EP1520035A2 - Verfahren zum nachweis der von willebrand-faktor-spaltenden protease-aktivit t von adamts-13 - Google Patents

Verfahren zum nachweis der von willebrand-faktor-spaltenden protease-aktivit t von adamts-13

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EP1520035A2
EP1520035A2 EP03762597A EP03762597A EP1520035A2 EP 1520035 A2 EP1520035 A2 EP 1520035A2 EP 03762597 A EP03762597 A EP 03762597A EP 03762597 A EP03762597 A EP 03762597A EP 1520035 A2 EP1520035 A2 EP 1520035A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
adamts
vwf
activity
test medium
plasma
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03762597A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Martina BÖHM
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Original Assignee
Dade Behring Marburg GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Dade Behring Marburg GmbH filed Critical Dade Behring Marburg GmbH
Publication of EP1520035A2 publication Critical patent/EP1520035A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Definitions

  • the invention relates to a diagnostic method for the detection of the VWF-splitting ADAMTS-13 activity in blood plasma and other media.
  • thrombocytopenic purpura is a disease in which the classic symptoms of thrombocytopenia, microangiopathic, hemolytic anemia, neurological symptoms, renal dysfunction and fever are observed.
  • Unusually large multimers of von Willebrand factor (VWF) are found in the plasma of TTP patients and are considered to be the cause of the formation of thrombi rich in VWF and platelets.
  • the von Willebrand factor is released by endothelial cells in the form of large multimers, which are split in normal plasma by the interaction of a reductase and a metalloprotease.
  • ADAMTS-13 a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs
  • ADAMTS-13 activity is typically measured by incubating a urea or guanidium hydrochloride treated VWF sample with diluted plasma at low ionic strength.
  • the proteolysis is detected by means of a multimer analysis using SDS agarose gel electrophoresis or by fragment analysis using SDS polyacrylamide gel electrophoresis and subsequent immunoblotting, ie the detection of the proteins on a cellulose membrane using the antigen-antibody reaction (4, 5).
  • the ADAMTS-13-catalyzed breakdown of von Willebrand factor can also be measured by measuring the collagen Binding activity of the VWF (WO-A 00/50904) or by a specific, two-sided ELISA detection (6) can be determined.
  • a recombinant, monomeric VWF which has been labeled with a green fluorescent protein at the N-terminus for determining proteolysis has also recently been described (7).
  • the conventional electrophoretic methods can only be carried out in specialized research laboratories, since the tests require special laboratory equipment and the necessary expertise.
  • the collagen binding test (WO-A 00/50904) and the specific ELISA (6) for the detection of the proteolytic activity of ADAMTS-13 simplify the ADAMTS-13 activity determination, but can also only be carried out in laboratories that use the appropriate equipment and the necessary know-how.
  • the two-sided ELISA also requires specific monoclonal antibodies, which are only available to a few laboratories because they are not commercially available. The task was therefore to develop a simple method for the determination of ADAMTS-13 activity. This new method should allow reliable and timely quantification of ADAMTS-13 activity in blood plasma and other body fluids (e.g. blood serum, saliva) and other media.
  • the new method should determine the area quickly and as far as possible Enable ADAMTS 13 activity.
  • the timely determination of ADAMTS-13 activity is also essential due to alternative therapy options.
  • the method should enable rapid detection of an inhibitor against ADAMTS-13 or the determination of the inhibitor titer, since this results in various therapeutic options (eg rituximab or immune adsorption).
  • the procedure should also allow a differentiation between congenital and acquired TTP.
  • a timely and routine determination of the ADAMTS-13 activity is the prerequisite for the use of the potentially available, recombinant ADAMTS-13 (W0242441).
  • the method should not only allow prompt diagnosis and monitoring of the therapy of TTP patients, but also allow reliable quantification of ADAMTS-13 activity in any media. Since ADAMTS-13 is an important regulator for the VWF and therefore an important factor for hemostasis, the novel method should be applicable in various studies on the importance of ADAMTS-13-catalyzed proteolysis of the VWF in healthy people and patients with different diseases.
  • the ADAMTS-13-catalyzed proteolysis of the VWF can be detected by its ability to aggregate platelets.
  • the splitting of the VWF by ADAMTS-13 leads to a shortening of the VWF multimers.
  • the ability of the VWF to aggregate platelets is largely determined by the length of the multimers. The larger the VWF multimers, the higher their platelet binding capacity. This connection was used in the method according to the invention to determine the ADAMTS-13 activity.
  • the invention accordingly relates to a diagnostic method for determining the VWF-splitting activity of ADAMTS-13 in a test medium, the test medium being treated with 0.5 to 5 U / ml of an ADAMTS-13-free von Willebrand factor (VWF) and after incubation the ADAMTS-13 activity is determined by the decrease in the VWF-mediated aggregation of platelets.
  • Test medium in the sense of the invention are all body fluids such as B. blood plasma, blood serum, saliva and cerebrospinal fluid and other test media such as. B. cell culture supernatant or cell extracts.
  • the test medium is mixed with an ADAMTS-13-free VWF, which is referred to below as the VWF substrate.
  • a highly purified, plasmatic VWF which has the multimer pattern typical of normal plasma and is free of endogenous ADAMTS-13 activity is preferably used as the VWF substrate.
  • various other VWF substrates which do not have ADAMTS-13 activity such as e.g. B. recombined VWF, VWF from cell culture supernatant or plasmatic VWF, in which the ADAMTS-13 activity has been irreversibly inhibited.
  • FIG. 1A The typical multimer pattern of a highly purified, plasmatic VWF is shown in FIG. 1A in the first column.
  • the following 7 columns show the time-dependent loss of the high molecular weight VWF multimers by the ADAMTS-13-catalyzed proteolysis.
  • a sample was taken from a test batch after the incubation times (0.5-22 h) indicated in FIG. 1A and the reaction was stopped by adding EDTA.
  • the samples were subsequently separated by SDS agarose gel electrophoresis in accordance with customary standard methods and then displayed by subsequent immunoblotting.
  • a sample for determining the functional activity of the VWF was taken from the reaction mixture after the corresponding incubation times.
  • ristocetin cofactor activity The RCo activity was determined using the commercially available BC von Willebrand reagent from Dade Behring (Marburg, Germany). The RCo activity of the corresponding samples measured in this way is indicated under the columns of immunoblotting in FIG. 1A. It can be seen that the time-dependent ADAMTS-13-catalyzed loss of the high molecular weight VWF multimers leads to a significant loss of RCo activity from 357% at the start of the reaction to 13% after 22 hours of incubation. FIG. 1B again illustrates this time-dependent ADAMTS-13 catalyzed loss of RCo activity of the added VWF substrate in the reaction medium.
  • the procedure according to the invention is such that 0.5-5 U / ml, preferably 1-3 U / ml, of an ADAMTS-13-free von Willebrand factor (VWF) with the diluted test medium, e.g. B. Blood plasma added.
  • the test medium should be diluted so that the endogenous VWF is negligible, ie it does not trigger any detectable platelet aggregation.
  • ADAMTS-13-free VWF and the diluted test medium are then incubated for a sufficiently long time, preferably 0.1-24 hours, particularly preferably 6-15 hours. According to the studies available, it even appears possible to reduce the incubation time to 0.5-6 minutes, preferably 1 to 3 minutes.
  • This incubation is expediently carried out in a low-molar reaction buffer (eg 5-20 mmol / l TRIS-HCl, pH8) and preferably in the presence of divalent cations, eg. B. Ba 2+ or Ca 2+ , a serine protease inhibitor, e.g. B. PefaBlocSC, and urea.
  • divalent cations eg. B. Ba 2+ or Ca 2+
  • a serine protease inhibitor e.g. B. PefaBlocSC
  • urea urea.
  • the preferred concentration of divalent cations in the reaction medium is 5 to 15 mmol / l, particularly preferably 7-9 mmol / l.
  • the preferred concentration of Pefabloc in the reaction medium is 0.5 to 6.5 mmol / l, particularly preferably 0.75 mmol / l.
  • the preferred concentration of urea in the reaction medium is 0.5 to 3 mol / l, particularly preferably 1.5 mol / l.
  • the remaining ability of the VWF substrate to aggregate platelets is determined. This can be measured, for example, using the ristocetin cofactor activity (which describes the VWF-mediated aggregation of platelets in the presence of ristocetin), preferably using the commercially available BC von Willebrand reagent from Dade Behring (Marburg, Germany), and is preferably carried out automatically on one coagulation analyzer. For this purpose, a certain amount of platelets and ristocetin is added to the reaction medium.
  • the preferred concentration of platelets in the test mixture is 1,000,000 to 100,000 platelets / ⁇ l, particularly preferably 500,000 to 200,000 platelets / ⁇ l.
  • the preferred concentration of ristocetin in the test mixture is 0.5 to 3 mg / ml, particularly preferably 1 to 2 mg / ml.
  • the VWF substrate in the reaction medium causes in Presence of ristocetin an aggregation of platelets. The aggregation that takes place reduces the turbidity of the reaction mixture. The ability of the VWF substrate for thrombocyte aggregation can thus be quantified by measuring the optical density.
  • the ristocetin cofactor activity of the VWF substrate in the reaction medium determined in this way depends on the ADAMTS-13 activity in the test medium.
  • ADAMTS-13 activity in the test medium the more the VWF substrate added is broken down and loses its ability to aggregate platelets.
  • Human normal plasma is used for calibration, which is diluted with varying amounts of inactivated human normal plasma (the activity of ADAMTS-13 is inactivated). The inactivation can take place, for example, by means of heating. This relationship is shown in Figure 2.
  • the y-axis shows the ability of the corresponding sample to aggregate platelets in the presence of ristocetin, measured in a decrease in absorbance in 90 seconds (mU / 1.5 min).
  • Dilution of the normal plasma leads to a limited loss of ADAMTS-13 activity in the test sample, the 1:21 dilution being defined as 100%.
  • the content of ADAMTS-13 in the test medium determines the ristocetin cofactor activity of the substrate in the reaction medium.
  • the VWF's ristocetin cofactor activity is usually determined in plasma (DE 199 64 109 A 1) and is a common and quick test in any well-equipped routine
  • the successful application of the test in the method according to the invention is particularly surprising, since here the RCo activity of a VWF substrate is measured in a very non-physiological reaction medium with a low buffer concentration and in the presence of a serine protease inhibitor and urea to determine the RCo activity in a given plasma sample Plasma (or the corresponding test medium) diluted to such an extent that the endogenous VWF cannot trigger a detectable aggregation of the platelets, ie the endogenous RCo activity is ⁇ 2.
  • an exogenous ADAMTS-13-free VWF is added to the plasma thus diluted, which is degraded by the ADAMTS-13 activity in the diluted plasma sample.
  • the degradation of the exogenous VWF substrate is quantified by determining the RCo activity.
  • the method according to the invention can be described schematically as the action of the ADAMTS-13 present in the test medium on an ADAMTS-13-free VWF substrate and thus a change in the VWF activity (shortening of the VWF multimers).
  • Measuring the changed VWF activity by determining the VWF-mediated aggregation of platelets in the presence of ristocetin. Equating the extent of the reduction in VWF activity with the ADAMTS-13 activity of the test medium.
  • the ADAMTS-13-free VWF substrate can also be attached to a solid phase, e.g. B. a micro titer plate, or a microparticle, e.g. B. be associated via a specific binding partner.
  • a solid phase e.g. B. a micro titer plate, or a microparticle, e.g. B. be associated via a specific binding partner.
  • solid phase in the sense of this invention includes an object which consists of porous and / or non-porous, usually water-insoluble material and can have a wide variety of shapes, such as B. vessel, tube, microtitration plate, sphere, microparticles, rods, strips, filter or chromatography paper, etc.
  • the surface of the solid phase is hydrophilic or can be made hydrophilic.
  • the solid phase can consist of a wide variety of materials such as. B. from inorganic and / or from organic materials, from synthetic, from naturally occurring and / or from modified naturally occurring materials. Examples of solid phase materials are polymers such as. B.
  • cellulose nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinyl chloride, polyacrylamide, cross-linked dextran molecules, agarose, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polymethacrylate or nylon; ceramics; Glass; Metals, especially precious metals such as gold and silver; magnetite; Mixtures or combinations thereof; etc.
  • Cells, liposomes or phospholipid vesicles are also included in the term solid phase.
  • the solid phase may have a coating of one or more layers, e.g. B. from proteins, carbohydrates, lipophilic substances, biopolymers, organic polymers or mixtures thereof, for example to suppress or prevent the non-specific binding of sample components to the solid phase or to achieve improvements in terms of the suspension stability of particulate solid phases, the storage stability, for example shaping stability or resistance to UV light, microbes or other destructive agents.
  • layers e.g. B. from proteins, carbohydrates, lipophilic substances, biopolymers, organic polymers or mixtures thereof, for example to suppress or prevent the non-specific binding of sample components to the solid phase or to achieve improvements in terms of the suspension stability of particulate solid phases, the storage stability, for example shaping stability or resistance to UV light, microbes or other destructive agents.
  • microparticles is understood to mean particles which have an approximate diameter of at least 20 nm and not more than 20 ⁇ m, usually between 40 nm and 10 ⁇ m, preferably between 0.1 and 10 ⁇ m, particularly preferably between 0.1 and 5 ⁇ m, very particularly preferably between 0.15 and 2 ⁇ m.
  • the microparticles can be regular or irregular in shape. They can represent spheres, spheroids, spheres with more or less large cavities or pores.
  • the microparticles can consist of organic, inorganic material or a mixture or a combination of both. They can consist of a porous or non-porous, a swellable or non-swellable material.
  • the microparticles can have any density, but preference is given to particles with a density which approximates the density of the water, such as about 0.7 to about 1.5 g / ml.
  • the preferred microparticles can be suspended in aqueous solutions and are stable in suspension for as long as possible. They may be translucent, partially translucent, or opaque.
  • the microparticles can consist of several layers, such as the so-called "core-and-shell" particles with a core and one or more enveloping layers.
  • the term microparticles includes, for example, dye crystals, metal sols, silica particles, glass particles, magnetic particles, particles with chemiluminescent and / or fluorescent substances, polymer particles, oil drops, lipid particles, dextran and protein aggregates.
  • Preferred microparticles are particles which can be suspended in aqueous solutions and consist of water-insoluble polymer material, in particular of substituted polyethylenes.
  • Latex particles are very particularly preferred.
  • reactive groups on their surface such as carboxyl, amino or aldehyde groups, which form a covalent bond e.g. B. allow specific binding partners to the latex particles.
  • the production of latex particles is described for example in EP 0080614, EP 0227054 and EP 0246 446.
  • a microparticle may have a coating of one or more layers, e.g. B. from proteins, carbohydrates, biopolymers, organic polymers or mixtures thereof, for example to suppress or prevent the non-specific binding of sample components to the particle surface or to achieve, for example, improvements in the suspension stability of the microparticles, the shaping stability or resistance to UV light, microbes or other destructive agents. So this coating can in particular from protein layers or polymer layers such. B. cyclodextrins, dextrans, hydrogels, albumin or polyalbumin exist, which, for. B. covalently or adsorptively applied to the microparticles.
  • B. from proteins, carbohydrates, biopolymers, organic polymers or mixtures thereof, for example to suppress or prevent the non-specific binding of sample components to the particle surface or to achieve, for example, improvements in the suspension stability of the microparticles, the shaping stability or resistance to UV light, microbes or other destructive agents. So this coating can in particular from protein layers or polymer layers such. B. cycl
  • association encompasses, for example, a covalent and a non-covalent bond, a direct and an indirect bond, the adsorption on a surface and the inclusion in a depression or a cavity etc.
  • a covalent bond between two molecules when at least one atomic nucleus of the one molecule shares electrons with at least one atomic nucleus of the second molecule.
  • a non-covalent bond are surface adsorption, inclusion in cavities or the binding of two specific binding partners.
  • the object to be bound can also be bound indirectly to the solid phase via specific interaction with specific binding partners.
  • a “specific binding partner” means a member of a specific binding pair.
  • the members of a specific binding pair are two molecules, each of which has at least one structure that is complementary to a structure of the other molecule, the two molecules being able to bind via a binding of the complementary structures.
  • the term molecule also includes molecular complexes such as e.g. B. enzymes consisting of apo and coenzyme, proteins consisting of several subunits, lipoproteins consisting of protein and lipids etc.
  • Specific binding partners can occur naturally, but also z. B. substances produced by means of chemical synthesis, microbiological techniques and / or genetic engineering processes. To illustrate the term specific binding partner, but not to be understood as a limitation, e.g.
  • thyroxine-binding globulin thyroxine-binding globulin, steroid-binding proteins, antibodies, antigens, haptens, enzymes, lectins, nucleic acids, repressors, oligo- and polynucleotides, protein A, protein G, avidin, streptavidin, biotin, grain component C1q, nucleic acid-binding proteins, etc.
  • Specific binding pairs are, for example: antibody-antigen, antibody-hapten, operator-repressor, nuclease nucleotide, biotin-avidin, lectin-polysaccharide, steroid-steroid-binding protein, active substance-active substance receptor, hormone -Hormone receptor, enzyme substrate, IgG protein A, complementary oligo- or polynucleotides, etc.
  • this can also take place under the influence of shear forces.
  • B. be carried out in a flowing medium.
  • the invention further relates to a diagnostic kit containing an ADAMTS-13-free VWF substrate, platelets and optionally ristocetin.
  • the invention further relates to the use of a reagent for the detection of VWF activity for the detection of the activity of ADAMTS-13.
  • the method according to the invention was compared in detail with the immunoblotting method previously used.
  • the diagnostic method according to the invention was used to determine the ADAMTS-13 activity in 14 TTP patients during acute attacks, in the course of therapy and in remission, also in 80 healthy subjects and in 23 patients with thrombocytopenia and / or hemolysis and in 14 patients with the Antiphospholipid syndrome (APS) used.
  • APS Antiphospholipid syndrome
  • Citrate-added plasma samples were obtained from 14 patients in 22 acute TTP attacks before plasma exchange with freshly frozen plasma. The initial diagnosis was based on clinical symptoms (especially neurological logical disorders) and laboratory findings such as severe thrombocytopenia and the detection of microangiopathic, hemolytic anemia. Plasma samples in remission were also obtained from 11 patients. Blood could also be obtained from 10 patients during plasma exchange therapy. Plasma samples from 23 patients with acute thrombocytopenia and / or hemolysis, 14 patients with antiphospholipid syndrome and 80 healthy volunteers were also analyzed. Platelet-poor plasma was produced by centrifugation at 4 ° C. and 2500 g for 40 minutes. The supernatant was then stored at -20 ° C until use.
  • Plasma samples were diluted 1:21 with 5 mM Tris-HCL buffer, pH 8, the 12.5 mM barium chloride (BaCI 2 ) and 1 mM PefaBloc SC, an inhibitor of serum proteases (AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany) and then Incubated for 5 minutes at 37 ° C to activate the protease.
  • a cleaned VWF Concendre de Facteur Willebrand Humain Tres Haute Purite, LFB France
  • the concentrate which was free of detectable ADAMTS-13 activity, was reconstituted with aqua ad iniectabilia to a concentration of 100 U / ml, divided and stored at -20 ° C. until use.
  • the substrate was thawed, diluted 1:20 with 5 M urea in 5 mM Tris-HCl, pH 8, and incubated for 5 minutes at room temperature. Then 100 ⁇ l of the substrate solution were added to 210 ⁇ l of diluted plasma and left to act at 37 ° C. overnight. The residual ristocetin cofactor activity of the VWF substrate added in the reaction medium was then determined using the commercial, so-called BC von Willebrand reagent from Dade Behring (Marburg, Germany). The ADAMTS-13 activity of a plasma mixture obtained from 80 apparently healthy, adult persons in a dilution of 1:21 was defined as 100%.
  • Plasma samples were diluted 1: 5 with 5 mM Tris buffer, pH 8 including 12.5 mM BaCI 2 and 1 mM PefaBloc SC, and the activation and action of the protease were carried out in the same manner as described for the method according to the invention.
  • the reaction was stopped by adding disodium EDTA to a final concentration of 23.5 mM.
  • the multimer analysis was carried out by SDS electrophoresis on a 1.4% strength agarose (Seakem HGT from Biozym Diagnostics, Hess, Oldenburg, Germany) and an anti-VWF antibody conjugated with peroxidase (P0226 from Dako- Glostrup, Denmark).
  • Serial dilutions of normal plasma were tested for quantitative determination, as already described above.
  • the results of an exemplary test by the immunoblotting method are shown in FIG. 3.
  • various dilutions (1: 5 to 1: 160) of a normal human plasma were mixed with VWF substrate.
  • Columns 8-10 show plasma samples from Pa- served with TTP.
  • the ADAMTS-13 activity of the test samples is estimated from the calibration in columns 1-7.
  • the method according to the invention can also be used for the determination of the inhibitory activity against ADAMTS-13.
  • the determination of the inhibitory activity against ADAMTS-13 is of particular clinical importance for the distinction between congenital and acquired TTP. Furthermore, the detection of an inhibitor or the determination of the inhibitor titer is essential for the decision about alternative therapy options (e.g. rituximab or immune adsorption).
  • alternative therapy options e.g. rituximab or immune adsorption.
  • the ADAMTS-13 activity in the mixtures was determined using the method according to the invention or the previously usual immunoblotting method.
  • the ADAMTS- 13 activity of the test sample was divided by the activity of the researchareasmi- 'and multiplied by 100 to determine the residual activity of ADAMTS-13 activity.
  • samples with a residual activity of 25 to 75% were selected and the amount of the inhibitor as described for inhibitors of blood coagulation factor VIII was determined (8).
  • a sample that caused 50% inhibition of normal ADAMTS-13 activity contained 1 U / ml inhibitor by definition.

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Abstract

Es wird ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Aktivität von ADAMTS-13 in einem Testmedium beschrieben, wobei man das Testmedium mit 0,5 bis 5 U/ml eines ADAMTS-13-freien von WillebrandFaktors (VWF) versetzt und nach Inkubation die ADAMTS-13- Aktivität über den Abfall der VWF­vermittelten Aggregation von Thrombozyten feststellt.

Description

Verfahren zum Nachweis der von Willebrand-Faktor-spaltenden Protease- aktivität von ADAMTS-13
Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis der VWF-spaltenden ADAMTS- 13-Aktivität im Blutplasma und anderen Medien.
Die thrombotische, thrombozytopenische Purpura (TTP) ist eine Erkrankung, bei der die klassischen Symptome der Thrombozytopenie, der mikroangiopathi- schen, hämolytischen Anämie, neurologische Symptome, Nierenfunktionsstö- rungen und Fieber beobachtet werden. Ungewöhnlich große Multimere des von Willebrand-Faktors (VWF) werden im Plasma von TTP-Patienten gefunden und als Ursache für die Bildung von VWF- und Thrombozyten-reichen Thromben angesehen. Der von Willebrand-Faktor wird von Endothelzellen in Form großer Multimere freigesetzt, die im normalen Plasma durch das Zusammenwirken einer Reduktase und einer Metalloprotease gespalten werden.
Es ist außerdem bereits bekannt, dass ein Mangel an einer spezifischen Metalloprotease, die den VWF zwischen den Peptidbindungen Tyr842 und Met843 spaltet, bei Patienten mit angeborener und erworbener TTP beobachtet wird. Diese Metalloprotease wurde kürzlich als ein neues Mitglied der ADAMTS (a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs)-Familie identifiziert und als ADAMTS-13 bezeichnet (1-3).
Die VWF-spaltende Proteaseaktivität von ADAMTS-13 wird im folgenden ledig- lieh als ADAMTS-13-Aktivität bezeichnet. Die ADAMTS-13-Aktivität wird normalerweise durch Inkubation einer, mit Harnstoff oder Guanidiumhydrochlorid behandelten, VWF-Probe mit verdünntem Plasma bei niedriger lonenstärke gemessen. Der Nachweis der Proteolyse erfolgt durch eine Multimeranalyse mittels der SDS-Agarosegelelektrophorese oder durch Bruchstückanalyse mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließendem Immun-Blotting, also dem Nachweis der Proteine auf einer Cellulosemembran mittels der Anti- gen-Antikörper-Reaktion (4, 5). Der ADAMTS- 13-katalysierte Abbau des von Willebrand-Faktors kann auch durch die Messung der Kollagen- Bindungsaktivität des VWF (WO-A 00/50904) oder durch einen spezifischen, zweiseitigen ELISA-Nachweis (6) ermittelt werden. Kürzlich ist auch ein rekom- binanter, monomerer VWF, der am N-Terminus mit einem grünfluoreszierenden Protein markiert worden ist, zur Bestimmung der Proteolyse beschrieben wor- den (7).
Die herkömmlichen elektrophoretischen Verfahren sind nur in spezialisierten Forschungslabors ausführbar, da die Durchführung der Teste spezielle Laborausrüstung und die notwendige Expertise benötigt. Der Kollagenbindungstest (WO-A 00/50904) und der spezifische ELISA (6) zum Nachweis der proteolyti- schen Aktivität von ADAMTS-13 vereinfachen die ADAMTS-13-Aktivitätsbestim- mung, können jedoch ebenfalls nur in Labors durchgeführt werden, welche über die entsprechende Ausrüstung und das notwendige Know-how verfügen. Bei dem zweiseitigen ELISA werden zudem spezifische monoklonale Antikörper benötigt, welche nur wenigen Labors zur Verfügung stehen, da sie nicht kommerziell erhältlich sind. Es stellte sich daher die Aufgabe, ein einfaches Verfahren für die Bestimmung der ADAMTS- 13-Aktivität zu entwickeln. Dieses neuartige Verfahren sollte eine zuverlässige und zeitnahe Quantifizierung der ADAMTS-13-Aktivität im Blutplasma und anderen Körperflüssigkeiten (z. B. Blutserum, Speichel) und anderen Medien erlauben. Es sollte in jedem klinischem Routine-Gerinnungslabor anwendbar sein, ergo keine spezielle Laborausrüstung, besonderes technisches Know-how oder nicht kommerziell erhältliche Reagenzien benötigen. Das neuartige Verfahren sollte zudem eine möglichst weitreichende Automatisierung im Gerinnungsautomaten zulassen, um einen hohen Probendurchsatz mit niedrigem Arbeitskostenaufwand zu ermöglichen. Da sich inzwischen gezeigt hat, dass auch bei anderen Krankheiten als bei TTP geringe ADAMTS-13-Aktivitäten zu beobachten sind (8), sollte ein derartiges Verfahren die Differenzierung zwischen dem für die TTP charakteristischen schweren ADAMTS-13-Mangel und dem milden ADAMTS-13-Mangel ermöglichen. Eine frühzeitige Diagnose und damit eine schnelle Einleitung der Plasmapherese-Therapie determiniert im wesentlichen den klinischen Verlauf der oft lebensbedrohlichen TTP-Episode. Das neuartige Verfahren sollte aus diesem Grunde eine schnelle und möglichst flächendeckende Bestimmung der ADAMTS- 13-Aktivität ermöglichen. Die zeitnahe Bestimmung der ADAMTS-13- Aktivität ist auch aufgrund alternativer Therapieoptionen unerlässlich. Insbesondere sollte das Verfahren einen schnellen Nachweis eines Inhibitors gegen ADAMTS-13 bzw. die Bestimmung des Inhibitortiters ermöglichen, da sich dar- aus verschiedene Therapiemöglichkeiten (z. B. Rituximab oder Immunadsortpi- on) ergeben. Das Verfahren sollte insbesondere auch eine Differenzierung zwischen congenitaler und erworbener TTP erlauben. Eine zeitnahe und routinefähige Bestimmung der ADAMTS- 13-Aktivität ist darüber hinaus die Vorrauset- zung für den Einsatz der potentiell verfügbaren, rekombinanten ADAMTS-13 (W0242441). Das Verfahren sollte nicht nur eine zeitnahe Diagnose und Überwachung der Therapie von TTP-Patienten gestatten, sondern zudem eine zuverlässige Quantifizierung der ADAMTS-13-Aktivität in beliebigen Medien erlauben. Da ADAMTS-13 ein wichtiger Regulator für den VWF darstellt und damit einen bedeutender Faktor für die Hämostase darstellt, sollte das neuartige Verfahren in mannigfaltigen Studien zur Bedeutung der ADAMTS-13- katalysierten Proteolyse des VWF bei Gesunden und Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen anwendbar sein.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass sich die ADAMTS- 13-katalysierte Proteolyse des VWF durch dessen Fähigkeit zur Aggregation von Thrombozyten detektieren lässt. Die Spaltung des VWF durch ADAMTS-13 führt zu einer Verkürzung der VWF-Multimere. Die Fähigkeit des VWF zur Aggregation von Thrombozyten wird im wesentlichen von der Länge der Multimeren bestimmt. Je größer die VWF-Multimere sind, desto höher ist ihre Bindungskapazität für Thrombozyten. Dieser Zusammenhang wurde in dem erfindungsgemässen Verfahren ausgenutzt, um die ADAMTS-13-Aktivität zu bestimmen.
Die Erfindung betrifft dementsprechend ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Aktivität von ADAMTS-13 in einem Testmedi- um, wobei man das Testmedium mit 0,5 bis 5 U/ml eines ADAMTS-13-freien von Willebrand-Faktors (VWF) versetzt und nach Inkubation die ADAMTS-13- Aktivität über den Abfall der VWF-vermittelten Aggregation von Thrombozyten feststellt. Testmedium im Sinne der Erfindung sind alle Körperflüssigkeiten wie z. B. Blutplasma, Blutserum, Speichel und Liquor und andere Testmedien wie z. B. Zell- kulturüberstand oder Zellextrakte.
Das Testmedium wird mit einem ADAMTS-13-freien VWF versetzt, welcher im folgenden als VWF-Substrat bezeichnet wird. Als VWF-Substrat wird bevorzugt ein hochgereinigter, plasmatischer VWF verwendet, welcher das für Normalplasma typische Multimerenmuster aufweist und frei von endogener ADAMTS- 13-Aktivität ist. Es können allerdings auch verschiedene andere VWF-Substrate verwendet werden, welche keine ADAMTS- 13-Aktivität aufweisen wie z. B. re- kombinanter VWF, VWF aus Zellkulturüberstand oder plasmatischer VWF, bei welchem die ADAMTS-13-Aktivität irreversibel gehemmt worden ist.
Das typische Multimerenmuster eines hochgereinigten, plasmatischen VWF ist in Figur 1 A in der ersten Spalte dargestellt. Die nachfolgenden 7 Spalten zeigen den zeitabhängigen Verlust der hochmolekularen VWF-Multimere durch die ADAMTS-13-katalysierte Proteolyse. Dazu wurde einem Testansatz nach den in Figur 1 A angegebenen Inkubationszeiten (0.5 - 22 h) eine Probe entnommen und die Reaktion durch Zugabe von EDTA gestoppt. Nachfolgend wurden die Proben gemäß üblicher Standardmethoden durch SDS-Agarosegelelektro- phorese aufgetrennt und durch anschließendes Immun-Blotting dargestellt. Zudem wurden dem Reaktionsansatz nach den entsprechenden Inkubationszeiten eine Probe für die Bestimmung der funktionalen Aktivität des VWF entnommen. Dazu wurde die Fähigkeit des VWF zur Aggregation von Bluplättchen in Gegenwart von Ristocetin bestimmt, welche gemeinhin als Ristocetin-Kofaktor- Aktivität bezeichnet wird (RCo). Die Bestimmung der RCo-Aktivität erfolgte mit dem kommerziell erhältlichem sogenannten BC von Willebrand-Reagenz von Dade Behring (Marburg, Deutschland). Die so gemessene RCo-Aktivität der entsprechenden Proben ist unter den Spalten des Immun-Blottings in Figur 1 A angegeben. Es ist ersichtlich, dass der zeitabhängige ADAMTS-13-katalysierte Verlust der hochmolekularen VWF-Multimere zu einem deutlichen Verlust der RCo-Aktivität von 357 % am Anfang der Reaktion bis zu 13 % nach 22 Stunden Inkubationszeit führt. Die Figur 1 B illustriert nochmals diesen zeitabhängigen ADAMTS-13-katalysierten Verlust der RCo-Aktivität des zugegebenen VWF- Substrates in dem Reaktionsmedium.
Im allgemeinen geht man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so vor, dass man 0,5 - 5 U/ml, bevorzugt 1 - 3 U/ml, eines ADAMTS- 13-freien von Willebrand-Faktors (VWF) mit dem verdünnten Testmedium, z. B. Blutplasma versetzt. Das Testmedium sollte dabei so verdünnt sein, dass der endogene VWF vernachlässigbar ist, d. h. er löst keine detektierbare Aggregation von Thrombozyten aus. ADAMTS- 13-freier VWF und das verdünnte Testmedium werden dann ausreichend lange, vorzugsweise 0,1 - 24 Stunden, besonders bevorzugt 6 - 15 Stunden, inkubiert. Nach vorliegenden Untersuchungen erscheint es sogar möglich, die Inkubationszeit auf 0,5 - 6 Minuten, vorzugsweise 1 bis 3 Minuten, zu reduzieren. Diese Inkubation erfolgt zweckmäßigerweise in einem niedrig-molaren Reaktionspuffer (z. B. 5 - 20 mmol/l TRIS-HCI, pH8) und bevor- zugterweise in Gegenwart von zweiwertigen Kationen, z. B. Ba2+ oder Ca2+, eines Serinproteaseinhibitors, z. B. PefaBlocSC, und Harnstoff. Die bevorzugte Konzentration an zweiwertigen Kationen im Reaktionsmedium beträgt 5 bis 15 mmol/l, besonders bevorzugt 7 - 9 mmol/l. Die bevorzugte Konzentration an Pefabloc im Reaktionsmedium beträgt 0,5 bis 6,5 mmol/l, besonders bevorzugt 0,75 mmol/l. Die bevorzugte Konzentration von Harnstoff im Reaktionsmedium beträgt 0,5 bis 3 mol/l, besonders bevorzugt 1 ,5 mol/l. Nach der ausreichenden Inkubation wird die verbliebene Fähigkeit des VWF-Substrates zur Aggregation von Thrombozyten bestimmt. Diese kann beispielsweise anhand der Ristocetin- Kofaktoraktivität (welche die VWF vermittelte Aggregation der Thrombozyten in Gegenwart von Ristocetin beschreibt), vorzugsweise mit dem kommerziell erhältlichen BC von Willebrand-Reagenz von Dade Behring (Marburg, Deutschland), gemessen werden und erfolgt bevorzugt automatisiert an einem Gerinnungsautomaten. Dazu wird das Reaktionsmedium mit einer bestimmten Menge von Thrombozyten und Ristocetin versetzt. Die bevorzugte Konzentration von Butplättchen im Testansatz beträgt 1000000 bis 100000 Thrombozyten/μl, besonders bevorzugt 500000 bis 200000 Thrombozyten/μl. Die bevorzugte Konzentration von Ristocetin im Testansatz beträgt 0.5 bis 3 mg/ml, besonders bevorzugt 1 bis 2 mg/ml. Das VWF-Substrat im Reaktionsmedium verursacht in Gegenwart von Ristocetin eine Aggregation der Thrombozyten. Die ablaufende Aggregation vermindert die Trübung des Reaktionsansatzes. Durch Messung der optischen Dichte kann somit die Fähigkeit des VWF-Substrates zur Throm- bozytenaggregation quantifiziert wird. Die so bestimmte verbliebene Ristocetin- Kofaktor-Aktivität des VWF-Substrates im Reaktionsmedium ist abhängig von der ADAMTS- 13-Aktivität in dem Testmedium. Je mehr ADAMTS-13-Aktivität im Testmedium vorliegt, desto mehr wird das zugegebene VWF-Substrat abgebaut und verliert seine Fähigkeit zur Aggregation von Thrombozyten. Für eine Eichung wird humanes Normalplasma verwendet, welches mit variierenden Mengen inaktiviertem (die Aktivität von ADAMTS-13 ist inaktiviert) humanem Normalplasma verdünnt ist. Die Inaktivierung kann beispielsweise mittels Erhitzung erfolgen. Dieser Zusammenhang ist in Figur 2 dargestellt. Die x-Achse zeigt die verschiedenen Verdünnungen des humanen Normalplasmas (1:21- Verdünnung = 100%). Die y-Achse zeigt die Fähigkeit der entsprechenden Pro- be zur Aggregation von Thrombozyten in Gegenwart von Ristocetin, gemessen in Extinktionsabnahme in 90 Sekunden (mE/1,5 min). Die Verdünnung des Normalplasmas führt zu einem limitierten Verlust an ADAMTS- 13-Aktivität in der Testprobe, wobei die 1:21 -Verdünnung als 100 % definiert wurde. Unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens determiniert der Gehalt an ADAMTS-13 im Testmedium die Ristocetin-Kofaktor-Aktivität des Substrates im Reaktionsmedium. Der Zusammenhang zwischen ADAMTS-13-Aktivität im Testmedium und Ristocetin-Kofaktor-Aktivität im Reaktionsmedium kann durch eine Gleichung folgender Art beschrieben werden: y=A+(D-A)/(1+e (B*(C'X)), (berechnet mit Easy fit, version 5.14, Software von Tecan, Basel, Switzerland). Die Bestimmung der Ristocetin-Kofaktor-Aktivität des VWF erfolgt üblicherweise im Plasma (DE 199 64 109 A 1) und ist ein gängiger und schneller Test in jedem gut ausgestatteten Routine-Gerinnungslabor. Die erfolgreiche Anwendung des Testes im erfindungsgemäßen Verfahren ist insbesondere überraschend, da hier die RCo-Aktivität eines VWF-Substrates in einem sehr unphysioloigschen Reaktionsmedium mit niedriger Pufferkonzentration und in Gegenwart von einem Serinproteaseinhibitor und Harnstoff gemessen wird. Üblicherweise dient der RCo-Aktivitätstest zur Bestimmung der RCo-Aktivität in einer gegebenen Plasmaprobe. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird stattdessen das Plasma (bzw. das entsprechende Testmedium) soweit verdünnt, dass der endogene VWF keine detektierbare Aggregation der Thrombozyten auslösen kann, d. h. die endogene RCo-Aktivität < 2.5% ist. Dem so verdünnten Plasma wird unter den beschriebenen Bedingungen ein exogener ADAMTS- 13-freier VWF zugesetzt, welcher durch die ADAMTS-13-Aktivität in der verdünnten Plasmaprobe abgebaut wird. Der Abbau des exogenen VWF-Substrates wird mittels Bestimmung der RCo-Aktivität quantifiziert. Die neuartige Verwendung eines bekannten, weit verbreiteten und routinefähigen Testes in dem erfindungsgemäßen Verfahren erlaubt die Anwendung des Verfahrens in jedem gut ausgestatteten Routine-Gerinnungslabor.
Schematisiert kann das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben werden als Einwirkung der im Testmedium vorhandenen ADAMTS-13 auf ein ADAMTS-13-freies VWF-Substrat und damit Verändern der VWF- Aktivität (Verkürzen der VWF-Multimeren)
Messen der veränderten VWF-Aktivität durch Bestimmung der VWF- vermittelten Aggregation von Thrombozyten in Gegenwart von Ristocetin Gleichsetzen des Ausmaßes der Reduzierung der VWF-Aktivität mit der ADAMTS-13-Aktivität des Testmediums.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann aber auch umgekehrt werden:
Aggregation von Thrombozyten durch ADAMTS-13-freien VWF in Gegenwart oder Abwesenheit von Ristocetin - Inkubation mit Testmedium, welches ADAMTS- 13 enthält
Dadurch Verändern der VWF-Aktivität, welches zur Dissoziation der Thrombozytenaggregate führt
Gleichsetzen des Ausmaßes der Dissoziation mit der ADAMTS-13- Aktivität des Testmediums.
In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das ADAMTS- 13-freie VWF-Substrat auch an eine Festphase, z. B. eine Mikro- titerplatte, oder einen Mikropartikel, z. B. über einen spezifischen Bindungspartner, assoziiert sein.
Der Begriff "Festphase" im Sinne dieser Erfindung beinhaltet einen Gegen- stand, der aus porösem und/oder nicht porösem, in der Regel wasserunlöslichem Material besteht und die unterschiedlichsten Formen aufweisen kann wie z. B. Gefäß, Röhrchen, Mikrotitrationsplatte, Kugel, Mikropartikel, Stäbchen, Streifen, Filter- oder Chromatographiepapier etc. In der Regel ist die Oberfläche der Festphase hydrophil oder kann hydrophil gemacht werden. Die Festphase kann aus den unterschiedlichsten Materialien bestehen wie z. B. aus anorganischen und/oder aus organischen Materialien, aus synthetischen, aus natürlich vorkommenden und/oder aus modifizierten natürlich vorkommenden Materialien. Beispiele für Festphasenmaterialien sind Polymere wie z. B. Zellulose, Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, vernetzte Dex- tranmoleküle, Agarose, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polymethacrylat oder Nylon; Keramik; Glas; Metalle, insbesondere Edelmetalle wie Gold und Silber; Magnetit; Mischungen oder Kombinationen derselben; etc. Auch Zellen, Liposomen oder Phospholipidvesikel sind vom Begriff Festphase miterfasst.
Die Festphase kann einen Überzug aus einer oder mehreren Schicht/en aufweisen, z. B. aus Proteinen, Kohlehydraten, lipophilen Substanzen, Biopolymeren, organischen Polymeren oder Mischungen hiervon, um beispielsweise die unspezifische Bindung von Probenbestandteilen an die Festphase zu unterdrücken oder zu verhindern oder um beispielsweise Verbesserungen zu erreichen hinsichtlich der Suspensionsstabilität von partikulären Festphasen, der Lagerstabilität, der formgebenden Stabilität oder der Resistenz gegen UV-Licht, Mikroben oder sonstige zerstörend wirkender Agenzien.
Unter dem Begriff "Mikropartikel" sind im Sinne dieser Erfindung Teilchen zu verstehen, die einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 μm aufweisen, üblicherweise zwischen 40 nm und 10 μm, bevorzugt zwischen 0,1 und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 5 μm, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,15 und 2 μm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus anorganischem Material oder aus einer Mischung oder Kombination von beiden bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen oder nicht schwellfähigen Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel jegliche Dichte haben, bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte des Wassers nahekommt wie etwa 0,7 bis etwa 1 ,5 g/ml. Die bevorzugten Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise durchsichtig oder undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen wie beispielsweise die so genannten "core-and-shell"-Partikel mit einem Kern und einer oder mehreren umhüllenden Schicht/en. Der Begriff Mikropartikel umfasst beispielsweise Farb- stoffkristalle, Metallsolen, Silica-Partikel, Glaspartikel, Magnetpartikel, Partikel mit chemolumineszierenden und/oder fluoreszierenden Substanzen, Polymerteilchen, Öltropfen, Lipidpartikel, Dextran und Proteinaggregate. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbare und aus wasserunlöslichem Polymermaterial bestehende Partikel, insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind Latexpartikel z. B. aus Poly- styrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren, Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyridin, Vinylchlorid- Acrylat. Von besonderem Interesse sind Latexpartikel mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung z. B. von spezifischen Bindungspartnern an die La- texpartikel erlauben. Die Herstellung von Latexpartikeln ist beispielsweise in EP 0080614, EP 0227054 und EP 0246 446 beschrieben.
Ein Mikropartikel kann einen Überzug aus einer oder mehreren Schicht/en aufweisen, z. B. aus Proteinen, Kohlehydraten, Biopolymeren, organischen Poly- meren oder Mischungen hiervon, um beispielsweise die unspezifische Bindung von Probenbestandteilen an die Partikeloberfläche zu unterdrücken oder zu verhindern oder um beispielsweise Verbesserungen zu erreichen hinsichtlich der Suspensionsstabilität der Mikropartikel, der formgebenden Stabilität oder der Resistenz gegen UV-Licht, Mikroben oder sonstige zerstörend wirkende Agenzien. So kann dieser Überzug insbesondere aus Proteinschichten oder Polymerschichten wie z. B. Cyclodextrine, Dextrane, Hydrogele, Albumin oder Polyalbumine bestehen, die z. B. kovalent oder adsortiv auf die Mikropartikel aufgebracht wurden.
Der Begriff "assoziiert" umfasst beispielsweise eine kovalente und eine nicht- kovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung, die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluss in eine Vertiefung oder einen Hohlraum etc.. Üblicherweise spricht man von einer kovalenten Bindung zwischen zwei Molekülen, wenn wenigstens ein Atomkern des einen Moleküls Elektronen mit wenigstens einem Atomkern des zweiten Moleküls teilt. Beispiele für eine nicht- kovalente Bindung sind die Oberflächenadsorption, der Einschluss in Hohlräume oder die Bindung von zwei spezifischen Bindungspartnern. Neben einer direkten Bindung kann der zu bindende Gegenstand auch indirekt über spezifische Wechselwirkung mit spezifischen Bindungspartnern an die Festphase gebunden sein.
Unter einem "spezifischen Bindungspartner" ist ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars zu verstehen. Bei den Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaars handelt es sich um zwei Moleküle, die jeweils mindestens eine zu einer Struktur des anderen Moleküls komplementäre Struktur aufweisen, wobei die beiden Moleküle sich über eine Bindung der komplementären Strukturen zu binden vermögen. Der Begriff Molekül umfasst auch Molekülkomplexe wie z. B. Enzyme, die aus Apo- und Coenzym bestehen, Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, Lipoproteine, bestehend aus Protein und Lipiden etc.. Spezifische Bindungspartner können natürlich vorkommende, aber auch z. B. mittels chemischer Synthese, mikrobiologischer Techniken und/oder gentechnologischer Verfahren hergestellte Substanzen sein. Zur Illustration des Begriffs spezifischer Bindungspartner, aber nicht als Einschränkung zu verstehen, sind z. B. zu nennen: Thyroxinbindendes Globulin, steroidbindende Proteine, Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme, Lektine, Nukleinsäuren, Repressoren, Oli- go- und Polynukleotide, Protein A, Protein G, Avidin, Streptavidin, Biotin, Korn- plementkomponente C1q, nukleinsäurebindende Proteine, etc.. Spezifische Bindungspaare sind beispielsweise: Antikörper-Antigen, Antikörper-Hapten, Opera- tor-Repressor, Nuclease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Lektin-Polysaccharid, Steroid- steroidbindendes Protein, Wirkstoff-Wirkstoffrezeptor, Hormon-Hormonrezeptor, Enzym-Substrat, IgG-Protein A, komplementäre Oligo- oder Polynukleotide, etc..
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann dieses auch unter Einwirkung von Scherkräften z. B. in einem fließenden Medium durchgeführt wer- den.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Diagnose-Kit, enthaltend einen ADAMTS-13- freies VWF-Substrat, Thrombozyten und gegebenenfalls Ristocetin.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines Reagenzes zum Nachweis der VWF-Aktivität zum Nachweis der Aktivität von ADAMTS-13.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert:
Beispiele
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde ausführlich mit der bisher angewendeten Immun-Blotting-Methode verglichen. Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren wurde zur Ermittlung der ADAMTS- 13-Aktivität an 14 TTP-Patienten während akuter Anfälle, im Verlauf der Therapie und in Remission, außerdem an 80 gesunden Probanden sowie an 23 Patienten mit Thrombozytopenie und/oder Hämolyse und an 14 Patienten mit dem Antiphospholipidsyndrom (APS) eingesetzt.
1. Plasmaproben
Mit Zitrat versetzte Plasmaproben wurden von 14 Patienten bei 22 akuten TTP- Anfällen vor dem Plasmaaustausch mit frischgefrorenem Plasma gewonnen. Die anfängliche Diagnose basierte auf klinischen Symptomen (vor allem neuro- logischen Störungen) und Laborbefunden wie schwerer Thrombozytopenie und dem Nachweis einer mikroangiopathischen, hämolytischen Anämie. Von 11 Patienten wurden auch Plasmaproben in Remission gewonnen. Von 10 Pateinten konnte auch Blut während der Plasmaaustauschtherapie erhalten werden. Außerdem wurden Plasmaproben von 23 Patienten mit akuter Thrombozytopenie und/oder Hämolyse, 14 Patienten mit Antiphospholipid-Syndrom und 80 gesunden Probanden analysiert. Thrombozytenarmes Plasma wurde durch Zentrifugation über 40 Minuten bei 4 °C und 2500 g hergestellt. Der Überstand wurde anschließend bei -20 °C bis zum Gebrauch gelagert.
2. Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren
Plasmaproben wurden 1 :21 mit 5 mM Tris-HCL-Puffer, pH 8, der 12,5 mM Bari- umchlorid (BaCI2) und 1 mM PefaBloc SC, einem Inhibitor von Serumproteasen (AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany) verdünnt und dann 5 Minuten bei 37 °C zur Aktivierung der Protease inkubiert. Als Substrat wurde ein gereinigter VWF (Concendre de Facteur Willebrand Humain Tres Haute Purite, LFB France) eingesetzt. Das Konzentrat, welches frei von dedektierbarer ADAMTS-13- Aktivität war, wurde mit aqua ad iniectabilia auf eine Konzentration von 100 U/ml rekonstituiert, aufgeteilt und bei -20 °C bis zu Verwendung gelagert. Vor der Einwirkung der Protease wurde das Substrat aufgetaut, im Verhältnis 1 :20 mit 5 M Harnstoff in 5 mM Tris-HCL, pH 8, verdünnt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 100 μl der Substratlösung zu 210 μl ver- dünntem Plasma gegeben und über Nacht bei 37 °C einwirken gelassen. Danach wurde die restliche Ristocetin-Kofaktor-Aktivität des zugegebenen VWF- Sustrates im Reaktionsmedium mit dem kommerziellen, so genannten BC von Willebrand-Reagenz von Dade Behring (Marburg, Deutschland) ermittelt. Die ADAMTS-13-Aktivität einer von 80 offensichtlich gesunden, erwachsenen Per- sonen gewonnenen Plasmamischung in einer Verdünnung von 1:21 wurde als 100 % definiert. Zur Eichung wurden Reihenverdünnungen des Plasmapools von 1 :2 bis 1 :32 mit hitzebehandeltem Plasmapool hergestellt. Für die Hitzebehandlung wurde der Plasmapool 30 min bei 60 °C inkubiert und anschließend 5 min bei 13000 UPM (Biofuge A, Heraeus) zentrifugiert, um Proteinaggregate zu sedimentieren. Das so behandelte Plasma enthielt keine detektierbare ADAMTS- 13-Aktivität. Die verschiedenen Verdünnungen wiesen somit definierte, prozentuale Mengen an ADAMTS- 13-Aktivität auf. Die so gewonnene Eich- kurve ist in Figur 2 dargestellt. Auf der x-Achse sind die verschiedenen Verdünnungen des Normalplasmapools aufgetragen, die definitionsgemäß 200 bis 0 % ADAMTS-13-Aktivität aufweisen. Die y-Achse zeigt die Fähigkeit der entsprechenden Probe zur Aggregation von Thrombozyten in Gegenwart von Ristocetin, gemessen in Extinktionsabnahme während der Messzeit von 90 Sekunden (mE/1.5 min).
3. Bestimmung der ADAMTS-13-Akti vität durch die Immun-Blotting- Methode (Vergleichsbeispiel)
Zur Messung der AD AMTS- 13- Aktivität durch die Immun-Blotting-Methode wurde eine Variante der zuerst von Furlan et al. und Tsai (4, 5) beschriebenen Methode verwendet. Plasmaproben wurden im Verhältnis 1 :5 mit 5 mM Tris-Puffer, pH 8 einschließlich 12,5 mM BaCI2 und 1 mM PefaBloc SC verdünnt und die Aktivierung und Einwirkung der Protease in gleicher Weise durchgeführt, wie es für das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben ist. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Dinatrium-EDTA bis zu einer Endkonzentration von 23,5 mM gestoppt. Die Multimeranalyse wurde durch SDS-Elektrophorese auf einer 1 ,4%- igen Agarose (Seakem HGT von Biozym Diagnostics, Hess, Oldenburg, Deutschland) durchgeführt und zum Immun-Blotting wurde ein mit Peroxidase konjugierter Anti-VWF-Antikörper (P0226 von Dako-Glostrup, Dänemark) eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung wurden Reihenverdünnungen von normalem Plasma getestet, wie es bereits vorstehend beschrieben ist. Die Ergebnisse eines beispielhaften Testes nach der Immun-Blotting Methode sind in Figur 3 abgebildet. Für die Eichung wurde verschiedene Verdünnung (1 :5 bis 1:160) eines humanen Normalplasmas mit VWF-Substrat versetzt. Die Verdünnungen enthalten definitionsgemäß 100 bis 0 % ADAMTS-13-Aktivität (Spalten 1-7; 1:5 Verdünnung = 100%). Die Spalten 8-10 zeigen Plasmaproben von Pa- tienten mit TTP. Die ADAMTS- 13-Aktivität der Testproben wird anhand der Eichung in den Spalten 1-7 abgeschätzt.
4. Inhibitortest
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität gegen ADAMTS-13 verwendet werden. Die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität gegen ADAMTS-13 ist insbesondere für die Unterscheidung zwischen congenitaler und erworbener TTP von entscheidender klinischer Bedeutung. Des weiteren ist der Nachweis eines Inhibitors bzw. die Bestimmung des Inhibitortiters für die Entscheidung über alternative Therapieoptionen (z. B. Rituximab oder Immunadsortpion) unerlässlich. Zur Testung der inhibitorischen Aktivität gegen ADAMTS-13 wurden Plasmaproben, entweder rein oder verdünnt mit hitzbehandeltem Plasmapool, mit gleichen Anteilen Normalplas- mas gemischt. Zum Vergleich wurde das Normalplasma 1 :1 mit hitzebehandeltem Plasmapool gemischt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37 °C wurde in den Mischungen die ADAMTS- 13-Aktivität mit der erfindungsgemäßen Methode bzw. der bisher üblichen Immun-Blotting-Methode bestimmt. Die ADAMTS- 13-Aktivität der Testprobe wurde durch die Aktivität der Vergleichsmi- ' schung geteilt und mit 100 multipliziert, um die Restaktivität der ADAMTS-13- Aktivität zu ermitteln. Zur quantitativen Bestimmung wurden Proben mit einer Restaktivität von 25 bis 75 % ausgewählt und die Menge des Inhibitors, wie es für Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors VIII beschrieben ist, ermittelt (8). Eine Probe, die eine Inhibition der normalen ADAMTS- 13-Aktivität von 50 % verur- sacht, enthielt definitionsgemäß 1 U/ml Inhibitor.
5. Ergebnisse
Richtigkeit und Wiederholbarkeit des erfindunαsαemäßen Verfahrens
Die Richtigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde bewiesen, indem 282 Plasmaproben von Patienten und gesunden Personen sowohl nach der herkömmlichen Immun-Blotting-Methode als auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet wurden. Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt. Die Ergebnisse der Immun-Blotting-Methode sind dabei in folgende Kategorien eingeteilt: schwerer ADAMTS- 13-Mangel bei Aktivitäten von <12,5 % (Dreiecke), mittelschwerer ADAMTS- 13-Mangel mit Aktivitäten zwischen 12,5 bis 25 % (Rau- ten), leichter ADAMTS-13-Mangel mit Aktivitäten zwischen 25 bis 50 % (Kreise) und normale ADAMTS-13-Aktivität mit Aktivitäten > 50 % (Vierecke). Die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens für die entsprechenden Proben sind auf der y-Achse dargestellt. Für 71 von 72 Proben mit schwerem ADAMTS-13-Mangel wurden gleiche Ergebnisse anhand beider Methoden ge- funden. Für eine Probe von einem TTP-Patienten während der Plasmaphere- setherapie wurde in der Immun-Blotting-Methode eine Aktivität von 0 bis 12,5 % gemessen, während die gleiche Probe im erfindungsgemäßen Verfahren eine Aktivität von 18 % aufwies. Die 19 Proben mit mittelschwerem ADAMTS-13- Mangel gemäß der Immun-Blotting-Methode zeigten im erfindungsgemäßen Verfahren ADAMTS-13-Aktivitäten zwischen 9 und 39 %. Für die 64 Proben mit leichtem Proteasemangel gemäß der Immun-Blotting-Methode wurde mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Aktivitäten zwischen 20 und 60 % gemessen. Die 127 normalen Proben gemäß der Immun-Blotting-Methode zeigten im erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls normale Aktivitäten von >50 %. Zusam- menfassend belegen die in Figur 4 abgebildeten Ergebnisse die gute Übereinstimmung der neuen Methode mit der herkömmlichen Immun-Blotting- Methode und beweisen damit, dass das herkömmliche und sehr aufwändige Immun-Blotting erfindungsgemäß durch Messung der VWF-vermittelten Thrombozytenaggregation ersetzt werden kann. Die erfindungsgemäße Methode ist reproduzierbar wie sich durch die sehr geringen Fehlergrenzen innerhalb einer Testreihe und zwischen verschiedenen Testreihen zeigt.
Klinische Anwendung des erfindunqsαemäßen Verfahrens
Die klinische Anwendbarkeit der neuen Methode konnte durch die an 51 Patienten erzielten Messergebnisse gezeigt werden, wobei 22 Anfälle von akuter TTP sowie andere thrombotische, thrombozytopenische und/oder hämolytische Erkrankungen untersucht wurden. Ein schwerer Mangel an ADAMTS-13-Aktivität wurde nur bei Patienten mit akuter klassischer TTP beobachtet. Patienten mit niedrigen Inhibitorkonzentrationen reagierten auf den Plasmaaustausch mit einem Anstieg der ADAMTS- 13-Aktivität, während es bei Patienten mit hoher Inhibitorkonzentration nicht zu einem messbaren Anstieg der ADAMTS-13- Aktivität kam, obwohl die Plasmaaustausch-Therapie zur klinischen Remission führte. Der beispielhafte Verlauf der ADAMTS-13-Aktivität für eine Patientin mit niedriger Inhibitorkonzentration bei Aufnahme (0,7 U/ml) ist in Figur 5 dargestellt. Die Patientin wurde mit insgesamt 36 Plasmapheresitzungen innerhalb von 50 Tagen erfolgreich therapiert. Die Plasmatherapie führt nach einem Früh- rezidiv am Tag 14 zu einem konsistenten Anstieg der ADAMTS-13-Aktivität. Dieser Anstieg ist eng mit dem Anstieg der Thrombozyten assoziert, welche in Figur 5 durch die Kreise dargestellt sind. Die Figur verdeutlicht, dass der klinische Verlauf der TTP-Episode durch die, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmte, ADAMTS- 13-Aktivität wiedergespiegelt werden kann.
Die Beispiele zeigen, dass das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren die Messung der VWF-spaltenden Proteaseaktivität von ADAMTS-13 erlaubt. Der Vergleich der erfindungsgemäßen Methode mit dem bekannten Immun-Blotting- Verfahren zeigt die Richtigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das erfin- dungsgemäße Verfahren ist reproduzierbar und erfordert im Gegensatz zur herkömmlichen Immun-Blotting-Methode keine spezielle Laborausrüstung oder besonderes Know-how. Es wird vorzugsweise über Nacht durchgeführt, wobei die Inkubationszeit auch auf wenige Stunden oder Minuten verkürzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ist weniger zeitaufwändig als das Im- mun-Blotting.
Mit dem erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren kann in jedem normal ausgestatteten Gerinnungslabor eine schnelle und sichere Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität erfolgen. Dies erlaubt insbesondere eine schnelle Diag- nose der TTP und damit einen alsbaldigen Beginn der Therapie, was für eine erfolgreiche Behandlung einer akuten Episode wesentlich ist. Der frühzeitige Therapiebeginn erniedrigt die Anzahl der notwendigen Plasmaaustauschbehandlungen, was die Kosten der Therapie ganz erheblich erniedrigt. Literaturverzeichnis:
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* * * * *

Claims

Patentansprüche:
1. Diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Aktivität von ADAMTS-13 in einem Testmedium, wobei man das Testme- dium mit 0,5 bis 5 U/ml eines ADAMTS-13-freien von Willebrand Faktors (VWF) versetzt und nach Inkubation die ADAMTS- 13-Aktivität über den Abfall der VWF-vermittelten Aggregation von Thrombozyten feststellt.
2. Diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Aktivität von ADAMTS-13 in einem Testmedium, wobei man ADAMTS- 13-freien von Willebrand Faktor (VWF) mit Thrombozyten versetzt, wobei die Thrombozyten aggregieren und diese Mischung dann mit dem Testmedium versetzt und die ADAMTS- 13-Aktivität über die Dis- soziation der Thrombozytenaggregate bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in Gegenwart von Ristocetin durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Feststellung des Abfalls der
VWF-vermittelten Aggregation von Thrombozyten mit Hilfe einer Eichkurve vorgenommen wird, wobei für die Erstellung der Eichkurve humanes Normalplasma verwendet wird, welches mit variierenden Mengen inaktiviertem humanem Normalplasma verdünnt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Feststellung der Dissoziation der Thrombozyten mit Hilfe einer Eichkurve vorgenommen wird, wobei für die Erstellung der Eichkurve humanes Normalplasma verwendet wird, welches mit variierenden Mengen inaktiviertem humanem Normalplasma verdünnt ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Serinproteaseinhibitor verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass kein Serinproteaseinhibitor verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zweiwertige Kationen verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass keine zweiwertige Kationen verwendet werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der ADAMTS-13-freie VWF an eine Festphase gebunden ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die
Festphase eine partikuläre Festphase ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Testmedium Blutplasma ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Testmedium Blutserum ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekenn- zeichnet, dass das Testmedium Speichel ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Testmedium Liquor ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Testmedium Zellkulturüberstand ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Testmedium Zellextrakt ist.
18. Diagnose-Kit, enthaltend einen ADAMTS- 13-freien VWF und Throm- bozyten.
19. Diagnose-Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner Ristocetin enthält.
20. Verwendung eines VWF-Aktivitäts-Nachweis-Reagenzes zur Detek- tion der Protease ADAMTS-13.
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