JPH057500A - 乾式アミラーゼ測定法および測定用素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 基質として２−クロロ−４−ニトロフェニル
−α−マルトトリオシドまたは４−ニトロフェニル−α
−マルトトリオシドをその中に含んだ担体（ａ）および
活性化剤としてアジ化化合物をその中に含んだ担体
（ｂ）を用い、検体試料溶液によって検体と基質と活性
化剤とを混合し発色させることを特徴とするアミラーゼ
測定法、および前記担体（ａ）と（ｂ）を必須構成要素
とし、所望により支持体および／または吸収層を組合わ
せてなるアミラーゼ測定用素子。 【効果】 高価な機器等をと必要せずに、簡便かつ正確
に測定できるアミラーゼ測定法およびアミラーゼ測定用
素子である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアミラーゼの測定法およ
び測定用素子に関する。さらに詳しく言えば、体液中
（血中、尿中等）のアミラーゼを簡便に測定する乾式の
測定法およびその測定法に使用する素子に関する。アミ
ラーゼの測定は、消化器系疾患の診断において重要であ
り、唾液型アミラーゼ測定により唾液腺の疾患を、また
膵型アミラーゼ測定により膵臓疾患を各々診断すること
ができる。

【０００２】

【従来の技術およびその課題】消化器系疾患の診断、特
に膵臓疾患の診断を目的として、アミラーゼ測定法が種
々提案されている。従来、アミラーゼに対する基質とし
ては、主に天然のデンプンが用いられてきた。デンプン
は入手しやすい反面、試薬の調製が煩雑であり、また品
質も一定しておらず、精度の面でも問題が多い。そのた
め、オリゴ糖に発色基を結合させたものを基質として用
い、アミラーゼによる発色基の切断により発色する方法
が考案された。しかしながら、この方法では基質がアミ
ラーゼだけでは完全に切断されず、他に共役酵素が必要
であり、このため、安定性、コストの面で問題があっ
た。そこで、基質としてα−マルトトリオースに発色基
（２−クロロ−４−ニトロフェノール等）を結合させた
ものを用い、また活性化剤としてアジ化化合物を用いる
方法が考えだされた(Clin. Chem. 34/10, 2005 (1988);
特開昭63-183595 号参照）。

【０００３】一方、現在アミラーゼの測定は、主として
多項目分析装置を用いて、溶液状態で行なわれている。
この方法は正確である反面、装置が高価で操作に熟練を
要するため、より簡便な方法として試験片を用いる乾式
法が考えだされている（ラピグノストアミラーゼ（商品
名）、ベーリング−ベルケ社製；レフロトロンシステム
ｐ−アミラーゼ、ベーリング−マンハイムトーホー社
製等）。しかし、これらの乾式法でも基質として天然デ
ンプンやオリゴ糖に発色基を結合させるものが用いられ
ているために、前述したような共役酵素が必要であるこ
とによる欠点等を有している。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、簡便でし
かも安定なアミラーゼ測定法を開発すべく努力した結
果、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトトリ
オシドまたは４−ニトロフェニル−α−マルトトリオシ
ドを基質に用いた乾式のアミラーゼ測定法が、正確かつ
実用的であることを見出だし、本発明を完成した。本発
明で用いる基質の２−クロロ−４−ニトロフェニル−α
−マルトトリオシドまたは４−ニトロフェニル−α−マ
ルトトリオシドは、α−アミラーゼのみで発色基である
２−クロロ−４−ニトロフェノールまたは４−ニトロフ
ェノールと糖残基とに切断されるが、この切断反応はア
ジ化化合物により速度が早められることが知られている
（特開昭63-183595 号）。しかしながら、前記公開公報
明細書中には、溶液状態での測定法が開示されているの
みで、乾式法を示唆する記載はない。事実、本発明者ら
が基質、バッファー、アジ化化合物の混合液をろ紙に含
浸させ、乾燥させたものを用いてα−アミラーゼを測定
しようとしたところ、ブランク（α−アミラーゼの代わ
りに生理食塩水を用いたもの）との間の発色強度にあま
り差が出ず、測定が困難であることが判明した（後述の
実施例１中の比較例参照）。

【０００５】この原因は、アジ化化合物と基質が乾燥の
過程で分解ないしは結合反応を起こすことによると考え
られる。このため、この方法は溶液状態での測定にしか
適せず、用時の試薬調製が必要となり、簡便な測定法と
は言い難い。そこで、本発明者らは、アジ化化合物と基
質を別々の試薬として調製した後、別々に乾燥し、この
２種の試薬を検体中の水分によって混合させて反応させ
る方法によりα−アミラーゼが測定できることを見出し
た。すなわち、本発明は、基質をその中に含有する担体
（ａ）と、活性化剤をその中に含有する担体（ｂ）とか
ら構成される素子を用いたアミラーゼの測定法およびそ
の素子自体に関する。

【０００６】本発明における試薬の担体としては、ろ紙
（定性用、定量用、クロマトグラフ用等）、繊維等の他
に、プラスチック板等上にセルロース粉末等をポリビニ
ルアルコール等の結合剤とともに塗布または印刷し、乾
燥したものも使用できる。ろ紙の場合は、試薬溶液を含
浸させ、乾燥させることにより、また、塗布法または印
刷法を用いる場合は、含浸法の他に、あらかじめセルロ
ース−結合剤に試薬を混合しておくことも可能である。

【０００７】本発明における構成成分の一つである２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトトリオシドま
たは４−ニトロフェニル−α−マルトトリオシドは、調
製時、0.5 〜５０m mol/l 、好ましくは１０m mol/l 前
後で使用することが望ましい。 また、もう一方の構成
成分であるアジ化化合物としては、アジ化ナトリウム、
アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化バリウム等が
挙げられるが、調製時、0.1 〜２０% w/v 、好ましくは
0.5% w/v以上用いることが望ましい。上記の基質および
アジ化化合物に加えて、通常測定に用いられるバッファ
ー（ＭＥＳ、リン酸−クエン酸バッファー等）、安定化
剤（アルブミン等）、界面活性剤（トリトンＸ１００
（商品名）等）等を加えてもよい。また、アミラーゼの
活性化剤として知られているＣａ⁺⁺イオン（１〜２００
mmol/l）、Ｃｌ^- イオン（１０〜５００m mol/l ）を
加えてもよい。これらは後述する吸収層の担体も含め、
いずれの担体に加えてもよい。さらに、体液中の膵臓由
来のアミラーゼまたは唾液腺由来のアミラーゼの分別定
量が、定量目的以外のアミラーゼの阻害物質（ヒトアミ
ラーゼのポリクロナル、モノクロナル抗体、小麦アミラ
ーゼインヒビター等）を加えることにより可能となる。

【０００８】本発明の測定法で使用する、それ自体本発
明の対象であるアミラーゼ測定用素子は、検体試料溶液
を添加したときに、その溶媒（水）によって検体中のア
ミラーゼと基質と活性化剤とが混合して発色し得るよう
に、基質を含む担体（ａ）および活性化剤を含む担体
（ｂ）を組合わせたものであればいかなる構成でもよ
い。例えば、基質担体（ａ）と活性化剤担体（ｂ）を単
に積層したもの、ずらして積層したもの、また２種の担
体を密接して並置したものなどが挙げられる。具体例と
しては、図１に示すようにプラスチック板等の支持板
（１）上に基質担体（２）と活性化剤担体（３）を密接
するように並置して張合わせたもの、図２に示すように
支持板（１）上に基質担体（２）と活性化剤担体（３）
を積層して張合わせたものなどである。図２の構成では
各層は同一の形状でもよく、また基質担体（２）と活性
化剤担体（３）とは上下逆でも発色にはさしつかえない
が、発色層である基質担体（２）側の発色が測定し易い
ように支持体（１）として透明性の材料を使用すること
が好ましい。

【０００９】また、図３または図４に示すように２種の
担体の前、すなわち検定試料添加側、または上に吸収層
の担体（４）を設置することも可能である。吸収層を置
くことにより、体液中の色成分等が除去され、より正確
な発色が得られる。また、先に述べた膵臓由来および唾
液腺由来のアミラーゼの分別定量を行なう際には、この
層に阻害物質を含ませると好都合である。この吸収層の
担体は、先に述べた試薬層の担体と同じものが無処理の
まま用いられるが、肉厚のものが素子全体をコンパクト
に出来るため好ましい。本発明のアミラーゼ測定用素子
はこれらの例に限定されるものではなく、上述のよう検
体試料溶液の溶媒によって検体中のアミラーゼと基質と
活性化剤とが混合して発色し得る、基質担体（ａ）と活
性化剤担体（ｂ）とを必須構成要素とし、所望によりこ
れに支持体および／または吸収層を組合わた素子はすべ
て本発明に含まれる。

【００１０】

【発明の効果】本発明によるアミラーゼ測定法は、高価
な機器等を必要せずに、容易に調製できる本発明の乾式
アミラーゼ測定用素子を用いて、簡便かつ正確に測定で
きる優れた方法である。

【００１１】

【実施例および比較例】以下、実施例と比較例により、
本発明を詳述するが、本発明はこれらの例により限定さ
れるものではない。 実施例１ ［アジ化ナトリウムの分離効果］

【００１２】発明例 下記の試薬を含む水溶液（１ml）を東洋ろ紙製No.2
（２０cm² ）に含浸させたのち、乾燥し、５mm×５mmに
切断して基質担体を調製した。 ・２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトトリオシド １０m mol/l ・ＮａＣｌ ２５０m mol/l ・酢酸カルシウム １０m mol/l ・トリトンＸ１００（商品名） 0.1 ％ ・ＭＥＳバッファー（ｐＨ5.5 ） ２５０m mol/l また、 0.1〜５％のアジ化ナトリウム水溶液（１ml）
を東洋ろ紙製No.2ろ紙（２０cm² ）に含浸させた後、乾
燥し、５mm×５mmに切断して活性化剤担体を調製した。
吸収層の担体として、東洋ろ紙製No.585ろ紙５mm×５mm
を用い、ポリスチレン板上に基質担体、アジ化化合物担
体、吸収担体の順に、図３のように各層が接触するよう
に並べて張合わせた。

【００１３】比較例 発明例の基質担体の試薬にアジ化ナトリウム 0.5〜５
％水溶液を加えた後、同様にろ紙に含浸させ、乾燥し
た。活性化剤担体には、ろ紙をそのまま用いて発明例と
同様にして張合わせた。ブランク 発明例および比較例の活性化剤担体中のアジ化ナトリ
ウム濃度５％のものに対して、検体の代わりに生理食塩
水を用いて測定した。

【００１４】測定方法および結果 発明例および比較例の吸収担体にヒト尿５０μｌを各
々滴下し、５分後に基質担体での発色をデンシトメータ
ーで測定した。発色強度はアジ化ナトリウム無添加のも
のを１００％として表わした。結果は、次表１に表わさ
れるように、比較例ではアジ化ナトリウムによる効果は
認められないが、発明例では、アジ化ナトリウムの濃度
に応じた発色強度の増大が見られた。また、ブランクに
おいても発色が見られたが、その発色強度は比較例とあ
まり差がなく、比較例での測定は事実上困難であること
がわかった。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】

【表３】

【００１８】実施例２ ［本発明におけるα−アミラーゼの測定（検量線）］実
施例１の発明例で用いた素子（アジ化ナトリウム濃度
（0.5 ％））を用いて、α−アミラーゼ濃度既知の被体
尿５０μｌを吸収層の担体に滴下し、発色強度をデンシ
トメーターで測定した。図５に検量線を示す。図５から
明らかなようにα−アミラーゼ濃度を発色強度はα−ア
ミラーゼ量１００〜2000（Ｕ／ｌ）の範囲で比例してお
り、正確な測定が行なえることがわかる。なお、健常人
の尿アミラーゼは、１００〜８００（Ｕ／ｌ）程度であ
り、本測定法は十分この範囲をカバーしている。

【００１９】実施例３ ［小麦ｓアミラーゼインヒビターを用いた分別定量］基
質担体として、下記の試薬を含む水溶液（１ml）を東洋
ろ紙製No.2（２０cm² ）に含浸させたのち、乾燥した。 ・２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトトリオシド １０m mol/l ・ＮａＣｌ ２５０m mol/l ・酢酸カルシウム １０m mol/l ・トリトンＸ１００（商品名） 0.1 ％ ・ＭＥＳバッファー（ｐＨ5.5 ） ２５０m mol/l 活性化剤担体として５％のアジ化ナトリウム水溶液
（１ml）を東洋ろ紙製No.2ろ紙（２０cm² ）に含浸させ
た後、乾燥した。吸収担体として、小麦ｓアミラーゼイ
ンヒビター１mg/ml 含む水溶液を、東洋ろ紙製No.585ろ
紙に含浸させた後、乾燥したものおよび無処理のろ紙の
２種を用意した。

【００２０】これらを図４に示すように、各々接触する
ように並べて支持体（ポリエステル板）の上にはりあわ
せた。サンプルとして、標準ｓアミラーゼ、標準ｐアミ
ラーゼおよび両者の比（ｐ／ｓ）既知のヒト尿を用いて
小麦ｓアミラーゼインヒビター添加のものおよび無添加
のもの２種に対し、各々５０μｌずつ滴下し、５分後の
発色をデンシトメーターで測定した。結果を表２に示
す。既知のｐ／ｓに対し、本発明における分別定量の数
値がよく一致した結果が得られた。

【００２１】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】基質担体と活性化剤担体を密接並置して支持体
に張付けた本発明の素子例の斜視図である。

【図２】基質担体と活性化剤担体を積層して支持体に張
付けた本発明の素子例の斜視図である。

【図３】支持体の上に吸収担体、活性化剤担体、基質担
体を順次密接並置して張付けた本発明の素子例の斜視図
である。

【図４】支持体の上に基質担体、活性化剤担体、吸収担
体を順次積層して張付けた本発明の素子例の斜視図であ
る。

【図５】本発明の測定法によりアジ化ナトリウム（５
％）を活性化剤として用いた時の、アミラーゼ濃度に対
する発色強度を示す検量線である。

【符号の説明】

１ 支持体 ２ 基質担体 ３ 活性化剤担体 ４ 吸収層担体 ５ 検体試料

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 基質として２−クロロ−４−ニトロフェ
   ニル−α−マルトトリオシドまたは４−ニトロフェニル
   −α−マルトトリオシドをその中に含んだ担体（ａ）お
   よび活性化剤としてアジ化化合物をその中に含んだ担体
   （ｂ）を用い、検体試料溶液によって検体と基質と活性
   化剤とを混合し発色させることを特徴とするアミラーゼ
   の測定法。
2. 【請求項２】 並置されている担体（ａ）と担体（ｂ）
   とのいずれかに検体試料溶液を添加し、検体と基質と活
   性化剤とを混合し発色させる請求項１に記載の測定法。
3. 【請求項３】 担体（ａ）または担体（ｂ）のいずれか
   に並置されている吸収層の担体（ｃ）に検体試料溶液を
   添加する請求項２に記載の測定法。
4. 【請求項４】 アミラーゼ阻害物質を含有する吸収層を
   使用し、分別定量を行なう請求項３に記載のアミラーゼ
   測定法。
5. 【請求項５】 基質が２−クロロ−４−ニトロフェニル
   −α−マルトトリオシドである請求項１に記載の測定
   法。
6. 【請求項６】 基質が４−ニトロフェニル−α−マルト
   トリオシドである請求項１に記載の測定法。
7. 【請求項７】 活性化剤がアジ化ナトリウムである請求
   項１に記載の測定法。
8. 【請求項８】 基質として２−クロロ−４−ニトロフェ
   ニル−α−マルトトリオシドまたは４−ニトロフェニル
   −α−マルトトリオシドをその中に含んだ担体（ａ）と
   活性化剤としてアジ化化合物をその中に含んだ担体
   （ｂ）とからなるアミラーゼ測定用素子。
9. 【請求項９】 基質を含んだ担体（ａ）と活性化剤を含
   んだ担体（ｂ）とが積層されている請求項７に記載のア
   ミラーゼ測定用素子。
10. 【請求項１０】 透明材料からなる支持体上に担体
    （ａ）と担体（ｂ）とが積層されている請求項８に記載
    のアミラーゼ測定用素子。
11. 【請求項１１】 表面に吸収層（ｃ）が積層されている
    請求項８または請求項９に記載のアミラーゼ測定用素
    子。
12. 【請求項１２】 基質を含んだ担体（ａ）と活性化剤を
    含んだ担体（ｂ）とが並置されている請求項７に記載の
    アミラーゼ測定用素子。
13. 【請求項１３】 吸収層の担体（ｃ）が、担体（ａ）ま
    たは担体（ｂ）に並置されている請求項１１に記載のア
    ミラーゼ測定用素子。
14. 【請求項１４】 担体が支持体上に設けられている請求
    項１１または請求項１２に記載のアミラーゼ測定用素
    子。