JP2714562B2 - 可溶性フイブリンの測定方法 - Google Patents
可溶性フイブリンの測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ある生物種の体液中の「可溶性」フイブリ
ンをこのフイブリンに対する固相に結合したバイオアフ
イニテイ結合相手とこのフイブリンに対する他の標識さ
れたバイオアフイニテイ結合相手とを用いそしてこの他
方の結合パートナーを最初の方の相手と交叉反応しない
ように選択することによって測定する方法に関する。
ンをこのフイブリンに対する固相に結合したバイオアフ
イニテイ結合相手とこのフイブリンに対する他の標識さ
れたバイオアフイニテイ結合相手とを用いそしてこの他
方の結合パートナーを最初の方の相手と交叉反応しない
ように選択することによって測定する方法に関する。
血液凝固系の活性化の検出は臨床診断上重要である。
すなわち、例えば血液凝固の活性化は手術後に起こって
血栓症に到ることがある。今のところ、血栓が起きるこ
とを予測するための信頼性ある診断基準はない。
すなわち、例えば血液凝固の活性化は手術後に起こって
血栓症に到ることがある。今のところ、血栓が起きるこ
とを予測するための信頼性ある診断基準はない。
あらゆる場合において、こういったことが起きる前で
あっても潜在的な血液凝固は起きてはいるが(例えば繊
維素溶解過程による)生物の反対調整により抑えられて
いると推測されうる。この時期には、この危険な状況を
認識するための診断基準が必要となる。
あっても潜在的な血液凝固は起きてはいるが(例えば繊
維素溶解過程による)生物の反対調整により抑えられて
いると推測されうる。この時期には、この危険な状況を
認識するための診断基準が必要となる。
測定可能な一つのパラメータはトロンビンの作用によ
りフイブリノゲンから形成されるフイブリンである。フ
イブリンは血栓症となった場合に血管を閉鎖する原因と
なる物質である。しかしながら前述の「前血栓症状態」
の時期にみられるような低濃度にあってはそれは可溶で
あって適当な検出方法により前血栓症状態の診断に用い
ることができる。
りフイブリノゲンから形成されるフイブリンである。フ
イブリンは血栓症となった場合に血管を閉鎖する原因と
なる物質である。しかしながら前述の「前血栓症状態」
の時期にみられるような低濃度にあってはそれは可溶で
あって適当な検出方法により前血栓症状態の診断に用い
ることができる。
現在、フイブリンはフイブリノゲンに結合しそしてこ
れによって溶液状態に保たれているものとされている。
フイブリン対フイブリノゲン比が特定比を超えると、血
管の血栓閉鎖を起こす物質である不溶性フイブリンが形
成される。
れによって溶液状態に保たれているものとされている。
フイブリン対フイブリノゲン比が特定比を超えると、血
管の血栓閉鎖を起こす物質である不溶性フイブリンが形
成される。
従って、可溶性フイブリン検出方法の目的は多少なり
とも大過剰のフイブリノゲンの存在下におけるフイブリ
ンの特異的検出である。
とも大過剰のフイブリノゲンの存在下におけるフイブリ
ンの特異的検出である。
一般に、このために用いられる方法はフイブリンの溶
解度を減じる方法である:使用された例は、Breenおよ
びTullis(Ann.Intern.Med.69,1197−1206,1968)のい
わゆるエタノール−ゲル化アツセイ、およびNiewiarows
kiおよびGurewich(J.Lab.Clin.Med.77,665−676,197
1)のプロタミンサルフエートアツセイである。最近の
方法はフイブリンがプラスミノゲン活性化物質を酵素作
用を高める性質を利用している(B.WimannおよびM.Rand
y,Thromb.Haemostas.55,189−193,1986)。もう一つの
アプローチはフイブリノゲンとフイブリンの間の構造上
の微差を認識できる抗体を生成させるというものである
(U.Scheefers−Borchel et al.,Proc.Nath.acad.Sci.8
2,7091−7095,1985)。
解度を減じる方法である:使用された例は、Breenおよ
びTullis(Ann.Intern.Med.69,1197−1206,1968)のい
わゆるエタノール−ゲル化アツセイ、およびNiewiarows
kiおよびGurewich(J.Lab.Clin.Med.77,665−676,197
1)のプロタミンサルフエートアツセイである。最近の
方法はフイブリンがプラスミノゲン活性化物質を酵素作
用を高める性質を利用している(B.WimannおよびM.Rand
y,Thromb.Haemostas.55,189−193,1986)。もう一つの
アプローチはフイブリノゲンとフイブリンの間の構造上
の微差を認識できる抗体を生成させるというものである
(U.Scheefers−Borchel et al.,Proc.Nath.acad.Sci.8
2,7091−7095,1985)。
前述の方法はすべて、程度の多少はあれ深刻な欠点を
有するが、それらには感度の不十分さから来るものと特
異性の不十分さから来るものとがある。あるいはそれら
はルーチンの臨床上の使用には複雑に過ぎる。
有するが、それらには感度の不十分さから来るものと特
異性の不十分さから来るものとがある。あるいはそれら
はルーチンの臨床上の使用には複雑に過ぎる。
驚くべきことに、フイブリンの公知のフイブリノゲン
結合特性を利用することにより、新しくしかも驚く程に
簡単な可溶性フイブリンの測定方法を提供できることを
見出した。それはフイブリンの機能的特性、すなわちフ
イブリノゲンに対する特異的結合という特性を免疫学的
方法と組み合わせるもので、その為にフイブリンに対す
る特別な特異抗体を必要としない。
結合特性を利用することにより、新しくしかも驚く程に
簡単な可溶性フイブリンの測定方法を提供できることを
見出した。それはフイブリンの機能的特性、すなわちフ
イブリノゲンに対する特異的結合という特性を免疫学的
方法と組み合わせるもので、その為にフイブリンに対す
る特別な特異抗体を必要としない。
従って、本発明はある生物種の体液中の「可溶性」フ
イブリンの測定方法であって、この体液をそのフイブリ
ンに対する固相に結合したバイオアフイニテイ結合相手
と接触させ、その体液を分離し、前記固相を前述するフ
イブリンに対する他の標識されたバイオアフイニテイ結
合相手と接触させ(そしてこの他方の結合相手は第一の
相手と交叉反応しないように選択するものとする)、ま
たこの他方の結合相手の過剰分を分離し、そして「可溶
性」フイブリン量を前記固相に結合した標識量から測定
することよりなる方法に関する。
イブリンの測定方法であって、この体液をそのフイブリ
ンに対する固相に結合したバイオアフイニテイ結合相手
と接触させ、その体液を分離し、前記固相を前述するフ
イブリンに対する他の標識されたバイオアフイニテイ結
合相手と接触させ(そしてこの他方の結合相手は第一の
相手と交叉反応しないように選択するものとする)、ま
たこの他方の結合相手の過剰分を分離し、そして「可溶
性」フイブリン量を前記固相に結合した標識量から測定
することよりなる方法に関する。
好ましい方法は固相上の結合パートナーを他の生物種
のフイブリノゲンとし、そして標識された結合相手をフ
イブリンと反応しそしてある生物種、好ましくはこの他
方の生物種、を体液が由来する方の生物種のフイブリノ
ゲンまたはフイブリンで免疫することにより得られ、そ
して標識されている抗体とする方法である。
のフイブリノゲンとし、そして標識された結合相手をフ
イブリンと反応しそしてある生物種、好ましくはこの他
方の生物種、を体液が由来する方の生物種のフイブリノ
ゲンまたはフイブリンで免疫することにより得られ、そ
して標識されている抗体とする方法である。
しかしながら、もう一つの可能な手順として、固相上
の結合相手をフイブリノゲンまたはフイブリンで免疫す
ることにより得られたフイブリンに対する抗体とし、そ
して標識された結合相手を測定すべきフイブリンの帰属
している生物種以外の生物種の標識フイブリノゲンとす
る手順がある。
の結合相手をフイブリノゲンまたはフイブリンで免疫す
ることにより得られたフイブリンに対する抗体とし、そ
して標識された結合相手を測定すべきフイブリンの帰属
している生物種以外の生物種の標識フイブリノゲンとす
る手順がある。
体液の由来する生物種は好ましくは人間である。
交叉反応の可能性を小さくするために、両結合相手の
一方が体液を由来する方の生物種以外の生物種からのフ
イブリノゲンであり、そして他方の結合相手がこの他方
の生物種からのフイブリンに対する抗体であるように結
合相手を選択するのが便利である。
一方が体液を由来する方の生物種以外の生物種からのフ
イブリノゲンであり、そして他方の結合相手がこの他方
の生物種からのフイブリンに対する抗体であるように結
合相手を選択するのが便利である。
体液が由来する方の生物種以外の生物種からのフイブ
リノゲンを固相に結合するときは、その体液と固相の接
触を、この他方の生物種からの付加的フイブリノゲンの
存在下に行うことができる。
リノゲンを固相に結合するときは、その体液と固相の接
触を、この他方の生物種からの付加的フイブリノゲンの
存在下に行うことができる。
標識には酵素が特に適している。
本発明は更に、ある生物種からのフイブリノゲンを別
の生物種の体液中の「可溶性」フイブリンの測定に用い
ることに関する。好ましい一態様においては固体担体に
結合されたフイブリノゲンが利用される。固体担体とし
ては固相イムノアツセイ(ELISA)に用いられているよ
うなプラスチツク面、例えばマイクロタイトレーシヨン
プレート、ポリスチレンチユーブまたはプラスチツクビ
ーズなどを用いることができる。フイブリノゲン被覆
は、吸着によっても、また共有結合によっても適用する
ことができる。特に適しているのはフイブリノゲン溶液
による含浸によって被覆し得るポリスチレン面である。
被覆に用いられるべきフイブリノゲン溶液は一般に1mg/
以上の濃度で用いられるが、吸着は溶液濃度よりも表
面の結合能の方に依存するので、厳密な濃度は重要でな
い。被覆に用いられるフイブリノゲンは、アツセイに用
いられるフイブリンに対する抗体と交叉反応すべきでな
い。これは測定されるべきフイブリンに対する標識抗体
の調製に用いたものと同じ生物種からのフイブリノゲン
を用いることによって最も簡単に達成される。このよう
にしてフイブリノゲンで被覆された表面は次いで導入さ
れる体液から「可溶性」フイブリンを吸着することがで
きる。流体を分離しそして表面を洗浄する。次いで検体
から吸着されたフイブリンを抗体を用いて検出すること
ができる。この抗体の性質は検体中のフイブリンとは反
応するがプラスチツク表面の被覆に用いたフイブリノゲ
ンとは反応しないように選択されるべきである。ヒト血
漿中の可溶性フイブリンを測定したいときは、ヒトフイ
ブリノゲンに対する、またはその分解生成物に対する抗
体が適している。抗体がポリクローナルかモノクローナ
ルかどうかということは重要ではない。唯一重要な点
は、それが固相の被覆に用いられたフイブリノゲンと交
叉反応しないことである。この条件を満たすための最も
簡単な方法は、同一生物種からの抗体と被覆用フイブリ
ノゲンとを用いることである。何故なら内因性タンパク
に対しては抗体が形成されないからである。結合を既知
の方法で検出するために、抗体を特にラジオアイソトー
プ、または好ましくは酵素で標識できる。同じく後の反
応において第一の抗体に対する標識抗体をもちいること
もできる(「サンドイツチアツセイ」)。
の生物種の体液中の「可溶性」フイブリンの測定に用い
ることに関する。好ましい一態様においては固体担体に
結合されたフイブリノゲンが利用される。固体担体とし
ては固相イムノアツセイ(ELISA)に用いられているよ
うなプラスチツク面、例えばマイクロタイトレーシヨン
プレート、ポリスチレンチユーブまたはプラスチツクビ
ーズなどを用いることができる。フイブリノゲン被覆
は、吸着によっても、また共有結合によっても適用する
ことができる。特に適しているのはフイブリノゲン溶液
による含浸によって被覆し得るポリスチレン面である。
被覆に用いられるべきフイブリノゲン溶液は一般に1mg/
以上の濃度で用いられるが、吸着は溶液濃度よりも表
面の結合能の方に依存するので、厳密な濃度は重要でな
い。被覆に用いられるフイブリノゲンは、アツセイに用
いられるフイブリンに対する抗体と交叉反応すべきでな
い。これは測定されるべきフイブリンに対する標識抗体
の調製に用いたものと同じ生物種からのフイブリノゲン
を用いることによって最も簡単に達成される。このよう
にしてフイブリノゲンで被覆された表面は次いで導入さ
れる体液から「可溶性」フイブリンを吸着することがで
きる。流体を分離しそして表面を洗浄する。次いで検体
から吸着されたフイブリンを抗体を用いて検出すること
ができる。この抗体の性質は検体中のフイブリンとは反
応するがプラスチツク表面の被覆に用いたフイブリノゲ
ンとは反応しないように選択されるべきである。ヒト血
漿中の可溶性フイブリンを測定したいときは、ヒトフイ
ブリノゲンに対する、またはその分解生成物に対する抗
体が適している。抗体がポリクローナルかモノクローナ
ルかどうかということは重要ではない。唯一重要な点
は、それが固相の被覆に用いられたフイブリノゲンと交
叉反応しないことである。この条件を満たすための最も
簡単な方法は、同一生物種からの抗体と被覆用フイブリ
ノゲンとを用いることである。何故なら内因性タンパク
に対しては抗体が形成されないからである。結合を既知
の方法で検出するために、抗体を特にラジオアイソトー
プ、または好ましくは酵素で標識できる。同じく後の反
応において第一の抗体に対する標識抗体をもちいること
もできる(「サンドイツチアツセイ」)。
特別な態様においては、フイブリノゲンをインキユベ
ーシヨン媒質に添加することができる。これは検査検体
中の異なるフイブリノゲン含量を補償する。可溶性フイ
ブリンはフイブリノゲンにより溶液として保たれるの
で、検体中のフイブリン含量が異なると測定結果に影響
することも考えられる。それ故、この影響はフイブリノ
ゲンの添加により除去できる。可溶性ヒトフイブリンを
測定するときは、ヒトフイブリノゲンをこの目的に用い
るのは適切でない。何故ならば、精製されたヒトフイブ
リノゲンは微量の可溶性フイブリンを含むことがあり、
そしてこのことは検出方法の干渉を意味するからであ
る。従ってフイブリノゲンが可溶性フイブリンで汚染さ
れている場合、抗フイブリノゲンとの交叉反応が得られ
ないようにするために、使用抗体を得るのに用いた生物
種からのフイブリノゲン、例えばウサギフイブリノゲン
を用いるのが便利である。
ーシヨン媒質に添加することができる。これは検査検体
中の異なるフイブリノゲン含量を補償する。可溶性フイ
ブリンはフイブリノゲンにより溶液として保たれるの
で、検体中のフイブリン含量が異なると測定結果に影響
することも考えられる。それ故、この影響はフイブリノ
ゲンの添加により除去できる。可溶性ヒトフイブリンを
測定するときは、ヒトフイブリノゲンをこの目的に用い
るのは適切でない。何故ならば、精製されたヒトフイブ
リノゲンは微量の可溶性フイブリンを含むことがあり、
そしてこのことは検出方法の干渉を意味するからであ
る。従ってフイブリノゲンが可溶性フイブリンで汚染さ
れている場合、抗フイブリノゲンとの交叉反応が得られ
ないようにするために、使用抗体を得るのに用いた生物
種からのフイブリノゲン、例えばウサギフイブリノゲン
を用いるのが便利である。
本発明を以下の実施例によって説明する。
実施例 1 ポリスチレンチユーブのウサギフイブリノゲンによる被
覆 20mg/のウサギフイブリノゲン(R.M.Husebyおよび
N.Bang:Fibrinogen,Thrombosis and Bleeding Disorder
s,Thieme−Verlag Stuttgart,N.Bang,F.Baller,E.Deuts
cheおよびE.Mammen(編者)第222〜247頁,1971年、の方
法により調製)を0.01モル/ホスフエート緩衝液(pH
7.4)に溶解し、そして0.25mlずつのサンプルをポリス
チレンチユーブ(供給元Greiner)に入れた。一夜イン
キユベーシヨン後、0.05モル/ Tris/クエン酸緩衝液
(pH7.4)で数回洗浄し、そしてそれらチユーブを室温
でシリカゲルを用いた乾燥箱内で乾燥した。乾燥後、そ
れらを気密および水密にアルミ封筒内に次に用いるまで
シールしておいた。
覆 20mg/のウサギフイブリノゲン(R.M.Husebyおよび
N.Bang:Fibrinogen,Thrombosis and Bleeding Disorder
s,Thieme−Verlag Stuttgart,N.Bang,F.Baller,E.Deuts
cheおよびE.Mammen(編者)第222〜247頁,1971年、の方
法により調製)を0.01モル/ホスフエート緩衝液(pH
7.4)に溶解し、そして0.25mlずつのサンプルをポリス
チレンチユーブ(供給元Greiner)に入れた。一夜イン
キユベーシヨン後、0.05モル/ Tris/クエン酸緩衝液
(pH7.4)で数回洗浄し、そしてそれらチユーブを室温
でシリカゲルを用いた乾燥箱内で乾燥した。乾燥後、そ
れらを気密および水密にアルミ封筒内に次に用いるまで
シールしておいた。
実施例 2 ウサギ抗ヒトフイブリノゲンとペルオキシダーゼのコン
ジユゲートの調製 ヒトフイブリノゲンに対するウサギ抗血清(Behringw
erke,製品番号No.ORCH)を同量の飽和硫酸アンモニウム
溶液と混合し、そして沈澱をスピンダウンした。沈澱を
50%強度硫酸アンモニウム溶液で2回洗浄し、次いで少
量の0.2モル/ Naホスフエート(pH8.2)に溶解し、
そして同じ緩衝液に対して透析した。この抗体溶液を次
いで既知の方法でペルオキシダーゼ(Boehringer Mannh
eim,注文番号No.108090)と結合した。手順については
S.Avrameas,Immunochemistry 6,43(1969)を参照され
たい。このようにして調製されたコンジユゲートをアツ
セイに適した希釈液となるよう予め希釈し、そして−70
℃で少量ずつ貯蔵した。
ジユゲートの調製 ヒトフイブリノゲンに対するウサギ抗血清(Behringw
erke,製品番号No.ORCH)を同量の飽和硫酸アンモニウム
溶液と混合し、そして沈澱をスピンダウンした。沈澱を
50%強度硫酸アンモニウム溶液で2回洗浄し、次いで少
量の0.2モル/ Naホスフエート(pH8.2)に溶解し、
そして同じ緩衝液に対して透析した。この抗体溶液を次
いで既知の方法でペルオキシダーゼ(Boehringer Mannh
eim,注文番号No.108090)と結合した。手順については
S.Avrameas,Immunochemistry 6,43(1969)を参照され
たい。このようにして調製されたコンジユゲートをアツ
セイに適した希釈液となるよう予め希釈し、そして−70
℃で少量ずつ貯蔵した。
実施例 3 可溶性フイブリンを含有する血漿の生産 クエン酸塩加ヒト血漿、例えば標準ヒト血漿(Behrin
gwerke,注文番号No.ORKL)を0.05IU/mlトロンビン、例
えばアツセイトロンビン(Behringwerke,注文番号No.OR
HT)と混合し、そして所定時間後に0.2mlのアリコート
をヒルジン10U/mlとヘパリン20U/mlの混合物0.02mlにピ
ペツトで入れてトロンビン反応を止めた。使用対照例
は、トロンビンに代えて生理学的食塩水と混合した血漿
検体とした。
gwerke,注文番号No.ORKL)を0.05IU/mlトロンビン、例
えばアツセイトロンビン(Behringwerke,注文番号No.OR
HT)と混合し、そして所定時間後に0.2mlのアリコート
をヒルジン10U/mlとヘパリン20U/mlの混合物0.02mlにピ
ペツトで入れてトロンビン反応を止めた。使用対照例
は、トロンビンに代えて生理学的食塩水と混合した血漿
検体とした。
実施例 4 可溶性フイブリンのアツセイ手順 実施例3における如く調製された検体をアツセイ前に
Tris緩衝液(0.05mol/、pH7.4、 Tween80 0.5%、ED
TA 5ミリモル/およびAntagosan 70KIU/mlを含有)で
1:100希釈した。0.2mlの予備希釈された検体を、実施例
1における如く調製されたウサギフイブリノゲン被覆チ
ユーブの各々にピペツトで入れ、そして室温で2時間イ
ンキユベートした。次に液体を吸引により除去し、そし
てそれらチユーブを緩衝液(例えばBehringwerke,注文
番号No.OSNKのEnzygnost洗浄用緩衝液)で3回洗浄し
た。次に実施例2における如く調製された抗体コンジユ
ゲート0.2mlを各チユーブにピペツトでとり、そして室
温で2時間インキユベートした。再び3回洗浄し、そし
て0.2mlの基質溶液(例えばo−フエニレンジアミン基
質溶液、Behringwerke、注文番号No.OSNK)を各チユー
ブに導入した。室温で10分後、各チユーブに1mlの2N硫
酸を添加して反応を止め、そしてこれら検体の492nmで
の吸光度を光度計で測定した。後掲の表に列挙された吸
光度が得られたが、これらはトロンビンの作用により血
漿中に可溶性フイブリンが生産されたこと、および可溶
性フイブリンの量がトロンビンへの曝露時間に依存する
ことを示している。
Tris緩衝液(0.05mol/、pH7.4、 Tween80 0.5%、ED
TA 5ミリモル/およびAntagosan 70KIU/mlを含有)で
1:100希釈した。0.2mlの予備希釈された検体を、実施例
1における如く調製されたウサギフイブリノゲン被覆チ
ユーブの各々にピペツトで入れ、そして室温で2時間イ
ンキユベートした。次に液体を吸引により除去し、そし
てそれらチユーブを緩衝液(例えばBehringwerke,注文
番号No.OSNKのEnzygnost洗浄用緩衝液)で3回洗浄し
た。次に実施例2における如く調製された抗体コンジユ
ゲート0.2mlを各チユーブにピペツトでとり、そして室
温で2時間インキユベートした。再び3回洗浄し、そし
て0.2mlの基質溶液(例えばo−フエニレンジアミン基
質溶液、Behringwerke、注文番号No.OSNK)を各チユー
ブに導入した。室温で10分後、各チユーブに1mlの2N硫
酸を添加して反応を止め、そしてこれら検体の492nmで
の吸光度を光度計で測定した。後掲の表に列挙された吸
光度が得られたが、これらはトロンビンの作用により血
漿中に可溶性フイブリンが生産されたこと、および可溶
性フイブリンの量がトロンビンへの曝露時間に依存する
ことを示している。
実施例 5 規定含量の可溶性フイブリンを含む血漿の生産およびフ
イブリン含量の測定 5mlのヒトEDTA血漿(2mg/ml EDTA、トリナトリウム
塩)を20mlの生理学的食塩水で希釈し、そして37℃に加
温した。次に0.167mlのトロンビン溶液(30IU/ml)を添
加し、そしてこの混合物を37℃で30分間インキユベート
した。
イブリン含量の測定 5mlのヒトEDTA血漿(2mg/ml EDTA、トリナトリウム
塩)を20mlの生理学的食塩水で希釈し、そして37℃に加
温した。次に0.167mlのトロンビン溶液(30IU/ml)を添
加し、そしてこの混合物を37℃で30分間インキユベート
した。
血餅をセルロースで押圧して乾かしそして生理学的食
塩水で3回洗浄した。それを次に2.5mlの3M尿素溶液に
溶解し、そしてその溶液を3000×gで10分間遠心分離し
て澄明化した。280nmでの吸光度測定は、15.6というフ
イブリンに対する特異吸光度に基づき、3.1g/という
濃度を示した。
塩水で3回洗浄した。それを次に2.5mlの3M尿素溶液に
溶解し、そしてその溶液を3000×gで10分間遠心分離し
て澄明化した。280nmでの吸光度測定は、15.6というフ
イブリンに対する特異吸光度に基づき、3.1g/という
濃度を示した。
なおも存在するトロンビンはすべて、ヒルジン(1000
IU/mlを25μ)添加により失活させた。
IU/mlを25μ)添加により失活させた。
2IU/mlヘパリンを含有する1mlのクエン酸塩加ヒト血
漿を上で調製したフイブリンの尿素溶液を用いて可溶性
フイブリンの含量が0.1mg/mlとなるように調整し、そし
てそれよりヘパリン含有クエン酸塩加血漿中の更なる幾
何級数的希釈液を調製した。それらの濃度を第2表に示
す。
漿を上で調製したフイブリンの尿素溶液を用いて可溶性
フイブリンの含量が0.1mg/mlとなるように調整し、そし
てそれよりヘパリン含有クエン酸塩加血漿中の更なる幾
何級数的希釈液を調製した。それらの濃度を第2表に示
す。
次に検体を緩衝液中で1:100希釈し、そして実施例4
の記載の如くアツセイした。
の記載の如くアツセイした。
第2表は得られた吸光度を記載しているが、それらは
可溶性フイブリン量の関数として増加している。また第
2表には対照例として純粋な尿素溶液と混合したクエン
酸塩加血漿検体、および血漿に代えて緩衝液を用いた検
体も入れてある。
可溶性フイブリン量の関数として増加している。また第
2表には対照例として純粋な尿素溶液と混合したクエン
酸塩加血漿検体、および血漿に代えて緩衝液を用いた検
体も入れてある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノルベルト・ハイムブルガー ドイツ連邦共和国デー‐3550 マルブル ク.ゾネンハング10 (56)参考文献 特開 昭60−158353(JP,A)
Claims (5)
- 【請求項1】ある生物種の体液中に「可溶性」フイブリ
ンの測定方法であって、この体液をそのフイブリンに対
する固相に結合したバイオアフイニテイ結合相手と接触
させ、その体液を分離し、前記固相を前記フイブリンに
対する他の標識されたバイオアフイニテイ結合相手と接
触させ、そしてこの他方の結合相手は第一の相手と交叉
反応しないように選択するものとし、そしてこの他方の
結合相手の過剰分を分離し、そして「可溶性」フイブリ
ン量を前記固相に結合した標識量から測定することより
なる前記測定方法において、固相上の結合相手を体液が
由来する生物種とは別の生物種のフイブリノゲンとし、
そして標識された結合相手をフイブリンと反応しそして
ある生物種を体液が由来する生物種のフイブリノゲンま
たはフイブリンで免疫することにより得られ、そして標
識されている抗体とするか、あるいは固相上の結合相手
を体液が由来する生物種のフイブリノゲンまたはフイブ
リンで免疫することにより得られたフイブリンに対する
抗体とし、そして標識された結合相手を測定すべきフイ
ブリンの帰属している生物種以外の生物種の標識フイブ
リノゲンとする方法。 - 【請求項2】体液を供与する生物種が人間である請求項
1記載の方法。 - 【請求項3】結合相手の一方を体液が由来する生物種以
外の生物種からのフイブリノゲンとし、そして他方の結
合相手を上記フイブリノゲンが由来する生物種からのフ
イブリンに対する抗体とする請求項1記載の方法。 - 【請求項4】体液が由来する生物種以外の生物種からの
フイブリノゲンを固相に結合し、かつその際体液と固相
の接触を上記フイブリノゲンが由来する生物種からの付
加的フイブリノゲンの存在下に行う請求項1記載の方
法。 - 【請求項5】標識が酵素である請求項1記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3730059.8 | 1987-09-08 | ||
DE19873730059 DE3730059A1 (de) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6491060A JPS6491060A (en) | 1989-04-10 |
JP2714562B2 true JP2714562B2 (ja) | 1998-02-16 |
Family
ID=6335495
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63222592A Expired - Lifetime JP2714562B2 (ja) | 1987-09-08 | 1988-09-07 | 可溶性フイブリンの測定方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6048684A (ja) |
EP (1) | EP0306813B1 (ja) |
JP (1) | JP2714562B2 (ja) |
AT (1) | ATE106571T1 (ja) |
AU (1) | AU613083B2 (ja) |
CA (1) | CA1338774C (ja) |
DE (2) | DE3730059A1 (ja) |
ES (1) | ES2056086T3 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4134833A1 (de) * | 1991-09-25 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fibrin |
DE4420742A1 (de) * | 1993-10-20 | 1995-04-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Synthetischer Standard für Immunoassays |
FR2813395B1 (fr) | 2000-08-28 | 2003-01-24 | Stago Diagnostica | Methode de dosage in vitro de la fibrine soluble par generation de produits de degradation specifiques |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4642285A (en) * | 1975-09-29 | 1987-02-10 | Diamedix Corporation | Sandwich EIA for antigen |
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