JPH0369520B2 - - Google Patents
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- JPH0369520B2 JPH0369520B2 JP58167641A JP16764183A JPH0369520B2 JP H0369520 B2 JPH0369520 B2 JP H0369520B2 JP 58167641 A JP58167641 A JP 58167641A JP 16764183 A JP16764183 A JP 16764183A JP H0369520 B2 JPH0369520 B2 JP H0369520B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、全血液、血漿、血清、生物学的液体
又はその他の物質中の酵素γ−グルタミルトラン
スフエラーゼ（γ−GT、γ−グルタミル−トラ
ンスペプチターゼ、EC Nr.2.3.2.2）の活性を測
定するに当り、酵素基質として作用するγ−グル
タミルアリールアミドをγ−グルタミルトランス
フエラーゼの存在でγ−グルタミル−受容体と反
応させかつ酵素反応の結果として形成される有色
物質をγ−グルタミルトランスフエラーゼ活性の
尺度として測光的に追跡することより成るγ−グ
ルタミルトランスフエラーゼ活性を測定するため
の試薬及び方法に関する。
又はその他の物質中の酵素γ−グルタミルトラン
スフエラーゼ（γ−GT、γ−グルタミル−トラ
ンスペプチターゼ、EC Nr.2.3.2.2）の活性を測
定するに当り、酵素基質として作用するγ−グル
タミルアリールアミドをγ−グルタミルトランス
フエラーゼの存在でγ−グルタミル−受容体と反
応させかつ酵素反応の結果として形成される有色
物質をγ−グルタミルトランスフエラーゼ活性の
尺度として測光的に追跡することより成るγ−グ
ルタミルトランスフエラーゼ活性を測定するため
の試薬及び方法に関する。
人間の血清中のγ−GTの発見以来、この酵素
は特に肝臓診断法において極めて重要になつた
〔H.U.ベルクマイヤー（Bergmeyer）、メトーデ
ン・デル・エンチーマテイツシエン・アナリーゼ
（Methoden der enzgmatischen Analyse）、
Band Ｉ ヴアインハイム（Weinheim）在フエ
ルラーク・ヒエミー（Verlag Chemie）1974、
14〜30頁及び757頁〕。試料中のγ−GTの活性の
測定のためには通常、γ−グルタミルアミドと受
容体としてのグリシルグリシンとが反応してγ−
グルタミルグリシルグリシド及びアミンを形成す
る際の反応速度を測定する。この測定方法は、二
種類、つまり一つは遊離されたアミン自体が色素
原体であるような種類及び他方は遊離されたアミ
ンが継続反応によつて初めて有色化合物に変えら
れるような種類に分類することができる。
は特に肝臓診断法において極めて重要になつた
〔H.U.ベルクマイヤー（Bergmeyer）、メトーデ
ン・デル・エンチーマテイツシエン・アナリーゼ
（Methoden der enzgmatischen Analyse）、
Band Ｉ ヴアインハイム（Weinheim）在フエ
ルラーク・ヒエミー（Verlag Chemie）1974、
14〜30頁及び757頁〕。試料中のγ−GTの活性の
測定のためには通常、γ−グルタミルアミドと受
容体としてのグリシルグリシンとが反応してγ−
グルタミルグリシルグリシド及びアミンを形成す
る際の反応速度を測定する。この測定方法は、二
種類、つまり一つは遊離されたアミン自体が色素
原体であるような種類及び他方は遊離されたアミ
ンが継続反応によつて初めて有色化合物に変えら
れるような種類に分類することができる。
第１群には、アミン基にγ−グルタミル基の結
合した種々のニトロアニリン誘導体が属する。こ
のγ−グルタミル基の受容体分子への転移によつ
てニトロアニリンが遊離され、その最大吸光度が
出発化合物よりも赤方に偏移しているので、黄色
又は赤色範囲内の適当な波長で色度増大が測定さ
れる。γ−GT用色素原体としては、就中γ−グ
ルタミル−ｐ−ニトロアニリド及びγ−グルタミ
ル−ｐ−ニトロアニリド−３−カルボン酸が公知
になつた。γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド
−３−スルホン酸はあまり使用されていない。こ
れらの色素原体は動力学的測定（kinetische
Messung）及び一点測定（Einpunktmessung）
を許す。
合した種々のニトロアニリン誘導体が属する。こ
のγ−グルタミル基の受容体分子への転移によつ
てニトロアニリンが遊離され、その最大吸光度が
出発化合物よりも赤方に偏移しているので、黄色
又は赤色範囲内の適当な波長で色度増大が測定さ
れる。γ−GT用色素原体としては、就中γ−グ
ルタミル−ｐ−ニトロアニリド及びγ−グルタミ
ル−ｐ−ニトロアニリド−３−カルボン酸が公知
になつた。γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド
−３−スルホン酸はあまり使用されていない。こ
れらの色素原体は動力学的測定（kinetische
Messung）及び一点測定（Einpunktmessung）
を許す。
第二群には、γ−グルタミル−アニリン、γ−
グルタミル−α−ナフチルアミン、γ−グルタミ
ル−β−ナフチルアミン、γ−グルタミル−ｐ−
ヒドロキシアニリン又はそれらの種々の置換誘導
体なる色素原体が属する。これらの色素原体は、
γ−GT−反応で遊離されたアリールアミンが酸
化的カツプリング、芳香族アルデヒドとの縮合又
はジアゾニウム塩とのカツプリングによつて測定
可能の有色物質に変化されるように使用される。
この際γ−GT−反応は特定時間の間実施され、
次に酸又はアルカリを加えて呈色反応が実施さ
れ、γ−GT−反応が停止される〔一点測定、例
えば西独国特許出願公告第2920292号及び同第
2338043号参照〕。この方法では動力学的測定を行
なうことができない。それというのもアミンの遊
離及び呈色は同一条件下では不可能だからであ
る。
グルタミル−α−ナフチルアミン、γ−グルタミ
ル−β−ナフチルアミン、γ−グルタミル−ｐ−
ヒドロキシアニリン又はそれらの種々の置換誘導
体なる色素原体が属する。これらの色素原体は、
γ−GT−反応で遊離されたアリールアミンが酸
化的カツプリング、芳香族アルデヒドとの縮合又
はジアゾニウム塩とのカツプリングによつて測定
可能の有色物質に変化されるように使用される。
この際γ−GT−反応は特定時間の間実施され、
次に酸又はアルカリを加えて呈色反応が実施さ
れ、γ−GT−反応が停止される〔一点測定、例
えば西独国特許出願公告第2920292号及び同第
2338043号参照〕。この方法では動力学的測定を行
なうことができない。それというのもアミンの遊
離及び呈色は同一条件下では不可能だからであ
る。
文献に記載された他のγ−GTの測定方法は、
コスト高で、操作困難なために実際には重要にな
らなかつた。
コスト高で、操作困難なために実際には重要にな
らなかつた。
ところで上記方法には、特にγ−GT−反応を
試験片上で行おうとする場合には適用が限定され
るという欠点がある。つまり、光の吸収が十分に
長波長の範囲で起る場合にしか眼による評価は可
能ではない。また試験片を反射測光により評価し
ようとする場合にも、565nｍを越える波長を有
する光を使用しなければならない、それというの
も血漿、血清又は尿のような生物学的物質は、短
波長の範囲で吸光し、ひいては測定に不利な影響
を及ぼす一連の化合物を含有するからである。し
かし従来公知になつたγ−GT活性測定用色素原
体は、せいぜい500nｍまでの波長の光でしか測
定できなかつた。この場合測定すべき試料は血
漿、血清又は尿中に存在するビリルビン
（Bilirubin）によつて500nｍまでの範囲ですでに
極めて高い基本吸光度を有している。一般に試料
の高い基本吸光度は希釈によつて低下される。し
かしビリルビンの高い吸光係数のために希釈がう
まく進まない。更にγ−グルタミル化された基質
及び遊離された色素原体のスペクトルは、大抵、
色素原体のバンド側面でしか測定できない程強く
重なるか、又は試薬の出発吸光度がすでに極めて
高い。これは、光度計の品質に対する極めて高い
要求がなされなければならず、方法の感受性が限
定されていることを意味する。しかし色素原体が
動力学的測定を許すことが、色素原体にとつては
有利である。これは特に試験片の場合に重要であ
る、それというのもこの場合には実際に動力学的
測定しか反射測光により容易にかつ有効に評価さ
れ得ないからである。
試験片上で行おうとする場合には適用が限定され
るという欠点がある。つまり、光の吸収が十分に
長波長の範囲で起る場合にしか眼による評価は可
能ではない。また試験片を反射測光により評価し
ようとする場合にも、565nｍを越える波長を有
する光を使用しなければならない、それというの
も血漿、血清又は尿のような生物学的物質は、短
波長の範囲で吸光し、ひいては測定に不利な影響
を及ぼす一連の化合物を含有するからである。し
かし従来公知になつたγ−GT活性測定用色素原
体は、せいぜい500nｍまでの波長の光でしか測
定できなかつた。この場合測定すべき試料は血
漿、血清又は尿中に存在するビリルビン
（Bilirubin）によつて500nｍまでの範囲ですでに
極めて高い基本吸光度を有している。一般に試料
の高い基本吸光度は希釈によつて低下される。し
かしビリルビンの高い吸光係数のために希釈がう
まく進まない。更にγ−グルタミル化された基質
及び遊離された色素原体のスペクトルは、大抵、
色素原体のバンド側面でしか測定できない程強く
重なるか、又は試薬の出発吸光度がすでに極めて
高い。これは、光度計の品質に対する極めて高い
要求がなされなければならず、方法の感受性が限
定されていることを意味する。しかし色素原体が
動力学的測定を許すことが、色素原体にとつては
有利である。これは特に試験片の場合に重要であ
る、それというのもこの場合には実際に動力学的
測定しか反射測光により容易にかつ有効に評価さ
れ得ないからである。
酸化的カツプリング、アルデヒド縮合又はジア
ゾニウム塩カツプリングによつて得られる、公知
のγ−GT試験における有色物質は、一般に赤
色、紫色又は青色であつて、従つて空試験値に関
しては問題はない。しかしこの場合は専ら終点測
定であつて、これを試験片で理性的に再現するこ
とはできない。
ゾニウム塩カツプリングによつて得られる、公知
のγ−GT試験における有色物質は、一般に赤
色、紫色又は青色であつて、従つて空試験値に関
しては問題はない。しかしこの場合は専ら終点測
定であつて、これを試験片で理性的に再現するこ
とはできない。
従つて本発明の課題は、有色物質を生成が動力
学的に測定可能であり、生成された有色物質が
565nｍを越える波長で最大吸光度を有するγ−
GT試験を創作することであつた。この課題は本
発明により、γ−グルタミルアリールアミドをPH
６〜10で、測定すべき酵素、γ−グルタミル−受
容体、酸化剤としてのシアン化第二鉄又はペルオ
キシド／ペルオキシダーゼ及びカツプリング成分
として作用する芳香族アミン又はフエノールと同
時に反応させ、この際酵素反応によつて酵素基質
からアリールアミンが遊離され、このものが存在
するカツプリング成分と酸化的にカツプルして
565nｍを越える波長で最大吸光度を有する有色
物質を生成することによつて解決される。
学的に測定可能であり、生成された有色物質が
565nｍを越える波長で最大吸光度を有するγ−
GT試験を創作することであつた。この課題は本
発明により、γ−グルタミルアリールアミドをPH
６〜10で、測定すべき酵素、γ−グルタミル−受
容体、酸化剤としてのシアン化第二鉄又はペルオ
キシド／ペルオキシダーゼ及びカツプリング成分
として作用する芳香族アミン又はフエノールと同
時に反応させ、この際酵素反応によつて酵素基質
からアリールアミンが遊離され、このものが存在
するカツプリング成分と酸化的にカツプルして
565nｍを越える波長で最大吸光度を有する有色
物質を生成することによつて解決される。
γ−GTの特性決定のための最初の論文にはす
でに、同時に本質的なSH基を有すう糖タンパク
質が重要であると記載されている〔A.スツエヴ
ツツク（Szewczuk）及びT.バラノヴスキー
（Baranowski）．Biochem.Z.338、317〜329
（1963）〕。このような化合物は、通常は酸化剤に
よつて不可逆的に変化する。過沃素酸塩で処理し
た酵素に関してはこの阻害又は変性は前記論文中
にすでに記載されている。これはおそらく、従来
記載された、酸化的カツプリングに基くすべての
γ−GT−反応が停止変法（Abstoppversion）と
してのみ行なわれる理由の一つであろう。もう一
つの理由は確かに、普通用いられる酸化的カツプ
リングの酸化剤がγ−GTの最適PH値、すなわち
PH６〜10、特にPH7.5〜8.5では全然反応しないか
又は徐々にしか反応しないことである。しかしカ
ツプリング反応は、動力学測定に対して速度決定
的でないためには、分解反応と比べて速くなけれ
ばならないので、従来は酸化的カツプリングは分
解終了後に酸性又はアルカリ性媒体中で実施され
た。
でに、同時に本質的なSH基を有すう糖タンパク
質が重要であると記載されている〔A.スツエヴ
ツツク（Szewczuk）及びT.バラノヴスキー
（Baranowski）．Biochem.Z.338、317〜329
（1963）〕。このような化合物は、通常は酸化剤に
よつて不可逆的に変化する。過沃素酸塩で処理し
た酵素に関してはこの阻害又は変性は前記論文中
にすでに記載されている。これはおそらく、従来
記載された、酸化的カツプリングに基くすべての
γ−GT−反応が停止変法（Abstoppversion）と
してのみ行なわれる理由の一つであろう。もう一
つの理由は確かに、普通用いられる酸化的カツプ
リングの酸化剤がγ−GTの最適PH値、すなわち
PH６〜10、特にPH7.5〜8.5では全然反応しないか
又は徐々にしか反応しないことである。しかしカ
ツプリング反応は、動力学測定に対して速度決定
的でないためには、分解反応と比べて速くなけれ
ばならないので、従来は酸化的カツプリングは分
解終了後に酸性又はアルカリ性媒体中で実施され
た。
従つて、アミンをPH６〜10で極めて迅速に反応
させる酸化剤が存在していて、その結果γ−GT
を活性がカツプリング反応によつて動力学的に測
定可能となり、それにも拘らずγ−GT酵素が糖
部分でもSH基でも不可逆的な変化を受けないと
いうことは、極めて意外というべきである。多数
の酸化剤の中からシアン化第二鉄及びH2O2／
POD又はペルオキシド形成体／PODのみが有効
であると判明した。前者が有利である。
させる酸化剤が存在していて、その結果γ−GT
を活性がカツプリング反応によつて動力学的に測
定可能となり、それにも拘らずγ−GT酵素が糖
部分でもSH基でも不可逆的な変化を受けないと
いうことは、極めて意外というべきである。多数
の酸化剤の中からシアン化第二鉄及びH2O2／
POD又はペルオキシド形成体／PODのみが有効
であると判明した。前者が有利である。
基質としては、アニリン、ナフチルアミン、２
−ヒドロキシ−４−アミノ安息香酸及びγ−GT
−反応の際にカツプリング可能の基質を供給する
他の化合物のγ−グルタミル化合物を使用するこ
とができる。特に次式（）： ［式中Ｘは基NR2R3又は−Ｏ−R2を表わし、R1
は水素、８個までのＣ原子を有するアルコキシ
基、アルキル基又はアリール基、塩素、臭素、沃
素又は基NR2R3、−SO3R2、−COOR2を表わし、
この際R2及びR3は同じか又は異つていて、水素、
８個までのＣ原子を有し、OH、アルコキシ基、
−CO2H、SO3Hによつて置換されていてもよい
アルキル基又はアリール基である〕で示される化
合物が適当である。
−ヒドロキシ−４−アミノ安息香酸及びγ−GT
−反応の際にカツプリング可能の基質を供給する
他の化合物のγ−グルタミル化合物を使用するこ
とができる。特に次式（）： ［式中Ｘは基NR2R3又は−Ｏ−R2を表わし、R1
は水素、８個までのＣ原子を有するアルコキシ
基、アルキル基又はアリール基、塩素、臭素、沃
素又は基NR2R3、−SO3R2、−COOR2を表わし、
この際R2及びR3は同じか又は異つていて、水素、
８個までのＣ原子を有し、OH、アルコキシ基、
−CO2H、SO3Hによつて置換されていてもよい
アルキル基又はアリール基である〕で示される化
合物が適当である。
相応の化合物及びそれらの製造方法は、例えば
西独国特許出願公開第2823342号明細書に記載さ
れている。
西独国特許出願公開第2823342号明細書に記載さ
れている。
特に、最良にはγ−グルタミル−４−ニトロ−
アニリン−３−カルボン酸の還元によつて入手で
きるγ−グルタミル−ｐ−フエニレンジアミン−
３−カルボン酸が有利であり、これは従来文献に
記載されなかつた基質である。
アニリン−３−カルボン酸の還元によつて入手で
きるγ−グルタミル−ｐ−フエニレンジアミン−
３−カルボン酸が有利であり、これは従来文献に
記載されなかつた基質である。
カツプリング成分としては、該反応にとつて公
知の基質、すなわち就中前記の西独国特許出願公
開第2823342号明細書に記載されているような芳
香族アミン又はフエノールが適当である。
知の基質、すなわち就中前記の西独国特許出願公
開第2823342号明細書に記載されているような芳
香族アミン又はフエノールが適当である。
特に式：
［式中Ｘは基NR2R3又は−Ｏ−R3を表わし、R1
は水素又はR4及び／又はR6が塩素である場合は
塩素を表わし、この際R2及びR3は同じか又は異
つていて、８個までのＣ原子を有し、場合によつ
てはヒドロキシ基、５個までのＣ原子を有するア
ルコキシ基、−CO2H、SO3Hによつて置換されて
いてもよいアルキル基、アルアルキル基又はアリ
ール基であり、R4及びR6は水素、５個までのＣ
原子を有する低級アルキル基、塩素、臭素、沃
素、−COOR2、SO3R2、OR2、NR2R3を表わし、
この際R2及びR3は上記のものを表わし、R5及び
R7は水素又は５個までのＣ原子を有するアルキ
ル基を表わし、この際R4及びR5又はR6及びR7は
ベンゾール環と一緒にナフチル核又はアントリル
核を形成していてもよい〕で示される化合物が適
当である。
は水素又はR4及び／又はR6が塩素である場合は
塩素を表わし、この際R2及びR3は同じか又は異
つていて、８個までのＣ原子を有し、場合によつ
てはヒドロキシ基、５個までのＣ原子を有するア
ルコキシ基、−CO2H、SO3Hによつて置換されて
いてもよいアルキル基、アルアルキル基又はアリ
ール基であり、R4及びR6は水素、５個までのＣ
原子を有する低級アルキル基、塩素、臭素、沃
素、−COOR2、SO3R2、OR2、NR2R3を表わし、
この際R2及びR3は上記のものを表わし、R5及び
R7は水素又は５個までのＣ原子を有するアルキ
ル基を表わし、この際R4及びR5又はR6及びR7は
ベンゾール環と一緒にナフチル核又はアントリル
核を形成していてもよい〕で示される化合物が適
当である。
前記化合物中のアルキル基は、６個までのＣ原
子、好ましくは１〜３個のＣ原子を有する。特に
メチル基が好ましい。
子、好ましくは１〜３個のＣ原子を有する。特に
メチル基が好ましい。
特に好ましいカツプリング成分は、例えば２，
３−キシレノール、ジエチルメタニル酸、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（3′−スルホベンゾール）−アニリン及
びＮ−メチルアントラニル酸である。
３−キシレノール、ジエチルメタニル酸、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（3′−スルホベンゾール）−アニリン及
びＮ−メチルアントラニル酸である。
本発明による試薬は、実際の反応に必要な成分
たるγ−グルタミルアリールアミド、受容体（グ
リシルグリシン）、カツプリング成分、酸化剤及
びPH６〜10緩衝剤物質の他に、更に活性剤（例え
ばマグネシウム塩）、湿潤剤、安定剤、増粘剤及
び他の常用助剤を含有することができる。試薬は
セルで普通のように行なうか又は試薬の含浸され
た吸収性キヤリヤー（試験片）上で実施すること
ができる。
たるγ−グルタミルアリールアミド、受容体（グ
リシルグリシン）、カツプリング成分、酸化剤及
びPH６〜10緩衝剤物質の他に、更に活性剤（例え
ばマグネシウム塩）、湿潤剤、安定剤、増粘剤及
び他の常用助剤を含有することができる。試薬は
セルで普通のように行なうか又は試薬の含浸され
た吸収性キヤリヤー（試験片）上で実施すること
ができる。
層厚10mm及び試験容積２〜３cm3を有する標準セ
ル中の通常の試験溶液の場合には、20〜100μ
の血液又は血清量が必要であり、ミクロセルの場
合には相応してより少なくなる。試薬溶液はほぼ
次の組成（それぞれｍmol／溶液）を有する： γ−グルタミルアリールアミド １〜100 受容体分子（例えばグリシルグリシン） 10〜200 カツプリング成分 １〜200 酸化剤 0.1〜100 PH６〜10緩衝剤 10〜200 更に、 活性剤（例えばマグネシウム塩中） ０〜10 湿潤剤 ０〜10 安定剤 ０〜50 増粘剤 ０〜100 を含有していてもよい。
ル中の通常の試験溶液の場合には、20〜100μ
の血液又は血清量が必要であり、ミクロセルの場
合には相応してより少なくなる。試薬溶液はほぼ
次の組成（それぞれｍmol／溶液）を有する： γ−グルタミルアリールアミド １〜100 受容体分子（例えばグリシルグリシン） 10〜200 カツプリング成分 １〜200 酸化剤 0.1〜100 PH６〜10緩衝剤 10〜200 更に、 活性剤（例えばマグネシウム塩中） ０〜10 湿潤剤 ０〜10 安定剤 ０〜50 増粘剤 ０〜100 を含有していてもよい。
吸収性キヤリヤー上での試験の場合には、血清
又は血漿の一滴（10〜50μ）を試薬の含浸され
た乾燥支持体上に施すことができる。
又は血漿の一滴（10〜50μ）を試薬の含浸され
た乾燥支持体上に施すことができる。
評価のために使用される層厚が薄いために、含
浸のために使用される試薬溶液は、セル試験の場
合よりも少し濃厚でなければならない。次の組成
（ｍmol／）が適当である： γ−グルタミルアリールアミド ５〜100 グリシルグリシン 50〜500 カツプリング成分 10〜500 酸化剤 １〜500 PH６〜10、特に7.5〜8.5緩衝剤 50〜1000 及びセル試験の場合に記載した他の物質を記載し
た量で含有していてもよい。使用することのでき
るγ−グルタミルアリールアミド、カツプリング
成分及び酸化剤はすでに記載してある。緩衝剤と
しては上記PH値に関して用いられるすべての弱ア
ルカリ性緩衝剤を使用することができる。
EDTA、トリス緩衝剤、２−アミノ−２−メチ
ルプロパン−１，３−ジオール等が好ましい、そ
れというのもこれら物質は同時にまた重金属錯生
成特性も有するからである。酵素の活性剤として
は有利にはマグネシウム塩、例えばMgCl2等が少
量添加される。
浸のために使用される試薬溶液は、セル試験の場
合よりも少し濃厚でなければならない。次の組成
（ｍmol／）が適当である： γ−グルタミルアリールアミド ５〜100 グリシルグリシン 50〜500 カツプリング成分 10〜500 酸化剤 １〜500 PH６〜10、特に7.5〜8.5緩衝剤 50〜1000 及びセル試験の場合に記載した他の物質を記載し
た量で含有していてもよい。使用することのでき
るγ−グルタミルアリールアミド、カツプリング
成分及び酸化剤はすでに記載してある。緩衝剤と
しては上記PH値に関して用いられるすべての弱ア
ルカリ性緩衝剤を使用することができる。
EDTA、トリス緩衝剤、２−アミノ−２−メチ
ルプロパン−１，３−ジオール等が好ましい、そ
れというのもこれら物質は同時にまた重金属錯生
成特性も有するからである。酵素の活性剤として
は有利にはマグネシウム塩、例えばMgCl2等が少
量添加される。
次に実施例により本発明を詳述するが、これら
の実施例を本発明を限定するものではない。
の実施例を本発明を限定するものではない。
例 １
γ−GTセルの試験
トリスHCl、PH8.0 100ｍmol／
γ−グルタミル−ｐ−フエニレンジアミン−３−
カルボン酸 10ｍmol／ グリシルグリシン 75ｍmol／ Ｎ−メチルアントラニル酸 50ｍmol／ K3（Fe（CH）6） 0.5ｍmol／ 溶剤：水 この溶液の３mlに人間の血清50μを加え、同
溶液を層厚10mm及び波長60〜800nｍで測定する。
カルボン酸 10ｍmol／ グリシルグリシン 75ｍmol／ Ｎ−メチルアントラニル酸 50ｍmol／ K3（Fe（CH）6） 0.5ｍmol／ 溶剤：水 この溶液の３mlに人間の血清50μを加え、同
溶液を層厚10mm及び波長60〜800nｍで測定する。
Ｖ＝3.05ml、ｖ＝0.05、Ｔ 37℃
λ＝630nｍ、ε＝18.4cm2／nmol
Ｕ／ｌ＝Ｖ・△Ｅ／min・1000／ε・ｖ
Ｕ／ｌ △Ｅ／min
０ ０
10 ３
20 ６
50 15
100 30
200 60
500 150
例 ２
γ−GT用試験片
２枚の紙に含浸して試験片を製造する。
(A) 基質紙
水 中
トリス、PH7.6 200ｍmol／
Ｎ−メチルアントラニル酸 100ｍmol／
グリシルグリシン 250ｍmol／
EDTA−Na2 100ｍmol／
γ−グルタミル−ｐ−フエニレンジアミン−３
−カルボン酸 20ｍmol／ この溶液を、適当な厚さ及び吸収力を有する
紙、例えば単位面積重量12ｇ／cm2、厚さ50μ
ｍ、吸収容量50ml／ｍを有するシエーレル及び
ホエツシ（Scho¨ller und Hoesch）社製テイー
バツグ紙に含浸し、30℃で５分間乾燥する。次
にこの紙を幅１cmに切断する。
−カルボン酸 20ｍmol／ この溶液を、適当な厚さ及び吸収力を有する
紙、例えば単位面積重量12ｇ／cm2、厚さ50μ
ｍ、吸収容量50ml／ｍを有するシエーレル及び
ホエツシ（Scho¨ller und Hoesch）社製テイー
バツグ紙に含浸し、30℃で５分間乾燥する。次
にこの紙を幅１cmに切断する。
(B) 酸化紙
水中のK3（Fe（CN）6） 300ｍmol／
この溶液を基質紙と同種の紙に含浸し、同様
に乾燥し、６mmの幅に切断する。
に乾燥し、６mmの幅に切断する。
材料を、西独特許出願公開第3130749号に記
載されている（第１図参照）ように、極めれ有
利に試験片に加工する。この際幅１cm、厚さ
110μｍの透明なポリカルボネートフイルムを
基質紙と一緒に、フイルムが外側からくるよう
にプラスチツク片の片側に固着する。その横に
幅15mm、厚さ1.5ｍ、繊維太さ約2μｍのガラス
繊維不織布を、フイルムと基質紙の自由端が同
不織布の上部のなお６mmに在るように施こす。
ガラス繊維不織布の他端に酸化紙及び同一のガ
ラス繊維材料の幅６mm片をまとめて結合する。
次に幅６mmの試験片に切断する。
載されている（第１図参照）ように、極めれ有
利に試験片に加工する。この際幅１cm、厚さ
110μｍの透明なポリカルボネートフイルムを
基質紙と一緒に、フイルムが外側からくるよう
にプラスチツク片の片側に固着する。その横に
幅15mm、厚さ1.5ｍ、繊維太さ約2μｍのガラス
繊維不織布を、フイルムと基質紙の自由端が同
不織布の上部のなお６mmに在るように施こす。
ガラス繊維不織布の他端に酸化紙及び同一のガ
ラス繊維材料の幅６mm片をまとめて結合する。
次に幅６mmの試験片に切断する。
さて、全血液30μをガラス繊維２ｂ上にも
たらすと、血漿分が30〜60秒以内に全ガラス繊
維不織布２に浸透しかつ同時にK3〔Fe（CN）6〕
から酸化紙から溶出しており、他方赤血球は２
ｂ内及び下に保留される。今度は透明フイルム
の圧着によつて血漿中のγ−GT及び酸化剤が
基質紙と接触し、同紙は均一に湿潤される。γ
−GTの濃度及び反応時間に応じて程度の差こ
そあれ顕著な緑色が形成され、その強度の変化
は酵素活性に比例していて、場合によつては反
射光度計で565〜850nｍで測定することができ
る。もちろん、血漿、血清又はその他の生物学
的物質のような他の試料も同一量で使用するこ
とができる。
たらすと、血漿分が30〜60秒以内に全ガラス繊
維不織布２に浸透しかつ同時にK3〔Fe（CN）6〕
から酸化紙から溶出しており、他方赤血球は２
ｂ内及び下に保留される。今度は透明フイルム
の圧着によつて血漿中のγ−GT及び酸化剤が
基質紙と接触し、同紙は均一に湿潤される。γ
−GTの濃度及び反応時間に応じて程度の差こ
そあれ顕著な緑色が形成され、その強度の変化
は酵素活性に比例していて、場合によつては反
射光度計で565〜850nｍで測定することができ
る。もちろん、血漿、血清又はその他の生物学
的物質のような他の試料も同一量で使用するこ
とができる。
この装置は特に、血漿採取の段階でビリルビ
ンがすでにビリベルジン（Biliverdin）に酸化
される故に有利であることが判る。この反応は
普通ならばγ−GT−反応と相俟つて進行し、
ビリベルジンが630nｍで吸光するので、動力
学的には不利である。
ンがすでにビリベルジン（Biliverdin）に酸化
される故に有利であることが判る。この反応は
普通ならばγ−GT−反応と相俟つて進行し、
ビリベルジンが630nｍで吸光するので、動力
学的には不利である。
図面は本発明による方法を実施するために使用
する試験片の側断面図である： １……支持体フイルム、２……ガラス繊維不織
布（幅15mm）、２ａ……酸化紙、２ｂ……ガラス
繊維不織布（幅６mm）、３……透明フイルム、４
……基質紙、５……接着剤。
する試験片の側断面図である： １……支持体フイルム、２……ガラス繊維不織
布（幅15mm）、２ａ……酸化紙、２ｂ……ガラス
繊維不織布（幅６mm）、３……透明フイルム、４
……基質紙、５……接着剤。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素基質として作用するγ−グルタミルアリ
ールアミドをγ−グルタミルトランスフエラーゼ
の存在でγ−グルタミル−受容体と反応させかつ
酵素反応の結果として形成される有色物質をγ−
グルタミルトランスフエラーゼ活性の尺度として
測光的に追跡することによつてγ−グルタミルト
ランスフエラーゼ活性を動力学的に測定するに当
り、γ−グルタミルアリールアミドをPH６〜10
で、測定すべき酵素、γ−グルタミル−受容体、
酸化剤としてのシアン化第二鉄又はペルオキシ
ド／ペルオキシダーゼ及びカツプリング成分とし
て作用する芳香族アミン又はフエノールと同時に
反応させ、この際酵素反応によつて酵素基質から
アリールアミンが遊離され、このものが存在する
カツプリング成分と酸化的にカツプルして565n
ｍを越える波長で最大吸光度を有する有色物質を
生成することを特徴とするγ−グルタミルトラン
スフエラーゼ活性の動力学的測定方法。 ２ γ−GTの基質として式： ［式中Ｘは基NR2R3又は−Ｏ−R2を表わし、R1
は水素、８個までのＣ原子を有するアルコキシ
基、アルキル基又はアリール基、塩素、臭素、沃
素又は基NR2R3、−SO3R2、−COOR2を表わしか
つR2及びR3は同じか異なつていて、水素である
か又はOH、アルコキシ基、−CO2H、SO3Hによ
つて置換されていてもよい８個までのＣ原子を有
するアルキル基又はアリール基である］で示され
る化合物を使用する特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ３ カツプリング成分として式： ［式中Ｘは基NR2R3又は−Ｏ−R3を表わし、R1
は水素又はR4及び／又はR6が塩素である場合に
はまた塩素を表わし、R2及びR3は同じか又は異
なつていて、水素、場合によつてはOH、５個ま
でのＣ原子を有するアルコキシ基、−CO2H、
SO3Hによつて置換されていてもよいアルキル
基、アルアルキル基又はアリール基を表わし、
R4及びR6は水素、５個までＣ原子を有する低級
アルキル基、塩素、臭素、沃素、−COOR2、
SO3R2、OR2、NR2R3（この際R2及びR3は上記の
ものを表わす）を表わし、R5及びR7は水素又は
５個までのＣ原子を有するアルキル基を表わし、
この際R4及びR5又はR6及びR7はベンゾール環と
共にナフチル核又はアントリル核を形成すること
ができる］で示される化合物を使用する特許請求
の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ カツプリング成分として２，３−キレノー
ル、ジエチルメタニル酸、Ｎ−エチル−Ｎ−
（3′−スルホベンゾール）−アニリン又はＮ−メチ
ルアントラニル酸を使用する特許請求の範囲第１
項から第３項までのいずれか１項記載の方法。 ５ 次の試薬成分： 10〜1000ｍmol／の濃度のPH６〜10を有する
緩衝剤、 １〜100ｍmol／の濃度の酵素基質としての
γ−グルタミルアリールアミド、 10〜500ｍmol／の濃度のγ−グルタミル−
受容体、 0.1〜500ｍmol／の濃度の酸化剤としてのシ
アン化第二鉄又はペルオキシド／ペルオキシダー
ゼ及び 酵素基質から遊離されるアリールアミンと酸化
的にカツプリングして565nｍを越える波長で最
大吸光度を有する有色物質を生成する、１〜500
ｍmol／の濃度のカツプリング成分 を含有することを特徴とするγ−グルタミルトラ
ンスフエラーゼ活性を動力学的に測定するための
試薬。 ６ 試薬成分が吸収性キヤリヤ−上に含浸されて
いる特許請求の範囲第５項記載の試薬。 ７ 緩衝剤が7.5〜8.5のPH値を有する特許請求の
範囲第５項又は第６項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3234478.3 | 1982-09-17 | ||
| DE19823234478 DE3234478A1 (de) | 1982-09-17 | 1982-09-17 | Reagenz und verfahren zur bestimmung von (gamma)-glutamyltransferase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59130199A JPS59130199A (ja) | 1984-07-26 |
| JPH0369520B2 true JPH0369520B2 (ja) | 1991-11-01 |
Family
ID=6173459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58167641A Granted JPS59130199A (ja) | 1982-09-17 | 1983-09-13 | γ−グルタミルトランスフエラ−ゼの測定方法及び試薬 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4603107A (ja) |
| EP (1) | EP0103823B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59130199A (ja) |
| AT (1) | ATE33678T1 (ja) |
| CA (1) | CA1215617A (ja) |
| DE (2) | DE3234478A1 (ja) |
| DK (1) | DK167159B1 (ja) |
| ES (1) | ES525673A0 (ja) |
| IE (1) | IE55922B1 (ja) |
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| DE3687928T2 (de) * | 1985-06-20 | 1993-07-08 | Fuji Photo Film Co Ltd | Reagenzblatt und integrierendes mehrschichtiges analytisches element zur messung der wirksamkeit von gamma-glutamyl-transferase. |
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| DE3640318A1 (de) * | 1986-11-26 | 1988-06-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und testtraeger zur bestimmung eines analyten |
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-
1983
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- 1983-09-09 EP EP83108912A patent/EP0103823B1/de not_active Expired
- 1983-09-09 DE DE8383108912T patent/DE3376342D1/de not_active Expired
- 1983-09-13 JP JP58167641A patent/JPS59130199A/ja active Granted
- 1983-09-14 DK DK417983A patent/DK167159B1/da not_active IP Right Cessation
- 1983-09-15 CA CA000436783A patent/CA1215617A/en not_active Expired
- 1983-09-16 ES ES525673A patent/ES525673A0/es active Granted
- 1983-09-16 IE IE2185/83A patent/IE55922B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-09-16 US US06/532,907 patent/US4603107A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
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| JPS5526870A (en) * | 1978-08-17 | 1980-02-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Method of measuring activity of gamma-glutamyl transpeptidase |
| JPS56158745A (en) * | 1980-05-13 | 1981-12-07 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | L-gamma-glutamyl-3-carboxy-4-aminoanilide derivative and its preparation |
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