DK167159B1 - Reagens og fremgangsmaade til bestemmelse af gamma-glutamyltransferase - Google Patents

Description

i DK 167159 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til kinetisk bestemmelse af γ-glutamyltransferaseaktivitet ved omsætning af et som enzymsubstrat virkende γ-glutamylarylamid med en γ-glutamylacceptor i nærværelse af γ-glutamyltransferase og fotometrisk overvåg-5 ning af dannelsen af et som følge af den enzymatiske reaktion dannet farvestof som mål for γ-glutamyltransferaseaktiviteten samt et reagens til anvendelse ved kinetisk bestemmelse af γ-glutamyltransferaseaktivitet.

Siden opdagelsen af γ-glutamyltransferase (γ-GT) i humanserum 10 har dette enzym opnået en stor betydning i leverdiagnostikken (H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, bind I, Verlag Chemie, Weinheim 1974, side 14-30 og side 757). Til bestemmelsen af γ-GT-aktiviteten i en prøve bestemmer man sædvanligvis hastigheden af en reaktion af et γ-glutamylamid 15 med glycylglycin som acceptor under dannelse af γ-glutamylgly-cylglycid og amin. Disse bestemmelsesmetoder kan opdeles i to grupper, på den ene side i dem, ved hvilke den frigjorte amin selv er et kromogent substrat, og på den anden side i sådanne, ved hvilke den frigjorte amin først ved hjælp af følgereaktio-20 ner bliver overført i en farvet forbindelse.

Til den første gruppe hører forskellige nitroanilinderivater, som ved aminresten er forbundet med en γ-glutamylrest. Ved overføringen af γ-glutamylresten på acceptormolekylet frigøres nitroanilinen, hvis ekstinktionsmaksimum i forhold til ud-25 gangsforbindelsen er forskudt bathokromt, således at farveforøgelsen ved egnede bølgelængder kan måles i det gule eller røde område. Som kromogene substrater for γ-GT kendes især γ-glutamyl-p-nitroanilid og γ-glutamyl-p-nitroanilid-3-carboxylsyre. Mindre almindelig er γ-glutamyl-p~nitroanilid-3-sulfon-30 syre. Disse substrater tillader kinetiske målinger og étpunkt-målinger.

Til den anden gruppe hører substraterne γ-glutamylanilin, γ-glutamyl-a-naphthylamin, γ-glutamyl-Ø-naphthylamin, γ-gluta-myl-p-hydroxyanilin og deres forskellige substituerede DK 167159 B1 2 derivater. Disse anvendes således, at den ved γ-GT-reaktionen frigjorte arylamin med oxidativ kobling, kondensation med aromatiske aldehyder eller ved diazoniumsaltkobling overføres i et måleligt farvestof. Derved bliver γ-GT-reaktionen for et 5 bestemt tidsrum gennemført og derefter farvereaktionen gennemført under tilsætning af syre eller lud, hvorved γ-GT-reaktio-nen stoppes (étpunktmåling) (se f.eks. DE-AS 29 20 292, DE-AS 23 38 043) . En kinetisk måling er ikke mulig ifølge denne metode, da frigørelsen af aminen og farvedannelsen ikke har 10 kunnet gennemføres under de samme betingelser.

De yderligere i litteraturen beskrevne bestemmelsesmetoder for γ-GT har ikke opnået nogen praktisk betydning, da de er kostbare og vanskelige at anvende.

De ovenfor anførte fremgangsmåder har nu tungtvejende mangler, 15 som især begrænser en anvendelse, når γ-GT-reaktionen skal gennemføres på teststrimler. Med øjet er en bestemmelse nemlig kun mulig, når lysabsorptionen finder sted i et tilstrækkeligt langbølget område. Også når teststrimlerne skal bestemmes remissionsfotometrisk, skal lyset indstilles til en bølgelæng-20 de på over 565 nm, da biologisk materiale såsom plasma, serum eller urin indeholder en række stoffer, som i det kortbølgede område absorberes, og som derfor ville påvirke målingen i negativ retning. De hidtil kendte kromogene substrater for γ-GT kan dog højst måles indtil 500 nm. Her absorberes specielt 25 bilirubin endnu meget kraftigt, således at selv i den fotometriske test, som omfatter en fortynding af prøven, bliver det samlede måleområde af fotometeret anvendt ved prøvens egenabsorption. Endvidere overlapper spektrene af de γ-glutamyle-rede substrater og det frigjorte kromogen for det meste så 30 kraftigt, at der kun kan måles i kromogenets båndside, eller reagensets begyndelsesekstinktion er allerede meget høj . Dette betyder, at der må stilles særligt store krav til fotometerets kvalitet, og metodens følsomhed er begrænset. Fordelagtigt med de kromogene substrater er det dog, at de muliggør en kinetisk 35 måling. Dette er især af betydning for teststrimler, da kine- DK 167159 Bl 3 tiske målinger her praktisk taget kun på simpel og hensigtsmæssig måde kan gennemføres remissionsfotometrisk.

De ved den oxidative kobling ved hjælp af aldehydkondensation eller diazoniumsaltkobling opnåede farvestoffer i de kendte γ-5 GT-tests er i reglen røde, violette eller blå og har derfor ingen problemer med prøve-blindværdien. Her drejer det sig dog udelukkende om endepunkt-be stemmel s er, og disse lader sig på den anden side ikke realisere fornuftigt i teststrimler.

Formålet med den foreliggende opfindelse var følgelig at til-10 vejebringe en γ-GT-test, ved hvilken en farvestofdannelse kan måles kinetisk, hvorhos det dannede farvestof har sit absorptionsmaksimum ved 565 nm. Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at γ-glutamylary 1 amidet omsættes samtidigt med det enzym, der skal bestemmes, en 15 γ-glutamylacceptor, ferricyanid eller peroxid/peroxidase som oxidationsmiddel og en som koblingskomponent virkende aromatisk amin eller phenol ved pH 6 til 10, og at der derved ved den enzymatiske reaktion frigøres en arylamin fra enzymsubstratet, hvilken arylamin med den tilstedeværende koblingskom-20 ponent-kobles oxidativt til et farvestof, der udviser et absorptionsmaksimum på over 565 nm. Denne reaktion kan følges kinetisk, og reaktionen kan også anvendes på teststrimler.

Allerede i de første arbejder, med henblik på at karakterisere γ-GT, er det beskrevet, at det drejer sig om et glycoprotein, 25 som samtidig indeholder essentielle SH-grupper (A. Szewczuk & T. Baranowski, Biochem. Z. 338, 317-329 (1963)).

Sådanne forbindelser bliver normalt ændret irreversibelt ved hjælp af oxidationsmidler. Til det med per jodat behandlede enzym er denne inhibering henholdsvis denaturering allerede 30 beskrevet i det citerede arbejde. Dette er formodentlig en af grundene til, at alle hidtil beskrevne på den oxidative kobling beroende γ-GT-reaktioner kun bliver gennemført under anvendelse af tidtagning med stopur. En yderligere grund er DK 167159 Bl 4 sikkert, at ved pH-optimet for γ-GT, dvs. ved pH-værdi 6-10, især pH-værdi 7,5 - 8,5, reagerer de sædvanligvis til den oxidative kobling anvendte oxidationsmidler ikke eller kun meget langsomt. Da koblingsreaktionen imidlertid skal være 5 hurtig i forhold til spaltningsreaktionen for ikke at blive hastighedsbestemmende for den kinetiske bestemmelse, er denne oxidative kobling hidtil blevet gennemført i enten surt eller alkalisk medium, efter at spaltningen havde fundet sted.

Det er derfor særdeles overraskende, at der findes oxidations-10 midler, som ved pH-værdi 6-10 oxiderer amineme så hurtigt, at man kan måle aktiviteten af γ-GT kinetisk ved hjælp af en koblingsreaktion og alligevel ikke beskadiger γ-GT-enzymet irreversibelt, hverken på sukkerdelen eller på SH-grupperne.

Af et større antal oxidationsmidler har ferricyanid og H202/-15 POD (peroxidase) henholdsvis peroxiddanner/POD hidtil alene vist sig at være anvendelige. Førstnævnte foretrækkes.

Som substrat kan anvendes γ-glutamylforbindelserne af anilin, naphthylamin, 2-hydroxy-4-aminobenzoesyre og andre forbindelser, som ved γ-GT-reaktionen giver et koblingsdygtigt sub-20 strat.-Særligt egnede er forbindelser med følgende formel I

/r^1 T-Glu-NH—// V\_v \=/ hvori X betegner gruppen-NH2R3 eller -0-R2, R-L betegner hydrogen, en alkoxy-, alkyl- eller arylgruppe med indtil 8 carbonatomer, chlor, brom, jod eller gruppen -NH2R3, 25 -S03R2 eller -COOR2, hvor R2 og R3, der kan være ens eller forskellige, betegner hydrogen eller en alkyl- eller arylgruppe med indtil 8 carbonatomer, som eventuelt kan være substitu- DK 167159 B1 5 eret med -OH, alkoxy, -C02H eller -SO3H.

Tilsvarende forbindelser og fremgangsmåder til deres fremstilling er f.eks. beskrevet i DE-OS 28 23 342.

Særligt foretrukket er det hidtil i litteraturen ikke beskrev-5 ne substrat, γ-glutamyl-p-phenylendiamin-3 - carboxylsyre, som er lettest tilgængelig ved reduktion af Y-glutamyl-4-nitroani-1in-3-carboxylsyre.

Som koblingskomponenter egner sig til reaktion kendte substrater, dvs. aromatiske aminer eller phenoler, således som det 10 bl.a. er anført i førnævnte DE-OS 28 23 342.

Særligt egnede er forbindelser med formlen II

Rc R.

5 4

Rl x (ii) R7 R6 hvori X betegner en -NR-^Rg- eller -0-R3-gruppe, R^ betegner hydrogen eller chlor, når R4 og/eller Rg også er chlor, r2 og R3, der kan være ens eller forskellige, betegner 15 hydrogen, en alkyl-, aralkyl- eller arylgruppe med indtil 8 carbonatomer, som eventuelt kan være substitueret med hydroxy, alkoxy med indtil 5 carbonatomer, -C02H eller -SO3H, r4 og Rg betegner hydrogen, lavere alkyl med indtil 5 carbonatomer, chlor, brom, jod, -COOR2, -S02R2, -0R2 eller -NR2R3' 20 idet R2 og R3 har ovennævnte betydning, R5 og R7 betegner hydrogen eller en alkylgruppe med indtil 5 carbonatomer, eller R4 og Rg henholdsvis Rg og R7 sammen med benzenringen danner et naphthyl- eller anthrylskelet.

DK 167159 B1 6

Alkylgrupperne i de ovennævnte forbindelser har indtil 6, fortrinsvis 1-3 carbonatomer. Methylgruppen foretrækkes især. Især foretrækkes f.eks. 2,3-xylenol, diethylmethanil-syre, N-ethyl-N-(3'-sulfobenzen)-anilin og N-methylanthranil-5 syre.

Opfindelsen angår også et reagens, der er ejendommeligt ved det i krav 5's kendetegnende del anførte.

Reagenserne ifølge opfindelsen kan foruden de til den egentlige reaktion nødvendige bestanddele, γ-glutamylarylamid, 10 acceptor (glycylglycin) , koblingskomponenter, oxidationsmidler og pufferstoffer, pH-værdi 6-10, yderligere indeholde aktivatorer (f.eks. magnesiumsalte), befugtningsmidler, stabiliseringsmidler, fortykkelsesmidler og andre sædvanlige hjælpestoffer. Testen kan enten, som sædvanligt, gennemføres i en 15 cuvette eller på en sugedygtig bærer (teststrimmel), som er imprægneret med reagenserne.

Til en sædvanlig testmængde i en standard-cuvette med 10 mm lagtykkelse og et testvolumen på 2 - 3 cm^ kræves en blodeller serummængde på 20 - 100 μΐ - ved mikro-cuvetter tilsva-20 rende mindre. Reagensopløsningen har omtrent følgende sammensætning i mmol/liter opløsning: 1 - 100 γ-glutamylarylamid, 10 - 200 acceptormolekyle (f.eks. glycylglycin), 1 - 200 koblingskomponent, 25 0,1-100 oxidationsmiddel, 10 - 200 puffer, pH 6 - 10.

Desuden kan der yderligere indgå: 0-10 aktivator (f.eks. magnesiumsalt), 0-10 befugtningsmiddel, 30 0 - 50 stabiliseringsmiddel, 0 - 100 fortykkelsesmiddel.

DK 167159 B1 7

Til testen på sugedygtig bærer kan en dråbe serum eller plasma (10 - 50 /il) anbringes på den tørre med reagenser imprægnerede bærer.

På grund af den ringe lagtykkelse, som står til rådighed ved 5 bestemmelsen, skal de til imprægneringen anvendte reagensopløsninger være mere koncentreret en dem, der anvendes ved cuvette-testen. Følgende sammensætninger i mmol/liter er egnede: 5 - 100 γ-glutamylarylamid, 10 50- 500 glycylglycin.

10 - 500 koblingskomponent, 1 - 500 oxidationsmiddel, 50 - 1000 puffer, pH 6 - 10, specielt 7,5 - 8,5 samt de til cuvette-testen anførte yderligere stoffer i de 15 anførte mængder. De anvendelige y-glutamylarylamider, koblingskomponenter og oxidationsmidler er allerede anført ovenfor. Som puffer kan anvendes alle de til det anførte pH-interval sædvanlige svagt alkaliske puffere. EDTA, trispuffer, 2-amino-2-methylpropan-l,3-diol og lignende foretrækkes, da de 20 samtidig også desuden har tungmetal-kompleksdannende egenskaber. Som aktivatorer for enzymet tilsættes fordelagtigt magnesiumsalte såsom MgCl2 etc. i ringe mængde.

De følgende eksempler skal belyse opfindelsen nærmere.

EKSEMPEL 1 25 Cuvette-test for γ-GT:

Tris, HC1, pH 8,0 100 mmol/1 7-glutamyl-p-phenylendiamin-3-carboxylsyre 10 mmol/1

Glycylglycin 75 mmol/1 N-methylanthranilsyre 50 mmol/1 30 K3(Fe(CN)6) 0,5 mmol/1

Opløsningsmiddel: vand.

DK 167159 B1 8

Til 3 ml af denne opløsning sættes 50 /il humanserum og måles ved en lagtykkelse på 10 mm og en bølgelængde på 600 - 800 nm.

V = 3,05 ml, v = 0,05, T 37°C, λ = 630 nm, e = 18,4 cm2/mmol.

5 U = V · AE/min. 1000 1 e · v U/l Δ E/min.

10 0 0 10 3 20 6 50 15 100 30 15 200 60 500 150 EKSEMPEL 2

Teststrimler for γ-GT: 20 Til fremstilling af teststrimler imprægneres 2 papirstykker: A) Substratpapir:

Tris, pH 7,6 200 mmol/1 N-methylanthranilsyre 100 mmol/1

Glycylglycin 250 mmol/1 25 EDTA/Na2 100 mmol/1 γ -glutamyl -p-phenyl endiamin- 3 - carboxyl syre 20 mmol/1 (i vand) .

Med denne opløsning imprægneres et papir af egnet tykkelse og sugedygtighed, f.eks. teposepapir fra Fa. Scholler & Hoesch 30 (fladvægt 12 g/cm2, tykkelse 50 /tm, sugevolumen 50 ml/m) , og DK 167159 B1 9 der tørres i 5 minutter ved 30°C. Papiret tilskæres derpå en bredde på 1 cm.

B) Oxidationspapir: K3(Fe(CN)6) 300 mmol/1 5 (i vand).

Med denne opløsning imprægneres et tilsvarende papir som sub-stratpapiret, hvorpå der tørres på tilsvarende måde, og papiret opskæres til en bredde på 6 mm.

Materialet forarbejdes på særlig fordelagtig måde til test-10 strimler, således som det er beskrevet i DE-OS 31 30 749 (se fig. 1). Derved bliver en 1 cm bred, gennemsigtig polycarbo-natfolie med en tykkelse på 110 μνα. sammen med substratpapiret på den ene side fastgjort til en plaststrimmel, således at folien ligger øverst. Derefter bliver et 15 mm bredt, uvævet 15 glasfibermateriale med en tykkelse på 1,5 mm, en fiberstyrke på ca. 2 μτη anbragt således, at frie ender af folien og substratpapiret fortsat rager 6 mm ud over det uvævede materiale. Sammen' med det uvævede glasfibermateriales anden ende fastgøres oxidationspapiret og en 6 mm bred strimmel af det samme 20 glasfibermateriale på det uvævede glasfibermateriale. Derpå opskæres i 6 mm brede teststrimler.

Fig. 1 viser en tes tf olie til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Testfolien på fig. 1 er sammensat af følgende: 25 1 bærerfolie, 2 uvævet glasfibermateriale, 15 mm bredt, 2 a oxidationspapir, 2b uvævet glasfibermateriale, 6 mm bredt, 3 gennemsigtig folie, 30 4 substratpapir, 5 klæbestof.

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til kinetisk bestemmelse af γ-glutamyl trans -feraseaktivitet ved omsætning af et som enzymsubstrat virkende γ-glutamylarylamid med en γ-glutamylacceptor i nærværelse af γ-glutamyltransferase og fotometrisk overvågning af dannelsen 25 af et som følge af den enzymatiske reaktion dannet farvestof som mål for γ-glutamyltransferaseaktiviteten, kendetegnet ved, at γ-glutamylarylamidet omsættes samtidigt med det enzym, der skal bestemmes, en γ-glutamylacceptor, ferricyanid eller peroxid/peroxidase som oxidationsmiddel og 30 en som koblingskomponent virkende aromatisk amin eller phenol ved pH 6 - 10, og at der derved ved den enzymatiske reaktion frigøres en arylamin fra enzymsubstratet, hvilken arylamin med den tilstedeværende koblingskomponent kobles oxidativt til et farvestof, der udviser et absorptionsmaksimum på over 565 nm. DK 167159 B1

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som γ-GT-substrat anvendes en forbindelse med formlen I _Λ γ -Glu-NH —// \\_χ \ (I) hvori X betegner gruppen -NR2R3 eller -0-R2» R-j^ betegner hydrogen, en alkoxy-, alkyl- eller arylgruppe med 5 indtil 8 carbonatomer, chlor, brom, jod eller gruppen -NR2R3, -SO3R2 eller -COOR2, hvor R2 og R3 er ens eller forskellige og betegner hydrogen, en alkyl- eller arylgruppe med indtil 8 carbonatomer, som eventuelt kan være substitueret med -OH, alkoxy, -C02H eller -SO3H.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man som koblingskomponent anvender en forbindelse med formlen II R5 R4 ri_^ ^\y_x (II) R7 R6 hvori X betegner en -NR2R3- eller -OR3-gruppe, R2 betegner hydrogen eller chlor, når R4 og/eller Rg også er 15 chlor, R2 og R3 er ens eller forskellige og betegner hydrogen, en alkyl-, aralkyl- eller arylgruppe med indtil 8 carbonatomer, som eventuelt kan være substitueret med hydroxy, alkoxy med indtil 5 carbonatomer, -CC^H eller -SO3H, r4 og r6 betegner hydrogen, lavere alkyl med indtil 5 carbon-20 atomer, chlor, brom, jod, -COOR2, -SO3R2, -OR2 eller -NR2R3, idet R2 og R3 har ovennævnte betydning, DK 167159 B1 Rs og Ry betegner hydrogen eller en alkylgruppe med indtil 5 carbonatomer, eller R^ og Rg henholdsvis Rg og Ry sammen med benzenringen danner et naphthyl- eller anthrylskelet.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 - 3, kendetegnet 5 ved, at der som koblingskomponent anvendes 2,3-xylenol, di- ethylmethanilsyre, N-ethyl-N-(3'-sulfobenzen)anilin eller N-methylanthranilsyre.

5. Reagens til kinetisk bestemmelse af γ-glutamyltransferase-aktivitet, kendetegnet ved, at det indeholder føl- 10 gende bestanddele: en puffer med pH 6 - 10 i en koncentration på 10-1000 mmol/1, et γ-glutamylarylamid som enzymsubstrat i en koncentration på 1-100 mmol/1, en γ-glutamylacceptor i en koncentration på 10 - 500 mmol/1, 15 ferri cyanid eller peroxid/peroxidase som oxidationsmiddel i en koncentration på 0,1 - 500 mmol/1, og en koblingskomponent i en koncentration på 1 - 500 mmol/1, der med en fra enzymsubstratet frigjort arylamin oxidativt kobles til et -farvestof, hvis absorptionsmaksimum ligger over 565 nm.

6. Reagens ifølge krav 5, kendetegnet ved, at bestanddelene er imprægneret på en sugedygtig bærer.

7. Reagens ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at pufferen har en pH-værdi på 7,5 -8,5. 25