JP2015213513A - フォンビルブランド因子のadamts13媒介インビボ切断を測定する方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年12月5日に出願された米国仮特許出願番号61/120,202の利益を主張し、上記米国仮特許出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
本発明は一般的に、切断されたフォンビルブランド因子(VWF)断片を測定する方法に関連する。より具体的には、本発明は、トロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13(ADAMTS13))の、インビボでVWFを切断する能力を測定する方法に関連する。本発明はまた、ヒトのものと同様のADAMTS13活性を示す様々な動物モデルの使用に関連する。
健康なヒトにおける循環フォンビルブランド因子(VWF)は、貯蔵プールからの放出に際し、約450,000から約2000万ダルトン(Da)の範囲、またはさらにより高い分子量の、一連の高分子量マルチマーから構成されている。VWFは、損傷血管に対する血小板の接着を補助する一次止血を媒介する。血小板凝集に必要であることに加えて、VWFは、循環第VIII因子(FVIII)の安定化に必要である。フォンビルブランド病(VWD)において、VWFのこれらの機能の少なくとも1つが抑制され、様々な重症度の臨床症状を生じる。
本発明は、ADAMTS13のインビボ活性を測定するための方法、および、続くその必要のある被験体への投与のために、インビボで新しい型の組換えフォンビルブランド因子(VWF)および組換えADAMTS13を評価する方法に関連する、当該分野における1つまたはそれ以上の必要性に取り組む。
そのVWF切断断片を、完全に分解したVWFの参照曲線または希釈したヒトもしくは動物血漿由来の参照曲線と比較する工程;および参照曲線に基づいてVWF切断断片を定量化する工程を含む、被験体におけるADAMTS13活性を測定する方法を含み、ここでVWF切断断片の量は、サンプル中のADAMTS13活性の量と相関する。1つの局面において、そのVWFは、まだADAMTS13によって切断されていない、インタクトな組換えVWF(rVWF)である。いくつかの局面において、そのずれ応力は、一定期間、約20℃から約40℃の温度で、約100s−1から約10,000s−1のすれ率を含む。他の局面において、そのすれ率は、約1,000s−1から約8,000s−1である。1つの局面において、そのすれ率は約6,000s−1である。様々な局面において、その温度は約30℃から約40℃である。1つの局面において、その温度は約37℃である。いくつかの局面において、その一定期間は、約30秒から約1時間の範囲である。他の局面において、その時間は約15分から約30分の範囲である。1つの局面において、その時間は約30分である。別の局面において、その時間は約15分である。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
異常なインビボトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)活性を決定するための方法であって、該方法は、テスト被験体由来の血液サンプルにおいて、フォンビルブランド因子(VWF)切断断片を測定する工程を包含し、ここで正常なADAMTS13活性を有することが公知であるコントロール被験体由来の血液サンプルにおけるVWF切断断片レベルと比較した、該テスト被験体の該血液サンプルにおけるVWF切断断片レベルの変化は、該テスト被験体における異常なインビボADAMTS13活性を示す、方法。
(項目2)
被験体由来の血液サンプルにおいてトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)活性を測定するための方法であって、該方法は:
(a)該血液サンプル中のフォンビルブランド因子(VWF)切断断片を測定する工程;(b)該VWF切断断片を完全に分解したVWFの参照曲線と比較する工程;および
(c)該参照曲線に基づいて該VWF切断断片を定量化する工程を包含し、ここでVWF切断断片の量は、ADAMTS13活性の量と相関する、方法。
(項目3)
被験体においてトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)活性または濃度を増加させる処置の有効性を試験するための方法であって、該方法は、該処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてフォンビルブランド因子(VWF)切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のVWF切断断片の増加は、該処置が、該被験体においてADAMTS13活性または濃度を増加させることにおいて有効であることを示す、方法。
(項目4)
被験体におけるフォンビルブランド病(VWD)の処置に使用されたVWFの有効性を試験するための方法であって、該方法は、処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてVWF切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のVWF切断断片の増加は、該被験体における内因性トロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)が該VWFを切断することを示し、そしてここで該処置後のVWF切断断片の減少または欠如は、該被験体における内因性ADAMTS13が該VWFを切断しないことを示す、方法。
(項目5)
被験体におけるトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)の欠損または機能不全に関連するフォンビルブランド病(VWD)の処置の有効性を試験するための方法であって、該方法は、該処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてフォンビルブランド因子(VWF)切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のVWF切断断片の増加は、該処置が該疾患の処置において有効であることを示す、方法。
(項目6)
前記処置が、前記被験体へのADAMTS13の投与である、項目3または5に記載の方法。
(項目7)
被験体における血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の処置の有効性を試験するための方法であって、該方法は、該処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてフォンビルブランド因子(VWF)切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のトリプレット構造の減少を伴うVWFの超大型マルチマー形態の量の減少は、該処置が該被験体におけるトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)活性または濃度の増加に有効であることを示す、方法。
(項目8)
前記VWF切断断片レベルを測定する工程が、VWF抗体によってウェスタンブロット分析を行ってVWF切断断片を可視化することを含む、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記ウェスタンブロット分析が、非還元条件下で行われる、項目8に記載の方法。
(項目10)
VWF断片を、マーカーに結合体化したVWF抗体を使用することによって可視化する、項目8に記載の方法。
(項目11)
前記マーカーが、アルカリホスファターゼ(ALP)または西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記マーカーを、増強化学発光(ECL)によって検出する、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記VWF抗体がモノクローナルまたはポリクローナルである、項目8に記載の方法。
(項目14)
VWFマルチマーを、高分解能水平SDS−アガロースゲル電気泳動、続くポリクローナルウサギ抗ヒトVWF抗体による免疫染色を用いることによって可視化する、項目7に記載の方法。
(項目15)
VWF切断断片を、約0.025AgU/mL VWFから約0.05AgU/mL VWFの感度レベルで検出する、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
被験体におけるトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)活性を評価する方法であって、該方法は、該被験体の血液サンプルの全VWFおよびVWF切断断片レベルを、徐々に分解したVWF〜完全に分解したVWFの参照曲線と比較する工程を包含する、方法。
(項目17)
前記血液サンプルが血漿または血清である、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記血液サンプルが血漿である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記被験体が、哺乳動物である、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記哺乳動物被験体が、ヒト、ウサギ、サル、イヌ、ラット、マウス、またはブタである、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記被験体が、ヒト、ウサギ、サル、またはイヌである、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記被験体が、ヒトである、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記テスト被験体の前記血液サンプルにおけるVWF切断断片レベルが、コントロール被験体由来の血液サンプルにおけるVWF切断断片レベルと比較して増加する、項目1に記載の方法。
(項目24)
前記テスト被験体の前記血液サンプルにおけるVWF切断断片レベルが、コントロール被験体由来の血液サンプルにおけるVWF切断断片レベルと比較して減少する、項目1に記載の方法。
(項目25)
VWF切断断片レベルの変化を、140kDaのVWF断片または176kDaのVWF断片のうちの1つまたはそれより多くのレベルを測定することによって検出する、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記VWF断片が、176kDaのVWF断片である、項目25に記載の方法。
(項目27)
被験体におけるトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー13(ADAMTS13)活性を測定するための方法であって、該方法は:
(a)該被験体由来の血液サンプルにフォンビルブランド因子(VWF)を加える工程;(b)ずれ応力の存在下および非存在下に該サンプルを曝露した後に、該血液サンプル中のVWF切断断片を測定する工程;
(c)該VWF切断断片を、完全に分解したVWFの参照曲線または希釈したヒトもしくは動物血漿由来の参照曲線と比較する工程;ならびに
(d)該参照曲線に基づいて該VWF切断断片を定量化する工程、
を包含し、ここでVWF切断断片の量は、ADAMTS13活性の量と相関する、方法。
(項目28)
前記ずれ応力が、一定期間、約20℃から約40℃の温度で、約100s−1から約10,000s−1のすれ率を含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記すれ率が、約1,000s−1から約8,000s−1である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記すれ率が約6,000s−1である、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記温度が、約30℃から約40℃である、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記温度が約37℃である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記一定期間が、約30秒から約1時間の範囲である、項目28に記載の方法。
(項目34)
前記時間が、約15分から約30分の範囲である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記時間が約30分である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記時間が約15分である、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記血液サンプルが血漿または血清である、項目27〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記血液サンプルが血漿である、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記被験体が、哺乳動物である、項目27〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記哺乳動物被験体が、ヒト、ウサギ、サル、イヌ、ラット、マウス、またはブタである、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記被験体が、ヒト、ウサギ、サル、またはイヌである、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記被験体が、ヒトである、項目41に記載の方法。
本発明は、ADAMTS13によるVWFまたはrVWFのインビボ切断を測定することによって、ADAMTS13活性を測定する方法を提供する。本発明はまた、VWFが正常にプロセシングされたかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、フォンビルブランド病(VWD)の処置、および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)および他の異常なレベルのADAMTS13に関連する障害の処置における、新規治療の有効性を試験するための改善された方法に関する、当該分野におけるニーズに取り組む。
DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編、1988);THE GLOSSARY OF GENETICS、第5版、R.Riegerら(編)、Springer Verlag(1991);およびHaleおよびMarham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。
本発明のさらなる局面および詳細が、制限ではなく説明であることが意図される、以下の実施例から明らかである。実施例1は、ヒトrVWFのADAMTS13切断に対する感度は、種間で異なることを示す。実施例2は、血漿中のADAMTS13由来の切断産物の定量化および検出を示す。実施例3は、ヒト組換えVWFで処置した被験体由来の血漿における、VWF切断断片の検出を記載する。実施例4は、ずれ応力下でのADAMTS13媒介VWFタンパク質分解後のVWF切断断片の検出を記載する。実施例5は、血漿中における内因性VWFに対する組換えADAMTS13の影響の検出を記載する。
上記の本明細書中で述べたように、VWFマルチマーサイズおよび従ってVWF活性は、血液中のADAMTS13活性によって調節される。その研究の目的は、異なる動物種の血漿中に存在するADAMTS13による切断に対するヒトrVWFの感度を決定することであった。異なる種のADAMTS13の、ヒトrVWFを切断する能力を、インビトロおよびインビボで試験した。
ヒトADAMTS13による切断後の、rVWFのマルチマー構造の変化を、図1に示す。正常ヒト血漿(NHP)におけるVWFマルチマーは、ADAMTS13切断の結果としてサテライトバンドを示す(図1Aを参照のこと)。組換えVWFは、いかなるサテライト構造も有さずに高MWのマルチマーを含む(図1Bを参照のこと)。変性条件下でのrVWFのADAMTS13とのインキュベーションは、より小さいマルチマーおよびサテライトバンドの出現と共に、マルチマー数の減少を引き起こす。
rVWFのADAMTS13依存性の切断を、残存VWFコラーゲン結合(VWF:CBA)活性によって検出した(図3を参照のこと)。FRETSおよびVWF:CBAによって測定されるADAMTS13活性も、図4に示す。ADAMTS13活性を、NHPのパーセンテージとして表す。ウサギ血漿におけるADAMTS13の酵素活性は、ヒト血漿と同じくらい高かった(CBAおよびFRETSによって測定)。カニクイザルおよびアカゲザル、ブタ、およびイヌのサンプルにおいては、より低いADAMTS13活性が観察された。しかし、FRETSは、CBAより高いADAMTS13活性を示した。VWF欠損マウス、ADAMTS13欠損マウス、ラット、およびモルモット由来の血漿サンプルにおいては、ADAMTS13活性はほとんど、または全く検出されなかった。
ウサギにおけるADAMTS13によるrVWF(1200IU VWF:RCo/kg)の特異的インビボ切断(140kDaおよび176kDa断片)を、還元SDS−PAGEの後、イムノブロッティングによってモノクローナル抗体で検出した(図8AおよびBを参照のこと)。コントロールとして、未切断rVWFおよびインビトロでrADAMTS13によって切断されたrVWFを示す。rVWF投与の直後にマルチマーパターンの特徴的な変化も見られる(図8Cを参照のこと)。
その研究の目的は、臨床試験中に、rVWFによる処置後、III型VWD被験体の血漿サンプルにおいて、VWFのADAMTS13媒介切断(すなわちVWF断片)を検出し得るかどうかを決定するためのアッセイを開発することであった。
臨床第I相試験の過程において、III型VWD被験体を、7.5IUVWF:RCo/kg体重のrVWFで処置した。処置の前および96時間までの処置後の様々な時点において血液サンプルを採取し、そしてADAMTS13依存性VWF切断断片の存在に関してアッセイした。
VWFのずれ応力誘導タンパク質分解切断を、60mmのコーン(0.5°の角度)を用いて、500μLの全容積で、コーンプレート型粘度計(HAAKE Rheo Stress1、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA)において行った。その実験デザインは、Shimら(Blood 111:651−657、2008)による刊行物に基づいていた。rVWF(1IU/mLの最終濃度)を、50mMのHEPES、150mMのNaCl、0.1μMのZnCl2、および5mMのCaCl2、pH=7.4を含む反応緩衝液において、rADAMTS13、血漿由来ADAMTS13(pADAMTS13)、または正常ヒト血漿(0.2U/mLの最終濃度)と混合した。サンプルを6000s−1のすれ率に37℃で15分間供することによって反応を開始し、そしてEDTA(5mMの最終濃度)の添加によって停止した。ネガティブコントロールとして、同一のサンプルを、ずれ応力の非存在下で、同様にインキュベートした。ポジティブコントロールとして、rVWFを、変性条件下(1.5Mの尿素)で24時間、rADAMTS13とインキュベートした。
この研究の目的は、ヒトおよび異なる動物サンプルにおいて、内因性VWFに対する注射された組換えADAMTS13(rADAMTS13)の効果を検出するために、血漿中のADAMTS13切断産物を検出する方法をさらに開発することである。これは、rADAMTS13の前臨床試験のために最も適したモデルを選択する方法を生じる。上記の本明細書中で述べたような方法を使用して、rVWFおよびヒト血漿を含む様々な動物種の血漿中の内因性VWFの切断に対するrADAMTS13の効果を試験する。
Claims (1)
- 明細書に記載された発明。
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US61/120,202 | 2008-12-05 |
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