な凝固検査室であっても通常の迅速試験である。本発明の方法の試験法の成功裡の使用は、この場合には、ＶＷＦ基質のＲＣｏ活性が、低い緩衝液濃度を含む非常に非生理的な反応液で、そしてセリンプロテアーゼインヒビターおよび尿素の存在下で測定されるために、とりわけ驚くべきことである。ＲＣｏ活性試験は通常は与えられた血漿サンプル中のＲＣｏ活性を測定するために使用される。この代わりに、血漿（または対応する被験液）を、本発明の方法により、内因性ＶＷＦがもはやどのような血漿の凝集をも起こさせないような、すなわち内因性ＲＣｏ活性が２.５％未満であるような程度まで希釈される。内因性ＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦは、記載された条件下で、このように希釈された血漿に、希釈血漿サンプル中でＡＤＡＭＴＳ−１３活性により分解されたＶＷＦと共に、添加される。内因性ＶＷＦ基質の分解はＲＣｏ活性を測定することにより定量化される。日常的に行われることが可能な、公知の広く用いられている試験法の、本発明による方法における新規な使用法は、どのような機器の完備した日常的な凝固検査室においても採用することができる。

簡略すれば本発明の方法は以下のように記載できる；
− 被験液に存在しているＡＤＡＭＴＳ−１３がＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷ
Ｆ基質に作用し、次に、それによりＶＷＦの活性を変化させる（ＶＷＦ多量体の短縮化）
− 変化したＶＷＦ活性をリストセチン存在下でＶＷＦ介在の血小板凝集を測定することにより定量する
− ＶＷＦ活性の減少の程度を被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性と同等のものと見做す。

しかしながら、本発明の方法は反対に行うことも可能である；
− リストセチンの存在または不存在下でＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦにより血小板を凝集させる
− ＡＤＡＭＴＳ−１３を含有している被験液と共にインキュベートする
− それによりＶＷＦ活性を変化させ、このために血小板凝集の解離をもたらす
− 解離の程度を被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性と同等のものと見做す。

本発明の方法の特別の実施態様では、ＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦ基質は、また、例えばマイクロタイタープレートまたはマイクロパーテクルのような固相に、例えば特異的な結合相手を利用して、結合させることもできる。

本発明における用語上、「固相」とは、多孔型および／または非孔型で一般的には水に不溶性で、例えば容器、チューブ、マイクロタイトレーションプレート、球体、マイクロパーテクル、ロッド、切片、濾紙、クロマトグラフィー用紙等のような非常に広い種類の形態を有することができる物質から構成された物品を意味する。概して、固相の表面は親水性であり、または親水性になるように作ることができる。固相は非常に広い種類の物質、例えば無機および／または有機物質によって構成でき、また、合成物質、天然由来物質および／または改良された天然由来物質によって構成できる。固相用物質の例には、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、塩化ポリビニル、ポリアクリルアミド、交差式デキストラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリレートもしくはナイロンのようなポリマー；セラミック；ガラス；金属、とりわけ金や銀のような貴金属；マグネタイト；それらの混合物もしくは組合せ；等が挙げられる。細胞、リポソームおよびリン脂質の小胞もまた固相の意味に包含される。

固相は、例えば、固相に対するサンプルの構成成分の非特異的結合を抑制もしくは防止するため、または、例えば、粒子状固相の懸濁安定性、保存安定性、形状安定性もしくは
紫外光線、微生物もしくは他の破壊作用のある作用物質への抵抗性に関して改善を行うために、１個またはそれ以上の層、例えば蛋白質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマー、またはそれらの混合物によって構成される被覆を有することができる。

本発明における用語上、「マイクロパーテクル」とは、おおよそ、少なくとも２０ｎｍで２０μｍを超えない、通常は４０ｎｍで１０μｍ、好ましくは０.１μｍから１０μｍの間、特に好ましくは０.１μｍから５μｍの間、さらに特に好ましくは０.１５μｍから２μｍの間の直径を有する粒子を意味するものと理解される。マイクロパーテクルは規則的または不規則な形状を取ることができる。これらは球、長球、または、空洞もしくはより大きなもしくはより小さな孔を有する球を構成できる。マイクロパーテクルは有機物質から、無機物質から、またはこれら二つの混合物もしくは組合せから構成することができる。これらは多孔型または非孔型物質から、および膨潤型または非膨潤型物質から構成することができる。原則的には、マイクロパーテクルはどのような密度でも良く；しかし好ましいのは、水の密度に近い密度、例えば、約０.７〜約１.５ｇ／ｍＬ、を有する粒子である。好ましいマイクロパーテクルは水性溶液の中で懸濁することができ、そして懸濁液は可能なかぎり長い間安定である。マイクロパーテクルは透明でも、半透明でもまたは不透明でも良い。マイクロパーテクルは、例えばコアと１個またはそれ以上の被覆層を有する、コアおよび殻（core-and-shell）粒子とよばれる数種の層から構成することができる。マイクロパーテクルという用語は、例えば、色素結晶、金属ゾル、シリカ粒子、ガラス粒子、帯磁粒子、化学発光性および／または蛍光性物質、ポリマー粒子、油滴、脂肪粒子、デキストランおよび蛋白質凝縮物を包含する。好ましいマイクロパーテクルは水性溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー物質、特に置換されたポリエチレンで構成されている粒子である。特に好ましいものは、例えばポリスチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリルニトリルポリマー、アクリルニトリルブタジエンスチレン、ポリビニル酢酸アクリレート、ポリビニルピリジンまたは塩化ビニルアクリレートから構成されたラテックス粒子である。表面に、例えばカルボキシ基、アミノ基もしくはアルデヒド基のような、例えば特定の結合パートナーとそのラテックス粒子に共有結合させることができる反応基を有するラテックス粒子がとりわけ関心がある。ラテックス粒子の製造方法は、例えば、ＥＰ００８０６１４、ＥＰ０２２７０５４およびＥＰ０２４６４４６に記載されている。

マイクロパーテクルは、例えば、粒子表面に対するサンプルの構成成分の非特異的結合を抑制もしくは防止するため、または、例えば、マイクロパーテクルの懸濁安定性、形状安定性もしくは紫外光線、微生物もしくは他の破壊作用のある作用物質への抵抗性に関して改善を行うために、１個またはそれ以上の層、例えば蛋白質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマー、またはそれらの混合物によって構成される被覆を有することができる。そのために、この被覆は、特に、マイクロパーテクルに共有結合でまたは吸着性で結合した、例えばシクロデキストリン、デキストラン、ハイドロゲル、アルブミンまたはポリアルブミンのような蛋白質層もしくはポリマー層で構成することができる。

「結合した（associated）」という用語は、例えば、共有結合および非共有結合の、直接および間接連結（linkage）、表面への吸着およびくぼみまたは空洞への組み込み等を包含している。通常、共有結合は、少なくとも１個の分子の１個の原子核が第二の分子の少なくとも１個の原子核と電子を分け合っているとき、２個の分子の間に存在すると言われている。非共有結合の例は、表面吸着、空洞への取り込み、または、２個の特異的結合パートナーの結合である。直接連結に加えて、結合する対象はまた、特異的結合パートナーとの特異的相互作用により間接的に固相に結合することができる。

「特異的結合パートナー」は特異的結合対の一員として理解される。特異的結合対のメンバーとは、その相補的構造により結合が構成されて互いに結合できる２個の分子の、そ
れぞれの場合に、少なくとも１個の他の分子が有する構造に相補的である構造を有する２個の分子である。分子という用語はまた、アポ酵素と補酵素から成る蛋白質、蛋白質と脂質から成るリン脂質のような様々なサブユニットから成る蛋白質、のような分子複合体も包含する。特異的結合パートナーは天然由来であっても良く、また、化学的合成、微生物学的技術により、および／または組換え方法により製造された物質であっても良い。特異的結合パートナーの用語を説明する目的のために、それに限定されると理解することなしに、以下の例を挙げることができる：チロキシン結合グロブロリン、ステロイド結合蛋白質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、レプレッサー、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃ１ｑ、核酸結合蛋白質、等。特異的結合対の例は：抗体−抗原、抗体−ハプテン、オペレーター−レプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビジン、レクチン−多糖類、ステロイド−ステロイド結合蛋白質、活性物質−活性物質受容体、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡ、相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド等が挙げられる。

方法の他の実施態様では、後者は、例えば流動液中で、剪断力の影響下で行うことができる。

本発明はさらにＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦ基質、血小板、および場合によってはリストセチンを含む、診断用キットに関している。

本発明はさらにＡＤＡＭＴＳ−１３活性を検出する目的でＶＷＦ活性を検出するための試薬の使用に関している。

本発明は、以下で実施例を用いてより詳細に説明される。

〔実施例〕
本発明の方法は、以前から採用されている免疫ブロッテイング法と、詳細に比較された。本発明の診断方法は、１４名の患者で、急性発症期、治療の経過中、および寛解期での、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定するために用いられ；さらに、８０名の健常人被験者、血小板減少症および／または溶血に罹患している２３名の患者、ならびに抗リン脂質症候群（antiphospholipid syndrome; ＡＰＳ）に罹患している１４名の患者のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定するために用いられた。

１．血漿サンプル
クエン酸処理血漿サンプルを、新鮮凍結血漿による血漿置換を行う前に、２２の急性ＴＴＰ発症に関連して１４名の患者から採取した。最初の診断は臨床症状（特に神経学的障害）および重篤な血小板減少および微小血管障害性溶血性貧血の検出のような検査室の所見に基づいていた。血漿サンプルはまた寛解期にある１１名の患者からも採取した。血液はまた血漿置換療法中の１０名の患者からも採取した。急性の血小板減少症および／または溶血に罹患した２３名の患者、抗リン脂質症候群に罹患した１４名の患者、ならびに８０名の健常人被験者から採取した血漿サンプルもまた分析した。血小板涸渇血漿（platelet-depleted plasma）は、４℃、２５００ｇで４０分間、遠心分離して調製した。次に、この上清は使用時まで−２０℃で保存した。

２．ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定するための本発明の方法の使用
血漿サンプルは、１２.５ｍＭの塩化バリウム（ＢａＣｌ₂）、１ｍＭのＰｅｆａＢｌｏｃＳＣ、および血清プロテアーゼインヒビター（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社、ダームシュタット、ドイツ）を含む５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８、で、１：２１に希釈され、次にプロテアーゼを活性化するために５分間、３７℃でインキュベートした。精製したＶＷＦ（ヒトウイルブランド因子濃縮物、超高度精製；Concendre de Facteur Willebrand Humain, Tres Haute Purite, ＬＦＢ、フランス）を基質として用いた。この濃縮物は、検出可能なＡＤＡＭＴＳ−１３活性を含まず、１００Ｕ／ｍＬの濃度で注射するために水で再構成され、一定量を取り出し、使用時まで−２０℃で保存した。プロテアーゼを作用させる前に、基質を解凍し、５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、中の５Ｍ尿素を用いて１：２０の割合で希釈した。次に、この基質溶液１００μＬを希釈血漿２１０μＬに加え、溶液全体を、３７℃で終夜放置し反応させた。その後、加えたＶＷＦ基質の残存するリストセチン補因子活性を、Dade Behring社（マールブルグ、ドイツ）より供給された商品のＢＣフォン・ウイルブランド試薬を用いて、反応液中で測定した。８０名の明らかに健常な成人被験者から採取し、１：２１に希釈した、血漿混合物中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を１００％であると定義した。検量のために１：２から１：３２まで連続して希釈した血漿プールを、加熱処理した血漿プールを用いて調製した。加熱処理のために、血漿プールを６０℃で３０分間インキュベートし、次に、蛋白質凝集物を沈殿させるために、１３,０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した（ＢｉｏｆｕｇｅＡ、Ｈｅｒａｅｕｓ）。このように処理された血漿には、いかなる検出可能なＡＤＡＭＴＳ−１３活性も含まれていなかった。従って、この異なった希釈液はＡＤＡＭＴＳ−１３活性の定められたパーセント量を含んでいた。このようにして得られた検量曲線は図２に示している。定義により２００から０％のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を含んでいる、正常血漿プールの異なった希釈をＸ軸にプロットする。Ｙ軸は、９０秒の測定時間における吸光（ｍＥ／１.５分）の減少により測定した、対応するサンプルの、リストセチンの存在下での血小板の凝集能を示している。

３．ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定するための免疫ブロッティング法の使用（対照用の実施例）
Furlan等およびTsai（４、５）により最初に記載された方法の変法を、免疫ブロッテイング法によるＡＤＡＭＴＳ−１３活性の測定のために用いた。血漿サンプルを、１２.５ｍＭのＢａＣｌ₂および１ｍＭのＰｅｆａＢｌｏｃＳＣを含む５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８、で、１：５に希釈し、活性化し、次にプロテアーゼ反応を、本発明の方法として記載されたものと同様に行った。反応を、最終濃度２３.５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムの添加により終結させた。多量体分析（multimer analysis）を、１.４％アガロース（Seakem HGT；Biozym Diagnostics, Hess, Oldenburg, ドイツ）上のＳＤＳ電気泳動を用いて実施し、ペルオキシダーゼ結合抗−ＶＷＦ抗体（Ｐ０２２６、Daka-Glostrup、デンマーク）を免疫ブロッティングに用いた。定量的測定のために、正常血漿の連続希釈液を上で既に記載したように試験した。免疫ブロッテイング法を用いた例示的な試験の結果を図３に示した。検量のために、正常人血漿の種々の希釈液（１：５から１：１６０）をＶＷＦ基質で処理した。定義により、希釈液は１００から０％のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を含んでいる（カラム１−７；１：５希釈＝１００％）。カラム８−１０はＴＴＰ患者から採取した血漿サンプルを示す。被験サンプルのＡＤＡＭＴＳ−１３活性は、カラム１−７の検量を用いて算定された。

４．インヒビター試験
また本発明の方法はＡＤＡＭＴＳ−１３に対する阻害活性を測定するためにも使用できる。ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する阻害活性を測定することは、特に、先天性と後天性のＴＴＰを識別するために臨床において決定的な重要性を有する。さらに、インヒビターを検出すること、つまりインヒビターの力価（titer）を測定することは、代替の治療の選択肢（例えば、リツキシマブまたは免疫吸着）に関する決定に達するために必須である。ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する阻害活性を測定する目的で、非希釈または加熱処理血漿プールにより希釈された血漿サンプルを等量の正常血漿と混合した。比較のために、正常血漿を加熱処理血漿プールと１：１で混合した。３７℃で３０分間インキュベーションの後、混合物中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を、本発明の方法を用いるか、または、これまでの慣用
法である免疫ブロッテイング法を用いて測定した。被験サンプル中のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を比較混合物の活性で割り１００を掛けて残存するＡＤＡＭＴＳ−１３活性を測定した。定量的な測定のために、２５から７５％の残存活性を有するサンプルを選択し、インヒビターの量を、第VIII血液凝固因子のインヒビターで記載された（８）ように測定した。定義により、正常ＡＤＡＭＴＳ−１３活性の５０％阻害を生じるサンプルは１Ｕ／ｍＬのインヒビターを含んでいた。

５．結果
本発明の方法の正確性および再現性
本発明の方法の正確性は、従来の免疫ブロッテイング法および本発明の方法に従って、患者および健常人被験者から採取した２８２個の血漿サンプルを試験することにより立証された。結果を図４に示す。この実験において、免疫ブロッテイング法の結果は次のカテゴリーに分けられた：重篤なＡＤＡＭＴＳ−１３欠損で活性は＜１２.５％（三角）、中程度の重篤性のＡＤＡＭＴＳ−１３欠損で活性は１２.５から２５％の間（ひし形）、軽度のＡＤＡＭＴＳ−１３欠損で活性は２５から５０％の間（円）および正常なＡＤＡＭＴＳ−１３活性で、＞５０％の活性を有するもの（四角）。対応するサンプルについて本発明の方法により得られた結果は、Ｙ軸に示した。重篤なＡＤＡＭＴＳ−１３欠損の７２例のサンプル中７１例において、両方の方法で同じ結果が得られた。血漿交換治療を受けているＴＴＰ患者の１例において、免疫ブロッテイング法では０から１２.５％の活性だったが、一方、本発明の方法では同じサンプルが１８％の活性を示した。免疫ブロッテイング法で中程度に重篤なＡＤＡＭＴＳ−１３欠損と判定された１９例のサンプルは、本発明の方法では９から３９％のＡＤＡＭＴＳ−１３活性を示した。免疫ブロッテイング法で軽度のプロテアーゼ欠損と判定された６４例のサンプルの場合は、本発明では２０から６０％の活性があると測定された。免疫ブロッテイング法で正常とされた１２７例のサンプルもまた本発明の方法で＞５０％との正常の活性を示した。要約すれば、図４に示された結果は従来の免疫ブロッテイング法とこの新規方法の優れた一致を立証し、そのために、非常に手間のかかる免疫ブロッテイング法を、ＶＷＦ介在血小板凝集を測定する、本発明に従って代替できることが証明された。本発明の方法は、特定の一連の試験の中で、および、異なった一連の試験との間での、非常に小さい誤差限界で示されたように、再現性がある。

本発明の方法の臨床適用
この新規な方法の臨床への適用性を、２２例の急性ＴＴＰ発症および他の血栓性、血小板減少性および／または溶血性疾患を含む５１例の患者から得られた測定結果を研究することにより証明することが可能であった。重篤なＡＤＡＭＴＳ−１３活性の欠損は、急性の古典的なＴＴＰに罹患した患者でのみ観察された。低いインヒビター濃度を有する患者は血漿置換にＡＤＡＭＴＳ−１３活性の増加を伴って反応し、一方、高いインヒビター濃度を有する患者では、血漿置換が臨床的な寛解をもたらしたにも関わらず、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性の測定可能な増加はみられなかった。入院時に低いインヒビター濃度（０.７Ｕ／ｍＬ）を有していた女性患者の症例におけるＡＤＡＭＴＳ−１３活性の経過を例示として図５に示した。この患者は５０日に渡って総計３６回の血漿置換による治療を受け良い結果を得た。１４日目の早期の再発の後、血漿療法はＡＤＡＭＴＳ−１３活性の一貫した増加をもたらした。この増加は、図５の円で示される血小板の増加と密接に関連している。この図は、ＴＴＰ発症の臨床的経過が、本発明の方法により測定されたＡＤＡＭＴＳ−１３活性により反映できることを明らかにしている。

これらの実施例は、本発明の方法による診断方法は、ＡＤＡＭＴＳ−１３のＶＷＦ分解プロテアーゼ活性を測定することを可能にしている。本発明の方法と公知の免疫ブロッテイング法との比較は、本発明の方法の正確性を立証している。本発明の方法は再現性があり、そして従来の免疫ブロッテイング法とは反対に、いかなる特殊な実験機器または特別
なノウハウも必要としない。この方法は、好ましくは終夜で実施され、またインキュベーション時間を、数時間から数分まで短縮することも可能である。本発明の方法は免疫ブロッテイング法より費やす時間が少なくてすむ。

本発明の診断方法は、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を、どのような一般的な機器を有する凝固検査室においても、迅速にかつ信頼性をもって測定するために使用できる。これは、特に、急性発症を成功裡に治療するための必須である、ＴＴＰを迅速に診断し、したがって治療を即座に開始することを可能にする。早期に治療を開始することは、必要とされる血漿置換の数を減少させ、これにより治療の費用を大きく実質的に減少させる。

〔参考文献〕
1. Fujikawa, K., Suzuki, H., McMullen, B., Chung, D. (2001) Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood 98: 1662-1666.
2. Gerritsen; H.E., Robles, R., Laemmele, B., Furlan, M. (2001) Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease Blood 98: 1654-1661.
3. Levy, G.G., Nichols, W.C., Lian, E.C. Foroud, T., McClintick, J.N., McGee, B.M., Yang, A.Y., Siemieniak, DR., Stark, K.R., Gruppo, R., Sarode, R., Shurin, S.B., Chandrasekaran, V., Stabler, S.P., Sabio, H., Bouhassira, E.E., Upshaw, J.D., Ginsburg, D., Tsai, H.M. (2001) Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature 413: 488-494.
4. Furlan, M., Robles, R., Laemmle, B., (1996) Partial purification and characterisation of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood 10: 4223-4234.
5. Tsai, H.M. (1996) Physiologic Cleavage of von Willebrand factor by a Plasma
Protease is dependent on its confirmation and requires Calcium ion. Blood 10: 4235-4244.
6. Obert B, Tout H, Veyradier A, Fressinaud E, Meyer D, Girma JP (1999) Estimation of the Willebrand factor-cleaving protease in plasma using monoclonal antibodies to VWF. Thromb Haemost 82: 1382-1385
7. Raife TJ, Atkinsons B, Christopherson P, Jozwiak M, Montgomery RR (2001) Recombinant, truncated monomeric von Willebrand factor (VWF) for the study of VWF proteolysis. Thromb Haemost, Suppl July: Abstract#1667
8. Kasper, C.K. (1991) Laboratory tests for factor VIII inhibitors, their variation, significance and interpretation. Blood Coagul Fibrinolysis 2: 7-10.

１ａは高度に精製された血漿性ＶＷＦの典型的な多量体パターンを示し、１ｂは経時的な、反応液に加えられたＶＷＦ基質のＲＣｏ活性のＡＤＡＭＴＳ−１３による消失を例示する。ＡＤＡＭＴＳ−１３活性［％］とＲＣｏ［ｍＥ／１.５分］との関係を示す。ＡＤＡＭＴＳ−１３活性の免疫ブロッティング法を用いた試験結果を示す。本発明方法の正確性を２８２個の血漿サンプルの試験結果から立証する図である。ＴＴＰ発症の臨床的経過が本発明の方法により測定されたＡＤＡＭＴＳ−１３活性により反映できることを示す図である。

Claims

被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３のフォン・ウイルブランド因子（ＶＷＦ）分解活性を測定する診断方法であって、被験液にその１ｍＬ当りＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないフォン・ウイルブランド因子０.５から５Ｕを加え、インキュベートした後、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を血小板のＶＷＦ媒介凝集の減少によって測定する、上記の方法。
被験液中のＡＤＡＭＴＳ−１３のフォン・ウイルブランド因子（ＶＷＦ）分解活性を測定する診断方法であって、血小板をＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないフォン・ウイルブランド因子に加え、血小板を凝集させ、ついで被験液をこの混合物に加え、ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を血小板凝集の解離によって測定する、上記の方法。
リストセチンの存在下で行われることを特徴とする、請求項１または２の方法。
血小板のＶＷＦ媒介凝集の減少が、検量線を構成するために用いられる不活性化正常ヒト血漿の異なった用量で希釈された正常ヒト血漿による、検量線を用いて測定される、請求項１の方法。
血小板の解離が、検量線を構成するために用いられる不活性化正常ヒト血漿の異なった用量で希釈された正常ヒト血漿による、検量線を用いて測定される、請求項２の方法。
セリンプロテアーゼインヒビターが用いられることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの方法。
セリンプロテアーゼインヒビターが用いられないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの方法。
二価のカチオンが用いられることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかの方法。
二価のカチオンが用いられないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかの方法。
ＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦが固相に結合していることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかの方法。
固相が粒子状固相であることを特徴とする、請求項１０の方法。
被験液が血漿であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの方法。
被験液が血清であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの方法。
被験液が唾液であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの方法。
被験液が脳脊髄液であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの方法。
被験液が細胞培養上清であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの方法。
被験液が細胞抽出物であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの方法。
ＡＤＡＭＴＳ−１３を含有しないＶＷＦおよび血小板を含む、診断キット。
さらにリストセチンを含むことを特徴とする、請求項１８の診断キット。
プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ−１３を測定するための、ＶＷＦ活性測定試薬の使用。