JPS59131166A - 抗トロンビン３用試薬細片を用いる試験方法およびそのための試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は喘乳綱の血漿中杭トロンビン■の定量的測定法
に関する。

近年、特定のプロティナーゼの分析のための小さいペプ
チド基質の使用に関する多くの文献が出ている。これら
の基質は、プロティナーゼによる加水分解が起ると放出
される色属性あるいは蛍光原性基を通常含有し、その結
果、存在するプロティナーゼ酵素量を定量するために発
色速度または蛍光発現速度を用−ることができる。この
発展により血液凝固の各段階において関与する多くの血
清ブロテイナーゼを個別に分析することが可能となった
。トロンビンとＸａ因子に特異的なペプチド基質が、血
漿中のトロンビンとＸａ因子の主要な抑制因子であると
考えらｎでいる臨床上重要な血液凝固抑制因子である抗
トロンビンＩ［Ｉ　（ＡＴ−ＩＩＩ）の間接溶液分析法
を発展させるために用９られている。

とれらの試験法は、ＡＴ−１［［がヘパリンの存在下で
トロンビンの急激な抑制因子となるという事実に依存し
ている。この抑制には、ヘパリンの不存在下では１０〜
６０分を要するが、ヘパリンの存在下では１５〜６０秒
を要するのみである。これらの試験における反応順序は
、以下の式によって表わされる。すなわち、 （１）　　ＡＴ−ＩＩＩ＋ＩＩＩン（過剰）→Ａ′Ｔ−
，ｌｌ（・ヘパリン （２）　　Ａ　Ｔ　−■・ヘパリン＋トロンビン（過剰
）→Ａ・Ｔ−１ｌ［（不活性）・トロンビン＋トロンビ
ン（３ａ余）＋ヘパリン 次いで、残余のトロンビンを好適な合成ペプチド基質を
用いて分析する。ＡＴ−■の分析のためには、ヘパリン
は、試験系中に存在するすべてのＡＴ−１［がそのトロ
ンビン抑制作用を急激に発揮するために、必要な触媒量
を超える過剰量で与えらｎる。必要なヘパリン量を測定
するために、徐々に増量したヘパリンを用いて滴定実験
を行なって、所望の結果を得るために必要力量を測定す
ることができる。ここに記載されて―る実験では、この
試験は行なわｎなかったが、その代シに１溶液試験法の
ために希釈された同様の試料中に用いら牡る量のヘパリ
ンが使用された。ブロムポック他著「トロン・ディアス
・ヘマウＪ　（Ｂｌｏｍｂｏｃｋ。

ａｔ　ａｌ　ｒＴｈｒａｍ　Ｄｌａｔｈ　Ｈａｅｍｏｕ
ｈＪ第９巻、３６８頁（１９６３年）にはトロンビンの
抑制が、ヘパリン２〜１６単位／１ｎＩの間で一定であ
ることが報告されている。ＡＴ−ＩＩＩについて発行さ
ｆ′Ｌ７′Ｃすべての試験法圧おいて、残余のトロンビ
ンを分析するために合成ペプチド基質の添加を行なう前
にくる反応（２）の後に時間の遅れがある。この遅れは
、ａＴ−■とトロンビンのヘパリン触媒反応が、低いｈ
値を有する基質の存在下で非常にゆつく）進むために必
要であることが発見されてする。上記分析法の多くにお
いて、付加的な構成成分であるポリブレン（Ｐｏ１ｙｂ
ｒ＠ｎ・）ｔ−ペプチド基質と共に添加してへｉ＜　ｙ
ンを中和し、かつ残余のトロンビンの分析時におけるあ
らゆるさらに急速なトロンビンの抑制作用を防止する。

ポリブレンまたはもう１つのヘパリン中和物質の使用か
、比較的高いｈ値を有する色原体性トロンビン基質を用
μる分析において最初に試みられた。これは、基質があ
る未反応ＡＴ−１ｉ・ヘパリン錯体とあまシ競合せず、
加水分解工程時、さら力る抑制作用が起り得るために必
要であった。この方法は、低いｈ値を有する色原性基質
を用いるいくつかの分析法においても行なわｎた。以下
の実例で報告されて―る研究に用いらｔている基質、Ｓ
−２２３８は非常に低い１値を有し、また、ポリブレン
が必要ではないことが見出されている。

上記のタイプの分析法は、オーデガード他著［トロンボ
シス−リサーチＪ　（Ｏｄｅｇａｒｄ、ｅｔ　ａｌＴｈ
ｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｓｍ＊ａｒｅｈ　）第６巻、２８
７〜２９４頁（１９７５年）〔ペルガモン参プレス・イ
ンコーホレーテイツド（Ｐ＠ｒｇａｍｏｎ　Ｐｒ拳ｍｓ
＋　Ｉｎｃ、）発行〕に記載されて釣る。この分析法で
は、試料血漿１００　ｐｉをヘハＩＪン含有緩衝液２．
９　ｍ／と混合し、次いでこ（Ｄ　希釈ｉｔ　４００　
ｐｉを２本のガラス管にそ詐ぞれ移し、３７℃の湯浴中
で２〜６分間予備加温する。この点で、３０　ＮＩＨ単
位／ｒｎｌ’ｅ含有するトロンビン、溶液を上記管内に
吹き込み、正確に３０秒後に基質−ポリブレン溶液３０
０μｌを反応混合物中に吹き込む。

使用される色原性基質はトリペプチドＢｚ　−Ｐｈ・−
Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−ＰＮＡ−ＨＣＡ！である。基質を
添加して正確に６０秒後に、酢酸３００μｌを該混合物
中に吹き込むことによってアミド分解反応を停止する。

標準血漿希釈液４００μｌ、酢酸３００μｌ、基質−ボ
リブレン溶液３００−およびトロンビン溶液１００μｌ
をこの順序で混合して得られる対照溶液に対する、この
ものの光学光度を４０５１１ｍにおいて読取る。２個の
光学密度の読みを得、その平均を用いて標準曲線からＡ
Ｔ−１１濃度（ヘパリン補助因子活性）を読取る。

この湿式分析法はフィブリンの凝固を利用する以前の分
析法ニジ便利であるが、それでも幾分時間を消費し、か
つ人間が誤ま）を起こし易い。トロンビンと色原性また
は蛍光原性の相互作用に基づ（ＡＴ−１の定量的測定用
試験細片が切望されている。しかしながら、互いに近接
してトロンビンと基質を含有する細片を用いて得らｎる
速度または簡便性の増加は、基質の存在が過剰のヘパリ
ン存在下でさえトロンビンとＡＴ−１の間の反応を抑制
する事実によってさらに相殺されてしまって余りがあろ
う。

本発明方法は、 ａ）血漿を過剰のヘパリンと、以下の３層試薬細片、す
なわち、 ｌ　過剰のトロンビンと緩衝液を吸収した担体マトリッ
クスの第１上部層 １１　　第１層と隣接して液体によって連通し得、かつ
トロンビン感応性蛍光原性または色原性（発色性）基質
および緩衝液を吸収した担体マトリックスからなシ、前
記基質が、トロンビンと基質が好適な液体環境中で接触
するとき分光蛍光測定手段または分光測光手段によって
検出可能な時間に関連する化学変化が起きる如き方法で
トロンビンと相互作用できるような第２下層、および…
　第２下層の下にある不透水性物質層からなる試薬細片
と接触させ、 ｂ）基質中のあらゆる化学変化を反射蛍光分光測光手段
または反射分光測光手段によって所＞１期間に亘って緑
シ返し：ｌ＋ｌＩ定して少なくとも２個の反射蛍光値ま
たは分光側元値を時間の関数として得、さらに、 Ｃ）上記工程ｂ）で得られた値と既知号の抗トロンビン
■を含有する」血漿試料を用いて同様の方法で得ら扛る
値の間の関係を比較し、このような比較１Ｙｉを用いる
ことによって試験すべき血漿試料甲の抗トロンビン■の
４朋を測定することからなる。

合成蛍光原性基質または色原性（発色性）基質を用いる
ＡＴ−■とヘパリンの分析法のための溶液技術を、紙製
試薬細片に適用することは試薬の、定期的なかつ順序立
った添加を必要とする友めに複雑である。基質を含有す
る下層パッドと、トロンビンおよび任意にヘパリンを含
有する土層パッドを有する２層試薬細片を構成し、上層
パッドに血漿試料を施すことによって、血漿ＡＴ−Ｉｌ
ｌが、上層パッドのトロンビンと接触してＡＴ−１ｌｌ
−）ロンビン錯体を形成した後下層パッドから基質が、
抑制作用を起こすに充分拡散するまでには充分な時間が
ある。試料溶液が測定装置のテーブル上に流れず、基質
の上層パッドへの拡散が確実に起こるようにするために
下層パッドの下に不透水性物質を設けるべきである。

試験細片の第１上層は、トロンビンを吸収した担体マト
リックスからなる。この担体マトリックスは血漿を吸収
できる一方、その血漿の一部を下層パッド中に流すこと
ができる物質である。下層パッドは、同一の材料でもよ
く、基質を吸収しており、かつ血漿流体が基質を溶解せ
しめ、それを、トロンビンＡ’ｒ−１１１錯体が形成さ
れた後、下層パッドから上層パッドに拡散させるように
機能する。

診断用試験細片の製造に通常用いられている物質がこの
目的のために好適であることが見出された。

用いることができる好適な物質としてはゼラチンまたは
アガロースから形成されるフィルムが包含さｎる。通常
、例えば紙、セルロース、木材、合成樹脂製フリース、
織布、および不織布等の吸′収性物質が担体マトリック
スを形成するために用いら扛る。

担体マ）　ＩＩラックス、液体試薬組成物に浸沈、浸漬
するかあるいは該組成物を吹き付けまたは印刷した後、
大気あるいは強制空気乾燥等の好適な手段によって乾燥
して乾燥試薬／マトリックス複合体を得ることができる
。担体が吸収性物質の場合、担体マトリックスには試薬
が吸収されてそのまま残存する。

土層は、担体マトリックスとトロンビン溶液および緩衝
液を接触させることによって調製きれる。トロンビン酵
素反応の速度は−に左右さｎるので緩衝液が必要である
。細片の両方のパッド中の緩衝液のｐＨはトロンビンと
基質の反応が最大になるように調整さ牡る。

基質が８−２２３８の場合、トロンビンの最大エステル
分解応答はｐＨ８，０〜８．５で達成される。好適な緩
衝液としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（ＴＲＩＳ）＋Ｎ、Ｎ−ビス−（２−ヒドロキ
シメチル）グリシンおよびトリス（ヒドロキシメチル）
メチルアミノプロパンスルホン酸が挙げら第１．る。さ
らに、この溶液はＢＳＡ　（牛血清アルブミン）等の、
乾保工程時、トロンビンを安定化する物質を含有すべき
である。代表的な溶液は２〜５　ＮＩＴ（単位／−の濃
度でトロンビンを含有し、紙乾燥工程時トロンビンを安
定化させるために０．２　ｑ６　（ｖ／ｖ　）のＢＳＡ
を含有する。

下層は通常、水溶液に約５ｍＭの基質を含有する溶液か
ら調製される。緩＠液は上層に用いられるものと同一ま
たは異なっていてもよく、この浸漬溶液に用−られる。

好適な色原性ま九は蛍光原性基質について、その商品名
、用途、構造式および検出法を第１表に示す。

本発明をさらに以下の実施例によって説明する。

これらの実施例では、ＴＲｌ５．ＢＳＡおよびトロンビ
ン（ウシトロンビン）をリサーチ・プロダクツ・ディビ
ジョン・オプーマイルス・ラボラトリーズ・インコーホ
レーテッド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄ
ｌｖｉ−８量ｏｎ　＠ｆ　Ｍｌｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）よシ得た。

ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　５４　ｔｔ紙はワッ
トマン・ペーパー・カンパ＝　−（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐ
ａｐ＠ｒ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）※ｌ−Ａ、Ｂ、ＫＡＲＴ ※２−　Ｐｓｎｔｐｈａｒｍ　ＬＴＤ ※３　−　Ａｂｂｏｔｔ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
※４−　Ｅｈｚｙｍｅ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ　　Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ＋※５−　Ｐｅｐｔｌｄｓ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ※６−短縮された発色団ま几は蛍光団は以下の通り
である。

ＰＮＡ　−ｐ−ニトロアニリン ４ＭＮＡ−４−メトキシ−β−ナフチルアミンＡＩＥ　
−５−アミノイソフタル酸ジメチルエステルＡＦＣ−４
−）　ＩＪ　フルオロメチル−クマリル−７−アミン ＭＣＡ　−４−メチル−クマリル−７−アミン製であり
、血漿はカッター・ラボラトリーズ・インコーホレーテ
ッド（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｊｔｓ、Ｉｎ
ｃ、）製のＴｈｒｏｍｂｏｇｅｒ＊ｅｎ　（登録商標）
　ＵｎｉｖｅｒｓａｌＣｏａｇｕｌａｔｌｏｎ　Ｒｅｆ
ｅｒ＠ｎｅ＠Ｐｌａｍｍｍであり　、Ｓ−２２３８基質
はニー・ビー・カビ（Ａ、Ｂ、ＫＡＢＩ）社から入手し
た。基質Ｈ−Ｄ−ｐｈｓ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ＡＩＥおよ
びＨ−Ｄ　−ｐｈａ　−ｐｒｏ　−ａｒｇ　−ＡＦＣエ
ンザイム・システムズープロダクツ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　）社から得、ヘパリ
ンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から得たヘパリンナトリウ
ム（ブタ腸粘膜）であった。

これらの実施例では、反射率または蛍光の測定は血漿希
釈液を細片に作用させた後裔指示薬についての最大の波
長で得られる。この反射率値は次式： ％式％ （式中、Ｋは試料の吸収係数、Ｓはマ）　ＩＪソックス
光分散係数およびＲは試薬から反射される入射光のフラ
クションでアル。） を用いて反射率値をＶｓ値に変換する。この式はクペル
カームンク（Ｋｗｂ＠ｌｋｍ　−Ｍｕｎｋ　）式の簡単
な変形である。このＶ値は反射率の測定に関連する。

試薬含有口紙の調製 方法Ａ：ワットマン中ペーパーーカムパニーカラ得たＷ
ｈａｔｍａｎ　５４０紙の３×３インチ片を少なくとも
１．０−の浸漬溶液で飽和し、複数のこすり棒間を通し
て引張シ、２÷×２÷の穴が形成された厚紙片に取付け
るかまたはナイロンメツシュに取付ける。

取付けた口紙片を強制空気乾燥炉中につシ下げ適当な時
間乾燥する。

方法Ｂ　：　Ｗｈａｔｍａｎ　５４０紙の３×９÷イン
チ片管溶液１Ｏｒｎｌに浸漬し、こすシ棒間を通して引
張シ、強制空気乾燥炉の棚罠つシ下げ、適当な時間乾燥
する。

方法Ｃ：４インチ幅のＷｈａｔｍａｎ　５４０紙片をＺ
ｏ。

−の浸漬溶液を用い、口紙速度３Ｌ４インチ／分、３つ
の乾燥部位における乾燥温度５０℃、それぞれ乾燥部１
，２．３における空気流速１　、１．５　、１．５イン
チを用−て自動浸漬装置によって行なった。

試薬細片の調製 方法（１）：乾燥試薬口紙を両面接着剤で反射性マイラ
ーフィルムに貼り付け、端部を切シ取シ、かつ積層体１
（Ｈｒｓ幅の細片、に切断した。これらの細片を両面接
着剤によって白色トリサイ）　（ｔｒｌｓｉｔｅ　）プ
ラスチック把手材の表面から１７４インチの所に貼り付
け、得られた積層体を色原性の実験用に５（１６） 細幅細片または蛍光実験用にｌｏｗ幅細片に切断しｍ’
、すべての細片を、貯蔵ビン１個当シ３〜４個の七しキ
ュラーシープ板と共に４℃で保存した。

方法（２）：方法（１）の工程を行なったが、最後の切
断前に第２パツドを第１パツドの上に以下の如く置いた
。

ａ）上部パッドの試薬口紙を、端部を切り、取った後１
１）ｌＩ１紙片に切断した。

ｂ）　　ｉ〜２■幅細片の両面接着剤を切断し、すでに
トリサイトに取付けた底部試薬パッドの後端部に置−た
。

璧）上部パッド用の１（至）幅細片の試薬口紙をｉｉ４
面接着剤細片によって下部パッドに結合した。

ｄ）得られたラミネートを５ｍ＋あるいは１０■幅試薬
細片に切断した。

方法（３）：方法（１）の工程を行なったが、最後の切
断前にポリプロピレンメツシュと第２試薬パツドを第１
　ハツトの土に以下の如く置いた。

＆）上部パッド用試薬口紙の端部を切シ＊、ａ、１−幅
細片に切断し、かつ１４９ミクロンのボリプロピレンメ
ツシュを手で１優＠細片に切断した。

ｂ）　　１〜２■幅細片の両面接着剤を切断し、すでに
トリサイトに取付けた底部試薬パッドの前方及び後方端
部の両方に置％Ａだ。

ｃ）ｌｃｎ幅片の１４９ミクロンポリプロピレンメツシ
ュを両面接着剤細片によって下部パッドに結合させた。

ｄ）　　１〜２■幅細片の両面接着剤を切断し、ポリプ
ロピレンメツシュの裏面端部に置いた。

ｅ）上部パッド用ＩＱＩＭ幅細片の試薬口紙をメツシュ
上にある両面接着剤細片によって下部パッドに結合させ
た。

実施例Ｊ ＡＴ−Ｉｌｌによるトロンビン抑制試験前述したオデガ
ード（Ｏｄｅｇａｒｄ　）の方法を用いて溶液中てのＡ
Ｔ−１１［によるトロンビンの抑制作用を試験した。抑
制作用は基質の存在下においてでざえかなり急速に進み
、それ故に、細片化学への本技術の適用が容易とがるで
あろうことが理論づケラれた。トロンビンとＡＴ−Ｉｆ
をオデガードの方法の変形によってＳ−２２３８基質の
不存在下で一緒にインキュベートしたときの残余のトロ
ンビン活性の割合を測定しｆｃｏその方法は以下の如く
であった。

ａ）　　Ｔｈｒｏｒｎｂｏｓｃｒｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒ
ｓａｌ　ＲｅｆｅｙｅｎｃｅＰｌａｓｍａの１５．０．
倍希釈液’ｔ　０．０５　ＭＯＴＲｌ５．０．１９Ｍの
Ｎａ（Ｊ、　３　ＵＳＰ　ｌｔｍ／ｍｌのヘパリン（ｐ
Ｈ９，１）中で調製した。

ｂ）　　ａ）の希釈液４００１１１を試験管に入ｎ、３
７℃で平衡化した。

ｅ）　　２、ＯＮＩＨ単位／ｍｌのウシトロピン溶液Ｚ
ｏ。

Ｉを添加、混合した。国立保健機関（Ｔｈｅ　Ｎａｔｉ
ｏｎａｌＴｎｓｔｌｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　）
が徐準トロンビン試料を調合することによるサービスを
行なって腟る。これらの試料は特定数の酵素単位を含有
する。このよう罠用語ＮＩＨ単位はこれらの様準物質と
の比較から誘導される。

ｄ）所望のインキュベーション時ｆＬＱ後、ｏ、ｚａＷ
Ｌｆ／ｒｎｌの８−２２３８基質水溶液３００４　（３
７℃に予め加温された）を添加した。

（１９） ・）３７℃で２分間インキュベートした後、氷酢酸３０
０ＩＩｌを添加して反応を停止し、４０５　ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。

ｆ）血漿を含有していない反応の吸光度を１００％残余
トロンシ活性とした。

Ｓ−２２３８基質の存在下におけるＡＴ−１［の抑制作
用を試験するためには同様の方法を使用することができ
ないので以下の方法を用埴た。

ａ）　　０．０５　Ｍ　ＴＲｌ５２．９８７．０．１９
　Ｍ　ＮａＣＡ’　、　３ＵＳＰ単位／−のヘパリン、
声９．１の緩衝液＋０．２６Ｔ！９ａｎ／　８−２２３
８基質水溶液２．２５−＋　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｏｒ＊ｅ
ｎ２０−の混合物を調製した。

ｂ）　　ａ）Ｋ記載された溶液ｔ−３７℃で１５分イン
中エペートし、次いでウシト四ンビンの２，０ＮＩＨ単
位／−溶液７５０ｐｌを添加、混合した。添加時を時間
−〇とした。

Ｃ）％定の間隔で、この溶液８００ｐ１分量を取出し、
氷酢酸３００μｌと混合して反応を停止した。

ｄ）　　４０５　ｎｍ　Ｋおける吸光度を測定した。

・）３個の近接点の回帰線が３個の点の中間（２０） 点の曲線の接線に対して同様の傾斜を有するものと仮定
して比率を計算した。

ｆ）血漿の不存在下における比率を１ｏｏｓ残余トロン
ビン活性とした。

このようにして得られたデータのプロットを第１図に示
す。第１図から、ＡＴ−［［ＩＣよるトロンビンの抑制
作用はＳ−２２３８の不存在下では非常に速く、この基
質の存在下では遅く、７分または８分間では完了しな−
ことが判る。

これと付合して、血漿ＡＴ−ＩＩＩを２ｍＭのＳ−２２
３８基質を含有する水性ヘパリンで６０倍希釈し、３０
ｐｌをトロンビン含有試薬細片に作用させるとき、細片
の反射率が観察された５分以内では些少な抑制作用が見
られただけであることが判明した。しかしながら、Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｍｃｒａｓｎ　ＵｎｉｖｅｒｓａｌＲ＠ｆ＠
ｒ＠ｍｅｅ　Ｐｌａｍｍｍの水性ヘパリンの種々の希釈
液１５ｐｔ４同一の細片に作用させ、細片をこの溶液で
１分間インキュベートシ、次φで４ｍＭのＳ−２２３８
基質１５１１１ｔ−添加し、反射率を求めると、血漿Ａ
　Ｔ　−［（濃度に対する応答が観察された。

実施例２ 水性ヘパリン中で希釈された血漿ＡＴ−１［に応答する
発色性細片 実施例１の結果に基づいて、水性ヘパリンで希釈した血
漿ＡＴ−［［を含有する試料をこのよう外相片に作用さ
せるとき、トロンビン含有層中にトロンビンを抑制する
ために基質が逆拡散するには充分な時間が要求されるの
で、下部パッドに基質、上部パッドにトロンビンを含有
する二層細片が考慮されると仮定された。二層細片を製
造してこの仮定を試験した。細片の下部）くラドは５ｍ
Ｍ水性Ｓ−２２３８に浸漬したＷｈａｔｍａｎ　５４０
紙であり、これｔ３５℃で３０分間乾燥した。上部パッ
ドは、２．０ＮＩＨ単位／ｒＩＬｌウシトロンビンと０
．２４　ＢＳＡの１．５Ｍ　ＴＲｌ５溶液を含有するｐ
Ｔ（８の浸漬溶液を用いる、方法Ｂにより製造されたト
ロンビン含有口紙であった。第２図は水性ヘパリンで希
釈さｎた血漿ＡＴ−ＩＩＩに対する細片の応答グラフで
示す。試料中のＡＴ−１［による抑制作用に対する上部
）（ラドのトロンビンの明確な応答があることが判る。

このことは下部パッドからトロンビンを含有する上部パ
ッドへのＳ−２２３８基質の拡散に必要な時間が充分長
いため、抑制的トロンビン・Ａ　Ｔ　−１１錯体が形成
さｎることを示している。第２図に示された量に対する
応答は、血漿のヘパリン水溶液への６０倍希釈で１０〜
１３０％の標準のレベルのＡＴ−１ＩＩｅ含有する血漿
を分析するために有用であろう。上部パッドに２倍量の
トロンビンを含有する細片を用いて第２の実験を行なっ
た。第３図は、１ＯＮ１３０％の標準レベルのＡＴ−Ｉ
１１’Ｔｈ含有する血漿を、血漿のヘパリン水溶液への
４０倍の希釈で分析するに有用な量による応答が達成さ
れることを示す。これらの試薬細片製造例の双方が、そ
の後に直線部が連続する随一時間曲綜（第４図参照）の
初期の遅延段階を示す。この遅延段階は下部パッドから
拡散しなければならない基質が酵素の飽和レベルに達し
ない時間であることは疑う余地がない。

実施例３ （２３） する蛍光原性細片 蛍光基質ｐｈｅ　−ｐｒｏ　−ａｒｇ　−ＡＩＥを含有
する二層試薬細片を以下のようにして製造した。

１）　　５ｍＭ　Ｄ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ＡＩＥ
の０．１ＭＴＲｌ５溶液、０．３Ｍ　Ｎａ（Ｊ、（ｐＨ
８゜３）溶液を浸漬溶液として用いる方法Ａによって基
質含有口紙を製造した。

２）　　１．５Ｍｔｒｉｇ−ＣＩ、　０．２ｑ６ＢＳＡ
、　１．６ＮＩＨ単位／−のウシトロンビンからなる浸
漬溶液を用いる方法Ｂによってトロンビン含有口紙を製
造した。

３）試薬細片を方法（３）によって製造し、水性ヘパリ
ンで、希釈した血漿６０ｒｎｌｙｋ添加し次いで水平位
置で細片を読み取るように変形されたＳＬＭｍｏｄｅ１
８０００分光蛍光光度計に発生した蛍光を求めることに
よって試験し−ｆｃ、第５図は血漿ＡＴ−ＩＩＩに対す
る応答が発色性細片の応答と同様であることを示す。

実施例４ （２４） 前述した実施例において、血漿をヘパリン含有溶液に希
釈した。本実施例ではヘパリンを細片に直接包含させる
可能性を試験した。発色性基質Ｓ−２２３８ｆ：含有す
る二層試薬細片を以下のようにして製造した。

ｌ）基質含有口紙を、５　ｍＭ　Ｓ　−２２３８水溶液
を浸漬溶液として用いて、方法人によって製造した。

２）ヘパリンをも含有するトロンビン含有口紙を以下の
浸漬溶液を用いて、方法Ｂによって製造した。細片調製
物■は１．５Ｍ　ｔｒｉｍ　−Ｃｌ３．０．２　％ＢＳ
Ａ、　ｌ０ＵＳＰ単位／−のヘパリン、および５．３　
ＮＩＨ単位／−のウシトロンビンであった。細片調製物
■はヘパリン濃度を３０　ＵＳＰ単位／ｒｒＬｌとした
以外は■と同じであつ几。試薬細片積層体を方法２によ
って製造した。第６図は試薬細片調製物■の応答を示し
、第７図は血漿ＡＴ−■の水性希釈液に対する試薬細片
調製物■の応答を示す。量に対する応答はヘパリン溶液
で希釈さｎ’ｆ１．、血漿ＡＴ−■の応答と同様−ｔ’
　、り　ルカ、ｄ（Ｋ／Ｓ）／ｄｔ−血漿ＡＴ−ＩＩＩ
曲線の傾きはよシ小さい。

実施例５ 実施例２に記載されたようにして製造された色原体試薬
細片を、血漿と同様のマトリックス（媒体）に既知量の
ＡＴ−１１［を含有する２またはそれ以上の標準溶液と
共に用い石。各標準溶液を３Ｕ８Ｐ単位／−のヘパリン
を含有する水溶液で４０倍に希釈する。希釈された標準
溶液３０Ｐ１分量を試薬細片に作用させて各試薬パッド
を４０５ｎｎで、試料を施してから３分間測定した。こ
れらの動力学的曲線の傾１！　ｄ　（Ｋ／ｅ　）／ｄｔ
を９０秒と１８０秒の間で得られたデータを用−て直線
回帰によって計算する。

検量線の傾きをそｎらの既知ＡＴ−１１ｉ濃度に対して
プロットして検量もしくは標準曲線のプロットを得るが
、これは、血漿試料のＡＴ−■濃度を測定するために用
−られる。

検量線を得た後、ＡＴ−１［濃度の分析を望む血漿また
は血清試料を３　ＵＳＰ単位／−のヘパリンを含有する
水溶液で４０倍に希釈した。各希釈された血漿または血
清試料の３０　ｐ１分量を試薬細片に作用させ、４０５
　ｎｍで５秒毎に３分間反射率を測定した。この動力学
的曲線の傾きａ　（’ｇ／Ｓ　）／ａｔは９０秒と１８
０秒の間のデータから直線回帰分析によって計算する。

この傾きの値を検量線上で位置ぎめし、Ａ’ｒ−１１Ｔ
濃度を対向軸から読取った。

【図面の簡単な説明】 第１図はＳ−２２３８基質の存在下および不存在下にお
ける血漿ＡＴ−１による溶液中のトロンビン抑制作用を
示すグラフ、第２図は水性ヘパリンで希釈された血漿Ａ
Ｔ−■に対する発色性二層細片調製物Ｉの応答を示すグ
ラフ、第３図は水性ヘパリンで希釈された血漿Ａ’ｒ−
［［に対する発色性二層細片調製物■の応答を示すグラ
フ、第４図は発色性細片調製物■に水性ヘパリン中で添
加された選ばれた血漿Ａ’ｒ−１１１濃度についての、
φ−待時間プロットを示すグラフ、第５図は水性ヘパリ
ンで希釈され几血漿ＡＴ−ＩＩＩに対する蛍光原性二層
細片の応答を示すグラフ、第６図は血漿ＡＴ−■の水性
希釈液に対する発色性二層細片調製物■の応答を示すグ
ラフおよび第７図は血漿Ａ〒−■（２７） の水性希釈液に対する発色性二層細片調製物■の応答を
示すグラフである。 （２８） ・基質布 ・基質なし ８　　　　　　　　　　２．０　　　　　　　　４．Ｏ
ｆｆ、０時　間（分） ０　　　　　　１０　　　　　２０　　　　　３０　　
　　　４０）Ａし　　血漿／ＭＬ 血漿濃度 がＬ／ＭＬ ０　　　４０　　８０　　１２０　　１６０　　２００
時　間（秒） ０　　　　　　　　１０　　　　　　２０　　　　　　
３０　　　　　　４Ｃ／４Ｌ　　血檗／ＭＬ ０　　　　　　　　１０　　　　　　　２０　　　　　
　３０　　　　　　４０／ＡＬ　　血漿／ＭＬ 「冒Ｇ、ＭＥ Ｏｔｏ　　　　　　　　２０　　　　　　３０　　　　
　　　４０μＬ　血漿／ＭＬ ＦＩＧ、Ｍ［ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特　許願第　１６８５２６号およびその丸め
の試験具 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　　称　マイルス・ラボラトリーズ・インコーホレー
テッド（氏　名） ４、代　理　人 ５、補正命令の日付　昭和５９年１月３１日６、補正に
より増加する発明の数　なＬ７、補正の対象　図面 ８、補正の内容　別紙のとおシ ９基質有 ・基質なし ０　　　　　　　　　２．０　　　　　　　４．０　　
　　　　　　６．０時間（分） ＦＩＧ、１ ０　　　　　　　　１０　　　　　　２０　　　　　　
３０　　　　　　４０）Ａし　　　血漿／ＭＬ 血漿濃度 μＬ／ＭＬ ０　　　　４０　　　８０　　　１２０　　　１６０　
　　２００時間（秒） ）ＡＬ　　血漿／ＭＬ ／ＡＬ　　　血漿／ＭＬ ０　　　　　　　　１０　　　　　　２０　　　　　　
３０　　　　　　４０、　　）ＡＬ　　　血漿／ＭＬ ＦＩＧ、　　　６ ＦＩＧ、　　７

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）＠乳綱血液血漿中の抗トロンビン■の定量的測定
   法であって、 ａ）血漿を過剰のヘパリンと以下の３層試薬細片、すな
   わち １　過剰のトロンビンと緩衝液を含有する担体マトリッ
   クスからなる第１層 ■　第１層と隣接して液体によって連通し得、かつトロ
   ンビン感応性蛍光原性または色原性基質および緩衝液を
   含有する担体マ）　ＩＪラックスらなシ、前記基質が、
   トロンビンと基質が好適力液体環境中で接触するとき蛍
   光測光手段または分光測光手段によって検出可能な時間
   に関連する化学変化が起こる如き方法でトロンビンと相
   互作用できるような第２下層、および ■　第２下層の下にある不透水性物質層からなる試薬細
   片と接触させ、 ｂ）基質中のあらゆる化学変化を反射蛍光分光手段また
   は反射分光測光手段によって所定期間［返し測定して少
   なくとも２個の蛍光値ｔたは分光測光値を時間の関数と
   して得、さらに、Ｃ）工程ｂ）で得られた値と既知量の
   抗トロンビン■を含有する血漿試料を用いて同様の方法
   で得られる値の間の関係を比較し、このような比較を用
   −て試験される血漿試料中の抗トロンビン■の濃度を測
   定することを特徴とする測定法。
2. （２）第１層および第２層が口紙で形成される特許請求
   の範囲第１項記載の測定法。
3. （３）トロンビン感応物質が発色性基質Ｓ−２２３８で
   ある特許請求の範囲第１項記載の測定法。
4. （４）緩衝液がｐＨを８．０〜８．５に維持することが
   できる特許請求の範囲第３項記載の測定法。
5. （５）トロンビン感応物質が、蛍光原性基質Ｄ−ｐｈ＊
   　−ｐｒｏ　−ａｒｇ　−ＡＩＥ・である特許請求の範
   囲第１項記載の測定法。
6. （６）哺乳綱血漿中の抗トロンビン■を定量的に測定す
   るに適した試験具であって、 １　過剰のトロンビンと緩衝液を含有する担体１トリツ
   クスの第１上層 １１　　第１層と隣接して液体で連通し得、かつトロン
   ビン感応性蛍光原性または色原性基質および緩衝液を含
   有する担体マトリックスからカリ、前記基質が、トロン
   ビンと基質が好適な液体環境中で接触するとき蛍光測光
   手段または分光測光手段によって検出可能な時間に関連
   する化学変化が起こる如き方法でトロンビンと相互作用
   できるような第２下層、および Ｉｌｌ　　第２下層の下にある不透水性物質層から々る
   ことを特徴とする試験具。
7. （７）第１層および第２層が口紙で形成される特許請求
   の範囲第６項記載の試験具。
8. （８）トロンビン感応物質が発色性基質Ｓ−２２３８で
   ある特許請求の範囲第６項記載の試験具。
9. （９）緩衝液がｐＨを８．０〜８．５に維持することが
   できる特許請求の範囲第８項記載の試験具。 Ｈ）ロンビン感応物質が蛍光原性基質Ｄ　−ｐｈｅ　−
   ｐｒｏ　−ａｒｇ　−ＡＩｇである特許請求の範囲第６
   項記載の試験具。