JPWO2006085441A1 - Adamts13活性検定用抗体及び活性検定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
非特許文献6〜8によれば、ADAMTS13の基質であるVWFのA2ドメイン又はその一部を用いたADAMTS13活性の測定法が報告されている。これらは天然の基質ではなく、遺伝子組換えにより大腸菌に発現させた基質である。上記測定法ではこれらの基質が、血漿試料中のADAMTS13により分解されることを利用して、電気泳動ウエスタンブロットによる基質分子の分子量の検定、および基質と酵素の反応後の未分解残存基質の免疫学的測定によるADAMTS13活性の検出、測定を行っている。しかし、これらの方法では、ADAMTS13の活性と得られるシグナル強度が逆相関し、いわゆる検量線が負の傾きをとるため、臨床的に重要な5%以下の低値領域での感度および再現性が得られず、課題となっていた。
これらの課題を改善する方法として、消光性蛍光基質を用いた血漿ADAMTS13活性の測定法が報告されている(非特許文献9)。この方法は、ADAMTS13の活性の増加に伴って蛍光強度が増加する正の傾きをしめす検量線を有する。しかし、化学合成した特殊な高価な基質を用いて、蛍光計を用いてレートアッセイしなければならないため、一般の臨床検査の検査室で用いるには課題があった。
New Engl. J. Med. 339, 1578-1584, 1998 New Engl. J. Med. 339, 1585-1594, 1988 J. Hematol. 74, 101-108, 2001 J Biochem. 130, 475-480, 2001 J. Biol. Chem. 276, 41059-41063, 2001 Blood, 103, 607-612, 2004 J. Thromb. Haemost. 2, 485-491, 2004 Thromb Haemost. 91, 806-811, 2004 日本血栓止血学会誌, 15, 421, 2004
1.フォンヴィルブランド因子(VWF)又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、VWF切断酵素(ADAMTS13)を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して反応性を有し、VWF又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドとは有意な反応性を有しない抗体。
2.VWF又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、ADAMTS13を作用させたときに生じる抗原決定部位は、前記VWF又は前記ペプチドがADAMTS13により切断されたときに生じる抗原決定部位である、前項第1項に記載の抗体。
3.前記抗原決定部位が、VWF又は前記ペプチドがADAMTS13により切断された切断部位おいて新たに生じたN末端側のペプチド断片又はC末端側のペプチド断片に存在する、前項第1項または第2項に記載の抗体。
4.配列表の配列番号2に記載のペプチドに対して反応性を有する、前項第1項〜第3項のいずれか1項に記載の抗体。
5.配列表の配列番号2に記載のペプチドのC末端より少なくとも4個のアミノ酸残基を含む領域に対して反応性を有する、前項第1項〜第4項のいずれか1項に記載の抗体。
6.配列表の配列番号2に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号3〜8に記載のいずれか1項のペプチドに対して有意な反応性を有しない前項第1項〜第5項のいずれか1項に記載の抗体。
7.配列表の配列番号2に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製したVWFに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、前項第1項〜第6項のいずれか1項に記載の抗体。
8.配列表の配列番号2に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号1に記載の配列を含むペプチドに対する反応性よりも少なくとも3倍大きい、前項第1項〜第7項のいずれか1項に記載の抗体。
9.配列表の配列番号2に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号8に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、前項第1項〜第8項のいずれか1項に記載の抗体。
10.配列表の配列番号9に記載のアミノ酸配列をC末端に有するペプチドを免疫原として得られる、前項第1項〜第9項のいずれか1項に記載の抗体。
11.配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として得られる、前項第1項〜第10項のいずれか1項に記載の抗体。
12.配列表の配列番号10に記載のペプチドに対して反応性を有する、前項第1項〜第3項のいずれか1項に記載の抗体。
13.配列表の配列番号10に記載のペプチドのN末端より少なくとも4個のアミノ酸残基を含む領域に対して反応性を有する、前項第1項〜第3項および第12項のいずれか1項に記載の抗体。
14.配列表の配列番号10に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号2〜9に記載のいずれか1のペプチドに対して有意な反応性を有しない、前項第1項〜第3項、第12項、および第13項のいずれか1項に記載の抗体。
15.配列表の配列番号10に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製したVWFに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、前項第1項〜第3項および第12項〜第14項のいずれか1項に記載の抗体。
16.配列表の配列番号10に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号1に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも3倍大きい、前項第1項〜第3項および第12項〜第15項のいずれか1項に記載の抗体。
17.配列表の配列番号10に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号8及び11に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、前項第1項〜第3項および第12項〜第16項のいずれか1項に記載の抗体。
18.配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列をN末端に有するペプチドを免疫原として得られる、前項第1項〜第3項および第12項〜第17項のいずれか1項に記載の抗体。
19.配列表の配列番号10に記載のペプチドを免疫原として得られる、前項第1項〜第3項および第12項〜第18項のいずれか1項に記載の抗体。
20.モノクローナル抗体である前項第1項〜第19項のいずれか1項に記載の抗体。
21.寄託番号がFERM BP‐10480又はFERM BP‐10479であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、前項第1項〜第11項のいずれか1項に記載の抗体。
22.前項第20項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
23.寄託番号がFERM BP‐10480又はFERM BP‐10479である前項第22項に記載のハイブリドーマ。
24.ADAMTS13により切断されうる基質ペプチドを、ADAMTS13活性を検定しようとする検体と反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第1項〜第21項のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体を反応させる工程を含む、ADAMTS13活性の測定方法。
25.配列表の配列番号1に記載の配列を含むペプチドとADAMTS13活性を検定しようとする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第1項〜第21項のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体を反応させる工程を含む試料中のADAMTS13活性の測定方法。
26.VWFとADAMTS13活性を検定しようとする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第1項〜第21項のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体を反応させる工程を含む試料中のADAMTS13活性の測定方法。
27.前記抗体が標識物質で標識されている、前項第24項〜第26項のいずれか1項に記載の試料中のADAMTS13活性の測定方法。
28.前記抗体が固相担体に固定化されている、前項第24項〜第27項のいずれか1項に記載の試料中のADAMTS13活性の測定方法。
29.前記抗体が水不溶性の粒子に担持されている、前項第24項〜第28項のいずれか1項に記載の試料中のADAMTS13活性の測定方法。
30.前項第24項〜第29項のいずれか1項に記載の方法によって、微小血管障害性疾患を検査する方法。
31.前項第1項〜第21項のいずれか1項に記載の抗体を含む、試薬またはキット。
上記N‐10ペプチドを免疫原として用いることにより、フォンヴィルブランド因子(VWF)又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、VWF切断酵素(ADAMTS13)を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して特異的反応性を有し、ADAMTS13の作用を受けていないVWFまたは前記ペプチドとは有意な特異的反応性を有しない、本発明の抗体を得ることができた。本明細書においては、ADAMTS13の作用をうけておらず、切断されていないVWF又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを、まとめて「完全なVWF分子」ともいう。また、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドは、ADAMTS13の水解を受けうるものであればよく、73個〜2050個のアミノ酸からなり、好ましくは73個〜210個、より好ましくは配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド(アミノ酸数73個)である。
かかる抗原決定部位の一例として、配列番号1に記載のペプチドがADAMTSにより水解された際に生じるN末端側のペプチド断片(配列番号2のペプチド)にできる抗原決定部位が挙げられる。N末端側の抗原決定部位は、C末端にチロシン(Tyr)が存在することを必須とする。また、配列番号2のN末端のアミノ酸が1つ少ないペプチドは抗原性を有するが、2つ少ないぺプチドは抗原性を有しないことから、上記N末端側の抗原決定部位は、少なくとも9個のアミノ酸からなる折れ曲がり構造のようなものと推測される。
また、「有意な反応性を有しない」とは、完全なVWF分子とは有意な結合性を有さないため、ウエスタンブロット、ELISA等の公知の免疫化学的手法により分析したときに、バックグランドの信号(抗体を含まない場合の信号、若しくは分析対象物に無関係な抗体により得られる信号)と比して同等程度の信号しか得られないものをいう。
当該基質をADAMTS13活性を測定しようとする試料と一定時間反応させ、酵素基質反応混合液中に生成する生成物(例えば、VWF73基質を用いた場合はN‐10ペプチド)を含む画分を測定する。測定法は、本発明の抗体を用いる限り、限定されない。該方法には、通常当分野で行われる各種のイムノアッセイが利用され得る。該方法は、酵素基質反応混合液と本発明の抗体とを反応させ、形成される免疫複合体を測定する工程を含むものであれば特に限定されず、沈降反応もしくは凝集反応を光学的に検出する免疫比濁法、または分別検出の容易な物質で標識した抗体を用いる標識化免疫測定法などを用いることができる。
標識化免疫測定法には、免疫複合体の検出のための標識としてRIを用いるラジオイムノアッセイ、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼ等の酵素を用いるエンザイムイムノアッセイ、蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイなどが含まれる。標識する対象によって、検出すべき抗体を直接標識する直接法、検出すべき抗体の抗体つまり二次抗体を標識する間接法などを用いることができる。間接法を用いる場合、例えば、本発明の抗体がマウスIgGモノクローナル抗体である場合、二次抗体としては例えば抗マウスIgGポリクローナル抗体等を使用すればよい。該二次抗体の調製法、並びに抗体の蛍光物質、RIおよび酵素等による標識は、当分野で慣用の方法を用いて行うことができる。また、当該測定法にビオチン‐アビジン(又はストレプトアビジン)の反応を利用する方法も可能であり、高い感度が要求される測定の場合には好ましく採用される。当該方法としては、例えばビオチンで標識した本発明の抗体と蛍光物質等で標識したストレプトアビジンとを組み合わせて用いるものが挙げられる。本発明の抗体のビオチンでの標識、ストレプトアビジンの蛍光物質等での標識は、当分野で通常行われる方法を用いて行うことができ、例えば蛍光物質等で標識したストレプトアビジンは商業的にも入手可能である。
1、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗GST抗体を固相化しておき、固相上にGST‐VWF73基質を予め固定化する。その固相と反応用緩衝液及び検体を反応後、抗N‐10モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗N‐10モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のADAMTS13活性を測定することが可能である。抗N‐10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
2、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗GST抗体を固相化しておき、固相上にGST‐VWF73基質を予め固定化する。その固相と反応用緩衝液、検体及び抗N‐10モノクローナル抗体を同時に反応させ、固相上の抗N‐10モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のADAMTS13活性を測定することが可能である。抗N‐10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
3、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗GST抗体を固相化した抗GST固相に、GST‐VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、抗N‐10モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗N‐10モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のADAMTS13活性を測定することが可能である。抗N‐10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
4、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗GST抗体を固相化した抗GST固相に、GST‐VWF73基質、反応用緩衝液、検体及び抗N‐10モノクローナル抗体を同時に反応させ、固相上の抗モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のADAMTS13活性を測定することが可能である。抗N‐10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
5、試験管等の容器中でGST‐VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗GST抗体と反応させ、次いで抗N‐10モノクローナル抗体を反応させ、固相上に結合した抗N‐10モノクローナル抗体量を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗N‐10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
6、試験管等の容器中でGST‐VWF73基質、反応用緩衝液、検体及び抗N‐10モノクローナル抗体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗GST抗体と反応させ、固相上に結合した抗N‐10モノクローナル抗体量を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗N‐10モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
7、試験管等の容器中でGST‐VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗N‐10モノクローナル抗体と反応させ、次いで抗GST抗体を反応させ、固相上に結合した抗GST抗体量を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗GST抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
8、試験管等の容器中でGST‐VWF73基質、反応用緩衝液、検体及び抗GST抗体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗N‐10モノクローナル抗体と反応させ、固相上に結合した抗GST抗体量を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗GST抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
9、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗N‐10モノクローナル抗体を固相化した抗N‐10モノクローナル抗体固相に、GST‐VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を同時に反応させた後、次いで抗GST抗体を反応させ、固相上に結合した抗GST抗体量を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗GST抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。また、抗GST抗体とGST‐VWF73基質を予め反応させておくことも本測定方法の例において可能である。
10、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗N‐10モノクローナル抗体を固相化した抗N‐10モノクローナル抗体固相に、GST‐VWF73基質、反応用緩衝液、検体及び抗GST抗体を同時に反応させた後、固相上に結合した抗GST抗体量を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗GST抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。また、抗GST抗体とGST‐VWF73基質を予め反応させておくことも本測定方法の例において可能である。
11、抗GST抗体を金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子等の肉眼的又は物理的検出可能な微粒子に固定化し、その上にGST‐VWF73基質を反応させ、さらに反応用緩衝液と検体を加え、酵素反応を行う。その後、抗N‐10モノクローナル抗体を固定化したろ紙、メンブラン等の多孔性担体に反応液を導き、多孔性担体上に捕獲される金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子等の粒子を検出することによって、ADAMTS13活性を測定することが可能である。抗N‐10モノクローナル抗体を固定化したろ紙、メンブラン等の多孔性担体に反応液を導く方法には、公知のラテラルフロー法又はフロースルー法が好適に選択される。
12、公知のエバネッセント波光学検出に適した反応容器を固相担体として用い、上記4と同様に操作し、抗N‐10モノクローナル抗体をエバネッセント波検出に適した蛍光団で標識したものを用いると、エバネッセント波検出によるADAMTS13活性の測定が可能となる。さらにこの場合、経時的にエバネッセント波の強度を測定することにより、ADAMTS13酵素活性をレートアッセイすることも可能である。この方法を用いれば、洗浄操作やB/F分離操作を必要とせずに、ホジニアスアッセイが可能である。
13、抗GST抗体を金コロイド粒子またはラテックス粒子等に固定化し、その上にGST‐VWF73基質を反応させ、さらに反応用緩衝液と検体を加え酵素反応を行う。その後、抗N‐10モノクローナル抗体を反応液に加え、粒子の凝集反応を惹起させ、その凝集を光学的または肉眼的に検出することによって、ADAMTS13活性を測定することが可能である。
14、試験管等の容器中でGST‐VWF73基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、その反応混合液に抗N‐10モノクローナル抗体を固定化した金コロイド粒子またはラテックス粒子を加えて反応させ、その後抗GST抗体、好適には抗GSTモノクローナル抗体を反応液に加え、粒子の凝集反応を惹起させ、その凝集を光学的または肉眼的に検出することによって、ADAMTS13活性を測定することが可能である。
15、ヒトまたは動物のVWFを基質として検体を反応させた後、反応液をゲル電気泳動で分離し、本発明の抗体を反応させてADAMTS13活性を測定することが可能である。
16、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗VWF抗体を固相化しておき、固相上にVWFを予め固定化する。その固相と反応用緩衝液及び検体を反応後、抗N‐10モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のADAMTS13活性を測定することが可能である。
1、試験管等の容器中でHRP標識VWF73基質、反応用緩衝液、検体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗N‐10モノクローナル抗体と反応させ、洗浄後、固相上のHRP活性を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。
2、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗N‐10モノクローナル抗体を固相化した抗N‐10モノクローナル抗体固相に、HRP標識したVWF73基質、反応用緩衝液、及び検体を同時に反応させ、洗浄後、固相上のHRP活性を測定することにより、ADAMTS13活性を測定することが可能である。
ハイブリドーマおよび抗N‐10モノクローナル抗体の作製
ハイブリドーマの作製方法
(1)マウス:7〜8週令の近交系BALB/c系マウス雌を、動物飼育チェンバー内(23±1℃、湿度70%)で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
(2)免疫抗原:化学合成した配列表の配列番号2で示されたN‐10ペプチドをKLHに化学結合させたものをN‐10ペプチド抗原として用いた。
(3)免疫方法:N‐10ペプチド抗原を100μg/0.5mlとなる様にPBSで調製し、同量(0.5ml)のフロイント完全アジュバント(Freund's complete adjuvant)(Difco社製)を混合して乳化した。この乳化状の抗原を7週令の4匹の雌のBALB/cマウスの腹腔に1匹あたり200μl投与した。さらに2週間毎に、GERBUVANT(GERBU Biotechnik,GmbH,D‐6901 Guiberg,Germany製)で100μg/mlとなるように調製した上記抗原を、マウスあたり20μgずつ4回投与した。さらに1ヶ月後、GERBUVANTで100μg/mlとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに2週間後にPBSで100μg/mlに調製したN‐10ペプチド抗原を、マウス尾静脈より注射して最終免疫とした。尚、抗体価の測定は、当該抗原で免疫したマウスの血清を用いて、後述のスクリーニングの方法に準じて行った。
(4)細胞融合:最終免疫から3日後にBALB/cマウスの摘脾を行い、DMEM培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、細胞数を算定し、1.9×108個の脾細胞を得た。細胞融合は、2‐アミノ‐6‐メルカプトプリン(6‐チオグアニン[2-amino-6-mercaptopurine])耐性のBALB/cマウス由来骨髄腫培養細胞株(P3‐X63‐Ag8・653、以下X63細胞ともいう)を親細胞株として用いた。X63細胞は、牛胎児血清(fetal calf serum: FCS)10%を含むDMEM培養液(5μg/ml、6‐チオグアニン含有)で継代培養し、細胞融合の3日前より6‐チオグアニンを含有しない10%FCS含有DMEM培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。X63細胞の細胞数を算定し、1.9×108個の生細胞を得た。DMEM培養液で、ポリエチレングリコール‐1500が50(w/v)%濃度となるように溶解し、上記の脾細胞とX63細胞の比が1:1となるように混合し、公知の方法(ケラーとミルスタイン共著,Nature, 第256 巻,495-497頁, 1975年, Eur. J.Immunol. 第6巻, 511-519頁, 1976年)に準じて細胞融合を行った。その後、10%FCSおよび5%ブリクローン(Archport社製)を添加したDMEM培養液に、1×10−4Mのヒポキサンチン、4×10−7Mのアメソプテリン、および1.6×10−5Mのチミジンを含有するHAT選択液を加え、脾細胞が2.0×106個/mlとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液の100μlを、96ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエルに分注した後、CO2無菌培養器において温度37℃、湿度100%、5%のCO2条件下で培養を行った。培養開始後、3日目にHAT培地100μlを各ウエルに加え、その後3日おきに半分量のHAT培地を交換しながら培養を行った。2〜3週間後に、目的の抗ADAMTS13モノクローナル抗体を産生するクローンを、ADAMTS13抗原を固相に吸着させたマイクロプレートを用いたエライザ法による、後述のスクリーニングによって検索した。
(5)スクリーニング:上記ハイブリドーマ細胞の培養上清を用いて、N‐10ペプチド固相化エライザプレート及びN‐15ペプチドとの反応により選択した。尚、精製VWF及びVWF73固相化エライザプレートに反応する非特異反応性クローンを除去し、N‐10ペプチドに特異的に反応するクローンを選別した。N‐10ペプチドを2μg/mlの濃度に調製し、各々、1ウエル当たり100μlずつマイクロタイタープレートに添加し、一晩吸着させた後、Tween‐20を0.05%含むリン酸緩衝液(以下洗浄液と略す)で5回洗浄し、さらに10%ブロックエース(商品名)を含むリン酸緩衝液でブロッキングしN‐10ペプチド固相化プレートを調製した。上記で得られたハイブリドーマ細胞系の培養上清100μlを、当該固相化プレートに添加し、37℃で60分間反応させた後、洗浄液で5回洗浄し、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ(以下HRPと略す)標識した抗マウスイムノグロブリン抗体(ヤギ由来)を37℃で60分反応させた。この反応の後、洗浄液で4回洗浄し、基質液(o‐フェニレンジアミン0.4mg/ml及び0.02%H2O2を含む)を37℃で15分間反応させた後、この反応を2N硫酸で停止させ、主波長492nmでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。N‐10ペプチドを固相化したエライザプレートに特異的に反応するハイブリドーマ細胞系を選別した後、限界希釈法によりクローニングし、受託番号FERM BP‐10480およびFERM BP‐10479のハイブリドーマより、それぞれ抗N‐10モノクローナル抗体、VWF‐peptide Ab N10‐146およびVWF‐peptide Ab N10‐116(以下、それぞれ「N10‐146」および「N10‐116」と略すこともある)を得た。
特異性の確認:N‐10ペプチド及びN‐15ペプチドを2μg/mlの濃度に調製し、各々、1ウエル当たり100μlずつマイクロタイタープレートに添加し、一晩吸着させた後、Tween‐20を0.05%含むリン酸緩衝液(以下「洗浄液」と略す)で5回洗浄し、さらに10%ブロックエース(商品名)を含むリン酸緩衝液でブロッキングしN‐10ペプチド固相化プレート及びN‐15ペプチド固相化プレートを調製した。各クローンの培養上清100μlを各固相プレートに添加し、37℃で60分間反応させた後、洗浄液で5回洗浄し、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ(以下「HRP」と略す)で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体(ヤギ由来)を37℃で60分反応させた。この反応の後、洗浄液で4回洗浄し、基質液(o‐フェニレンジアミン0.4mg/ml及び0.02%H2O2を含む)を37℃で15分間反応させた後、この反応を2N硫酸で停止させ、主波長492nmでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。
その結果を表1に示した。
従って、本発明のモノクローナル抗体は、N‐10ペプチドのC末端近傍を特異的に認識する抗体であることが判った。
マウスイムノグロブリンサブクラスの同定:上記クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマ細胞系の産生するモノクローナル抗体について、マウスイムノグロブリンサブクラスを決定した。マウスイムノグロブリンサブクラスの同定には、各ハイブリドーマ細胞系の培養上清を用い、セロテック(Serotec)社製Mouse Monoclonal Antibody Isotyping kitを用いた。その結果、クローンVWF‐peptide Ab N10‐116及びVWF‐peptide Ab N10‐146は共にIgG2であることが判った。
マウスモノクローナル抗体の機能の確認:公知の方法により大腸菌で発現させたVWF73ペプチドのN末端側にGSTをタグとして融合させ、さらにC末端側にヒスチジン6残基(Hisタグ)を有するADAMTS13活性測定用基質(GST‐VWF73基質)、1μg/ml、100μlを抗GST抗体(ヤギ由来、ポリクローナル抗体)を固定化したマイクロタイタープレートに予め反応させ、固相化した基質に対して正常ヒト血漿30μlを加えて37℃で1時間反応させた。反応液は、ADAMTS13が金属酵素であり、活性発現には2価金属を必要とすることから、20mM塩化バリウムを含む5mM Tris塩酸緩衝液(pH=8)100μlを用いた。盲検用反応液は20mM塩化バリウムに代えて、20mMEDTAを含む5mM Tris塩酸緩衝液(pH=8)を用いた。反応終了後、酵素基質反応混合液を除去、洗浄し、抗N‐10モノクローナル抗体(クローン、VWF‐peptide Ab N10‐146、以下「N10‐146」と略す)を37℃で1時間反応させた。洗浄して抗N‐10モノクローナル抗体を除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を標識した抗マウスイムノグロブリン抗体(ヤギ)を37℃で1時間反応させ、洗浄後、オルトフェニレンジアミン‐過酸化水素を反応させ、反応終了後、1M硫酸で反応を停止した。波長492nmの吸光度を測定した。
その結果を表2に示した。
配列表の配列番号2〜8に示した7種類の各ペプチド(各々、N‐10ペプチド、N‐6ペプチド、N‐8ペプチド、N‐11ペプチド、N‐9ペプチド、N‐13ペプチド、N‐15ペプチド)を1μg/mlの濃度でマイクロタイタープレートのウエルに100μlずつ分注し、2〜8℃で一夜放置後、洗浄、ブロッキングして各ペプチド固相を調製した。各ペプチド固相に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ(HRP)標識抗N‐10モノクローナル抗体(N10‐146)を反応させ、抗N10‐モノクローナル抗体と各ペプチドの反応性を調べた。
その結果を表3に示した。
上記の結果をさらに確認するために、各ペプチドを15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000ng/mlの濃度でHRP標識抗N‐10モノクローナル抗体(N10‐146)と予め反応させた後、N‐10ペプチド固相と反応させた。
その結果を表4に示した。
正常ヒト血漿を、56℃で30分間熱処理したヒト血漿(加熱血漿)で×1、×2、×4、×8、×16、×32、×64倍希釈した試料及び加熱血漿を検体とした他は実施例4と同様に操作し、正常ヒト血漿の×1を、100%のADAMTS13活性としてADAMTS13活性測定の検量線を作成した。
その結果を、図1に示す。X軸はADAMTS13活性(%)を示し、Y軸は492nmの吸光度を示す。No.116は、抗N−10モノクローナル抗体のN10‐116を用いて測定を行った結果を示す。吸光度は、ADAMTS13活性に比例して上昇することが確認され、本発明の方法によりADAMTS13活性を測定することが可能であることが判った。
実施例4と同様に操作してADAMTS13活性の検量線を作成すると同時に、先天性ADAMTS13欠損症(USS例)の血漿中のADAMTS13活性を測定した。
その結果、USS例のADAMTS13活性は1%以下と算出された(図1の矢印)。この結果はVWFマルチマー解析の結果とよく一致していた。従って、本発明の方法により、ADMTS13活性を特異的に測定できることが判り、臨床検査に有用であることが明らかになった。
本発明の抗N‐10モノクローナル抗体(N10‐146)を1μg/mlの濃度で100μlずつマイクロタイタープレートの各ウエルに分注し一夜放置して、抗N‐10抗体固相を調製した。試験管にVWF73基質(1μg/ml)の100μlと、10μl被検血漿(実施例7と同様に正常ヒト血漿を加熱血漿で希釈して調製)とをとり、37℃で1時間反応させた後、50mM EDTAを20μlずつ加え反応を停止させた。反応物100μlを抗N‐10抗体固相と室温で1時間反応させ、洗浄後HRP標識抗GST抗体(ヤギ由来)を1時間反応させた。酵素反応により生じた吸光度を測定した。正常ヒト血漿の×1を、100%の被検血漿濃度(ADAMTS13活性)とした。
得られた吸光度と被検血漿濃度(ADAMTS13活性)との関係を図2に示した。X軸は被検血漿濃度(ADAMTS13活性)(%)を示し、Y軸は492nmの吸光度を示す。この結果、本発明の抗体を固相に用いることによって、ADAMTS13活性を特異的に測定できることがわかった。
Claims (31)
- フォンヴィルブランド因子(VWF)又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、VWF切断酵素(ADAMTS13)を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して反応性を有し、VWF又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドとは有意な反応性を有しない抗体。
- VWF又は配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、ADAMTS13を作用させたときに生じる抗原決定部位は、前記VWF又は前記ペプチドがADAMTS13により切断されたときに生じる抗原決定部位である、請求の範囲第1項に記載の抗体。
- 前記抗原決定部位が、VWF又は前記ペプチドがADAMTS13により切断された切断部位おいて新たに生じたN末端側のペプチド断片又はC末端側のペプチド断片に存在する、請求の範囲第1項または第2項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号2に記載のペプチドに対して反応性を有する、請求の範囲第1項〜第3項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号2に記載のペプチドのC末端より少なくとも4個のアミノ酸残基を含む領域に対して反応性を有する、請求の範囲第1項〜第4項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号2に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号3〜8に記載のいずれか1項のペプチドに対して有意な反応性を有しない請求の範囲第1項〜第5項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号2に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製したVWFに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、請求の範囲第1項〜第6項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号2に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号1に記載の配列を含むペプチドに対する反応性よりも少なくとも3倍大きい、請求の範囲第1項〜第7項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号2に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号8に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、請求の範囲第1項〜第8項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号9に記載のアミノ酸配列をC末端に有するペプチドを免疫原として得られる、請求の範囲第1項〜第9項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として得られる、請求の範囲第1項〜第10項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号10に記載のペプチドに対して反応性を有する、請求の範囲第1項〜第3項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号10に記載のペプチドのN末端より少なくとも4個のアミノ酸残基を含む領域に対して反応性を有する、請求の範囲第1項〜第3項および第12項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号10に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号2〜9に記載のいずれか1のペプチドに対して有意な反応性を有しない、請求の範囲第1項〜第3項、第12項、および第13項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号10に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製したVWFに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、請求の範囲第1項〜第3項および第12項〜第14項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号10に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号1に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも3倍大きい、請求の範囲第1項〜第3項および第12項〜第15項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号10に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号8及び11に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも5倍大きい、請求の範囲第1項〜第3項および第12項〜第16項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列をN末端に有するペプチドを免疫原として得られる、請求の範囲第1項〜第3項および第12項〜第17項のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列表の配列番号10に記載のペプチドを免疫原として得られる、請求の範囲第1項〜第3項および第12項〜第18項のいずれか1項に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である請求の範囲第1項〜第19項のいずれか1項に記載の抗体。
- 寄託番号がFERM P‐20482又はFERM P‐20483であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、請求の範囲第1項〜第11項のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求の範囲第20項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 寄託番号がFERM P‐20482又はFERM P‐20483である請求の範囲第22項に記載のハイブリドーマ。
- ADAMTS13により切断されうる基質ペプチドを、ADAMTS13活性を検定しようとする検体と反応させる工程、及び該工程の反応生成物に請求の範囲第1項〜第21項のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体を反応させる工程を含む、ADAMTS13活性の測定方法。
- 配列表の配列番号1に記載の配列を含むペプチドとADAMTS13活性を検定しようとする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に請求の範囲第1項〜第21項のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体を反応させる工程を含む試料中のADAMTS13活性の測定方法。
- VWFとADAMTS13活性を検定しようとする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に請求の範囲第1項〜第21項のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体を反応させる工程を含む試料中のADAMTS13活性の測定方法。
- 前記抗体が標識物質で標識されている、請求の範囲第24項〜第26項のいずれか1項に記載の試料中のADAMTS13活性の測定方法。
- 前記抗体が固相担体に固定化されている、請求の範囲第24項〜第27項のいずれか1項に記載の試料中のADAMTS13活性の測定方法。
- 前記抗体が水不溶性の粒子に担持されている、請求の範囲第24項〜第28項のいずれか1項に記載の試料中のADAMTS13活性の測定方法。
- 請求の範囲第24項〜第29項のいずれか1項に記載の方法によって、微小血管障害性疾患を検査する方法。
- 請求の範囲第1項〜第21項のいずれか1項に記載の抗体を含む、試薬またはキット。
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