WO2006085441A1 - Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 - Google Patents

Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 Download PDF

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antibody
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Seiji Kato
Hisahide Hiura
Yoshihiro Fujimura
Masanori Matsumoto
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Japan Clinical Laboratories, Inc.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Definitions

  • a von Willebrand factor hereinafter also referred to as “VWF” or a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is provided with a VWF cleavage enzyme (hereinafter also referred to as “ADAMTS13”). It has specific reactivity (binding) to the antigen-determining site generated when it is allowed to act, ADAMTS 13 acts, and it does not have significant specific reactivity with the VWF or the peptide
  • the present invention relates to antibodies, particularly monoclonal antibodies, and methods for producing them, and their uses.
  • Thrombotic thrombocytopenic purpura is a syndrome characterized by thrombocytopenia, hemolytic anemia, swaying neuropsychiatric disorder and the like. In the past, approximately 80% of patients had a poor prognosis that died within 3 months. Today, plasma replacement has greatly improved prognosis.
  • ADAMTS13 VWF-cleaving enzyme
  • ADAMTS 13 is a zinc-type meta-oral protease that specifically cleaves the Tyr842-Met843 bond of the VWF subunit.
  • This enzyme activity is measured by VWF multimer analysis in which VWF fragments generated using VWF as a substrate are detected by electrophoresis.
  • This method has the advantage that ADMATS13 activity can be accurately measured. Therefore, the development of a particularly simple measurement method has been desired.
  • Non-patent documents 6 to 8 report a method for measuring ADAMTS13 activity using the A2 domain of VWF, which is a substrate of ADAMTS 13, or a part thereof. These are substrates expressed in E. coli by genetic recombination that is not natural. In the above measurement method, these substrates are decomposed by ADAMTS13 in the plasma sample, and the molecular weight of the substrate molecule is determined by electrophoresis Western plot, and the undegraded residue after the reaction between the substrate and the enzyme. ADAMTS13 activity is detected and measured by immunological measurement of the substrate. However, in these methods, the activity of ADAMTS 13 and the signal intensity obtained are inversely related and the so-called calibration curve has a negative slope. Reproducibility could not be obtained and it became a problem.
  • Non-patent Document 9 a method for measuring plasma ADAMTS13 activity using a quenching fluorescent substrate has been reported (Non-patent Document 9). This method has a calibration curve showing a positive slope in which the fluorescence intensity increases with increasing ADAMTS13 activity.
  • Non-patent Document 9 there is a problem in using it in a general clinical laboratory because it has to be rate-assessed using a fluorometer with a specially synthesized chemically expensive substrate.
  • Non-Patent Document 1 New Engl. J. Med. 339, 1578-1584, 1998
  • Non-Patent Document 2 New Engl. J. Med. 339, 1585-1594, 1988
  • Non-Patent Document 3 J. Hematol. 74, 101-108, 2001
  • Non-Patent Document 4 J Biochem. 130, 475-480, 2001
  • Non-Patent Document 5 J. Biol. Chem. 276, 41059-41063, 2001
  • Non-Patent Document 6 Blood, 103, 607-612, 2004
  • Non-Patent Document 7 J. Thromb. Haemost. 2, 485-491, 2004
  • Non-Patent Document 8 Thromb Haemost. 91, 806-811, 2004
  • Non-Patent Document 9 Journal of the Japan Thrombosis and Hemostasis, 15, 421, 2004
  • the present invention has the following constitutional power.
  • VWF von Willebrand factor
  • the antigen determination site generated when ADAM TS13 is allowed to act on VWF or a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is generated when the VWF or the peptide is cleaved by ADAMTS13. 2.
  • the antigen-determining site is present in the N-terminal peptide fragment or C-terminal peptide fragment newly generated at the cleavage site where VWF or the peptide was cleaved by ADAMTS 13; The antibody according to item 2.
  • Reactivity against the peptide described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing At least three times greater than the reactivity against the peptide containing the sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing Or the antibody of claim 1.
  • Reactivity against the peptide described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is at least 5 times greater than the reactivity against the peptide described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, according to any one of items 1 to 8 above The antibody described.
  • Reactivity against the peptide of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is at least 5 times greater than the reactivity against VWF purified from human plasma, as described in paragraphs 1 to 3 and 12 to 14 above.
  • Reactivity against the peptide of SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing At least 3 times greater than the reactivity to the peptide of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, the preceding paragraphs 1 to 3 and 12 to 12 16.
  • the reactivity in the peptide of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is at least 5 times greater than the reactivity to the peptide in SEQ ID NOs: 8 and 11 in the sequence listing;
  • the antibody according to any one of items 1 to 11 above which is a monoclonal antibody produced by a hyperidoma whose deposit number is FERM BP-10480 or FERM BP-10479.
  • a method for measuring ADAMTS 13 activity in a sample comprising the step of reacting at least one antibody according to any one of the above.
  • a step of reacting VWF with a specimen to be assayed for ADAMTS 13 activity, and a reaction product of the step comprising at least one of the items described in any one of paragraphs 1 to 21 above A method for measuring ADAMTS 13 activity in a sample, comprising a step of reacting an antibody.
  • the antibody of the present invention is an antibody that specifically recognizes an antigenic determinant site generated when ADAMTS 13 is allowed to act on VWF or a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the antibody does not have a significant specific reactivity with the VWF or the peptide, in which ADAMTS 13 does not act.
  • it is possible to measure and assay ADAMTS13 enzyme activity. That is, by using the antibody of the present invention, (1) rapid and simple measurement of ADAMTS13 activity by sandwich immunoassay, and (2) rapid and simple measurement of ADAMTS13 activity by particle-labeled immunoassay are possible. Therefore, the present invention is of great significance in (3) the development of therapeutic agents, diagnostic agents, etc. based on these results.
  • the antibody of the present invention is stably produced by monocloned fused cells, and thus has high industrial utility value.
  • FIG. 1 is a diagram showing a calibration curve of ADAMTS13 activity measurement using the monoclonal antibody of the present invention as a secondary antibody and the measurement results of USS examples. (Examples 7 and 8)
  • FIG. 2 is a diagram showing a calibration curve for measuring ADAMTS13 activity using the monoclonal antibody of the present invention as a solid phase. (Example 9)
  • the antibody refers to any of a monoclonal antibody and a polyclonal antibody.
  • a monoclonal antibody is an antibody produced from a monocloned fused cell prepared by a known method.
  • the antibody of the present invention includes whole antibody molecules or partial fractions of antibody molecules having antibody activity.
  • the antigen used as an immunogen for producing the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it can solve the problems of the present invention, but a peptide is preferably used. Includes those bound to a carrier protein.
  • the “peptide” refers to a peptide in which two or more amino acids are bound by a peptide bond.
  • ADAMTS13 is a zinc-type meta-oral protease that specifically cleaves the bond corresponding to the bond between the 1065th tyrosin (Tyrl605) and the 1606th methionine (Metl606) of the VWF molecule.
  • Tyrl605 the 1065th tyrosin
  • Metal606 the 1606th methionine
  • a new C-terminal and N-terminal are generated on the amino acid sequence.
  • new antigenic determinants can occur. If an antibody that recognizes the antigen-determining site is prepared, an antibody that can specifically bind to the cleaved VWF is expected.
  • the antibody in the present invention is not particularly limited as long as it has specific reactivity at an antigen determination site generated in either a newly generated N-terminal peptide or C-terminal peptide.
  • ADAMTS13 is reported to specifically cleave the binding of Tyrl605-Metl606 using peptides from the 1459th Asp to the 1668th Arg of the VWF molecule as substrates.
  • VWF73 a peptide consisting of 73 amino acids from the 1596th Asp to the 1668th Arg
  • N-10 peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • VWF von Willebrand factor
  • ADAMTS13 a peptide containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing by using the N-10 peptide as an immunogen. It has a specific reactivity to the antigen-determining site that occurs in the blood and is affected by ADAMTS 13! / ⁇ ⁇ Significantly different from VWF or the peptide
  • the antibody of the present invention having no specific reactivity could be obtained.
  • VAM that is not affected by ADAMTS 13 and is not cleaved or includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is also referred to as “complete VWF molecule”.
  • a peptide including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence table has an amino acid strength of 73 to 2050, preferably 73 to 210, as long as it can undergo hydrolysis of ADAMTS13.
  • Preferred is a peptide (73 amino acids) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • the antibody of the present invention obtained by force is an antibody that recognizes an antigenic determinant site generated when ADAMTS 13 is allowed to act on VWF or a peptide containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. And a complete VWF molecule with no significant reactivity.
  • An example of a strong antigen determination site is an antigen determination site that can be formed into an N-terminal peptide fragment (peptide of SEQ ID NO: 2) generated when the peptide of SEQ ID NO: 1 is hydrolyzed by ADAMTS.
  • the N-terminal antigen-determining site requires the presence of tyrosine (Tyr) at the C-terminus.
  • the peptide having one less N-terminal amino acid in SEQ ID NO: 2 has antigenicity, and the peptide having two fewer amino acids has no antigenicity. Therefore, the N-terminal antigen-determining site has at least 9 antigen-determining sites. It is presumed to be a bent structure with amino acid power.
  • not having significant reactivity means that there is no significant binding to a complete VWF molecule, and therefore, when analyzed by a known immunochemical technique such as Western plot or ELISA, A signal that is only comparable to a signal in the background (a signal without an antibody or a signal obtained with an antibody unrelated to the analyte).
  • the antibody of the present invention is prepared by (a) reacting each of the antibody with VWF purified from human plasma and the peptide described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing in which the antibody is immobilized on a microplate well.
  • the property that the reactivity to the peptide shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence table is at least 5 times greater than the reactivity to VWF purified from human plasma (b) the sequence sequence sequence in which the antibody is immobilized on a microplate well When reacted with the peptide of No. 2 and the peptide containing the sequence of SEQ ID No. 1 in the sequence listing, the reactivity to the peptide of SEQ ID No. 2 of the sequence listing is shown in SEQ ID No.
  • the antibody of the present invention can be obtained by (d) reacting the antibody with the peptide shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing immobilized on a microplate well and VWF purified from human plasma, respectively.
  • the property that the reactivity to the peptide shown in SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing is at least 5 times greater than the reactivity to VWF purified from human plasma (e) the Sequence Listing in which the antibody is immobilized on a microplate well Reacting with the peptide shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing and the peptide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, respectively, the reactivity against the peptide listed in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is shown in A property that is at least 3 times greater than the reactivity with respect to the peptide; (£) arrangement of the peptide and the sequence listing in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing in which the antibody is immobilized on a microplate well; When reacted with the peptid
  • the reactivity with respect to the peptide with SEQ ID No. 10 in the sequence listing is at least 5 times the reactivity with respect to the peptides with SEQ ID No. 8 and 11 in the sequence listing. It is preferable to have at least one of the characteristics of large heels and heels. These properties (a) to (l) can be confirmed using the methods of Examples 5 to 8 described later.
  • the monoclonal antibody is prepared by a method commonly practiced in the art. That is, antibody-producing cells having specific affinity for an antigen (for example, N-10 peptide) are fused with myeloma cells to form a hyperidoma, and the hybridoma is cloned and specific for each protein. Produced by selecting clones that produce antibodies.
  • an antigen for example, N-10 peptide
  • an antigen for example, the ability to use the entire N-10 peptide As long as it contains at least tyrosine (Tyr) at the C-terminus and retains antigenicity, the N-10 peptide contains 1 to several amino acids. Changes such as deletion, substitution, or addition may be made.
  • the antigen determining site is considered to have at least 4 amino acids, preferably 9 amino acids.
  • a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is used as the antigen.
  • the amino acid sequence of the antigen peptide includes one or several amino acid deletions, substitutions, or additions. It ’s okay to make a change!
  • the antigen can be prepared based on a selected partial amino acid sequence and / or synthesized or genetic engineering techniques.
  • the peptide antigen obtained can be directly dissolved or suspended in an appropriate buffer such as phosphate buffer (PBS) as a sensitizing antigen.
  • PBS phosphate buffer
  • it is preferably used after being crosslinked with an appropriate carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • the antigen solution may be prepared usually at a concentration of about 50 to 500 gZml as the amount of the antigen substance.
  • animals to be immunized with the antigen include mice, rats, horses, goats, and rabbits. Preferred are mice, more preferred are BALBZc mice.
  • the antigen solution can be mixed with an adjuvant and administered.
  • Adjuvants used in the present invention include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), Ribi (MPL), Ribi (TDM), Ribi (MPL + TDM), pertussis vaccine (Bordetella pertussisvaccine), Muramiruj Peptide (MDP), aluminum adjuvant (ALUM), and the power of which these combinations are exemplified Combinations that use FCA for the first immunization and FIA for the booster are particularly preferred.
  • the injection site, schedule, and the like can be appropriately changed depending on the type of antigen used and the presence or absence of adjuvant mixing.
  • adjuvant mixed antigen solution 0.05-: Lml (antigen substance 10-200 / ⁇ ) is injected intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly or (tail) intravenously, Perform booster immunization 1 to 4 times about every 4 to 14 days after immunization, and further about 1 to 4 weeks later.
  • the antigen amount may be increased and injected intraperitoneally.
  • the antibody titer is examined by collecting blood approximately 5-6 days after the boost. The antibody titer can be measured by a method commonly used in this field according to the antibody assay described below. About 3 to 5 days after the final immunization, the immunized animal splenocytes are separated to obtain antibody-producing cells.
  • myeloma cells those derived from mice, rats, humans and the like are used.
  • mouse Examples include Eroma P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-Ul, P3NS1-Ag4, SP2Z0-Agl4, P3X63-Ag8, 653.
  • Myeloma cells can be maintained by passage in conventional media supplemented with cryopreservation power, horse, rabbit, or fetal bovine serum.
  • cells in the logarithmic growth phase are preferably used.
  • Examples of methods for fusing antibody-producing cells and myeloma cells to form ibridomas include methods using polyethylene glycol (PEG), methods using Sendai virus, and methods using an electrofusion device. Is done.
  • PEG polyethylene glycol
  • splenocytes and myeloma cells are placed in an appropriate medium or buffer containing about 30 to 60% PEG (average molecular weight 1000 to 6000) 1 to LO: 1, preferably 5 to The suspension may be suspended at a mixing ratio of LO: 1 and allowed to react for about 30 seconds to 3 minutes under conditions of a temperature of about 25 to 37 ° C and a pH of 6 to 8. After the reaction is complete, remove the PEG solution, resuspend it in the medium, and inoculate it into a cellwell plate to continue the culture.
  • PEG polyethylene glycol
  • the cells after the fusion operation are cultured in a selective medium to select a hyperidoma.
  • the selection medium is a medium in which the parent cell line can be killed and only the fused cells can grow.
  • hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used.
  • HAT hypoxanthine-aminopterin-thymidine
  • the selection of hybridomas is started by exchanging a part of the medium, preferably about half of the medium, with the selective medium 1 to 7 days after the fusion operation, and the same medium exchange every 2 or 3 days. Repeat this step to incubate. The wells where colonies are growing are confirmed by microscopic observation.
  • N-15 peptide the peptide of SEQ ID NO: 8 of the sequence listing (hereinafter also referred to as “N-15 peptide”) immobilized on the solid phase and measured in the same manner. Compare the signal of the N-10 peptide with the signal of the N-15 peptide and select the one with the former signal at least 10 times greater than the latter signal. Isolate single clones by Sarakuko, limiting dilution method, soft agar method, method using fluorescence excitation cell sorter.
  • clones that produce the desired monoclonal antibody can be isolated by serially diluting and culturing the hyperpride macaque mouth--around 1 cell Zwell. .
  • the resulting antibody-producing hybridoma is frozen in the presence of about 10% (vZv) dimethyl sulfoxide (DMSO) or a cryoprotectant such as glycerin.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ⁇ 1 When stored at 196 ° C, it can be stored for about half a year to semi-permanently. Cells should be used after rapid thawing in a constant temperature bath before and after use at 37 ° C. It is desirable that the cryoprotectant be thoroughly washed and used so that the cytotoxicity of the cryoprotectant does not remain.
  • the monoclonal antibody of the present invention obtained by the above method is specifically a mouse-derived, IgG class or IgM class monoclonal antibody, for example, "VWF-peptide
  • the hybridoma is cultured under general conditions, and the antibody class secreted in the culture supernatant is determined using a commercially available antibody class' subclass determination kit or the like. It can be examined by using and analyzing.
  • the high-pridoma producing the monoclonal antibodies VWF-peptide Ab N10-116 and VWF-peptide Ab NIO-146 VWF-peptide Ab NIO-116 and VWF-
  • the peptide Ab NIO-146 strain was newly isolated by the present inventors.
  • the acquisition of the monoclonal antibody can be appropriately selected depending on the required amount, the properties of the hyperidoma, etc., from mouse ascites or by cell culture.
  • Hypridoma that can grow in the peritoneal cavity of mice can be obtained from ascites at a high concentration of several mgZml. If you can't proliferate in vivo, Hypridoma can get the culture supernatant of cell culture. According to cell culture, antibody production is lower than in vivo, but there is an advantage that purification is easy because there is little contamination with immunoglobulins and other contaminants contained in the peritoneal cavity.
  • a culture method such as a high-density culture method or a spinner flask culture method is used. And culture supernatant containing the antibody is obtained.
  • Serum contains contaminants such as other antibodies and albumin, and there are many inconveniences in antibody purification, so it is desirable to reduce the amount of addition to the culture medium.
  • Monoclonal antibodies with ascites and culture supernatant strength can be purified by a fractionation method by salting out using ammonium sulfate sodium sulfate, a polyethylene glycol fractionation method. It can be easily achieved by applying ethanol fractionation method, DEAE ion exchange chromatography method, gel filtration method, etc. Further, when the anti-monoclonal antibody of the present invention is a mouse IgG antibody, it can be purified by affinity chromatography using a protein A binding carrier or an anti-mouse immunoglobulin binding carrier. Convenient.
  • ADAMTS 13 activity in a sample can be rapidly measured.
  • VWF which is a natural substrate of ADAMTS 13
  • a peptide consisting of 73 to 2050 amino acids preferably a peptide consisting of 73 to 210 amino acids, including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, more preferably the amino acid of SEQ ID NO: 1.
  • a peptide consisting of a sequence (VWF73) can be used as a substrate.
  • Such a substrate is preferably expressed and prepared using a genetic engineering technique with, for example, a dartathione-S-transferase (GST) tag attached to the N-terminus of the substrate molecule (hereinafter also referred to as “GST-VWF73 substrate”).
  • GST dartathione-S-transferase
  • an enzyme labeled at the N-terminus of VWF73 for example, a VWF73 substrate labeled at the N-terminus with horse radish peroxidase (HRP) can be used.
  • HRP-labeled VWF73 substrate add several amino acids to the N-terminus of the VWF73 peptide, and mutate one amino acid to cysteine.
  • VWF73 prepared for use as these substrates can be summarized as follows: HRP labeling via Cys (J. Thromb. Haemo st., 4, 129-136, 2006) Sometimes referred to as “VWF73 substrate”.
  • the substrate is allowed to react with the sample to be measured for ADAMTS13 activity for a certain period of time, and the fraction containing the product (for example, N-10 peptide when using VWF73 substrate) in the enzyme-substrate reaction mixture is measured.
  • the measuring method is not limited as long as the antibody of the present invention is used.
  • various types of immunoassays usually performed in the art can be used.
  • the method is not particularly limited as long as it includes a step of reacting the enzyme substrate reaction mixture with the antibody of the present invention and measuring the formed immune complex, and optically detects a precipitation reaction or an agglutination reaction.
  • An immunoturbidimetric assay method, or an antibody labeled with a substance that can be easily detected separately, or a labeled immunoassay method can be used.
  • Labeled immunoassays include radioimmunoassay using RI as a label for detection of immune complexes, enzyme immunoassay using enzymes such as alkaline phosphatase peroxidase, and fluorescent immunoassay using fluorescent substances. Is included.
  • a direct method of directly labeling the antibody to be detected an indirect method of labeling the antibody of the antibody to be detected, that is, the secondary antibody, or the like can be used.
  • the indirect method for example, when the antibody of the present invention is a mouse IgG monoclonal antibody, for example, an anti-mouse IgG polyclonal antibody or the like is used as the secondary antibody.
  • the method for preparing the secondary antibody and the labeling of the antibody with a fluorescent substance, RI, enzyme, etc. can be carried out using methods commonly used in this field.
  • a method using a reaction of piotin-avidin (or streptavidin) is also possible for the measurement method, and it is preferably employed in the case of measurement requiring high sensitivity.
  • Examples of the method include a method using a combination of the antibody of the present invention labeled with piotin and streptavidin labeled with a fluorescent substance.
  • the antibody of the present invention can be labeled with piotin and streptavidin with a fluorescent substance or the like using a method commonly used in the art.
  • streptavidin labeled with a fluorescent substance or the like is commercially available. It is available.
  • a polyclonal antibody can be prepared as follows. Use the same antigen as the monoclonal antibody to animals such as rabbits, goats, hidges, rats, and mice. Immunize and get antisera. Since generally obtained antisera contain antibodies that cause non-specific reactions, it is possible to perform specific absorption by performing absorption procedures with substances that can cause non-specific reactions such as human serum, human VWF, and VWF73. Raise sex. It is also possible to obtain antibodies with high specificity that meet the purpose of the present invention by affinity purification with the immunogen used. The obtained antibody can be used for the measurement of ADAMTS13 activity as in the case of the monoclonal antibody.
  • an antibody of the present invention a monoclonal antibody (hereinafter, also referred to as “anti-N-10 monoclonal antibody”) obtained using N-10 peptide as an immunogen, and the aforementioned GST-VWF73 substrate as a substrate are used.
  • the ability to disclose a method for measuring ADAMTS13 activity is sufficient if the antibody is an antibody of the present invention.
  • the substrate is not particularly limited as long as it is a peptide that can be hydrolyzed to ADAMTS13.
  • An anti-GST antibody is immobilized on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube or magnetic particle, and a GST-VWF73 substrate is immobilized on the solid phase in advance. After reacting the solid phase with the reaction buffer and the sample, react with anti-N-10 monoclonal antibody, and measure the amount of anti-N-10 monoclonal antibody on the solid phase to measure ADAMTS13 activity in the sample. It is possible. It is preferable to label the anti-N-10 monoclonal antibody with a known labeling substance.
  • An anti-GST antibody is immobilized on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube or magnetic particle, and a GST-VWF73 substrate is immobilized on the solid phase in advance.
  • the ADAMTS 13 activity in the sample is measured by reacting the solid phase with the reaction buffer, the sample, and the anti-N-10 monoclonal antibody simultaneously, and measuring the amount of the anti-N-10 monoclonal antibody on the solid phase. It is possible. It is preferable to label the anti-N-10 monoclonal antibody with a known labeling substance.
  • anti-N -It After reacting the GST-VWF73 substrate, reaction buffer and specimen with an anti-GST solid phase in which anti-GST antibody is immobilized on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube or magnetic particle, anti-N -It is possible to measure ADAMTS13 activity in a sample by reacting with 10 monoclonal antibody and measuring the amount of anti-N-10 monoclonal antibody on the solid phase It is. It is preferable to label the anti-N-10 monoclonal antibody with a known labeling substance.
  • GST-VWF73 substrate, reaction buffer, specimen and anti-N-10 monoclonal antibody are simultaneously applied to an anti-GST solid phase in which anti-GST antibody is immobilized on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube or magnetic particle. It is possible to measure ADAMTS13 activity in a sample by reacting and measuring the amount of anti-monoclonal antibody on the solid phase. It is preferable to label the anti-N-10 monoclonal antibody with a known labeling substance.
  • the reaction mixture is immobilized in advance on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube or magnetic particles. It is possible to measure ADAMTS13 activity by reacting with anti-GST antibody and then reacting with anti-N-10 monoclonal antibody and measuring the amount of anti-N-10 monoclonal antibody bound on the solid phase. . It is preferable to label the anti-N-10 monoclonal antibody with a known labeling substance.
  • reaction mixture After reacting the GST-VWF73 substrate, reaction buffer, sample, and anti-N-10 monoclonal antibody in a test tube or other container, the reaction mixture is mixed with a microtiter plate, tube, magnetic particle, etc. It is possible to measure ADAMTS 13 activity by reacting with an anti-GST antibody previously immobilized on a solid phase carrier and measuring the amount of anti-N-10 monoclonal antibody bound on the solid phase. It is preferable to label the anti-N-10 monoclonal antibody with a known labeling substance.
  • the reaction mixture is immobilized in advance on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube or magnetic particles. It is possible to measure ADAMTS 13 activity by reacting with the anti-N-10 monoclonal antibody and then reacting with the anti-GST antibody and measuring the amount of the anti-GST antibody bound on the solid phase. It is preferable to label the anti-GST antibody with a known labeling substance.
  • reaction mixture After reacting the GST-VWF73 substrate, reaction buffer, sample, and anti-GST antibody in a test tube or other container, the reaction mixture is mixed with a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube, or magnetic particle. React with anti-N-10 monoclonal antibody previously immobilized on It is possible to measure ADAMTS 13 activity by measuring the amount of anti-GST antibody bound above. It is preferable to label the anti-GST antibody with a known labeling substance.
  • a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube, or magnetic particle.
  • ADAMTS13 activity can be measured by reacting anti-GST antibody and then measuring the amount of anti-GST antibody bound on the solid phase. It is preferable to label the anti-GST antibody with a known labeling substance. It is also possible to react the anti-GST antibody with the GST-VWF73 substrate in advance, as an example of this measurement method.
  • Anti-GST antibody is immobilized on microscopically or physically detectable fine particles such as colloidal gold particles or colored latex particles, then reacted with GST-VWF73 substrate, and then a reaction buffer and specimen are added. In addition, an enzyme reaction is performed. After that, the reaction solution is guided to a porous carrier such as filter paper or membrane on which anti-N-10 monoclonal antibody is fixed, and particles such as gold colloid particles or colored latex particles captured on the porous carrier are detected. It is possible to measure ADA MTS 13 activity.
  • a known lateral flow method or flow-through method is suitably selected as a method for introducing the reaction solution to a porous carrier such as filter paper or membrane on which an anti-N-10 monoclonal antibody is immobilized.
  • a known reaction vessel suitable for optical detection of evanescent waves as a solid phase carrier and operate in the same manner as in 4 above to label the anti-N-10 monoclonal antibody labeled with a fluorophore suitable for evanescent wave detection.
  • ADAMTS 13 activity When used, it is possible to measure ADAMTS 13 activity by evanescent wave detection. Furthermore, in this case, the intensity of the evanescent wave is measured over time. Thus, it is also possible to rate-act AD AMTS 13 enzyme activity. Using this method, hosiery assembly is possible without the need for washing or BZF separation.
  • ADAMTS 13 Immobilize the anti-GST antibody on gold colloidal particles or latex particles, react with GST-VWF73 substrate, and add the reaction buffer and sample to perform the enzyme reaction. Then, ADAMTS 13 activity can be measured by adding anti-N-10 monoclonal antibody to the reaction solution, inducing agglutination of particles and detecting the aggregation optically or macroscopically. is there.
  • an anti-GST antibody preferably an anti-GST monoclonal antibody, is added to the reaction mixture to induce particle agglutination, and the aggregation is detected optically or macroscopically. The activity can be measured.
  • reaction solution After reacting a specimen using human or animal VWF as a substrate, the reaction solution can be separated by gel electrophoresis and reacted with the antibody of the present invention to measure ADAMTS13 activity.
  • Anti-VWF antibody is immobilized on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube or magnetic particle, and VWF is immobilized on the solid phase in advance. After reacting the solid phase with the reaction buffer and the sample, anti-N-10 monoclonal antibody is reacted, and the amount of anti-monoclonal antibody on the solid phase is measured to measure ADAMTS13 activity in the sample. It is possible.
  • the following method can be mentioned as a further specific example of the method for measuring ADAMTS13 activity using the antibody of the present invention.
  • the anti-N-10 monoclonal antibody is used as the antibody of the present invention, and the substrate is not limited to these, using the VWF73 substrate labeled at the N-terminus with HRP as described above.
  • the reaction mixture is immobilized in advance on a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube, or magnetic particle.
  • a solid phase carrier such as a microtiter plate, tube, or magnetic particle.
  • ADAMTS 13 activity can be measured.
  • 2.HRP-labeled VW F73 substrate, reaction buffer, anti-N-10 monoclonal antibody solid phase obtained by immobilizing anti-N-10 monoclonal antibody on solid phase carrier such as microtiter plate, tube or magnetic particle
  • the ADAMTS 13 activity can be measured by reacting the sample and the sample at the same time, measuring the HRP activity on the solid phase after washing.
  • an anti-His tag antibody is used instead of the above anti-GST antibody in the same manner. Can be implemented.
  • the above method can be carried out by using a conjugate that can specifically bind to each tag.
  • the sample measured by the measurement method of the present invention is generally blood with no particular restriction.
  • the measurement can be performed at the cell and tissue force extract, etc. It is also possible to measure using the above sample as a specimen. These measurement methods can be applied to methods usually performed in the field.
  • the novel antibody of the present invention can be included in a reagent or a kit.
  • the reagent or kit herein include a reagent or kit for measuring ADAMTS13 activity in a sample, and a clinical examination reagent or kit.
  • the antibody used here refers to both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody, and is not limited as long as the object of the present invention can be achieved.
  • the antibody of the present invention is also applied to a clinical test by measuring ADAMTS13 activity, and the present invention extends to the test method.
  • Applicable clinical tests include thrombotic thrombocytopenic purpura (TT P), hemolytic uremic syndrome (HUS), disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), cerebral infarction, chronic liver disease, malignant tumor, HIV, myocardial infarction It can be applied to the examination of risk factors for disease progression of microvascular disorders such as autoimmune diseases, pregnancy complications, and acute renal failure.
  • the present invention extends to a reagent or kit for measuring ADAMTS 13 activity and the above-described test reagent or kit.
  • These reagents or kits contain the antibody of the present invention, and optionally contain VWF or peptide that can serve as a substrate.
  • Reagent or kit contains ADAMTS 13 substrate and N-10 peptide, which is a hydrolysis product of the substrate.
  • a fraction suitable for immunoassay using the anti-N-10 monoclonal antibody of the present invention can be appropriately selected and included.
  • kits by appropriately combining solid phase reagents such as microplates on which antibodies are immobilized and magnetic particles, labeled antibody reagents, enzyme substrate reagents, standard solutions, washing solutions, and the like.
  • the present invention includes, for example, an anti-N-10 monoclonal antibody using N-10 peptide (a peptide having an N-terminal site generated by cleavage of VWF or VWF73), and ADAMTS13 activity using the same.
  • Antibodies against are also included. More specifically, it is an antibody against the peptide shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing, or an antibody against the peptide containing the sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing on the N-terminal side.
  • Antibodies that do not substantially react with VWF73, methods for measuring ADAMTS13 activity using these antibodies, and reagents or kits containing these antibodies are also included.
  • mice 7-8 weeks old inbred BALBZc mice females are bred using standard pellets in an animal breeding chamber (23 ⁇ 1 ° C, humidity 70%) and optionally supplied with water. And reared.
  • Immune antigen A chemically synthesized N-10 peptide represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was used as an N-10 peptide antigen.
  • mice with high antibody titers were further immunized two weeks later by injecting N-10 peptide antigen prepared in PBS to 100 gZ ml from the tail vein of mice.
  • the antibody titer was measured using the serum of a mouse immunized with the antigen according to the screening method described below.
  • X63 cells are subcultured in DMEM culture medium (containing 5 ⁇ g / m 1 6-thioguanine) containing 10% fetal calf serum (FCS) and contain 6-thioguanine 3 days before cell fusion. Not further cultured in DMEM culture medium containing 10% FCS, and cells in logarithmic growth phase were used. The number of X63 cells was counted and 1.9 ⁇ 10 8 viable cells were obtained. Dissolve polyethylene glycol-1500 to a concentration of 50 (wZv)% in DMEM culture medium, mix the mixture so that the ratio of the above spleen cells to X63 cells is 1: 1, and use a known method (Keller And Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975, Eur.
  • FCS fetal calf serum
  • the plate was washed 5 times with an acid buffer solution (hereinafter abbreviated as a washing solution), and further blocked with a phosphate buffer solution containing 10% Block Ace (trade name) to prepare an N-10 peptide-immobilized plate.
  • the culture supernatant 100 1 obtained above is added to the immobilized plate, reacted at 37 ° C for 60 minutes, washed 5 times with a washing solution, and further horseradish perovskite.
  • HRP Xidase
  • a labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (derived from goat) was reacted at 37 ° C for 60 minutes.
  • the plate was washed 4 times with a washing solution, and the substrate solution (containing 0-phenoldiamine 0.4 mgZml and 0.02% HO) was reacted at 37 ° C for 15 minutes, and then this reaction was treated with 2N sulfuric acid. Stop at the main
  • a labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (derived from goat) was reacted at 37 ° C for 60 minutes. After this reaction, the plate was washed 4 times with the washing solution, and the substrate solution (0-phenoldiamine 0.4 mg Zml and 0.02% HO) was obtained. Reaction) at 37 ° C for 15 minutes, and then the reaction was stopped with 2N sulfuric acid,
  • the monoclonal antibody of the present invention was found to be an antibody that specifically recognizes the vicinity of the C-terminus of the N-10 peptide.
  • mouse immunoglobulin subclass was determined for the monoclonal antibody produced by the hyperidoma cell line obtained as a single clone by the above cloning. To identify the mouse immunoglobulin subclass, the culture supernatant of each hybridoma cell line was used, and the mouse monoclonal antibody isotyping kit manufactured by Serotec was used. As a result, clones VWF-peptide Ab Nl 0-116 and VWF-peptide Ab N10-146 were both found to be IgG2.
  • ADAMTS13 is a metalloenzyme, and a divalent metal is required for the expression of activity, so 5 mM Tris containing 20 mM barium chloride.
  • N10-146 an anti-N-10 monoclonal antibody
  • anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with horse radish peroxidase HRP
  • HRP horse radish peroxidase
  • clone N 15Ab undergoes an enzymatic reaction with ADAMTS 13!
  • the absorbance in the reaction solution containing barium chloride is almost equal to the absorbance in the reaction solution containing EDTA.
  • the N-10 peptide produced by the enzyme reaction with ADAMTS13 is the same as the VWF73 substrate. It proved to be impossible to measure separately.
  • the anti-N-10 monoclonal antibody (N10-146) of the present invention the enzyme reaction with ADAMTS 13 proceeds!
  • the anti-N-10 monoclonal antibody of the present invention has extremely low reactivity with the VWF73 substrate, and the N-10 peptide generated by enzymatic hydrolysis of the substrate by AD AMTS13 has a very high specificity. It was found to react with Therefore, it has been clarified that ADAMTS 13 activity can be measured by using the anti-N-10 monoclonal antibody of the present invention.
  • Example 5 Each of the seven types of peptides shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing (each N-10 peptide, N-6 peptide, N-8 peptide, N-11 peptide, N-9 peptide, N-13 peptide, N- 15 peptides) at a concentration of 1 ⁇ gZml was dispensed 100 ⁇ l at a time on microtiter plate wells, left overnight at 28 ° C., washed and blocked to prepare each peptide solid phase.
  • Each peptide solid phase was reacted with peroxidase (HRP) -labeled anti-N-10 monoclonal antibody (N 10-146) derived from horse radish to examine the reactivity of the anti-N 10 -monoclonal antibody with each peptide.
  • HRP peroxidase
  • the N-10 monoclonal antibody was reactive only with the N-10 peptide and not significantly reactive with any of the other peptides. Therefore, it was found that the N-10 monoclonal antibody of the present invention is specific for the N-10 peptide, and the force is also specific for the region containing the C-terminal tyrosine of the N-10 peptide.
  • each peptide was preliminarily added to the HRP-labeled anti-N-10 monoclonal antibody (N10-14 6) at a concentration of 15. 6 31. 3 62. 5 125 2 50 500 lOOOngZml. After the reaction, it was reacted with an N-10 peptide solid phase.
  • the anti-N10-monoclonal antibody of the present invention is specific to the N-10 peptide and also specific to the region containing the tyrosin at the C-terminal of the N-10 peptide.
  • Samples obtained by diluting normal human plasma with human plasma (heated plasma) heat-treated at 56 ° C for 30 minutes XI, X 2, X 4, X 8, X 16, X 32, X 64 times and heated plasma were used as samples.
  • the other procedures were carried out in the same manner as in Example 4, and a calibration curve for measuring ADAMTS 13 activity was prepared using XI in normal human plasma as 100% ADAMTS13 activity.
  • X-axis shows ADAMTS 13 activity (%)
  • Y-axis shows absorbance at 492 nm.
  • No. 116 shows the result of measurement using anti-N-10 monoclonal antibody N10-116. The absorbance was confirmed to increase in proportion to ADAMTS 13 activity, and it was found that ADAMTS13 activity can be measured by the method of the present invention.
  • a calibration curve of ADAMTS 13 activity was prepared in the same manner as in Example 4, and simultaneously ADAMTS 13 activity in plasma of congenital ADAMTS 13 deficiency (USS case) was measured.
  • ADAMTS13 activity in USS cases was calculated to be 1% or less (arrow in FIG. 1). This result was in good agreement with the VWF multimer analysis. Therefore, it was found that the ADMTS 13 activity can be specifically measured by the method of the present invention, and it was revealed that it is useful for clinical examination.
  • Anti-N-10 monoclonal antibody (N 10-146) of the present invention was dispensed at 100 g 1 at a concentration of 1 gZml to each well of the microtiter plate and allowed to stand overnight to prepare an anti-N-10 antibody solid phase. .
  • a test tube take 100 1 of VWF73 substrate (1 / z gZml) and 10 1 test plasma (prepared by diluting normal human plasma with heated plasma as in Example 7) at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, 20 ⁇ l of 50 mM EDTA was added to stop the reaction.
  • reaction product 100 ⁇ l of the reaction product was reacted with the anti- ⁇ -10 antibody solid phase at room temperature for 1 hour, washed, and then washed with HRP-labeled anti-GST antibody (derived from goat). Reacted for 1 hour. The absorbance generated by the enzyme reaction was measured. XI of normal human plasma was taken as 100% test plasma concentration (ADAMTS13 activity).
  • FIG. X-axis shows test plasma concentration (ADAMTS13 activity) (%)
  • Y-axis shows absorbance at 492 nm.
  • ADAMTS13 activity can be measured and tested, and can be used for the development of therapeutic agents, diagnostic agents, etc. based on the results.

Abstract

　本発明の課題は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するために有用な抗体、とりわけモノクローナル抗体とＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法を提供することである。さらに本発明の課題は、基質であるＶＷＦや基質となりうるＶＷＦの部分ペプチドにＡＤＡＭＴＳ１３を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して特異的反応性を有し、完全なＶＷＦ分子とは特異的反応性を有しないモノクローナル抗体の提供ならびに当該抗体の用途を提供することである。かかる課題は、ＶＷＦの部分ペプチドがＡＤＡＭＴＳ１３により特異的に切断される切断部位に対して特異的反応性を有するモノクローナル抗体（抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体）を得ることに成功し、さらに当該モノクローナル抗体を用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法を見出したことにより、達成された。

Description

明 細 書
ADAMTS 13活性検定用抗体及び活性検定方法
技術分野
[0001] 本発明はフォンヴィルブランド因子（以下「VWF」ともいう。）又は配列表の配列番 号 1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、 VWF切断酵素（以下「ADAMTS13」 ともいう。）を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して特異的反応性 (結合性） を有し、 ADAMTS 13が作用して 、な 、前記 VWF又は前記ペプチドとは有意な特 異的反応性を有しない抗体、とりわけモノクローナル抗体、およびその製造方法、な らびにそれらの用途に関するものである。
[0002] 本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願 2005-03661 2号および特願 2005- 157530号からの優先権を請求する。
背景技術
[0003] 血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP)は、血 小板減少、溶血性貧血、動揺性精神神経障害などを特徴とする症候群である。かつ ては約 80%の患者が 3ヶ月以内に死亡する予後不良の疾患であった。現在では血 漿交換によって、予後が大幅に改善されるようになっている。
[0004] 最近、 ΤΤΡの病因として VWF切断酵素 (ADAMTS13)の活性低下が報告された 。すなわち、後天性の ΤΤΡは、 VWF切断酵素に対する IgG型インヒビターが産生さ れることによって酵素活性が低下することが原因であることが明らかにされた (非特許 文献 1及び 2)。また先天的な TTPである Upshaw-Schulman症候群（USS)では、遺 伝的に VWF切断酵素が欠損して ヽることが判明した (非特許文献 3)。この VWF切 断酵素をコードする遺伝子は、 ADAMTS13であることが判明した (非特許文献 4及 び 5)。
[0005] ADAMTS 13は亜鉛型メタ口プロテアーゼで、 VWFサブユニットの Tyr842-Met84 3結合を特異的に切断する。この酵素活性の測定は、 VWFを基質として生じた VWF フラグメントの検出を電気泳動法で行う VWFマルチマー解析により行われて 、る。こ の方法は、 ADMATS13活性を正確に測定できるという利点はある力 操作が煩雑 であるため、とりわけ簡便な測定法の開発が望まれていた。
非特許文献 6〜8によれば、 ADAMTS 13の基質である VWFの A2ドメイン又はそ の一部を用いた ADAMTS13活性の測定法が報告されている。これらは天然の基 質ではなぐ遺伝子組換えにより大腸菌に発現させた基質である。上記測定法ではこ れらの基質が、血漿試料中の ADAMTS13により分解されることを利用して、電気泳 動ウェスタンプロットによる基質分子の分子量の検定、および基質と酵素の反応後の 未分解残存基質の免疫学的測定による ADAMTS13活性の検出、測定を行ってい る。し力し、これらの方法では、 ADAMTS 13の活性と得られるシグナル強度が逆相 関し、いわゆる検量線が負の傾きをとるため、臨床的に重要な 5%以下の低値領域 での感度および再現性が得られず、課題となって ヽた。
これらの課題を改善する方法として、消光性蛍光基質を用いた血漿 ADAMTS13 活性の測定法が報告されている（非特許文献 9)。この方法は、 ADAMTS13の活性 の増加に伴って蛍光強度が増加する正の傾きをしめす検量線を有する。しかし、化 学合成した特殊な高価な基質を用いて、蛍光計を用いてレートアツセィしなければな らな 、ため、一般の臨床検査の検査室で用いるには課題があった。
非特許文献 1 : New Engl. J. Med. 339, 1578-1584, 1998
非特許文献 2 : New Engl. J. Med. 339, 1585-1594, 1988
非特許文献 3 : J. Hematol. 74, 101-108, 2001
非特許文献 4: J Biochem. 130, 475-480, 2001
非特許文献 5 : J. Biol. Chem. 276, 41059-41063, 2001
非特許文献 6 : Blood, 103, 607-612, 2004
非特許文献 7 : J. Thromb. Haemost. 2, 485-491, 2004
非特許文献 8 :Thromb Haemost. 91, 806-811, 2004
非特許文献 9 :日本血栓止血学会誌， 15, 421, 2004
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の目的は、 ADAMTS 13活性を測定するために有用な抗体を提供すること である。さらに具体的には、本発明の目的は、基質である VWFまたは基質となりうる VWFの部分ペプチドが ADAMTS 13により水解されて生成するペプチドに、親和 性を有する抗体の提供、ならびに当該抗体の用途を提供することであり、当該抗体を モノクローナル抗体として提供することである。また、本発明の別の目的は、当該モノ クローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞系を提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、 ADAMTS 13活性の測定法を鋭意研究した結果、 VWFまたは基 質となりうる VWFの部分ペプチドにおいて ADAMTS13により特異的に切断される 切断部位に対して N末端側のアミノ酸配列を C末端に有するペプチドを、抗原として 用いることによって、 ADAMTS13により基質が切断されて生じる抗原決定部位を特 異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに成功し、当該モノクローナル抗体を 産生するハイプリドーマ細胞系を確立し、さらに当該モノクローナル抗体の用途を見 出した。
[0008] すなわち、本発明は以下の構成力もなる。
1.フォンヴィルブランド因子 (VWF)又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列 を含むペプチドに、 VWF切断酵素 (ADAMTS 13)を作用させたときに生じる抗原 決定部位に対して反応性を有し、 VWF又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸 配列を含むペプチドとは有意な反応性を有しない抗体。
2. VWF又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、 ADAM TS13を作用させたときに生じる抗原決定部位は、前記 VWF又は前記ペプチドが A DAMTS 13により切断されたときに生じる抗原決定部位である、前項第 1項に記載 の抗体。
3.前記抗原決定部位が、 VWF又は前記ペプチドが ADAMTS 13により切断された 切断部位おいて新たに生じた N末端側のペプチド断片又は C末端側のペプチド断 片に存在する、前項第 1項または第 2項に記載の抗体。
4.配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対して反応性を有する、前項第 1項〜第 3項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
5.配列表の配列番号 2に記載のペプチドの C末端より少なくとも 4個のアミノ酸残基 を含む領域に対して反応性を有する、前項第 1項〜第 4項のいずれか 1項に記載の 抗体。
6.配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番 号 3〜8に記載のいずれか 1項のペプチドに対して有意な反応性を有しない前項第 1 項〜第 5項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
7.配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製した V WFに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、前項第 1項〜第 6項のいずれか 1項 に記載の抗体。
8.配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対する反応性力 配列表の配列番号 1 に記載の配列を含むペプチドに対する反応性よりも少なくとも 3倍大きい、前項第 1項 〜第 7項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
9.配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対する反応性力 配列表の配列番号 8 に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、前項第 1項〜第 8項の いずれか 1項に記載の抗体。
10.配列表の配列番号 9に記載のアミノ酸配列を C末端に有するペプチドを免疫原 として得られる、前項第 1項〜第 9項のいずれか 1項に記載の抗体。
11.配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として得ら れる、前項第 1項〜第 10項のいずれか 1項に記載の抗体。
12.配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対して反応性を有する、前項第 1項 〜第 3項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
13.配列表の配列番号 10に記載のペプチドの N末端より少なくとも 4個のアミノ酸残 基を含む領域に対して反応性を有する、前項第 1項〜第 3項および第 12項のいずれ か 1項に記載の抗体。
14.配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列 番号 2〜9に記載のいずれか 1のペプチドに対して有意な反応性を有しない、前項第 1項〜第 3項、第 12項、および第 13項のいずれか 1項に記載の抗体。
15.配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対する反応性力 ヒト血漿より精製し た VWFに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、前項第 1項〜第 3項および第 12 項〜第 14項のいずれか 1項に記載の抗体。 16.配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対する反応性力 配列表の配列番号 1に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも 3倍大きい、前項第 1項〜第 3項 および第 12項〜第 15項のいずれか 1項に記載の抗体。
17.配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号 8 及び 11に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、前項第 1項〜 第 3項および第 12項〜第 16項のいずれか 1項に記載の抗体。
18.配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列を N末端に有するペプチドを免疫 原として得られる、前項第 1項〜第 3項および第 12項〜第 17項のいずれか 1項に記 載の抗体。
19.配列表の配列番号 10に記載のペプチドを免疫原として得られる、前項第 1項〜 第 3項および第 12項〜第 18項のいずれか 1項に記載の抗体。
20.モノクローナル抗体である前項第 1項〜第 19項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
21.寄託番号が FERM BP- 10480又はFERM BP- 10479であるハイプリドー マにより産生されるモノクローナル抗体である、前項第 1項〜第 11項のいずれか 1項 に記載の抗体。
22.前項第 20項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。
23.寄託番号が FERM BP- 10480又はFERM BP- 10479である前項第 22項 に記載のハイプリドーマ。
24. ADAMTS 13により切断されうる基質ペプチドを、 ADAMTS13活性を検定し ようとする検体と反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第 1項〜第 21項 のいずれ力 1項に記載の少なくとも 1種の抗体を反応させる工程を含む、 ADAMTS 13活性の測定方法。
25.配列表の配列番号 1に記載の配列を含むペプチドと ADAMTS 13活性を検定 しょうとする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第 1項〜第 2 1項のいずれか 1項に記載の少なくとも 1種の抗体を反応させる工程を含む試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
26. VWFと ADAMTS 13活性を検定しょうとする検体とを反応させる工程、及び該 工程の反応生成物に前項第 1項〜第 21項のいずれか 1項に記載の少なくとも 1種の 抗体を反応させる工程を含む試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
27.前記抗体が標識物質で標識されている、前項第 24項〜第 26項のいずれか 1項 に記載の試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
28.前記抗体が固相担体に固定化されている、前項第 24項〜第 27項のいずれか 1 項に記載の試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
29.前記抗体が水不溶性の粒子に担持されている、前項第 24項〜第 28項のいず れカ 1項に記載の試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
30.前項第 24項〜第 29項のいずれか 1項に記載の方法によって、微小血管障害性 疾患を検査する方法。
31.前項第 1項〜第 21項のいずれか 1項に記載の抗体を含む、試薬またはキット。 発明の効果
[0009] 本発明の抗体は、 VWF又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するぺ プチドに ADAMTS 13を作用させたときに生じる抗原決定部位を特異的に認識する 抗体である。そして当該抗体は、 ADAMTS 13が作用していない前記 VWF又は前 記ペプチドとは有意な特異的反応性を有しな 、ものである。当該抗体を用いることに より、 ADAMTS13酵素活性の測定および検定が可能になる。即ち、本発明の抗体 を用いることにより、（1)サンドイッチ免疫測定法による ADAMTS 13活性の迅速、簡 便な測定、（2)粒子標識免疫測定法による ADAMTS13活性の迅速、簡便な測定 が可能となり、従って本発明は（3)これらの成果に基づく治療薬、診断薬等の開発等 に大きな意義を持つ。また、本発明の抗体は、モノクローン化された融合細胞により 安定して産生されることから、産業上の利用価値も高い。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明のモノクローナル抗体を 2次抗体として用いた ADAMTS13活性測定 の検量線と USS例の測定結果を示した図である。（実施例 7および 8)
[図 2]本発明のモノクローナル抗体を固相に用いた ADAMTS13活性測定の検量線 を示した図である。（実施例 9)
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明において、抗体とは、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれ もを含む。モノクローナル抗体とは、公知の方法で調製されたモノクローンィ匕された融 合細胞より産生される抗体である。本発明の抗体には、全抗体分子または抗体活性 を有する抗体分子の一部画分も含まれる。本発明の抗体を作製するために免疫原と して用いる抗原は、本発明の課題を解決しうるものであれば特に限定されるものでは ないが、好適にはペプチドが用いられ、当該ペプチドにはキャリアー蛋白質に結合さ れているものも含まれる。なお、本明細書において「ペプチド」とは、 2以上のアミノ酸 がペプチド結合によって結合したものを示す。
ADAMTS13は亜鉛型メタ口プロテアーゼであって、 VWF分子の 1065番目のチロ シン（Tyrl605)と 1606番目のメチォニン（Metl606)の間の結合に該当する結合を、 特異的に切断する。 VWFが切断されること〖こより、アミノ酸配列上に新たな C末端と N末端が生じる。その結果、新たな抗原決定部位が生じる可能性がある。その抗原 決定部位を認識する抗体を作製すれば、切断された VWFに特異的に結合しうる抗 体が得られることが予想される。本発明における抗体は、新たに生じる N末端側又は C末端側のペプチドのいずれかに生じた抗原決定部位に特異的反応性を有するも のであれば、特に限定されるものではない。非特許文献 6によれば、 ADAMTS13 は、 VWF分子の 1459番目の Aspから 1668番目の Argまでのペプチドを基質として、特 異的に Tyrl605-Metl606の結合を切断することが報告されている。なかでも、 1596番 目の Aspから 1668番目の Argまでの 73個のアミノ酸からなるペプチド（以下「VWF73 」ともいう。配列表の配列番号 1で示されるペプチド） 1S 効率よく ADAMTS13によ る水解を受けることが、上記文献には示されている。配列表の配列番号 1に示される ペプチドからなる VWF73に ADAMTS13が働くと、 10番目の Tyrと 11番目の Metの 間が水解され、切断部位に対して N末端側の 10個のアミノ酸力もなるペプチドが遊 離する。この N末端側の 10個のアミノ酸力もなるペプチドは、以下「N- 10ペプチド」と も 、 、、配列表の配列番号 2に表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
上記 N- 10ペプチドを免疫原として用いることにより、フォンヴィルブランド因子 (VW F)又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、 VWF切断酵 素 (ADAMTS13)を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して特異的反応性 を有し、 ADAMTS 13の作用を受けて!/ヽな ヽ VWFまたは前記ペプチドとは有意な 特異的反応性を有しない、本発明の抗体を得ることができた。本明細書においては、 ADAMTS 13の作用をうけておらず、切断されていない VWF又は配列表の配列番 号 1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを、まとめて「完全な VWF分子」ともいう。ま た、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドは、 ADAMTS13の 水解を受けうるものであればよぐ 73個〜 2050個のアミノ酸力もなり、好ましくは 73 個〜 210個、より好ましくは配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるぺプ チド (アミノ酸数 73個）である。
[0013] 力べして得られた本発明の抗体は、 VWF又は配列表の配列番号 1に記載のァミノ 酸配列を含むペプチドに ADAMTS 13を作用させたときに生じる抗原決定部位を認 識する抗体であり、かつ完全な VWF分子とは有意な反応性を有しな 、ものである。 力かる抗原決定部位の一例として、配列番号 1に記載のペプチドが ADAMTSに より水解された際に生じる N末端側のペプチド断片 (配列番号 2のペプチド）にできる 抗原決定部位が挙げられる。 N末端側の抗原決定部位は、 C末端にチロシン (Tyr) が存在することを必須とする。また、配列番号 2の N末端のアミノ酸が 1つ少ないぺプ チドは抗原性を有する力 2つ少ないペプチドは抗原性を有しないことから、上記 N 末端側の抗原決定部位は、少なくとも 9個のアミノ酸力もなる折れ曲がり構造のような ものと推測される。
また、「有意な反応性を有しない」とは、完全な VWF分子とは有意な結合性を有さ ないため、ウェスタンプロット、 ELISA等の公知の免疫化学的手法により分析したと きに、ノ ックグランドの信号 (抗体を含まない場合の信号、若しくは分析対象物に無 関係な抗体により得られる信号)と比して同等程度の信号しか得られないものをいう。
[0014] 本発明の該抗体は、（a)該抗体をマイクロプレートウエルに固相化した配列表の配 列番号 2に記載のペプチド及びヒト血漿より精製した VWFとそれぞれ反応させたとき 、配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対する反応性がヒト血漿より精製した VW Fに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きいという性質、（b)該抗体をマイクロプレート ゥエルに固相化した配列表の配列番号 2に記載のペプチド及び配列表の配列番号 1に記載の配列を含むペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号 2に記 載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号 1に記載の配列を含むペプチド に対する反応性よりも少なくとも 3倍大きいという性質、（c)該抗体をマイクロプレートウ エルに固相化した配列表の配列番号 2に記載のペプチド及び配列表の配列番号 8 に記載のペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号 2に記載のぺプチ ドに対する反応性が配列表の配列番号 8に記載のペプチドに対する反応性よりも少 なくとも 5倍大き 、と 、う性質の少なくとも 1以上の性質を有することが好ま 、。ある いは、本発明の該抗体は、（d)該抗体を、マイクロプレートウエルに固相化した配列表 の配列番号 10に記載のペプチド及びヒト血漿より精製した VWFとそれぞれ反応させ たとき、配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対する反応性がヒト血漿より精製し た VWFに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きいという性質、（e)該抗体を、マイクロ プレートウエルに固相化した配列表の配列番号 10に記載のペプチド及び配列表の 配列番号 1に記載のペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号 10に記 載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号 1に記載のペプチドに対する反 応性よりも少なくとも 3倍大きいという性質、（£)該抗体をマイクロプレートウエルに固相 化した配列表の配列番号 10に記載のペプチド及び配列表の配列番号 8及び 11に 記載のペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号 10に記載のペプチド に対する反応性が配列表の配列番号 8及び 11に記載のペプチドに対する反応性よ りも少なくとも 5倍大き ヽと 、う性質の 、ずれか 1以上を有することが好ま 、。これら（ a)〜(l)の性質は、後述する実施例 5〜8の方法を用いて確認することが可能である。
[0015] 本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、当該モノクローナル抗体は、当分野 で通常実施されている方法により調製される。即ち、抗原 (例えば、 N- 10ペプチド） に特異的に親和性を有する抗体産生細胞を、骨髄腫細胞と融合させてハイプリドー マを形成させ、該ハイブリドーマをクローンィ匕し、各蛋白質に特異的な抗体を産生す るクローンを選択すること〖こよって製造される。
[0016] 抗原としては、例えば N- 10ペプチド全体を用いることができる力 少なくとも C末端 にチロシン (Tyr)を含み、かつ抗原性を保持する限り、 N— 10ペプチドに 1〜数個の アミノ酸の欠失や置換、若しくは付加といった変更がなされていてもよい。抗原決定 部位は少なくとも 4個以上、好ましくは 9個以上のアミノ酸力 なるものと考えられる。 あるいは、配列表の配列番号 10のアミノ酸配列力もなるペプチドを抗原として用いる こともでき、少なくとも当該ペプチドの N末端の 4個のアミノ酸を含み、かつ抗原性を 保持している限り、抗原ペプチドのアミノ酸配列は、 1〜数個のアミノ酸の欠失や置換 、若しくは付加と 、つた変更がなされて 、てもよ!/、。
[0017] 当該抗原は選択した部分的なアミノ酸配列に基づ!/、て合成あるいは遺伝子工学的 手法によって調製することができる。感作抗原として、得られたペプチド抗原を、直接 リン酸緩衝液 (PBS)等の適当な緩衝液中に溶解、あるいは懸濁したものを用いるこ とも可能である力 より強い抗原性を得るために、アルブミンやキーホールリンペット へモシァニン等の適当なキヤリヤータンパク質に架橋して用いることが好ましい。抗原 溶液は、通常、抗原物質の量として約 50〜500 gZmlの濃度に調製すればよい。 該抗原を免疫感作させる動物としては、マウス、ラット、ゥマ、ャギ、ゥサギなどが例示 される。好ましくはマウス、より好ましくは BALBZcマウスである。このとき、被免疫動 物の抗原への応答性を高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投与す ることができる。本発明において用いられるアジュバントとしては、フロイント完全アジ ュバント (FCA)、フロイント不完全アジュバント（FIA)、 Ribi (MPL)、 Ribi (TDM)、 Ribi (MPL+TDM)、百日咳ワクチン（Bordetella pertussisvaccine)、ムラミルジぺプ チド（MDP)、アルミニウムアジュバント（ALUM)、およびこれらの組合せが例示され る力 初回免疫時に FCA、追加免疫時に FIAを使用する組み合わせが特に好まし い。
[0018] 免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無等により、注射部位、 スケジュールなどを適宜変化させることができる。例えば、被免疫動物としてマウスを 用いる場合は、アジュバント混合抗原溶液 0. 05〜： Lml (抗原物質 10〜200 /^)を 腹腔内、皮下、筋肉内または (尾)静脈内に注射し、初回免疫から約 4〜14日毎に 1 〜4回追加免疫を行い、さらに約 1〜4週間後に最終免疫を行う。該抗原溶液をアジ ュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多くして腹腔内注射してもよい。 抗体価は追加免疫の約 5〜6日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体 アツセィに準じ、当分野で通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約 3〜 5日後に、該免疫動物力 脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
[0019] 骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。例えばマウスミ エローマ P3X63- Ag8、 P3X63-Ag8-Ul、 P3NS1 -Ag4、 SP2Z0- Agl4、 P3X 63 -Ag8， 653等が例示されるが、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物、特に 同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞は凍結保存する力、ゥマ、ゥサ ギまたはゥシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細 胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。
[0020] 抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてノ、イブリドーマを形成させる方法として は、ポリエチレングリコール (PEG)を用いる方法、センダイウィルスを用いる方法、電 気融合装置を用いる方法などが例示される。例えば PEG法の場合、約 30〜60%の PEG (平均分子量 1000〜6000)を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨 髄腫細胞を 1〜： LO : 1、好ましくは 5〜： LO : 1の混合比で懸濁し、温度約 25〜37°C、 p H6〜8の条件下で、約 30秒〜 3分間程度反応させればよい。反応終了後、 PEG溶 液を除 、て培地に再懸濁し、セルゥエルプレート中に播種して培養を続ける。
[0021] 融合操作後の細胞を選択培地で培養して、ハイプリドーマの選択を行う。選択培地 は、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖し得る培地であり、通常ヒポキサンチン -アミノプテリン-チミジン (HAT)培地が使用される。ノ、イブリドーマの選択は、通常融 合操作の 1〜7日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換すること〖こ よって開始し、さらに 2、 3日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより 行う。顕微鏡観察によりコロニーが生育しているゥエルを確認する。
[0022] 生育しているハイプリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを確認するには、 培養上清を採取して抗体アツセィを行えばよ！ヽ。例えば抗原に N- 10ペプチドを用い た場合、固相化した N- 10ペプチドに該上清を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵 素、 RI等で標識した二次抗体 (抗グロブリン、抗 IgG、抗 IgM血清等)を反応させるこ とにより、抗体価を測定することができる。このようにして適切な抗体を産生しているゥ エルを得る。そして、同時に固相化した配列表の配列番号 8に記載のペプチド (以下 「N- 15ペプチド」ともいう）にも該上清をカ卩えて反応させ、同様に測定する。 N- 10ぺ プチドのシグナルと N- 15ペプチドのシグナルを比較し、前者のシグナルが後者のシ グナルよりも少なくとも 10倍大きいものを選択する。さら〖こ、限界希釈法、軟寒天法、 蛍光励起セルソーターを用いた方法等により単一クローンを分離する。例えば、限界 希釈法の場合、ハイプリドーマコ口-—を 1細胞 Zゥ 'エル前後となるように培地で段階 希釈し、培養することにより、目的とするモノクローナル抗体を産生するクローンを単 離することができる。得られた抗体産生ノヽイブリドーマは、約 10% (vZv)ジメチルス ルホキシド (DMSO)またはグリセリン等の凍結保護剤の共存下に凍結させて、一 70
〜一 196°Cで保存すると約半年〜半永久的に保存可能である。細胞は用時 37°C前 後の恒温槽中で急速融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存しなレ、ように よく洗浄して力も使用するのが望ましい。
[0023] 上記の方法で得られる本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、例えばマウス 由来かつ IgGクラス又は IgMクラスのモノクローナル抗体であって、「VWF-peptide
Ab NIO- 116」及ぴ「VWF- peptide Ab N10_ 146」と命名されたものである。 ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマを一 般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体のクラスを市販の抗体クラ ス'サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより調べることができる。
[0024] 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、モノクローナル抗体 VWF-peptide Ab N10- 116および VWF-peptide Ab NIO- 146を産生する ハイプリドーマ VWF-peptide Ab NIO- 116株およひ VWF- peptide Ab NIO -146株は、本発明者らによって新たに分離され、具体的には、ブタペスト条約に基 づく国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一（〒 305- 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に 2005年 3月 29日付 けで国内寄託され、寄託番号として FERM P- 20483および FERM P-20482力 S 付され、その後、国際寄託されて受託番号として FERM BP- 10479および FERM BP- 10480が付されてレ、る。
[0025] モノクローナル抗体の取得は、その必要量やハイプリドーマの性状等によってマウ ス腹水から取得するか、細胞培養によるかを、適宜選択できる。マウス腹腔内で増殖 可能なハイプリドーマは腹水から数 mgZmlの高濃度で得ることができる。インビボで 増殖できなレ、ハイプリドーマは細胞培養の培養上清力 取得すればょレ、。細胞培養 によれば、抗体産生量はインビポより低いが、腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他 の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。
訂正された用紙 (規則 ) [0026] マウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（2, 6, 10, 14-テトラメチ ルペンタデカン)等の免疫抑制作用を有する物質を投与した BALBZcマウスの腹腔 内へ、ノ、イブリドーマ (約 106個以上)を移植し、約 1〜3週間後に貯留した腹水を採 取する。異種ハイプリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線 処理マウスを使用することが好まし ヽ。
[0027] 一方、細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静 置培養法の他に、高密度培養方法またはスピンナーフラスコ培養方法などの培養法 を用い、当該ハイプリドーマを培養し、抗体を含有する培養上清を得る。血清には、 他の抗体やアルブミン等の夾雑物が含まれ、抗体精製に不便な点が多いので、培養 液への添カ卩は少なくすることが望ましい。
[0028] 腹水、培養上清力ものモノクローナル抗体の精製は、免疫グロブリンの精製法とし て従来既知の硫酸アンモ-ゥムゃ硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエ チレングリコール分画法、エタノール分画法、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー法 、ゲル濾過法等を応用することで、容易に達成される。さらに、本発明の抗モノクロ一 ナル抗体が、マウス IgG抗体である場合には、プロテイン A結合担体あるいは抗マウ スィムノグロブリン結合担体を用いたァフィユティークロマトグラフィーにより精製する ことが可能であり、簡便である。
[0029] 本発明の新規抗体を用 、て試料中の ADAMTS 13活性を迅速に測定することが 可能である。該測定には、 ADAMTS 13の天然の基質である VWFを用いることも可 能である。また、配列表の配列番号 1に表されたアミノ酸配列を含む 73個〜 2050個 のアミノ酸からなるペプチド、好ましくは 73個〜 210個のアミノ酸からなるペプチド、さ らに好ましくは配列番号 1のアミノ酸配列からなるペプチド (VWF73)を基質として用 いることができる。このような基質は遺伝子工学の手法を用いて、基質分子の N末端 に例えばダルタチオン- S-トランスフェラーゼ (GST)タグをつけて発現、調製すること が好ましい（以下「GST- VWF73基質」ともいう。 ) oまた、 VWF73の N末端に酵素 標識したもの、例えば、西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP)で N末端を標識した V WF73基質を用いることができる。 HRP標識された VWF73基質の調製は、 VWF73 ペプチドの N末端にアミノ酸を数個加え、そのうち 1アミノ酸をシスティン (Cys)に変異 させて、その Cysを介して HRP標識することにより行うことができる（J. Thromb. Haemo st., 4, 129-136, 2006) o以下、これらの基質として用いるために調製した VWF73を 、まとめて「VWF73基質」ということもある。
当該基質を ADAMTS13活性を測定しょうとする試料と一定時間反応させ、酵素 基質反応混合液中に生成する生成物（例えば、 VWF73基質を用いた場合は N- 10 ペプチド)を含む画分を測定する。測定法は、本発明の抗体を用いる限り、限定され ない。該方法には、通常当分野で行われる各種のィムノアツセィが利用され得る。該 方法は、酵素基質反応混合液と本発明の抗体とを反応させ、形成される免疫複合体 を測定する工程を含むものであれば特に限定されず、沈降反応もしくは凝集反応を 光学的に検出する免疫比濁法、または分別検出の容易な物質で標識した抗体を用 V、る標識ィ匕免疫測定法などを用いることができる。
標識ィヒ免疫測定法には、免疫複合体の検出のための標識として RIを用いるラジオ ィムノアツセィ、アルカリホスファターゼゃパーォキシダーゼ等の酵素を用いるェンザ ィムィムノアツセィ、蛍光物質を用いる蛍光ィムノアッセィなどが含まれる。標識する 対象によって、検出すべき抗体を直接標識する直接法、検出すべき抗体の抗体つま り二次抗体を標識する間接法などを用いることができる。間接法を用いる場合、例え ば、本発明の抗体がマウス IgGモノクローナル抗体である場合、二次抗体としては例 えば抗マウス IgGポリクローナル抗体等を使用すればょ 、。該二次抗体の調製法、 並びに抗体の蛍光物質、 RIおよび酵素等による標識は、当分野で慣用の方法を用 Vヽて行うことができる。また、当該測定法にピオチン-アビジン (又はストレプトアビジン )の反応を利用する方法も可能であり、高い感度が要求される測定の場合には好まし く採用される。当該方法としては、例えばピオチンで標識した本発明の抗体と蛍光物 質等で標識したストレプトアビジンとを組み合わせて用いるものが挙げられる。本発明 の抗体のピオチンでの標識、ストレプトアビジンの蛍光物質等での標識は、当分野で 通常行われる方法を用いて行うことができ、例えば蛍光物質等で標識したストレプト アビジンは商業的にも入手可能である。
本発明にお 、て、ポリクローナル抗体は次のようにして調製することができる。モノク ローナル抗体と同様の抗原を用いて、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、ラット、マウス等の動物に 免疫し、抗血清を得る。一般に得られた抗血清中には、非特異反応を引き起こす抗 体が含まれているため、ヒト血清、ヒト VWF、 VWF73等の非特異反応の原因となりう る物質で吸収操作を行うことにより特異性をあげる。また、使用した免疫原によるァフ ィニティー精製によって、特異性の高い、本発明の目的に合致する抗体を得ることも 可能である。得られた抗体は、モノクローナル抗体の場合と同様に、 ADAMTS13 活性の測定に用いることができる。
本発明の抗体を用いた ADAMTS13活性の測定方法の具体例を以下に説明する 。ここでは、本発明の抗体として、 N- 10ペプチドを免疫原に用いて得られたモノクロ ーナル抗体（以下「抗 N- 10モノクローナル抗体」とも 、う）、基質として前述の GST- VWF73基質を用いた ADAMTS13活性の測定法を開示する力 抗体は本発明の 抗体であれば良ぐ基質は ADAMTS 13に水解されうるペプチドであればよぐ特に 上記のものに限定されるものではない。
1、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 GST抗体を 固相化しておき、固相上に GST-VWF73基質を予め固定ィ匕する。その固相と反応 用緩衝液及び検体を反応後、抗 N- 10モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗 N- 10モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中の ADAMTS13活性を 測定することが可能である。抗 N- 10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識し ておくことが好適である。
2、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 GST抗体を 固相化しておき、固相上に GST-VWF73基質を予め固定ィ匕する。その固相と反応 用緩衝液、検体及び抗 N- 10モノクローナル抗体を同時に反応させ、固相上の抗 N- 10モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中の ADAMTS 13活性を測 定することが可能である。抗 N- 10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識して おくことが好適である。
3、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 GST抗体を 固相化した抗 GST固相に、 GST-VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応さ せた後、抗 N- 10モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗 N- 10モノクローナル 抗体の量を測定することにより、検体中の ADAMTS13活性を測定することが可能 である。抗 N- 10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適で ある。
4、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 GST抗体を 固相化した抗 GST固相に、 GST-VWF73基質、反応用緩衝液、検体及び抗 N- 10 モノクローナル抗体を同時に反応させ、固相上の抗モノクローナル抗体の量を測定 することにより、検体中の ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗 N- 10 モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
5、試験管等の容器中で GST-VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた 後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相 担体に予め固定ィ匕した抗 GST抗体と反応させ、次 ヽで抗 N- 10モノクローナル抗体 を反応させ、固相上に結合した抗 N- 10モノクローナル抗体量を測定することにより、 ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗 N- 10モノクローナル抗体を公知 の標識物質で標識しておくことが好適である。
6、試験管等の容器中で GST-VWF73基質、反応用緩衝液、検体及び抗 N- 10モ ノクローナル抗体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チ ユーブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定ィ匕した抗 GST抗体と反応させ、固相 上に結合した抗 N - 10モノクローナル抗体量を測定することにより、 ADAMTS 13活 性を測定することが可能である。抗 N- 10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標 識しておくことが好適である。
7、試験管等の容器中で GST-VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた 後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相 担体に予め固定ィ匕した抗 N- 10モノクローナル抗体と反応させ、次 ヽで抗 GST抗体 を反応させ、固相上に結合した抗 GST抗体量を測定することにより、 ADAMTS 13 活性を測定することが可能である。抗 GST抗体を公知の標識物質で標識しておくこ とが好適である。
8、試験管等の容器中で GST-VWF73基質、反応用緩衝液、検体及び抗 GST抗 体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性 粒子等の固相担体に予め固定ィ匕した抗 N- 10モノクローナル抗体と反応させ、固相 上に結合した抗 GST抗体量を測定することにより、 ADAMTS 13活性を測定するこ とが可能である。抗 GST抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
9、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 N- 10モノク ローナル抗体を固相化した抗 N- 10モノクローナル抗体固相に、 GST-VWF73基 質、反応用緩衝液及び検体を同時に反応させた後、次いで抗 GST抗体を反応させ 、固相上に結合した抗 GST抗体量を測定することにより、 ADAMTS13活性を測定 することが可能である。抗 GST抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適で ある。また、抗 GST抗体と GST-VWF73基質を予め反応させておくことも本測定方 法の例にぉ 、て可能である。
10、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 N- 10モノ クローナル抗体を固相化した抗 N- 10モノクローナル抗体固相に、 GST-VWF73基 質、反応用緩衝液、検体及び抗 GST抗体を同時に反応させた後、固相上に結合し た抗 GST抗体量を測定することにより、 ADAMTS13活性を測定することが可能で ある。抗 GST抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。また、抗 GST 抗体と GST-VWF73基質を予め反応させておくことも本測定方法の例において可 能である。
11、抗 GST抗体を金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子等の肉眼的又は物理的検 出可能な微粒子に固定ィ匕し、その上に GST-VWF73基質を反応させ、さらに反応 用緩衝液と検体を加え、酵素反応を行う。その後、抗 N- 10モノクローナル抗体を固 定ィ匕したろ紙、メンブラン等の多孔性担体に反応液を導き、多孔性担体上に捕獲さ れる金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子等の粒子を検出することによって、 ADA MTS 13活性を測定することが可能である。抗 N- 10モノクローナル抗体を固定ィ匕し たろ紙、メンブラン等の多孔性担体に反応液を導く方法には、公知のラテラルフロー 法又はフロースルー法が好適に選択される。
12、公知のエバネッセント波光学検出に適した反応容器を固相担体として用い、上 記 4と同様に操作し、抗 N- 10モノクローナル抗体をエバネッセント波検出に適した蛍 光団で標識したものを用いると、エバネッセント波検出による ADAMTS 13活性の測 定が可能となる。さらにこの場合、経時的にエバネッセント波の強度を測定することに より、 AD AMTS 13酵素活性をレートアツセィすることも可能である。この方法を用い れば、洗浄操作や BZF分離操作を必要とせずに、ホジ-アスアッセィが可能である
13、抗 GST抗体を金コロイド粒子またはラテックス粒子等に固定ィ匕し、その上に GS T-VWF73基質を反応させ、さらに反応用緩衝液と検体を加え酵素反応を行う。そ の後、抗 N- 10モノクローナル抗体を反応液に加え、粒子の凝集反応を惹起させ、そ の凝集を光学的または肉眼的に検出することによって、 ADAMTS 13活性を測定す ることが可能である。
14、試験管等の容器中で GST-VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応させ た後、その反応混合液に抗 N- 10モノクローナル抗体を固定ィ匕した金コロイド粒子ま たはラテックス粒子を加えて反応させ、その後抗 GST抗体、好適には抗 GSTモノクロ ーナル抗体を反応液に加え、粒子の凝集反応を惹起させ、その凝集を光学的また は肉眼的に検出することによって、 ADAMTS 13活性を測定することが可能である。
15、ヒトまたは動物の VWFを基質として検体を反応させた後、反応液をゲル電気泳 動で分離し、本発明の抗体を反応させて ADAMTS13活性を測定することが可能で ある。
16、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 VWF抗体 を固相化しておき、固相上に VWFを予め固定ィ匕する。その固相と反応用緩衝液及 び検体を反応後、抗 N- 10モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗モノクローナ ル抗体の量を測定することにより、検体中の ADAMTS13活性を測定することが可 能である。
本発明の抗体を用いた ADAMTS13活性の測定方法のさらなる具体例として、以 下の方法を挙げることができる。本発明の抗体として、抗 N- 10モノクローナル抗体を 用い、基質としては前述した HRPで N末端を標識した VWF73基質を用いる力 これ らに限定されるものではない。
1、試験管等の容器中で HRP標識 VWF73基質、反応用緩衝液、検体を反応させた 後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相 担体に予め固定ィ匕した抗 N- 10モノクローナル抗体と反応させ、洗浄後、固相上の H RP活性を測定することにより、 ADAMTS 13活性を測定することが可能である。 2、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗 N- 10モノク ローナル抗体を固相化した抗 N- 10モノクローナル抗体固相に、 HRP標識した VW F73基質、反応用緩衝液、及び検体を同時に反応させ、洗浄後、固相上の HRP活 性を測定することにより、 ADAMTS 13活性を測定することが可能である。
[0033] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対して特異的反応性を有する抗体を用 いる場合には、上記の抗 GST抗体に代えて抗 Hisタグ抗体を用いることにより、同様 にして実施することができる。また、 GST及び Hisタグに代えて、異なるタグを用いた 場合にはそれぞれのタグに特異的に結合しうる結合体を用いることで、前記方法が 実施可能である。
[0034] 本発明の測定方法により測定される検体は特に制限はなぐ血液が一般的である 力 当該測定は、細胞、組織レベルで測定可能である他、当該細胞、組織力 の抽 出物等の試料を検体として用いても測定可能である。これらの測定方法は通常当分 野で行われて ヽる方法を適用し得る。
[0035] さらに本発明の新規抗体を試薬またはキットに含めることができる。ここでいう試薬 またはキットには、例えば試料中の ADAMTS13活性の測定用試薬またはキット、臨 床検査試薬またはキットが挙げられる。ここで用いる抗体は、モノクローナル抗体及 びポリクローナル抗体のいずれもを指し、本発明の目的を達成しうるものであれば限 定されるものではない。
[0036] 本発明の抗体は、 ADAMTS13活性測定による臨床検査にも適用され、本発明は 当該検査の方法にも及ぶ。適用される臨床検査は、血栓性血小板減少紫斑症 (TT P)、溶血性尿毒症候群 (HUS)、播種性血管内凝固症候群 (DIC)、脳梗塞、慢性 肝疾患、悪性腫瘍、 HIV、心筋梗塞、自己免疫疾患、妊娠合併症、急性腎不全等の 微小血管障害性疾患の病状進展のリスクファクターの検査に適用されうる。
[0037] 本発明は、 ADAMTS 13活性を測定するための試薬またはキット、および上述の 検査用の試薬またはキットにも及ぶ。これらの試薬またはキットは、本発明の抗体を 含み、所望により基質となりうる VWFもしくはペプチドを含む。試薬またはキットには、 前記の ADAMTS 13の基質および基質の水解生成物である N - 10ペプチドを含む 画分を、本発明の抗 N- 10モノクローナル抗体を用いて免疫学的測定するのに適し たものを適宜選択して含めることができる。例えば EIA法であれば、抗体を固相化し たマイクロプレートや磁性粒子等の固相試薬、標識抗体試薬、酵素基質試薬、標準 液、洗浄液等を適宜組み合わせてキットィ匕することが可能である。
[0038] 本発明には、例えば N- 10ペプチド (VWFまたは VWF73が切断されて生じる N末 端側の部位を有するペプチド)を用いた抗 N- 10モノクローナル抗体、およびこれらを 用いた ADAMTS13活性の測定法、および試薬もしくはキットのみならず、 ADAM TS13により基質 VWFまたは VWF73が切断されて新たに生じる C末端側の部位（ 切断後の C末端側のペプチドにお ヽては N末端近傍の部位）に対する抗体も含まれ る。より具体的には、配列表の配列番号 10で示されたペプチドに対する抗体、あるい は配列表の配列番号 12で示された配列を N末端側に含むペプチドに対する抗体で 、完全長の VWFや VWF73とは実質的に有意な反応を示さない抗体、これらの抗体 を用いた ADAMTS13活性の測定法、およびこれらの抗体を含む試薬もしくはキット も含まれる。
実施例
[0039] (実施例 1)
ハイプリドーマおよび抗 N- 10モノクローナル抗体の作製
ノヽイブリドーマの作製方法
(1)マウス： 7〜8週令の近交系 BALBZc系マウス雌を、動物飼育チ ンバー内（23 ± 1°C、湿度 70%)で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
(2)免疫抗原：化学合成した配列表の配列番号 2で示された N- 10ペプチドを KLH に化学結合させたものを N- 10ペプチド抗原として用いた。
(3)免疫方法: N- 10ペプチド抗原を 100 gZO. 5mlとなる様に PBSで調製し、同 量（0. 5ml)のフロイント完全アジュバント（Freund's complete adjuvant) (Difco社製） を混合して乳化した。この乳化状の抗原を 7週令の 4匹の雌の BALBZcマウスの腹 腔に 1匹あたり 200 1投与した。さらに 2週間毎に、 GERBUVANT(GERBU Biot echnik, GmbH, D-6901 Guiberg, Germany製）で 100 gZmlとなるように調 製した上記抗原を、マウスあたり 20 /z gずつ 4回投与した。さらに 1ヶ月後、 GERBU VANTで 100 /z gZmlとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マ ウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに 2週間後に PBSで 100 gZ mlに調製した N- 10ペプチド抗原を、マウス尾静脈より注射して最終免疫とした。尚、 抗体価の測定は、当該抗原で免疫したマウスの血清を用いて、後述のスクリーニング の方法に準じて行った。
(4)細胞融合:最終免疫から 3日後に BALBZcマウスの摘脾を行い、 DMEM培養 液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、細胞数を算定し 1. 9 X 108個の脾細胞を得た。細胞融合は、 2-ァミノ- 6-メルカプトプリン (6-チォ グァニン [2- amino- 6- mercaptopurine] )而性の BALBZcマウス由来骨髄腫培養細 胞株（P3-X63-Ag8 ' 653、以下 X63細胞ともいう）を親細胞株として用いた。 X63 細胞は、牛胎児血清（fetal calf serum: FCS) 10%を含む DMEM培養液（5 μ g/m 1 6-チォグァニン含有)で継代培養し、細胞融合の 3日前より 6-チォグァニンを含有 しない 10%FCS含有 DMEM培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。 X63細胞の細胞数を算定し、 1. 9 X 108個の生細胞を得た。 DMEM培養液で、ポリ エチレングリコール- 1500が 50 (wZv) %濃度となるように溶解し、上記の脾細胞と X 63細胞の比が 1 : 1となるように混合し、公知の方法 (ケラーとミルスタイン共著， Natur e,第 256卷, 495- 497頁， 1975年, Eur. J.Immunol.第 6卷， 511- 519頁, 1976年）に準 じて細胞融合を行った。その後、 10%FCSおよび 5%プリクローン (Archport社製） を添カ卩した DMEM培養液に、 1 X 10 Mのヒポキサンチン、 4 X 10_7Mのァメソプ テリン、および 1. 6 X 10_5Mのチミジンを含有する HAT選択液をカ卩え、脾細胞が 2. 0 X 106個 Zmlとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液の 100 1を、 96ゥ エルのマイクロタイタープレートの各ゥエルに分注した後、 CO無菌培養器において
2
温度 37°C、湿度 100% 5%の CO条件下で培養を行った。培養開始後、 3日目に
2
HAT培地 100 μ 1を各ゥエルに加え、その後 3日おきに半分量の HAT培地を交換し ながら培養を行った。 2 3週間後に、 目的の抗 ADAMTS13モノクローナル抗体を 産生するクローンを、 ADAMTS13抗原を固相に吸着させたマイクロプレートを用い たエライザ法による、後述のスクリーニングによって検索した。
(5)スクリーニング：上記ハイプリドーマ細胞の培養上清を用いて、 N- 10ペプチド固 相化工ライザプレート及び N- 15ペプチドとの反応により選択した。尚、精製 VWF及 び VWF73固相化工ライザプレートに反応する非特異反応性クローンを除去し、 N- 1 0ペプチドに特異的に反応するクローンを選別した。 N- 10ペプチドを 2 g/mlの濃 度に調製し、各々、 1ゥエル当たり 100 1ずつマイクロタイタープレートに添カ卩し、一 晚吸着させた後、 Tween-20を 0. 05%含むリン酸緩衝液 (以下洗浄液と略す)で 5 回洗浄し、さらに 10%ブロックエース（商品名）を含むリン酸緩衝液でブロッキングし N- 10ペプチド固相化プレートを調製した。上記で得られたノ、イブリドーマ細胞系の 培養上清 100 1を、当該固相化プレートに添加し、 37°Cで 60分間反応させた後、 洗浄液で 5回洗浄し、さらにホースラディッシュペルォキシダーゼ（以下 HRPと略す） 標識した抗マウスィムノグロブリン抗体 (ャギ由来）を 37°Cで 60分反応させた。この反 応の後、洗浄液で 4回洗浄し、基質液 (0 -フエ-レンジァミン 0. 4mgZml及び 0. 02 %H Oを含む）を 37°Cで 15分間反応させた後、この反応を 2N硫酸で停止させ、主
2 2
波長 492nmでェライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。 N- 10ペプチドを 固相化したェライザプレートに特異的に反応するハイブリドーマ細胞系を選別した後 、限界希釈法によりクローユングし、受託番号 FERM BP- 10480および FERM B P- 10479のハイブリドーマより、それぞれ抗 N- 10モノクローナル抗体、 VWF-pepti de Ab N10- 146および VWF-peptide Ab N10- 116 (以下、それぞれ「N10- 146」および「N 10 - 116」と略すこともある）を得た。
(実施例 2)
特異性の確認: N- 10ペプチド及び N- 15ペプチドを 2 μ g/mlの濃度に調製し、 各々、 1ゥエル当たり 100 1ずつマイクロタイタープレートに添カ卩し、ー晚吸着させた 後、 Tween- 20を 0. 05%含むリン酸緩衝液 (以下「洗浄液」と略す)で 5回洗浄し、さ らに 10%ブロックエース（商品名）を含むリン酸緩衝液でブロッキングし N- 10ぺプチ ド固相化プレート及び N- 15ペプチド固相化プレートを調製した。各クローンの培養 上清 100 1を各固相プレートに添加し、 37°Cで 60分間反応させた後、洗浄液で 5 回洗浄し、さらにホースラディッシュペルォキシダーゼ（以下「HRP」と略す)で標識し た抗マウスィムノグロブリン抗体 (ャギ由来）を 37°Cで 60分反応させた。この反応の後 、洗浄液で 4回洗浄し、基質液（0 -フエ-レンジァミン 0. 4mgZml及び 0. 02%H O を含む）を 37°Cで 15分間反応させた後、この反応を 2N硫酸で停止させ、主波長 49
2
2nmでェライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。
その結果を表 1に示した。
[表 1]
Figure imgf000024_0001
N- 15ペプチド固相で得られた吸光度はいずれも 0. 00であり、一方 N- 10ぺプチ ド固相で得られた吸光度は 0. 5以上を示した (表 1)。
従って、本発明のモノクローナル抗体は、 N- 10ペプチドの C末端近傍を特異的に 認識する抗体であることが判った。
[0041] (実施例 3)
マウスィムノグロブリンサブクラスの同定：上記クロー-ングにより単一クローンとして 得られたハイプリドーマ細胞系の産生するモノクローナル抗体について、マウスィムノ グロブリンサブクラスを決定した。マウスィムノグロブリンサブクラスの同定には、各ハ イブリドーマ細胞系の培養上清を用い、セロテック（Serotec)社製 Mouse Monocl onal Antibody Isotyping kitを用いた。その結果、クローン VWF- peptide Ab Nl 0- 116及び VWF- peptide Ab N10- 146は共に IgG2であることが判った。
[0042] (実施例 4)
マウスモノクローナル抗体の機能の確認:公知の方法により大腸菌で発現させた V WF73ペプチドの N末端側に GSTをタグとして融合させ、さらに C末端側にヒスチジ ン 6残基 (Hisタグ）を有する ADAMTS13活性測定用基質 (GST-VWF73基質）、 1 μ g/m 100 1を抗 GST抗体（ャギ由来、ポリクローナル抗体）を固定化したマ イクロタイタ一プレートに予め反応させ、固相化した基質に対して正常ヒト血漿 30 1 をカロえて 37°Cで 1時間反応させた。反応液は、 ADAMTS13が金属酵素であり、活 性発現には 2価金属を必要とすることから、 20mM塩化バリウムを含む 5mM Tris 塩酸緩衝液 (pH = 8) 100 1を用いた。盲検用反応液は 20mM塩化バリウムに代え て、 20mMEDTAを含む 5mM Tris塩酸緩衝液 (pH = 8)を用いた。反応終了後、 酵素基質反応混合液を除去、洗浄し、抗 N- 10モノクローナル抗体 (クローン、 VWF -peptide Ab N10- 146、以下「N10- 146」と略す）を 37°Cで 1時間反応させた。 洗浄して抗 N- 10モノクローナル抗体を除去した後、西洋ヮサビペルォキシダーゼ（ HRP)を標識した抗マウスィムノグロブリン抗体 (ャギ）を 37°Cで 1時間反応させ、洗 浄後、オルトフヱ-レンジァミン-過酸ィ匕水素を反応させ、反応終了後、 1M硫酸で反 応を停止した。波長 492nmの吸光度を測定した。
その結果を表 2に示した。
[表 2]
Figure imgf000025_0001
対照として用 、たクローン N 15Abでは ADAMTS 13による酵素反応が進行して！/ヽ る塩化バリウム含有反応液での吸光度と、反応が進行して ヽな ヽ EDTA含有反応液 での吸光度がほぼ等しぐ ADAMTS13による酵素反応により生成する N- 10ぺプ チドを VWF73基質と分別して測定できないことがわ力つた。一方、本発明の抗 N- 1 0モノクローナル抗体（N 10 - 146)では、 ADAMTS 13による酵素反応が進行して！/ヽ る塩化バリウム含有反応液での吸光度は、酵素反応が起きて ヽな ヽ EDTA含有反 応液での吸光度の 、ずれも約 14倍から 63倍を示し、さらに EDTA含有反応液での 吸光度はいずれのクローンでも 0. 2以下であった（表 2)。これらのことから、本発明の 抗 N- 10モノクローナル抗体は VWF73基質との反応性が極微小であり、基質が AD AMTS13により酵素的に水解されて生じる N- 10ペプチドと、非常に高い特異性を 有して反応することが判った。従って、本発明の抗 N- 10モノクローナル抗体を用い ることにより、 ADAMTS 13活性を測定することが可能であることが明らかになつた。 (実施例 5) 配列表の配列番号 2 8に示した 7種類の各ペプチド（各々、 N- 10ペプチド、 N-6 ペプチド、 N-8ペプチド、 N- 11ペプチド、 N-9ペプチド、 N- 13ペプチド、 N- 15ぺ プチド）を 1 μ gZmlの濃度でマイクロタイタープレートのゥエルに 100 μ 1ずつ分注し 2 8°Cで一夜放置後、洗浄、ブロッキングして各ペプチド固相を調製した。各ぺプ チド固相に西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼ (HRP)標識抗 N- 10モノクローナル抗 体 (N 10 - 146)を反応させ、抗 N 10 -モノクローナル抗体と各ペプチドの反応性を調 ベた。
その結果を表 3に示した。
[表 3]
Figure imgf000026_0002
N- 10モノクローナル抗体は N- 10ペプチドとのみ反応性を示し、他のいずれのぺ プチドとも有意な反応性を示さな力つた。従って、本発明の N- 10モノクローナル抗体 は N- 10ペプチドに特異的で、し力も、 N- 10ペプチドの C末端のチロシンを含む領 域に特異的であることが判った。
(実施例 6)
上記の結果をさら【こ確認するため【こ、各ペプチド、を 15. 6 31. 3 62. 5 125 2 50 500 lOOOngZmlの濃度で HRP標識抗 N- 10モノクローナル抗体（N10- 14 6)と予め反応させた後、 N- 10ペプチド固相と反応させた。
その結果を表 4に示した。
[表 4]
Figure imgf000026_0001
N- 10ペプチドを除!、て、 、ずれのペプチドも抗 N- 10モノクローナル抗体の N- 10 ペプチド固相への反応を阻害することは無かった。従って、本発明の抗 N10-モノク ローナル抗体は N- 10ペプチドに特異的で、し力も、 N- 10ペプチドの C末端のチロ シンを含む領域に特異的であることがより確かめられた。
[0045] (実施例 7)
正常ヒト血漿を、 56°Cで 30分間熱処理したヒト血漿 (加熱血漿)で X I、 X 2、 X 4、 X 8、 X 16、 X 32、 X 64倍希釈した試料及び加熱血漿を検体とした他は実施例 4と 同様に操作し、正常ヒト血漿の X Iを、 100%の ADAMTS13活性として ADAMTS 13活性測定の検量線を作成した。
その結果を、図 1に示す。 X軸は ADAMTS 13活性（％)を示し、 Y軸は 492nmの 吸光度を示す。 No. 116は、抗 N— 10モノクローナル抗体の N10- 116を用いて測 定を行った結果を示す。吸光度は、 ADAMTS 13活性に比例して上昇することが確 認され、本発明の方法により ADAMTS13活性を測定することが可能であることが判 つた o
[0046] (実施例 8)
実施例 4と同様に操作して ADAMTS 13活性の検量線を作成すると同時に、先天 性 ADAMTS 13欠損症（USS例）の血漿中の ADAMTS 13活性を測定した。 その結果、 USS例の ADAMTS13活性は 1%以下と算出された（図 1の矢印）。こ の結果は VWFマルチマー解析の結果とよく一致していた。従って、本発明の方法に より、 ADMTS 13活性を特異的に測定できることが判り、臨床検査に有用であること が明らかになった。
[0047] (実施例 9)
本発明の抗 N- 10モノクローナル抗体（N 10- 146)を 1 gZmlの濃度で 100 μ 1 ずつマイクロタイタープレートの各ゥエルに分注し一夜放置して、抗 Ν- 10抗体固相 を調製した。試験管に VWF73基質（1 /z gZml)の 100 1と、 10 1被検血漿 (実施 例 7と同様に正常ヒト血漿を加熱血漿で希釈して調製)とをとり、 37°Cで 1時間反応さ せた後、 50mM EDTAを 20 μ 1ずつ加え反応を停止させた。反応物 100 μ 1を抗 Ν - 10抗体固相と室温で 1時間反応させ、洗浄後 HRP標識抗 GST抗体 (ャギ由来)を 1時間反応させた。酵素反応により生じた吸光度を測定した。正常ヒト血漿の X Iを、 100%の被検血漿濃度 (ADAMTS13活性）とした。
得られた吸光度と被検血漿濃度 (ADAMTS 13活性）との関係を図 2に示した。 X 軸は被検血漿濃度 (ADAMTS13活性）（％)を示し、 Y軸は 492nmの吸光度を示 す。この結果、本発明の抗体を固相に用いることによって、 ADAMTS13活性を特 異的に測定できることがわ力つた。
産業上の利用可能性
本発明の抗 N- 10モノクローナル抗体を用いることにより、 ADAMTS13活性の測 定、検査が可能になり、それらの成果に基づく治療薬、診断薬等の開発に利用でき る。

Claims

請求の範囲
[1] フォンヴィルブランド因子 (VWF)又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を 含むペプチドに、 VWF切断酵素 (ADAMTS13)を作用させたときに生じる抗原決 定部位に対して反応性を有し、 VWF又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配 列を含むペプチドとは有意な反応性を有しな!/ヽ抗体。
[2] VWF又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、 ADAMT S 13を作用させたときに生じる抗原決定部位は、前記 VWF又は前記ペプチドが AD AMTS13により切断されたときに生じる抗原決定部位である、請求の範囲第 1項に 記載の抗体。
[3] 前記抗原決定部位が、 VWF又は前記ペプチドが ADAMTS13により切断された切 断部位おいて新たに生じた N末端側のペプチド断片又は C末端側のペプチド断片 に存在する、請求の範囲第 1項または第 2項に記載の抗体。
[4] 配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対して反応性を有する、請求の範囲第 1項
〜第 3項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
[5] 配列表の配列番号 2に記載のペプチドの C末端より少なくとも 4個のアミノ酸残基を含 む領域に対して反応性を有する、請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか 1項に記載 の抗体。
[6] 配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号 3
〜8に記載のいずれか 1項のペプチドに対して有意な反応性を有しない請求の範囲 第 1項〜第 5項のいずれか 1項に記載の抗体。
[7] 配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製した VW
Fに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか
1項に記載の抗体。
[8] 配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号 1に記 載の配列を含むペプチドに対する反応性よりも少なくとも 3倍大きい、請求の範囲第 1 項〜第 7項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
[9] 配列表の配列番号 2に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号 8に記 載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、請求の範囲第 1項〜第 8項 の！、ずれか 1項に記載の抗体。
[10] 配列表の配列番号 9に記載のアミノ酸配列を C末端に有するペプチドを免疫原として 得られる、請求の範囲第 1項〜第 9項のいずれ力 1項に記載の抗体。
[11] 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として得られる
、請求の範囲第 1項〜第 10項のいずれ力 1項に記載の抗体。
[12] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対して反応性を有する、請求の範囲第 1 項〜第 3項の 、ずれか 1項に記載の抗体。
[13] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドの N末端より少なくとも 4個のアミノ酸残基を 含む領域に対して反応性を有する、請求の範囲第 1項〜第 3項および第 12項のい ずれか 1項に記載の抗体。
[14] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号
2〜9に記載のいずれか 1のペプチドに対して有意な反応性を有しない、請求の範囲 第 1項〜第 3項、第 12項、および第 13項のいずれか 1項に記載の抗体。
[15] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製した V
WFに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、請求の範囲第 1項〜第 3項および第
12項〜第 14項のいずれか 1項に記載の抗体。
[16] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号 1に 記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも 3倍大きい、請求の範囲第 1項〜第 3 項および第 12項〜第 15項のいずれか 1項に記載の抗体。
[17] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号 8及 び 11に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも 5倍大きい、請求の範囲第 1 項〜第 3項および第 12項〜第 16項のいずれか 1項に記載の抗体。
[18] 配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列を N末端に有するペプチドを免疫原とし て得られる、請求の範囲第 1項〜第 3項および第 12項〜第 17項のいずれか 1項に 記載の抗体。
[19] 配列表の配列番号 10に記載のペプチドを免疫原として得られる、請求の範囲第 1項
〜第 3項および第 12項〜第 18項のいずれか 1項に記載の抗体。
[20] モノクローナル抗体である請求の範囲第 1項〜第 19項のいずれ力 1項に記載の抗体
[21] 寄託番号が FERM P-20482又は FERM P-20483であるハイプリドーマにより 産生されるモノクローナル抗体である、請求の範囲第 1項〜第 11項のいずれか 1項 に記載の抗体。
[22] 請求の範囲第 20項に記載のモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマ。
[23] 寄託番号が FERM P- 20482又は FERM P- 20483である請求の範囲第 22項に 記載のハイプリドーマ。
[24] ADAMTS13により切断されうる基質ペプチドを、 ADAMTS 13活性を検定しようと する検体と反応させる工程、及び該工程の反応生成物に請求の範囲第 1項〜第 21 項のいずれ力 1項に記載の少なくとも 1種の抗体を反応させる工程を含む、 ADAM TS 13活性の測定方法。
[25] 配列表の配列番号 1に記載の配列を含むペプチドと ADAMTS 13活性を検定しょう とする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に請求の範囲第 1項〜第 21項のいずれか 1項に記載の少なくとも 1種の抗体を反応させる工程を含む試料中 の ADAMTS 13活性の測定方法。
[26] VWFと ADAMTS13活性を検定しょうとする検体とを反応させる工程、及び該工程 の反応生成物に請求の範囲第 1項〜第 21項のいずれか 1項に記載の少なくとも 1種 の抗体を反応させる工程を含む試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
[27] 前記抗体が標識物質で標識されて!、る、請求の範囲第 24項〜第 26項の 、ずれか 1 項に記載の試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
[28] 前記抗体が固相担体に固定ィ匕されている、請求の範囲第 24項〜第 27項のいずれ 力 1項に記載の試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
[29] 前記抗体が水不溶性の粒子に担持されている、請求の範囲第 24項〜第 28項のい ずれ力 1項に記載の試料中の ADAMTS 13活性の測定方法。
[30] 請求の範囲第 24項〜第 29項のいずれか 1項に記載の方法によって、微小血管障害 性疾患を検査する方法。
[31] 請求の範囲第 1項〜第 21項のいずれか 1項に記載の抗体を含む、試薬またはキット
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