CN116298264A - 一种用于tm、tat和pic联合检测的试剂卡及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡及其应用。该试剂卡包括试纸条，试纸条包括：底板，和沿层析方向依次固定于底板上且顺次接触的样本垫、荧光结合垫、层析膜和吸水垫；荧光结合垫上喷涂有荧光微球‑SA‑生物素‑抗TM抗体偶联物、荧光微球‑SA‑生物素‑抗TAT抗体偶联物、荧光微球‑SA‑生物素‑抗PIC抗体偶联物和荧光微球‑SA‑生物素‑质控抗体偶联物；层析膜的质控线上固定有与所述质控抗体结合的第二抗体；所述层析膜的第一检测线上固定有抗TAT抗体，第二检测线上固定有抗PIC抗体，第三检测线上固定有抗TM抗体。该试剂卡能够对样本中的TM、TAT和PIC同时进行检测，实现了一卡多检，且各指标间无交叉反应，降低了检测成本和检测时间。

Description

一种用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡及其应用
技术领域
本申请涉及体外诊断免疫检测技术领域，尤其是涉及一种用于血栓调节蛋白(TM)、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)和纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物(PIC)联合检测的试剂卡及其应用。
背景技术
血栓调节蛋白(TM)是一种广泛存在于血管内皮细胞的一种具有抗凝作用的跨膜糖蛋白。分为膜型TM和溶解型sTM两种存在形式。膜型TM存在于细胞表面，sTM是膜型TM经蛋白酶裂解脱落形成的一种可溶形式。TM能够加速凝血酶(Thrombin)转换酶原蛋白C(PC)到活化蛋白C(APC)这一过程。当凝血酶与TM形成复合物时，凝血酶的底物特异性便会转换，从促凝作用转变为抗凝作用。该复合物不能裂解纤维蛋白原，无法激活因子V或XIII，也不能在内皮细胞或血小板上裂解蛋白酶激活的受体1或3。但是可以有效地将PC转化为APC，在蛋白S作用下，水解凝血酶因子Va(与因子V共同作用)和VIIIa。因此，APC下调了凝血酶生成，这是TM作为天然抗凝系统中辅助因子的基础机制。
凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)是血液凝固和与抗凝的矛盾产物，是凝血酶生成的标志；体内的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物的演变过程与出凝血机制关系密切，该指标与出凝血疾病的关系密不可分。在生理或病理状态下，凝血酶原分子中的肽键一次被切断，或多或少的产生二硫键桥连的A链及B链，也即α-凝血酶，其中A链的N端发生水解，变成β-凝血酶和γ-凝血酶，而失去凝血活性，而ATⅢ以另外的方式以1：1比例与凝血酶结合生成酰基共价键结合的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物。研究表明，该复合物生成量与生成率可能是机体抗凝血，凝血物质活化的标志；因此该项指标有益于检测血栓的形成，对抗凝及溶栓治疗观察具有重要的指导作用。
机体凝血酶水平升高意味着凝血级联的激活。但由于血液中的凝血酶半衰期很短，很快被抗凝物质中和，测定凝血酶证明凝血活化非常困难。而TAT的半衰期为3～15min，可直接测量。因此，TAT可作为凝血活化的分子标志物，间接评估凝血酶生成。PIC是纤溶酶与α2-纤溶酶抑制物(α2-PI)结合形成的复合物。当凝血系统被激活，机体内形成纤维蛋白后，纤溶系统激活，组织型纤溶酶原激活物tPA释放并活化。tPA活化后促进纤溶酶原转化为纤溶酶。随后纤溶酶降解纤维蛋白/纤维蛋白原产生D-二聚体(DD)和FDP。纤溶酶在血液中的半衰期短，PIC更易于检测并反映机体内纤溶系统的状态。创伤时机体内皮受损激活凝血，凝血酶生成增多，凝血酶与抗凝血酶结合形成的复合物TAT和纤溶酶与α2-PI结合形成的PIC也随之增加。有研究显示创伤性DIC阶段，机体内皮受损严重，凝血酶和组织纤溶酶原激活物大量生成，蛋白C通路激活，而活化的蛋白C可抑制凝血因子Va和凝血因子VⅢa导致机体呈低凝状态。除此之外，蛋白C还可抑制组织纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)，从而导致促进大量纤溶酶原活化成纤溶酶。此时TAT和PIC水平也随着创伤的严重程度增加而显著升高。因而TAT、PIC联合诊断可作为创伤性弥散性血管内凝血(DIC)的敏感检测标准，用于诊断DIC和DIC分型；同时结合其他指标，TAT、PIC联合诊断检测可用于抗凝或溶栓治疗人群治疗疗效的判断，结合DD等指标评价凝血和纤溶功能等。
目前凝血-纤溶系统相关项目检测，主要为化学发光免疫分析法，该方法灵敏度高，但试剂稳定性难以控制，仪器故障率高，需要专业的人士进行检测；同时需单独分项目检测，提高了检测成本和检测时间。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于血栓调节蛋白(TM)、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)和纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物(PIC)联合检测的试剂卡和含有该试剂卡的试剂盒，利用所述试剂卡或者试剂盒能够对样本中的TM、TAT和PIC同时进行检测，实现了一卡多检，且各指标间无交叉反应，降低了检测成本和检测时间；同时检测灵敏度高，检测范围更宽，操作简便，无需专业的检测人员，利于推广使用。
为此，本申请第一方面提供了一种用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡，所述试剂卡包括试纸条，所述试纸条包括：
底板，和沿层析方向依次固定于所述底板上的样本垫、荧光结合垫、层析膜和吸水垫，且所述样本垫、荧光结合垫、层析膜和吸水垫顺次接触；
所述荧光结合垫上喷涂有荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物，所述荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物包括荧光微球-SA-生物素-抗TM抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-抗TAT抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-抗PIC抗体偶联物和荧光微球-SA-生物素-质控抗体偶联物；
所述层析膜远离荧光结合垫的一端设置有质控线，所述质控线上固定有与所述质控抗体结合的第二抗体；所述层析膜靠近标记垫的一端依次设置有第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线上固定有抗TAT抗体，第二检测线上固定有抗PIC抗体，第三检测线上固定有抗TM抗体。
本申请所述试剂卡中的试纸条运用双抗体夹心法，配套使用荧光检测仪器，对待测样本中TM、TAT和PIC进行联合检测。具体地，所述试纸条的荧光结合垫上同时含有荧光微球-SA(链酶亲和素)-生物素-抗TM抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-抗TAT抗体偶联物和荧光微球-SA-生物素-抗PIC抗体偶联物，待测样本中所含的TM、TAT和PIC检测物与荧光结合垫上的相应荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物上的抗体反应后，生成检测物(抗原)-抗体-生物素-SA-荧光微球偶联物，通过层析作用上述偶联物到达层析膜上，并与层析膜的检测线上固定的抗体进一步进行反应，进而将其固定于相应的检测线上，通过配套的仪器检测各检测线荧光强度的信号值，即可计算出待测样本中TM、TAT和PIC的含量。本申请中，针对同一检测物，所述层析膜检测线上固定的抗体与荧光微球上偶联的抗体与该检测物(TM、TAT或PIC)上的结合位点不同，便于形成双抗体夹心复合物。在一些具体实施方式中，所述层析膜和荧光微球上偶联的抗TM抗体、抗TAT抗体和抗PIC抗体均为单克隆抗体，如抗TM单克隆抗体、抗TAT单克隆抗体和抗PIC单克隆抗体。
本申请所述荧光结合垫上含有的荧光微球-SA-生物素-质控抗体偶联物为质控物，该偶联物在层析的作用下到达层析膜上，并与层析膜的质控线上固定的第二抗体反应，进而将其固定于质控线上。检测结束后，通过仪器检测质控线上荧光强度的有无，进而对该试纸条检测结果的准确性进行判定。只有当质控线上有荧光强度时，才能根据各检测线荧光强度的信号值计算待测样本中TM、TAT和PIC的含量；相反地，若质控线上没有荧光强度，说明检测过程有问题，需要重新进行检测。
本申请中对所述荧光微球-SA-生物素-质控抗体中的质控抗体的具体种类没有明确限定，只要其能够与质控线上固定的抗体能够结合即可。在本申请的一些具体实施方式中，所述标记质控抗体为鸡IgY抗体或兔IgG，此时与之对应的质控线上固定的抗体为羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG。
本申请中，荧光结合垫上喷涂的荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物中，荧光微球与抗体之间通过生物素-链酶亲和素系统偶联，经过生物素-链酶亲和素系统的放大，可以提高检测的灵敏度。
本申请中，所述底板可以为PVC底板，所述层析膜的材质为硝酸纤维素(NC)膜。
在一些实施方式中，所述荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物中的生物素为NHS-PEG12-生物素。
本申请中，对抗体进行生物素标记时，当采用的生物素标记试剂为NHS-PEG12-生物素，此时的偶联物具体为荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗体偶联物(分别为荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗TM抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗TAT抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗PIC抗体偶联物、和荧光微球-SA-生物素-PEG12-质控抗体偶联物)。
由于生物素分子量小，形成的生物素化标记物容易受大分子蛋白位阻效应的影响，采用NHS-PEG12-生物素作为生物素标记试剂使得标记至抗体上的生物素为PEG12-生物素，延长了生物素母体结构与抗体的间距，进而减少了抗原抗体及生物素和SA结合时因空间位阻导致的结合受限而灵敏度低的问题。本申请经过生物素-链酶亲和素系统的放大和同时延长生物素母体结构与抗体的间距离，更利于生物素与链酶亲和素的结合及抗体与待测抗原(TM、TAT和PIC)的结合，极大的提高了检测的灵敏度，同时扩大了检测试剂的检测范围，同时实现了一卡多检且无交叉反应。
在一些实施方式中，所述荧光微球为时间分辨荧光微球，其表面修饰有链酶亲和素，且内部包埋有铕、钐、钆、铽和镝中的至少一种。
本申请中，由于时间分辨荧光微球的荧光半衰期长，斯托克斯位移大。因此通过采用时间分辨荧光微球能够有效降低背景光干扰。其原理是采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，由于这种标记物Stokes位移大(>150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此，测定时只要延缓测量时间，待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可有效地消除各种非特异性荧光的干扰，获得很高的灵敏度。
在一些实施方式中，所述荧光结合垫在喷涂荧光微球-抗体偶联物之前先采用结合垫封闭液进行浸渍并烘干处理；所述结合垫封闭液中含有0.25～0.45mg/mL的阻断剂。
本申请中通过采用含阻断剂的结合垫封闭液对荧光结合垫进行浸渍处理，能够促进标记物的释放，降低非特异性吸附(HAMA效应)，提高试纸条的稳定性。本申请中，所述阻断剂例如可以为TRU BLOCK或动物IGG。
在一些优选的实施方式中，所述结合垫封闭液中含有0.05～0.15wt％的PEG20000，1～3mmol/L的硼酸，1～5wt％的海藻糖，0.3～1.0wt％的牛血清蛋白(BSA)和0.25～0.45mg/ml的阻断剂。
在一些具体实施方式中，所述结合垫封闭液中含有0.1wt％的PEG20000，2mmol/L的硼酸，3wt％的海藻糖，0.5wt％的牛血清蛋白(BSA)和0.35mg/ml的阻断剂。
通过采用上述组成的结合垫封闭液能够进一步降低检测过程的非特异性吸附(HAMA)，进而提高检测结果的准确性。
在一些实施方式中，所述荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物的制备方法包括如下步骤：S1，将含待标记抗体的溶液与生物素标记试剂混合后进行标记，标记结束后用脱盐柱脱盐收集回收液，制得生物素标记的抗体；
S2，将SA-荧光微球与生物素标记的抗体混合后进行偶联反应，制得荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物；
所述待标记的抗体选自抗TM抗体、抗TAT抗体、抗PIC抗体和质控抗体中的任意一种。
本申请中，荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物共包含四种类型：荧光微球-SA-生物素-抗TM抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-抗TAT抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-抗PIC抗体偶联物和荧光微球-SA-生物素-质控抗体偶联物，制备过程中，四种类型的偶联物分别进行制备。当制备时的标记抗体为抗TM抗体，制得的偶联物为荧光微球-SA-生物素-抗TM抗体偶联物；当制备时的标记抗体为抗TAT抗体，制得的偶联物为荧光微球-SA-生物素-抗TAT抗体偶联物；当制备时的标记抗体为抗PIC抗体，制得的偶联物为荧光微球-SA-生物素-抗PIC抗体偶联物；当制备时的标记抗体为质控抗体，制得的偶联物为荧光微球-SA-生物素-质控抗体偶联物。
在一些具体实施方式中，所述待标记抗体与生物素标记试剂的质量比为(10～15):1，所述SA-荧光微球与生物素标记的抗体的质量比：(30～100):1；其中生物素标记的抗体的质量以抗体的质量计。
本申请中，制备过程中SA-荧光微球中所加入的生物标记的抗体的量(质量比)按标记后的抗体浓度计算。
本申请中，所述SA-荧光微球表示链酶亲和素修饰的荧光微球，可以通过市售途径获得SA-荧光微球。
本申请中，所述生物素标记试剂为生物素或者NHS-PEG12-生物素；优选为NHS-PEG12-生物素。
本申请中，对待标记抗体进行生物素标记的方法以及将SA-荧光微球与生物素标记的抗体进行偶联的方法均为本领域的常规方法，本领域技术人员可以根据需要进行常规选择。
本申请中，将荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物喷涂至荧光结合垫上的方法例如可以为：将包含荧光微球-SA-生物素-抗TM抗体偶联物的溶液、包含荧光微球-SA-生物素-抗TAT抗体偶联物的溶液、包含荧光微球-SA-生物素-抗PIC抗体偶联物的溶液和包含荧光微球-SA-生物素-质控抗体偶联物的溶液进行混合，获得混合液；将所述混合液喷涂到玻纤上，烘干后获得荧光结合垫。
在一些实施方式中，所述层析膜上检测线的制备方法为：将配好的抗TAT抗体的包被溶液划线固定至第一检测线，将配好的抗PIC抗体的包被溶液划线固定至第二检测线上，将配好的抗TM抗体的包被溶液划线固定至第三检测线上；
所述层析膜上质控线的制备方法为：将配好的与所述质控抗体结合的第二抗体的包被溶液划线固定至质控线上。
本申请中，与所述质控抗体结合的第二抗体能够与质控抗体特异性结合。例如，当质控抗体为鸡IgY时，与所述质控抗体结合的第二抗体为羊抗鸡IgY；当质控抗体为兔IgG，与所述质控抗体结合的第二抗体为羊抗鸡兔IgG。
本申请中，所述第一检测线、第二检测线、第三检测线和质控线之间相互平行。本申请对第一检测线、第二检测线、第三检测线和质控线之间的间距没有明确限定，其为本领域的常规间距。在一些具体实施方式中，所述第一检测线与第二检测线的间距可以为3～7mm，第二检测线与第三检测线的间距可以为3～7mm，第三检测线与质控线的间距可以为3～7mm，具体根据视窗和NC膜规格微调。
在一些实施方式中，所述抗TAT抗体的包被溶液、抗PIC抗体的包被溶液、抗TAT抗体的包被溶液和与所述质控抗体结合的第二抗体的包被溶液中抗体的浓度各自独立地为0.6～1.2mg/mL；所述抗TAT抗体的包被溶液、抗PIC抗体的包被溶液、抗TAT抗体的包被溶液和与所述质控抗体结合的第二抗体的包被溶液的划膜量各自独立地为0.8～1.2uL/cm。
本申请中，可以采用包被缓冲液配制用于划线固定至层析膜上的各抗体溶液，所述包被缓冲液中含有pH值为7.4±0.05的5～10mmom/L的PBS缓冲液和2～4wt％的海藻糖。在一些具体实施例中，所述包被缓冲液中含有pH值为7.4±0.05的10mmom/L的PBS缓冲液和3wt％的海藻糖。
本申请中，所述层析膜在进行划膜前优选先于湿度为45％～60％环境下平衡3～4小时。通过平衡能够使采用相应的抗体溶液进行划线时更容易进行，进而改善划膜质量。
在一些实施方式中，所述样本垫上浸渍有样品垫封闭缓冲液；所述样品垫封闭缓冲液中含有pH值为8.0±0.05的40～60mmol/L的Tris缓冲液，0.5～1.5wt％的BSA和0.3～0.9wt％的S9。
本申请中，通过在样本垫上浸渍上述组成的样品垫封闭缓冲液，能够助于调节样本的pH值，减少干扰，改善反应灵敏度等。
在一些实施方式中，所述试剂卡还包括外壳，所述外壳能相互扣合的上盖和下盖，所述上盖对应所述试纸条上层析膜的位置设有显示窗，对应对应所述试纸条上样本垫的位置设置有加样孔。
本申请中，所述外壳用于对所述试纸条进行封装。
本申请第二方面提供了一种用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂盒，所述试剂盒中含有如本申请第一方面所述的试剂卡。
本申请中，所述试剂盒中含有所述试剂卡，使得利用所述试剂盒能够对待测样本中的TM、TAT和PIC进行联合检测，降低了检测成本和检测时间。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括样本稀释液。
本申请中，所述样本稀释液用于对待测样本进行稀释，以进一步提高检测结果的准确性。所述样本稀释液中含有缓冲液、表面活性剂、氯化钠、防腐剂和海藻糖和蛋白；所述缓冲液选自磷酸盐、硼酸盐和Tris缓冲液中的至少一种，浓度为10～50mM；所述表面活性剂选自曲拉通x-100、吐温20、S9和Brij-35中的至少一种，浓度为0.1～1wt％；所述氯化钠的浓度为0.5～1wt％；所述防腐剂选自山梨酸、苯甲酸或proclin300中的至少一种，浓度为0.01～0.1wt％；所述蛋白为牛血清蛋白、酪蛋白、明胶、鱼皮明胶的一种，浓度为0.5～2wt％。
在一些具体实施例中，所述样本稀释液中含有pH7.4±0.05的50mmol/L的Tris缓冲液，0.1wt％的吐温20，0.9wt％的氯化钠，0.1wt％的proclin300，0.5wt％的海藻糖和0.5wt％BSA。
本申请的有益技术效果：本申请所述用于血栓调节蛋白(TM)、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)和纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物(PIC)联合检测的试剂卡，能够对样本中的TM、TAT和PIC同时进行检测，实现了一卡多检，且各指标间无交叉反应，降低了检测成本和检测时间。同时检测灵敏度高，检测范围更宽，操作简便，无需专业的检测人员，利于推广使用，能够较好的应用在凝血-纤溶系统相关项目检测中，应用前景广阔。
附图说明
图1为实施例1制备的用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡中试纸条的结构示意图；其中附图标记的含义为：1底板；2样本垫；3荧光结合垫；4层析膜；5吸水垫。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡的制备
一、试纸条的制备
1、样本垫的制备
配制样品垫封闭缓冲液：样品垫封闭缓冲液中含有pH值为8.0的50mmol/L的Tris缓冲液，1.0wt％的BSA和0.5wt％的S9。
将配制的样品垫封闭缓冲液均匀涂布并完全润湿玻璃纤维素膜-Ahlstrom 8964，烘干后裁剪成23mm×290mm的尺寸，制得样本垫。
2、荧光结合垫的制备
(1)荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物的制备
按照质量比：抗TM单克隆抗体:NHS-PEG12-生物素(以生物素的质量计)为15:1，将抗TM单克隆抗体与NHS-PEG12-生物素混合后进行标记，标记结束后用脱盐柱脱盐收集回收液，制得生物素标记的抗TM单克隆抗体，即生物素-PEG12-抗TM单克隆抗体；
按照质量比：SA-荧光微球:生物素-PEG12-抗TM单克隆抗体(以抗体的质量计)为50:1，将SA-荧光微球与生物素-PEG12-抗TM单克隆抗体混合后进行偶联，制得荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗TM单克隆抗体偶联物。
按照上述相同的方法依次制备荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗TAT单克隆抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗PIC单克隆抗体偶联物和荧光微球-SA-生物素-PEG12-鸡IgY偶联物。
(2)荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物的喷涂
配制结合垫封闭液：结合垫封闭液中含有0.1wt％的PEG20000，2mmol/L的硼酸，3wt％的海藻糖，0.5wt％的牛血清蛋白(BSA)和0.35mg/mL的动物IGG阻断剂。
将配制的结合垫封闭液均匀涂布并完全润湿玻璃纤维素膜-Ahlstrom 8964，烘干后裁剪成12mm×290mm的尺寸，制得浸渍有结合垫封闭液的玻璃纤维素膜。
根据制备荧光结合垫的条数计算标记物稀释工作液的用量及需要用的标记物母液体积，将荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗TM单克隆抗体偶联物母液，荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗TAT单克隆抗体偶联物母液，荧光微球-SA-生物素-PEG12-抗PIC单克隆抗体偶联物分别按100倍、80倍、110倍稀释，荧光微球-SA-生物素-PEG12-鸡IgY偶联物母液按200倍混合稀释后，得到荧光标记偶联物工作液，将所述工作液按5uL/cm的量喷涂到裁剪好且浸渍有结合垫封闭液的玻璃纤维素膜上，烘干后获得荧光结合垫。
3、层析膜的制备
配制包被缓冲液：包被缓冲液中含有pH值为7.4的10mmom/L的PBS缓冲液和3wt％的海藻糖。
采用配制的包被缓冲液分别配制浓度为1.0mg/mL的抗TM单克隆抗体的包被溶液、浓度为1.0mg/mL的抗TAT单克隆抗体的包被溶液、浓度为1.0mg/mL的抗PIC单克隆抗体的包被溶液和浓度为1.0mg/mL的抗鸡IgY抗体的包被溶液。
将硝酸纤维素膜于湿度为50～65％的环境下平衡4小时后，用喷金划膜仪将配好的抗TAT单克隆抗体的包被溶液划线至第一检测线(T1线)区域(划膜量为1μL/cm)，将配好的抗PIC单克隆抗体的包被溶液划线至第二检测线(T2线)区域(划膜量为1μL/cm)，将配好的抗TM单克隆抗体的包被溶液划线至第三检测线(T3线)区域(划膜量为1μL/cm)，将配好的抗鸡IgY抗体的包被溶液划线至质控线(C线)区域(划膜量为1μL/cm)。将划好的膜于45℃烘干20小时，制得含检测线和质控线的层析膜。其中，制得的层析膜的T1线与T2线的间距为5mm，T2线与T3线的间距为5mm，T3线与C线的间距为5mm。
4、组装
沿层析方向将步骤1制备的样本垫、步骤1制得的荧光标记垫，和吸水垫依次固定于带有步骤3制得的层析膜的PVC底板上，且样本垫压荧光标记垫2mm、荧光标记垫压层析膜2mm、吸水垫压层析膜2mm，然后将其裁切成宽为3.5mm的试纸条，即为用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡中试纸条，其结构如图1所示。
二、试剂卡的组装
将步骤一制备的试纸条装入卡壳，并用压卡机压卡，获得用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡。
实施例2：用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡的制备
制备过程基本同实施例1，不同之处在于，荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物制备过程中采用的生物素标记试剂为生物素。
实施例3：用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡的制备
制备过程基本同实施例1，不同之处在于，荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物制备过程中采用的生物素标记试剂为NHS-PEG8-生物素。
实施例4：用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡的制备
制备过程基本同实施例1，不同之处在于，荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物制备过程中所配制的结合垫封闭液中含有0.1wt％的PEG20000，2mmol/L的硼酸，3wt％的海藻糖，0.5wt％的牛血清蛋白(BSA)和0.25mg/mL的动物IGG阻断剂。
实施例5：用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡的制备
制备过程基本同实施例1，不同之处在于，荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物制备过程中所配制的结合垫封闭液中含有0.1wt％的PEG20000，2mmol/L的硼酸，3wt％的海藻糖，0.5wt％的牛血清蛋白(BSA)和0.45mg/mL的动物IGG阻断剂。
测试例1：稳定性测试
将实施例1-5制备的用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡分别在4℃保存7天、以及37℃加速7天(指将试剂卡装入铝箔袋于37℃环境加速老化7天)后，采用实施例1-5制备的用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡与配套的检测仪器，分别对含有18.32TU/mL的TM、12.74ng/mL的TAT和7.61ug/dL的PIC的同一样本溶液中TM、TAT和PIC含量进行检测，重复检测3次取平均值，结果如表1所示。
表1稳定性测试结果
Figure BDA0004139202160000101
从表1可知，本申请实施例1-5制备的试剂卡均能对样本中TM、TAT和PIC的含量进行有效检测，且均具有较好的稳定性。加速7天其测试结果与4℃度保存相比，其偏差均在±10％以内。在本反应体系条件下试剂卡的稳定性均良好，且试剂卡的测试结果与样本靶值相比其偏差在10％内，检测准确性优异。
测试例2：干扰性测试
干扰物一般分为内源性干扰和外源性干扰，其对实验结果的影响，一般是通过测定对照或基础样本中浓度得出的，常见内源性干扰包括甘油三酯、胆红素、血红蛋白等，选择含有含有18.32TU/mL的TM、12.74ng/mL的TAT和7.61ug/dL的PIC的样本，进行干扰性测试，实验分3组。向实验组1的样本溶液中加入甘油三酯溶液，使甘油三酯的终浓度为3000mg/dL；向对照组1的样本溶液中加入用于配制甘油三酯溶液的空白溶剂。向实验组2的样本溶液中加入胆红素溶液，使胆红素的终浓度为20mg/dL；向对照组2的样本溶液中加入用于配制胆红素溶液的空白溶剂。向实验组3的样本溶液中加入血红蛋白溶液，使血红蛋白的终浓度为0.3mg/mL；向对照组3的样本溶液中加入用于配制血红蛋白溶液的空白溶剂。
采用实施例1-5制备的试剂卡与配套的检测仪器对3组实验中的实验组和对照组的样本溶液中的TM、TAT和PIC的含量进行检测，重复检测3次取平均值，结果如表2-4所示。
表2：甘油三酯的干扰性测试检测结果
Figure BDA0004139202160000111
表3：胆红素的干扰性测试检测结果
Figure BDA0004139202160000112
Figure BDA0004139202160000121
表4：血红蛋白的干扰性测试检测结果
Figure BDA0004139202160000122
从上表可知，本申请实施例1-5制备的试剂卡均具有较好的抗干扰效果。从实施例1-3的检测结果可知，相较于生物素和NHS-PEG8-生物素，在本工艺体系条件下当采用的生物素标记试剂为NHS-PEG12-生物素，制得的试剂卡的抗干扰效果更为优异。
测试例3：交叉反应测试
本申请提供的试剂卡采用三联检的形式，需要验证其检测线之间是否有交叉反应，因此用含BSA基质的稀释液，分别向其中添加复合抗原，即抗原为完整序列的蛋白。同时由于测试的样本为采用稀释液添加复合抗原，对交叉反应能较好的评估。分别用含BSA基质的稀释液添加复合抗原的形式配制50TU/mL的TM样本(未赋值)、50ug/dL的PIC样本(未赋值)、50ng/mL的TAT样本(未赋值)进行测试，其测试结果见表5所示：
表5：交叉反应测试结果
Figure BDA0004139202160000131
由表5可以看出，同时测试TM的阳性样本，PIC及TAT的值低于检测限未出现假阳，而测试PIC阳性样本，TM和PIC结果低于检测限未出现假阳，测试TAT阳性样本时，TM及TAT结果低于检测限未出现假阳，因此本试剂盒个检测指标符合要求，不存在交叉反应的情况。
测试例4：灵敏度测试
用样本稀释液作为空白测试，并用样本稀释液分别制备接近各指标检出限的含TM、TAT、和PIC参考品，测试其荧光值，测试结果见表6所示。样本稀释液中含有pH7.4的50mmol/L的Tris缓冲液，0.1wt％的吐温20，0.9wt％的氯化钠，0.1wt％的proclin300，0.5wt％的海藻糖和0.5wt％BSA。
表6：灵敏度测试结果
Figure BDA0004139202160000141
由表6可以看出，实施例1-5中，采用NHS-PEG12-生物素标记的方案，测试其检测限质控品其荧光值与本底比较增强了3倍以上，而采用生物素和NHS-PEG8-生物素标记的方案中荧光值低于NHS-PEG12-生物素标记的方案，因而本申请最后采用的是采用NHS-PEG12-生物素进行抗体的标记制备试剂卡更利于灵敏度的提升。
测试例5：特异性测试
本测试例采用向样本稀释液中添加含HAMA样本，使其浓度为40ng/mL，对实施例1-5中的试剂卡进行测试，根据其荧光值判断HAMA消除的效果，以便评估各试剂卡的特异性。样本稀释液中含有pH7.4的50mmol/L的Tris缓冲液，0.1wt％的吐温20，0.9wt％的氯化钠，0.1wt％的proclin300，0.5wt％的海藻糖和0.5wt％BSA。
表7：特异性测试结果
Figure BDA0004139202160000151
根据表7的测试结果可以看出，实施例1-3中阻断剂的使用量均为0.35mg/mL，测试本底和HAMA样本结果可以看出，HAMA样本的荧光值基本接近本底，对异嗜性抗体的消除效果较好，而实施例5采用0.45mg/mL的阻断剂效果没有明显提升，从成本考虑实施例1-3的阻断剂用量可满足性能要求，而实施例4阻断剂用量为0.25mg/mL，测试HAHA样本其荧光值明显较本底高很多，出现非特异性吸附。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包括试纸条，所述试纸条包括：
底板，和沿层析方向依次固定于所述底板上的样本垫、荧光结合垫、层析膜和吸水垫，且所述样本垫、荧光结合垫、层析膜和吸水垫顺次接触；
所述荧光结合垫上喷涂有荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物，所述荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物包括荧光微球-SA-生物素-抗TM抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-抗TAT抗体偶联物、荧光微球-SA-生物素-抗PIC抗体偶联物和荧光微球-SA-生物素-质控抗体偶联物；
所述层析膜远离荧光结合垫的一端设置有质控线，所述质控线上固定有与所述质控抗体结合的第二抗体；所述层析膜靠近标记垫的一端依次设置有第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线上固定有抗TAT抗体，第二检测线上固定有抗PIC抗体，第三检测线上固定有抗TM抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂卡，其特征在于，所述荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物中的生物素为NHS-PEG12-生物素。
3.根据权利要求1或2所述的试剂卡，其特征在于，所述荧光微球为时间分辨荧光微球，其表面修饰有链霉亲和素，且内部包埋有铕、钐、钆、铽和镝中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的试剂卡，其特征在于，所述荧光结合垫在喷涂荧光微球-抗体偶联物之前先采用结合垫封闭液进行浸渍并烘干处理；所述结合垫封闭液中含有0.25~0.45mg/mL的阻断剂。
5.根据权利要求4所述的试剂卡，其特征在于，所述结合垫封闭液中含有0.05~0.15wt%的PEG20000，1~3mmol/L的硼酸，1~5wt%的海藻糖，0.3~1.0 wt%的牛血清蛋白和0.25~0.45mg/ml的阻断剂。
6.根据权利要求1或2所述的试剂卡，其特征在于，所述荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物的制备方法包括如下步骤：
S1，将含待标记抗体的溶液与生物素标记试剂混合后进行标记，标记结束后用脱盐柱脱盐收集回收液，制得生物素标记的抗体；
S2，将SA-荧光微球与生物素标记的抗体混合后进行偶联反应，制得荧光微球-SA-生物素-抗体偶联物；
所述待标记的抗体选自抗TM抗体、抗TAT抗体、抗PIC抗体和质控抗体中的任意一种；
优选地，所述待标记抗体与生物素标记试剂的质量比为（10~15）: 1，所述SA-荧光微球与生物素标记的抗体的质量比：（30~100）:1；其中生物素标记的抗体的质量以抗体的质量计。
7.根据权利要求1或2所述的试剂卡，其特征在于，所述层析膜上检测线的制备方法为：将配好的抗TAT抗体的包被溶液划线固定至第一检测线，将配好的抗PIC抗体的包被溶液划线固定至第二检测线上，将配好的抗TM抗体的包被溶液划线固定至第三检测线上；
所述层析膜上质控线的制备方法为：将配好的与所述质控抗体结合的第二抗体的包被溶液划线固定至质控线上；
优选地，所述抗TAT抗体的包被溶液、抗PIC抗体的包被溶液、抗TAT抗体的包被溶液和与所述质控抗体结合的第二抗体的包被溶液中抗体的浓度各自独立地稀释为0.6~1.2mg/mL；所述抗TAT抗体的包被溶液、抗PIC抗体的包被溶液、抗TAT抗体的包被溶液和与所述质控抗体结合的第二抗体的包被溶液的划膜量各自独立地为0.8~1.2uL/cm。
8.根据权利要求1或2所述的试剂卡，其特征在于，所述试剂卡还包括外壳，所述外壳能相互扣合的上盖和下盖，所述上盖对应所述试纸条上层析膜的位置设有显示窗，对应对应所述试纸条上样本垫的位置设置有加样孔。
9.一种用于TM、TAT和PIC联合检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求1-8中任意一项所述的试剂卡。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括样本稀释液。
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