JP2002014096A - キレート化剤を含む尿トリプシンインヒビタアッセイ - Google Patents
キレート化剤を含む尿トリプシンインヒビタアッセイInfo
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な尿中トリプシンインヒビタ検定法の提
供。 【解決手段】 尿試料を、トリプシン、トリプシンによ
って開裂すると検出可能な応答を発するトリプシンの基
質及び尿中に存在するカルシウムからのアッセイに対す
る干渉を阻害するのに十分な量のポリカルボン酸キレー
ト化剤を含む緩衝アッセイ媒体と接触させ、トリプシン
インヒビタの濃度を該基質の開裂からの検出可能な応答
と相関させる工程を含む、尿中のトリプシンインヒビタ
のアッセイ。
供。 【解決手段】 尿試料を、トリプシン、トリプシンによ
って開裂すると検出可能な応答を発するトリプシンの基
質及び尿中に存在するカルシウムからのアッセイに対す
る干渉を阻害するのに十分な量のポリカルボン酸キレー
ト化剤を含む緩衝アッセイ媒体と接触させ、トリプシン
インヒビタの濃度を該基質の開裂からの検出可能な応答
と相関させる工程を含む、尿中のトリプシンインヒビタ
のアッセイ。
Description
【０００１】
【従来の技術】ヒトの尿には尿トリプシンインヒビタ
（ＩＴＵ）が存在し、腎疾患によって尿中のその濃度が
増すことが長らく知られている。
（ＩＴＵ）が存在し、腎疾患によって尿中のその濃度が
増すことが長らく知られている。
【０００２】Pietteらは、The European Journal of Me
dicine Vol. 1, 5 September 1992で、尿トリプシン阻
害活性が、特に原因不明の高熱及び／又は血沈速度の上
昇のある患者において有用なマーカとなりうることを報
告している。Kuwajimaらは、Clinical Biochemistry Vo
l. 23, April 1990, Pp. 167-171で、尿トリプシンイン
ヒビタの自動化アッセイ（検定法）が、急性期反応の臨
床診断に役立つかもしれないことを報告している。
dicine Vol. 1, 5 September 1992で、尿トリプシン阻
害活性が、特に原因不明の高熱及び／又は血沈速度の上
昇のある患者において有用なマーカとなりうることを報
告している。Kuwajimaらは、Clinical Biochemistry Vo
l. 23, April 1990, Pp. 167-171で、尿トリプシンイン
ヒビタの自動化アッセイ（検定法）が、急性期反応の臨
床診断に役立つかもしれないことを報告している。
【０００３】したがって、ＵＴＩの尿分析は重要な診断
ツールである。そのような分析技術は通常、尿試料を、
アルギニン又はリシンのいずれかでクロモフォアに付着
したトリプシン基質と接触させることを含む。理由は、
アルギニン及びリシンは、トリプシンによって開裂する
アミノ酸であるからである。尿トリプシンインヒビタ
は、流体試料中のその濃度にしたがってトリプシン活性
を阻害するため、尿試料中の尿トリプシンインヒビタの
濃度は、クロモフォアの色反応の強さに反比例する。１
９９８年３月１７日公開の特開平１０−７０９９７号公
報には、尿試料、トリプシンを含有する酵素試料及び緩
衝剤を、反応流体中トリプシン１μgあたり０．１５μm
ol以上から尿試料１mlあたり最大１００μmolまでの量
のカルシウムとともに混合することによる、尿中のトリ
プシン活性の阻害度を計測する方法が記載されている。
加えて、トリプシン基質をその有機溶媒に溶解しやすく
するため、界面活性剤が使用される。この技術は、明ら
かに、大きく過剰のカルシウムをアッセイ試薬に加える
ことによって尿試料中に存在するカルシウムによって生
じる干渉を隠蔽するように設計されている。
ツールである。そのような分析技術は通常、尿試料を、
アルギニン又はリシンのいずれかでクロモフォアに付着
したトリプシン基質と接触させることを含む。理由は、
アルギニン及びリシンは、トリプシンによって開裂する
アミノ酸であるからである。尿トリプシンインヒビタ
は、流体試料中のその濃度にしたがってトリプシン活性
を阻害するため、尿試料中の尿トリプシンインヒビタの
濃度は、クロモフォアの色反応の強さに反比例する。１
９９８年３月１７日公開の特開平１０−７０９９７号公
報には、尿試料、トリプシンを含有する酵素試料及び緩
衝剤を、反応流体中トリプシン１μgあたり０．１５μm
ol以上から尿試料１mlあたり最大１００μmolまでの量
のカルシウムとともに混合することによる、尿中のトリ
プシン活性の阻害度を計測する方法が記載されている。
加えて、トリプシン基質をその有機溶媒に溶解しやすく
するため、界面活性剤が使用される。この技術は、明ら
かに、大きく過剰のカルシウムをアッセイ試薬に加える
ことによって尿試料中に存在するカルシウムによって生
じる干渉を隠蔽するように設計されている。
【０００４】このアッセイ技術は、カルシウム干渉を覆
い隠すための過剰のカルシウム及びトリプシン基質を溶
解するための界面活性剤を使用する尿中のトリプシンイ
ンヒビタの液相試験を含む。この技術は、尿中の緩衝剤
に打ち勝つために乾相アッセイで必要な緩衝剤の量が尿
中で沈澱するため、乾相アッセイには適さない。
い隠すための過剰のカルシウム及びトリプシン基質を溶
解するための界面活性剤を使用する尿中のトリプシンイ
ンヒビタの液相試験を含む。この技術は、尿中の緩衝剤
に打ち勝つために乾相アッセイで必要な緩衝剤の量が尿
中で沈澱するため、乾相アッセイには適さない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、尿試料を、ト
リプシン、トリプシンによって開裂すると検出可能な応
答を発するトリプシンの基質及び尿試料中に存在するカ
ルシウムからのアッセイに対する干渉を阻害するのに十
分な量のポリカルボン酸キレート化剤を含む緩衝アッセ
イ媒体（medium）と接触させ、トリプシンインヒビタの
濃度を該基質の開裂からの検出可能な応答と相関させる
ことを含む、尿中のトリプシンインヒビタのアッセイで
ある。
リプシン、トリプシンによって開裂すると検出可能な応
答を発するトリプシンの基質及び尿試料中に存在するカ
ルシウムからのアッセイに対する干渉を阻害するのに十
分な量のポリカルボン酸キレート化剤を含む緩衝アッセ
イ媒体（medium）と接触させ、トリプシンインヒビタの
濃度を該基質の開裂からの検出可能な応答と相関させる
ことを含む、尿中のトリプシンインヒビタのアッセイで
ある。
【０００６】同じく本発明の範囲に含まれるものは、尿
試料中のトリプシンインヒビタの存在及び濃度を検出す
るための、トリプシン、緩衝剤、トリプシン基質及びキ
レート化剤を吸収性キャリヤ中に有する乾式アッセイ試
験具である。
試料中のトリプシンインヒビタの存在及び濃度を検出す
るための、トリプシン、緩衝剤、トリプシン基質及びキ
レート化剤を吸収性キャリヤ中に有する乾式アッセイ試
験具である。
【０００７】
【発明の実施の形態】尿トリプシンインヒビタは、トリ
プシン、αキモトリプシン、ヒアルロニダーゼ及びクレ
アチンホスホキナーゼの酵素反応性を阻害する糖タンパ
クである。トリプシンインヒビタ活性は、以前、細菌感
染の診断に可能なスクリーニング試験として示唆されて
いた。細菌感染が起こると、白血球が動員され、白血球
のエラスターゼ活性が活性化される。急性期反応の間、
インターロイキン−１が、エラスターゼ活性によって低
分子量トリプシンインヒビタに分解されるインター−α
−トリプシンインヒビタの産生を誘発する。これらのト
リプシンインヒビタは、炎症部位に作用して抗炎症活性
及び抗ショック活性を示したのち、尿中に排出されると
考えられる。トリプシンインヒビタの量的変化は、感染
又は炎症の指標として有用であることが示されている。
トリプシンインヒビタはまた、他の状況、たとえば悪性
腫瘍、腎疾患、心筋梗塞及び術後で上昇することが示さ
れている。トリプシンインヒビタは、健康な個人の尿中
に微量で存在する。
プシン、αキモトリプシン、ヒアルロニダーゼ及びクレ
アチンホスホキナーゼの酵素反応性を阻害する糖タンパ
クである。トリプシンインヒビタ活性は、以前、細菌感
染の診断に可能なスクリーニング試験として示唆されて
いた。細菌感染が起こると、白血球が動員され、白血球
のエラスターゼ活性が活性化される。急性期反応の間、
インターロイキン−１が、エラスターゼ活性によって低
分子量トリプシンインヒビタに分解されるインター−α
−トリプシンインヒビタの産生を誘発する。これらのト
リプシンインヒビタは、炎症部位に作用して抗炎症活性
及び抗ショック活性を示したのち、尿中に排出されると
考えられる。トリプシンインヒビタの量的変化は、感染
又は炎症の指標として有用であることが示されている。
トリプシンインヒビタはまた、他の状況、たとえば悪性
腫瘍、腎疾患、心筋梗塞及び術後で上昇することが示さ
れている。トリプシンインヒビタは、健康な個人の尿中
に微量で存在する。
【０００８】感染及び炎症のマーカとしては、血清Ｃ反
応性タンパク、シアリン酸及び血沈速度が利用されてき
た。しかし、これらのマーカはすべて血清ベースであ
り、分析の前に採血ならびに血液試料の凝固、遠心処理
及び分離のための時間を要する。尿トリプシンインヒビ
タアッセイは、血液試料を必要としない、感染を評価す
る簡単で迅速で低廉な手段を提供する。尿試料は、容易
に収集することができ、分析の前に前処理を要しない。
トリプシンインヒビタアッセイは、診断前試験として使
用されると、尿試料が血液試料よりも特に採取しやすい
小児科の分野で特に高レベルの利用性がある。さらに
は、トリプシンインヒビタはＣ反応性タンパク及び血沈
速度の変化に十分に相関することが実証されている。
応性タンパク、シアリン酸及び血沈速度が利用されてき
た。しかし、これらのマーカはすべて血清ベースであ
り、分析の前に採血ならびに血液試料の凝固、遠心処理
及び分離のための時間を要する。尿トリプシンインヒビ
タアッセイは、血液試料を必要としない、感染を評価す
る簡単で迅速で低廉な手段を提供する。尿試料は、容易
に収集することができ、分析の前に前処理を要しない。
トリプシンインヒビタアッセイは、診断前試験として使
用されると、尿試料が血液試料よりも特に採取しやすい
小児科の分野で特に高レベルの利用性がある。さらに
は、トリプシンインヒビタはＣ反応性タンパク及び血沈
速度の変化に十分に相関することが実証されている。
【０００９】本発明のアッセイは、尿中のカルシウムイ
オンの存在によって生じる尿トリプシンアッセイへの干
渉を特定のキレート化剤の使用によって排除することが
できるという発見に基づく。キレート化剤は、カルシウ
ムを抽出し、除去するために使用したのではなく、塩を
錯化するために使用しただけであったため、これは予想
外であった。トリプシンはなおも、錯化した塩とで有害
に相互作用すると予想されていた。
オンの存在によって生じる尿トリプシンアッセイへの干
渉を特定のキレート化剤の使用によって排除することが
できるという発見に基づく。キレート化剤は、カルシウ
ムを抽出し、除去するために使用したのではなく、塩を
錯化するために使用しただけであったため、これは予想
外であった。トリプシンはなおも、錯化した塩とで有害
に相互作用すると予想されていた。
【００１０】アッセイは、アッセイ試薬を水性又は極性
非プロトン性溶媒、たとえば水、エタノール、メタノー
ル、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスル
ホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミド又はメチル
エチルケトンに溶解させることにより、液相で実施する
ことができる。最低で、溶液は、１０〜７５０IU/ml
（好ましくは１００〜５００IU/ml）の濃度のトリプシ
ン、通常は０．２〜５．０mM、好ましくは０．５〜２．
０mMの濃度のトリプシン基質、０．２〜５０mM（好まし
くは１０〜２５mM）の濃度のキレート化剤及び溶液のpH
を６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０に維持す
るための緩衝剤、たとえばホスフェートを含む。
非プロトン性溶媒、たとえば水、エタノール、メタノー
ル、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスル
ホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミド又はメチル
エチルケトンに溶解させることにより、液相で実施する
ことができる。最低で、溶液は、１０〜７５０IU/ml
（好ましくは１００〜５００IU/ml）の濃度のトリプシ
ン、通常は０．２〜５．０mM、好ましくは０．５〜２．
０mMの濃度のトリプシン基質、０．２〜５０mM（好まし
くは１０〜２５mM）の濃度のキレート化剤及び溶液のpH
を６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０に維持す
るための緩衝剤、たとえばホスフェートを含む。
【００１１】本発明の一つの態様は、尿試料中のトリプ
シンインヒビタを検出するための分析試験片に関する。
試験片は、尿試料が貫流することができ、試薬系で含浸
されている吸収性キャリヤを含む。試験片に使用される
吸収性キャリヤは、好ましくはろ紙である。吸収性キャ
リヤとして有用である他の材料は、フェルト、多孔質セ
ラミック片及び紡織又はつや出しガラス繊維である。同
じく適したものは、木、布及びスポンジ材料である。調
製するには、試験片を通常、緩衝剤、キレート化剤、ト
リプシン及び場合によっては界面活性剤の水溶液で含浸
させたのち、乾燥させる。そして、試験片をトリプシン
基質の溶媒溶液で含浸させ、乾燥させる。
シンインヒビタを検出するための分析試験片に関する。
試験片は、尿試料が貫流することができ、試薬系で含浸
されている吸収性キャリヤを含む。試験片に使用される
吸収性キャリヤは、好ましくはろ紙である。吸収性キャ
リヤとして有用である他の材料は、フェルト、多孔質セ
ラミック片及び紡織又はつや出しガラス繊維である。同
じく適したものは、木、布及びスポンジ材料である。調
製するには、試験片を通常、緩衝剤、キレート化剤、ト
リプシン及び場合によっては界面活性剤の水溶液で含浸
させたのち、乾燥させる。そして、試験片をトリプシン
基質の溶媒溶液で含浸させ、乾燥させる。
【００１２】好ましいキレート化剤は、少なくとも一つ
の式−Ｎ（ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）2の錯形成基を有するアミノ
カルボン酸であり、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ジ
エチレントリアミン五酢酸、トリエチレントリアミノ六
酢酸、２，-３−プロピレンジアミン四酢酸及び１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸を含む。
の式−Ｎ（ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）2の錯形成基を有するアミノ
カルボン酸であり、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ジ
エチレントリアミン五酢酸、トリエチレントリアミノ六
酢酸、２，-３−プロピレンジアミン四酢酸及び１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸を含む。
【００１３】本発明で使用するのに適したトリプシン基
質は、トリプシンによって開裂すると、目視又は分光測
光手段によって検出することができる色付き種を形成す
ることができるリシン又はアルギニン結合を含む化合物
である。そのような基質は、ベンゾイル−Ｌ−アルギニ
ンｐ−ニトロアニリドを含む。本発明で使用するのに適
した他のトリプシン基質は、７−アミノ−４−メチルク
マリン、２−アミノナフタレン、４−メトキシ−２−ア
ミノナフタレン、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−ア
ニリン、２−クロロ−４−ニトロ−アニリン、３−アミ
ノインドール、２−アミノアクリドン、２−アミノベン
ゾチアゾール、２−アミノピリミジン、ローダミン１１
０及び６−アミノグイノリンのアルギニン又はリシンア
ミド誘導体を含むが、これらに限定されない。また、種
々のエステル及びアミドが、トリプシンのようなプロテ
アーゼの検出のための基質として使用されている。芳香
族アルコールのＮα，ＮGで保護されたニトロ−Ｌ−ア
ルギニンエステル、たとえば同時係属出願（ＭＳＥ＃２
６０９と特定され、本出願と同日に出願）に開示されて
いる３−（Ｎα−トシル−ＮG−ニトロアルギニルオキ
シ）−５−フェニルピロールを含む新たなクラスの基質
もまた適している。このトリプシン基質は、試験片が尿
試料で濡らされるまでトリプシンと基質との反応を防ぐ
そのニトロ保護基のおかげで、乾式試薬フォーマットに
特に適している。
質は、トリプシンによって開裂すると、目視又は分光測
光手段によって検出することができる色付き種を形成す
ることができるリシン又はアルギニン結合を含む化合物
である。そのような基質は、ベンゾイル−Ｌ−アルギニ
ンｐ−ニトロアニリドを含む。本発明で使用するのに適
した他のトリプシン基質は、７−アミノ−４−メチルク
マリン、２−アミノナフタレン、４−メトキシ−２−ア
ミノナフタレン、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−ア
ニリン、２−クロロ−４−ニトロ−アニリン、３−アミ
ノインドール、２−アミノアクリドン、２−アミノベン
ゾチアゾール、２−アミノピリミジン、ローダミン１１
０及び６−アミノグイノリンのアルギニン又はリシンア
ミド誘導体を含むが、これらに限定されない。また、種
々のエステル及びアミドが、トリプシンのようなプロテ
アーゼの検出のための基質として使用されている。芳香
族アルコールのＮα，ＮGで保護されたニトロ−Ｌ−ア
ルギニンエステル、たとえば同時係属出願（ＭＳＥ＃２
６０９と特定され、本出願と同日に出願）に開示されて
いる３−（Ｎα−トシル−ＮG−ニトロアルギニルオキ
シ）−５−フェニルピロールを含む新たなクラスの基質
もまた適している。このトリプシン基質は、試験片が尿
試料で濡らされるまでトリプシンと基質との反応を防ぐ
そのニトロ保護基のおかげで、乾式試薬フォーマットに
特に適している。
【００１４】
【実施例】以下の例により、本発明を実施する方法をさ
らに説明する。
らに説明する。
【００１５】例Ｉ 以下のアッセイ系を使用して、尿トリプシンインヒビタ
の変形液アッセイの初期試験を実施した。
の変形液アッセイの初期試験を実施した。
【００１６】アッセイ手順は、Cobas-Fara分光光度計
（Roche Diagnostics）で実施した。尿の１０μlアリコ
ートを試料として、リン酸二水素ナトリウム５０mMを単
独で又はＥＧＴＡ０．４７g/lとともに含む緩衝剤水溶
液１２０μlに加えた。尿中のカルシウムの最大実用量
は、公表されたデータに基づくと８０mg/dlであると決
定され、この量のカルシウムを錯化するために必要なＥ
ＧＴＡの量の２倍（０．４７g/l）をアッセイ系に加え
た。第二に、３２mg/lトリプシン酵素水溶液１００μl
を加え、合わせた溶液を２５℃で２分間混合した。最後
に、ＤＭＳＯ中ベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−ニトロ
アニリド（ＢＡＰＮＡ）０．７０g/lからなる基質溶液
１００mlを加えた。得られた混合物を遠心分離し、１５
秒間隔で８分間、４０５nmで読みとった。
（Roche Diagnostics）で実施した。尿の１０μlアリコ
ートを試料として、リン酸二水素ナトリウム５０mMを単
独で又はＥＧＴＡ０．４７g/lとともに含む緩衝剤水溶
液１２０μlに加えた。尿中のカルシウムの最大実用量
は、公表されたデータに基づくと８０mg/dlであると決
定され、この量のカルシウムを錯化するために必要なＥ
ＧＴＡの量の２倍（０．４７g/l）をアッセイ系に加え
た。第二に、３２mg/lトリプシン酵素水溶液１００μl
を加え、合わせた溶液を２５℃で２分間混合した。最後
に、ＤＭＳＯ中ベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−ニトロ
アニリド（ＢＡＰＮＡ）０．７０g/lからなる基質溶液
１００mlを加えた。得られた混合物を遠心分離し、１５
秒間隔で８分間、４０５nmで読みとった。
【００１７】ユリナスタチン（商品名Miraclidの下で販
売されている、分子量６７，０００g/mol及び等電点
２．４の糖タンパク）を加えることにより、インヒビタ
を含まない三つの尿試料をそれぞれ使用して、１リット
ルあたり尿トリプシンインヒビタ（ＵＴＩ）活性５０、
１５０、２５０及び３５０（IU/L）の５個の試料を調製
した。このアッセイ系を使用して尿試料を試験し、基質
の色の変化をRoche Cobas-Faraクリニカルアナライザで
検出した。この実証試験は、ＥＧＴＡを含めたときのア
ッセイの変動の減少を実証するために実施した。結果を
以下の表Ａ及びＢに示す。
売されている、分子量６７，０００g/mol及び等電点
２．４の糖タンパク）を加えることにより、インヒビタ
を含まない三つの尿試料をそれぞれ使用して、１リット
ルあたり尿トリプシンインヒビタ（ＵＴＩ）活性５０、
１５０、２５０及び３５０（IU/L）の５個の試料を調製
した。このアッセイ系を使用して尿試料を試験し、基質
の色の変化をRoche Cobas-Faraクリニカルアナライザで
検出した。この実証試験は、ＥＧＴＡを含めたときのア
ッセイの変動の減少を実証するために実施した。結果を
以下の表Ａ及びＢに示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】表Ａ及びＢから、ＥＧＴＡがアッセイ溶液
中になかったとき、種々の尿試料の間で結果に大きなば
らつきがあったことがわかる。表Ａの標準誤差は１９．
０２IU/lであるが、表Ｂ（ＥＧＴＡを含む）の標準誤差
は１０．５３IU/lである。したがって、ＥＧＴＡは、増
大する量のカルシウムを有する尿試料の間のばらつきを
減らす。３個の尿試料は、異なる量のカルシウムを有し
ていた。カルシウムレベルが高くなるほど、観察された
結果は予想された結果から遠かった。これは、カルシウ
ムがトリプシンのインヒビタであることを示した他の標
準溶液と一致した。他の尿成分、たとえば他の塩、比重
及びpHの分析は、予想された結果と観察された結果との
間の相関を実証しなかった。潜在的な尿トリプシン活性
化物質及びインヒビタの多数の組み合わせの試験を実施
した結果、カルシウムはその活性を増すことがわかった
が、塩化物、ナトリウム及びマグネシウムはほとんど影
響を及ぼさないことがわかった。さらに、カルシウム
は、オーバーウェルムするか錯化させるかしてアッセイ
系から除去しなければならないことがわかった。長期的
目標は、尿トリプシンインヒビタの乾相試験を製造する
ことであり、カルシウムは大部分の緩衝剤を沈澱させる
ため、錯化によってカルシウムを除去することにした。
中になかったとき、種々の尿試料の間で結果に大きなば
らつきがあったことがわかる。表Ａの標準誤差は１９．
０２IU/lであるが、表Ｂ（ＥＧＴＡを含む）の標準誤差
は１０．５３IU/lである。したがって、ＥＧＴＡは、増
大する量のカルシウムを有する尿試料の間のばらつきを
減らす。３個の尿試料は、異なる量のカルシウムを有し
ていた。カルシウムレベルが高くなるほど、観察された
結果は予想された結果から遠かった。これは、カルシウ
ムがトリプシンのインヒビタであることを示した他の標
準溶液と一致した。他の尿成分、たとえば他の塩、比重
及びpHの分析は、予想された結果と観察された結果との
間の相関を実証しなかった。潜在的な尿トリプシン活性
化物質及びインヒビタの多数の組み合わせの試験を実施
した結果、カルシウムはその活性を増すことがわかった
が、塩化物、ナトリウム及びマグネシウムはほとんど影
響を及ぼさないことがわかった。さらに、カルシウム
は、オーバーウェルムするか錯化させるかしてアッセイ
系から除去しなければならないことがわかった。長期的
目標は、尿トリプシンインヒビタの乾相試験を製造する
ことであり、カルシウムは大部分の緩衝剤を沈澱させる
ため、錯化によってカルシウムを除去することにした。
【００２１】トリプシン酵素はpH依存性であり、一定の
活性を得るためには約７．０〜８．０の一定のpHが望ま
しいため、緩衝剤が必要である。ホスフェート及びカル
ボキシル基は、緩衝剤の電荷を帯びた電離性基として一
般的であり、これらの基のカルシウム塩はあまり水溶性
ではない（リン酸カルシウムは比較的不溶性である）た
め、溶液から沈澱する傾向を示す。
活性を得るためには約７．０〜８．０の一定のpHが望ま
しいため、緩衝剤が必要である。ホスフェート及びカル
ボキシル基は、緩衝剤の電荷を帯びた電離性基として一
般的であり、これらの基のカルシウム塩はあまり水溶性
ではない（リン酸カルシウムは比較的不溶性である）た
め、溶液から沈澱する傾向を示す。
【００２２】例II この実験には、変形液相アッセイを使用した。液アッセ
イには以下を使用した。 ｉ．１０％界面活性剤０．１ml（表Ｃに示すとおり） ii．緩衝液３ml iii．Ｈ2Ｏ０．５ml（ＮａＣｌ添加及び無添加） iv．ＭＭＢＤジアゾニウム０．９ml（１２５mg/２５m
l） ｖ．酵素０．２ml（トリプシン１０mg／１００ml） vi．基質３−（Ｎα−トシル−ＮG−ニトロ−Ｌ−アル
ギニルオキシ）−５−フェニルピロール０．３ml（２０
mg／５０mlアセトン）
イには以下を使用した。 ｉ．１０％界面活性剤０．１ml（表Ｃに示すとおり） ii．緩衝液３ml iii．Ｈ2Ｏ０．５ml（ＮａＣｌ添加及び無添加） iv．ＭＭＢＤジアゾニウム０．９ml（１２５mg/２５m
l） ｖ．酵素０．２ml（トリプシン１０mg／１００ml） vi．基質３−（Ｎα−トシル−ＮG−ニトロ−Ｌ−アル
ギニルオキシ）−５−フェニルピロール０．３ml（２０
mg／５０mlアセトン）
【００２３】前記例と同様に、３個の尿試料においてト
リプシンインヒビタの分析を実施し、吸光度の結果を表
Ｃに示す。試験した３個の尿試料は次のとおりであっ
た。 試料１＝トリプシンインヒビタを含まない通常の尿 試料２＝トリプシンインヒビタ２５０IU/lを含む同じ通
常の尿 試料３＝トリプシンインヒビタ２５０IU/lならびに生理
的限界の１０倍の尿素、カルシウム、マグネシウム、ナ
トリウム及びカリウムを含む同じ通常の尿
リプシンインヒビタの分析を実施し、吸光度の結果を表
Ｃに示す。試験した３個の尿試料は次のとおりであっ
た。 試料１＝トリプシンインヒビタを含まない通常の尿 試料２＝トリプシンインヒビタ２５０IU/lを含む同じ通
常の尿 試料３＝トリプシンインヒビタ２５０IU/lならびに生理
的限界の１０倍の尿素、カルシウム、マグネシウム、ナ
トリウム及びカリウムを含む同じ通常の尿
【００２４】
【表３】
【００２５】表Ｃから、トリプシンインヒビタの水溶液
によって良好な反応性及び混合物レベル区別が可能であ
ったが、アッセイにおける界面活性剤の存在が有意な変
動を生じさせることがわかる。陰性試料が影響を受ける
だけでなく、２個の陽性試料の間の差が拡大し、界面活
性剤の性質に依存する。
によって良好な反応性及び混合物レベル区別が可能であ
ったが、アッセイにおける界面活性剤の存在が有意な変
動を生じさせることがわかる。陰性試料が影響を受ける
だけでなく、２個の陽性試料の間の差が拡大し、界面活
性剤の性質に依存する。
【００２６】例III 例II及び表Ｃに記載のようにして、２２個の異なる界面
活性剤を試験した。この試験は、以下の５クラスの界面
活性剤が存在することを示した。 ｉ．ブランク又は反応性に影響を及ぼさなかったもの。 ii．ブランク及び反応性を増大させたもの。 iii．ブランク及び反応性を低下させたもの。 iv．加えられる塩との反応性を増大させたもの。 ｖ．加えられる塩との反応性を低下させるもの。
活性剤を試験した。この試験は、以下の５クラスの界面
活性剤が存在することを示した。 ｉ．ブランク又は反応性に影響を及ぼさなかったもの。 ii．ブランク及び反応性を増大させたもの。 iii．ブランク及び反応性を低下させたもの。 iv．加えられる塩との反応性を増大させたもの。 ｖ．加えられる塩との反応性を低下させるもの。
【００２７】以下の手順にしたがって、各クラスからの
界面活性剤１種を使用して、第一及び第二の溶液を調製
することによって試験片を製造した。ろ紙（Alstrom社
の２０４Ｃグレード）を第一の浸漬溶液で飽和させ、９
０℃で１５分間乾燥させた。得られた試薬を第二の浸漬
溶液で飽和させ、９０℃で１０分間乾燥させて、完全な
試薬試験片を形成した。接着剤（３Ｍ社のＹ９４９４）
を試薬試験片に被着させ、それを０．８６cm四方のパッ
ドの形状でポリスチレン取っ手に固着した。
界面活性剤１種を使用して、第一及び第二の溶液を調製
することによって試験片を製造した。ろ紙（Alstrom社
の２０４Ｃグレード）を第一の浸漬溶液で飽和させ、９
０℃で１５分間乾燥させた。得られた試薬を第二の浸漬
溶液で飽和させ、９０℃で１０分間乾燥させて、完全な
試薬試験片を形成した。接着剤（３Ｍ社のＹ９４９４）
を試薬試験片に被着させ、それを０．８６cm四方のパッ
ドの形状でポリスチレン取っ手に固着した。
【００２８】Ａ．第一の浸漬液の成分 ａ．水５０ml ｂ．一塩基性リン酸緩衝剤（５．００g） ｃ．界面活性剤（Ninate 411、Aerosol OT、Tween 80、
BioTergr AS-40又はなし） ｄ．５．１mM（０．１１９g）エチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四
酢酸（ＥＧＴＡ） ｅ．１．７５％ Plasdone（０．８７７g）（Sigma-Aldr
ich社のＰＶＰ K30） ｆ．３４０U/mlトリプシン酵素 ｇ．１７５mM ＭｇＳＯ4（２．１６g） ｈ．２．７０mM（４３．７mg）２−メトキシ−４−モル
ホリノ−ベンゼンジアゾニウムクロリド、塩化亜鉛（Ｍ
ＭＢＤ）（ジアゾニウムカップリング剤） ｉ．pH７．８０±０．０２に調節するための１N Ｎａ
ＯＨ
BioTergr AS-40又はなし） ｄ．５．１mM（０．１１９g）エチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四
酢酸（ＥＧＴＡ） ｅ．１．７５％ Plasdone（０．８７７g）（Sigma-Aldr
ich社のＰＶＰ K30） ｆ．３４０U/mlトリプシン酵素 ｇ．１７５mM ＭｇＳＯ4（２．１６g） ｈ．２．７０mM（４３．７mg）２−メトキシ−４−モル
ホリノ−ベンゼンジアゾニウムクロリド、塩化亜鉛（Ｍ
ＭＢＤ）（ジアゾニウムカップリング剤） ｉ．pH７．８０±０．０２に調節するための１N Ｎａ
ＯＨ
【００２９】Ｂ．第二の浸漬液の成分 ａ．１９．３mg又は０．７５mM３−（Ｎα−トシル−Ｎ
G−ニトロ−Ｌ−アルギニルオキシ）−５−フェニルピ
ロール ｂ．アセトン５０ml
G−ニトロ−Ｌ−アルギニルオキシ）−５−フェニルピ
ロール ｂ．アセトン５０ml
【００３０】データは、試験片を、表Ｄに示す尿配合物
に浸漬したのち、Bayer Diagnostics社のCLINITEK（商
標）50分光計に入れて、浸漬後１５及び６０秒でデータ
を収集し、以下の式を使用してデコード値を計算するこ
とによって収集した。 デコード＝｛〔（Ｂ１５＋Ｇ１５）−（Ｂ６０＋Ｇ６
０）〕／（Ｂ１５＋Ｇ１５）｝＊１０００ （式中、Ｂ１５は、１５秒での青波長の反射率であり、
Ｂ６０は、６０秒での青波長の反射率であり、Ｇ１５
は、１５秒での緑波長の反射率であり、Ｇ６０は、６０
秒での緑波長の反射率である）
に浸漬したのち、Bayer Diagnostics社のCLINITEK（商
標）50分光計に入れて、浸漬後１５及び６０秒でデータ
を収集し、以下の式を使用してデコード値を計算するこ
とによって収集した。 デコード＝｛〔（Ｂ１５＋Ｇ１５）−（Ｂ６０＋Ｇ６
０）〕／（Ｂ１５＋Ｇ１５）｝＊１０００ （式中、Ｂ１５は、１５秒での青波長の反射率であり、
Ｂ６０は、６０秒での青波長の反射率であり、Ｇ１５
は、１５秒での緑波長の反射率であり、Ｇ６０は、６０
秒での緑波長の反射率である）
【００３１】デコード値はＵＴＩ濃度に正比例する。＞
１８０の結果には０IU/mlを割り当て、＜１２０の結果
には２５０IU/mlの値を割り当てる。
１８０の結果には０IU/mlを割り当て、＜１２０の結果
には２５０IU/mlの値を割り当てる。
【００３２】この実験の結果を表Ｄに示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】界面活性剤なしでトリプシンインヒビタに
対する大きな反応が見られているため、表Ｄは、乾燥試
薬中の界面活性剤の存在又は非存在が干渉を減らす効果
又は利点をもたらさないことを示す。
対する大きな反応が見られているため、表Ｄは、乾燥試
薬中の界面活性剤の存在又は非存在が干渉を減らす効果
又は利点をもたらさないことを示す。
【００３５】表Ｃで報告されたように、ＥＧＴＡの非存
在で強い界面活性効果が認められたため、表Ｄに示す結
果は予想とは異なった。尿pHは、緩衝効果を排除するの
に最適な試験片pHである７．５〜８．０に調節した。界
面活性剤を含むすべてのアッセイは、水を上回る改善を
示さなかった。この研究は、ＥＧＴＡを含む配合が、Ｅ
ＧＴＡを含まない配合物よりも、界面活性剤の影響を受
けにくいという結論を導いた。界面活性剤によって生じ
るアッセイばらつきのため、界面活性剤をアッセイ配合
物から省いてもよい。しかし、基質を溶液に溶かすのに
難がある配合物では、非イオン性ポリオキシアルキル界
面活性剤、たとえばエチレングリコール単位を含むもの
を使用してもよい。このクラスの界面活性剤は、Aeroso
l OT、Ninate 411及びBioterge A-40を含む。これらの
界面活性剤はアッセイの再現精度に悪影響を及ぼさない
ことがわかっている。
在で強い界面活性効果が認められたため、表Ｄに示す結
果は予想とは異なった。尿pHは、緩衝効果を排除するの
に最適な試験片pHである７．５〜８．０に調節した。界
面活性剤を含むすべてのアッセイは、水を上回る改善を
示さなかった。この研究は、ＥＧＴＡを含む配合が、Ｅ
ＧＴＡを含まない配合物よりも、界面活性剤の影響を受
けにくいという結論を導いた。界面活性剤によって生じ
るアッセイばらつきのため、界面活性剤をアッセイ配合
物から省いてもよい。しかし、基質を溶液に溶かすのに
難がある配合物では、非イオン性ポリオキシアルキル界
面活性剤、たとえばエチレングリコール単位を含むもの
を使用してもよい。このクラスの界面活性剤は、Aeroso
l OT、Ninate 411及びBioterge A-40を含む。これらの
界面活性剤はアッセイの再現精度に悪影響を及ぼさない
ことがわかっている。
【００３６】例IV さらなる試験片態様では、界面活性剤を使用せず、試験
片の緩衝能力を改善することに集中した。緩衝剤のレベ
ルを増しながら一連の試験片配合物を製造した。尿pH効
果に打ち勝つのに十分なリン酸緩衝剤（＞１M）は、浸
漬溶液に溶解することができないことがわかった。尿緩
衝能力に打ち勝つ程度に水に溶解することができる有機
緩衝剤はわずか数種である。トリス〔トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕はその１種である。この例で
は、７．８のpHを得るためにトリスを１．５Mのレベル
で使用した。試験片を調製するための配合及び手法は、
緩衝剤が１．３Mトリス（水５０ml中７．８７g）であ
り、界面活性剤を配合に加えなかったことを除き、例II
Iで使用したものと同じであった。
片の緩衝能力を改善することに集中した。緩衝剤のレベ
ルを増しながら一連の試験片配合物を製造した。尿pH効
果に打ち勝つのに十分なリン酸緩衝剤（＞１M）は、浸
漬溶液に溶解することができないことがわかった。尿緩
衝能力に打ち勝つ程度に水に溶解することができる有機
緩衝剤はわずか数種である。トリス〔トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕はその１種である。この例で
は、７．８のpHを得るためにトリスを１．５Mのレベル
で使用した。試験片を調製するための配合及び手法は、
緩衝剤が１．３Mトリス（水５０ml中７．８７g）であ
り、界面活性剤を配合に加えなかったことを除き、例II
Iで使用したものと同じであった。
【００３７】この例IVで記載した研究の目的は、T. Noa
dによってOsaka-stii Igakkai Zasshi Vol. 44, No. 2
June 1992; 485-500に記載されている免疫学的液アッセ
イ基準法に対する試験片アッセイの相関を実証すること
であった。例IIで示すように開発した免疫学的基準法を
使用し、Hitachi 7070オートアナライザ及びEiken Japa
n社の抗体キットを使用して、９１１個の臨床尿を評価
した。分析パラメータは次のとおりであった。
dによってOsaka-stii Igakkai Zasshi Vol. 44, No. 2
June 1992; 485-500に記載されている免疫学的液アッセ
イ基準法に対する試験片アッセイの相関を実証すること
であった。例IIで示すように開発した免疫学的基準法を
使用し、Hitachi 7070オートアナライザ及びEiken Japa
n社の抗体キットを使用して、９１１個の臨床尿を評価
した。分析パラメータは次のとおりであった。
【００３８】１）方法：２点末端 ２）計測時間：１回目３５５．３５秒、２回目５９０．
９４秒 ３）波長：６６０nm ４）試料希釈：pH７．４緩衝液で１００倍（標準）／pH
７．４緩衝液で５０倍（低濃度試料） ５）試料値：５μl ６）試薬値：１回目試薬１５０μl、２回目試薬５０μl ７）標準点：７点（０、７．８、１５．６、３１．３、
６２．５、１２５、２５０IU/ml） ８）標準曲線：スプライン
９４秒 ３）波長：６６０nm ４）試料希釈：pH７．４緩衝液で１００倍（標準）／pH
７．４緩衝液で５０倍（低濃度試料） ５）試料値：５μl ６）試薬値：１回目試薬１５０μl、２回目試薬５０μl ７）標準点：７点（０、７．８、１５．６、３１．３、
６２．５、１２５、２５０IU/ml） ８）標準曲線：スプライン
【００３９】表Ｅは、この例の試験片アッセイと免疫学
的液アッセイ基準との相関を示す真理表である。全体的
に、０、１００及び２００の試験片結果の一致を表Ｅの
＜５０、５０〜１５０及び≧１５０IU/mlでのイムノア
ッセイ結果と比較することによって示されるように、二
つの方法の間の相関は良好である。０、１００及び２０
０の値を得るために使用されるデコード範囲及び等式
（式中、≧２７５のデコードは「０」であり、２００〜
２７５は「１００」であり、＜２００のデコードは「２
００」の試験片結果である）。陽性及び陰性の一致は、
免疫学的方法の場合、しきい値５０IU/mlで６６．７及
び８８．５％であり、試験片試験の妥当な範囲内であっ
た。正常な個人は、９９％の場合、＜５０IU/mlを有す
ることがわかった。
的液アッセイ基準との相関を示す真理表である。全体的
に、０、１００及び２００の試験片結果の一致を表Ｅの
＜５０、５０〜１５０及び≧１５０IU/mlでのイムノア
ッセイ結果と比較することによって示されるように、二
つの方法の間の相関は良好である。０、１００及び２０
０の値を得るために使用されるデコード範囲及び等式
（式中、≧２７５のデコードは「０」であり、２００〜
２７５は「１００」であり、＜２００のデコードは「２
００」の試験片結果である）。陽性及び陰性の一致は、
免疫学的方法の場合、しきい値５０IU/mlで６６．７及
び８８．５％であり、試験片試験の妥当な範囲内であっ
た。正常な個人は、９９％の場合、＜５０IU/mlを有す
ることがわかった。
【００４０】
【表５】
【００４１】臨床尿試料のうち、８９８個を、米国特許
第５，７３３，７８７号明細書に記載のクレアチニン試
験片及び定量的Jaffeクレアチニンアッセイを使用してC
obas-Faraアナライザでさらに評価した。クレアチニン
試験片に対する例IVの試験片アッセイの比率をクレアチ
ニン基準法に対する免疫学的液トリプシンインヒビタア
ッセイに比較した相関を示す真理表を表Ｇに示す。クレ
アチニン基準法は、Roche Diagnostics社のCOBAS-FARA
機器のための市販のアッセイであった。全体的に、二つ
の方法の間の相関は、臨床的に正常、異常及び高度に異
常な試料を表す三つのレベル、すなわち＜５０IU/g、５
０〜１５０IU/g及び＞１５０IU/gで試験片結果をイムノ
アッセイ結果と比較することによる測定で良好であっ
た。デコード比結果は、ＴＩ試薬デコードをクレアチン
試薬デコードで割ることによって得た。クレアチニンデ
コードは、赤波長における反射率／緑波長における反射
率である。≧８５のデコード比結果は、試験片結果では
「０」であり、８４．９〜５０は、試験片結果では「１
００」であり、＜５０は、試験片結果では「２００」で
あった。しきい値＜５０IU/gにおける陽性及び陰性の結
果とイムノアッセイとの一致は、８５．２％及び８６．
４％であり、それは試験片試験の妥当な範囲内であっ
た。
第５，７３３，７８７号明細書に記載のクレアチニン試
験片及び定量的Jaffeクレアチニンアッセイを使用してC
obas-Faraアナライザでさらに評価した。クレアチニン
試験片に対する例IVの試験片アッセイの比率をクレアチ
ニン基準法に対する免疫学的液トリプシンインヒビタア
ッセイに比較した相関を示す真理表を表Ｇに示す。クレ
アチニン基準法は、Roche Diagnostics社のCOBAS-FARA
機器のための市販のアッセイであった。全体的に、二つ
の方法の間の相関は、臨床的に正常、異常及び高度に異
常な試料を表す三つのレベル、すなわち＜５０IU/g、５
０〜１５０IU/g及び＞１５０IU/gで試験片結果をイムノ
アッセイ結果と比較することによる測定で良好であっ
た。デコード比結果は、ＴＩ試薬デコードをクレアチン
試薬デコードで割ることによって得た。クレアチニンデ
コードは、赤波長における反射率／緑波長における反射
率である。≧８５のデコード比結果は、試験片結果では
「０」であり、８４．９〜５０は、試験片結果では「１
００」であり、＜５０は、試験片結果では「２００」で
あった。しきい値＜５０IU/gにおける陽性及び陰性の結
果とイムノアッセイとの一致は、８５．２％及び８６．
４％であり、それは試験片試験の妥当な範囲内であっ
た。
【００４２】
【表６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル・ジェー・プジア アメリカ合衆国、インディアナ州、46530、 グレンジャー、タッディントン・ドライブ 14342 (72)発明者 ポール・エフ・コーリー アメリカ合衆国、インディアナ州、46514、 エルクハート、スプリングブルック・ドラ イブ 1535 Ｆターム(参考） 2G045 AA16 BB10 BB29 BB51 CB03 FB01 GC10 4B063 QA01 QA19 QQ95 QR16 QR54 QR58 QS36 QX01
Claims (14)
- 【請求項１】 尿試料を、トリプシン、トリプシンによ
って開裂すると検出可能な応答を発するトリプシンの基
質及び尿中に存在するカルシウムからのアッセイに対す
る干渉を阻害するのに十分な量のポリカルボン酸キレー
ト化剤を含む緩衝アッセイ媒体と接触させ、トリプシン
インヒビタの濃度を該基質の開裂からの検出可能な応答
と相関させる工程を含む、尿中のトリプシンインヒビタ
のアッセイ。 - 【請求項２】 該アッセイ試薬が溶液状態にある、請求
項１記載のアッセイ。 - 【請求項３】 該溶液を形成するために使用される溶媒
が、水性又は極性非プロトン性溶媒である、請求項２記
載のアッセイ。 - 【請求項４】 該溶媒が、水、エタノール、メタノー
ル、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスル
ホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミド又はメチル
エチルケトンである、請求項３記載のアッセイ。 - 【請求項５】 該アッセイ試薬が乾相にある、請求項１
記載のアッセイ。 - 【請求項６】 尿試料が貫流することができる材料の乾
式試験具を緩衝アッセイ媒体に浸漬することによって、
アッセイ試薬を乾式試験具に浸漬させたのち、溶媒を乾
燥させる、請求項５記載のアッセイ。 - 【請求項７】 該キレート化剤が、エチレングリコール
ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
−四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（Ｎ
ＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ト
リエチレントリアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、２，３−プ
ロピレンジアミノ四酢酸（ＵＥＤＴＡ）及び１，２−ジ
アミノシクロヘキサン四酢酸である、請求項１記載のア
ッセイ。 - 【請求項８】 該トリプシンが１０〜７５０IU/mlの量
で存在し、該キレート化剤が０．２〜５０mMの量で存在
し、該トリプシン基質が０．２〜５０mMの濃度で存在
し、pHが６．０〜８．０のレベルに緩衝されている、請
求項１記載のアッセイ。 - 【請求項９】 該トリプシン濃度が１００〜５００IU/m
lであり、該キレート化剤が１０〜２５mMの濃度で存在
し、pHが７．０〜８．０のレベルにある、請求項８記載
のアッセイ。 - 【請求項１０】 トリプシンの該基質が、７−アミノ−
４−メチルクマリン、２−アミノナフタレン、４−メト
キシ−２−アミノナフタレン、３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシ−アニリン、２−クロロ−４−ニトロ−アニリ
ン、３−アミノインドール、２−アミノアクリドン、２
−アミノベンゾチアゾール、２−アミノピリミジン、ロ
ーダミン１１０及び６−アミノキノリンのアルギニン又
はリシン誘導体からなる群より選択される、請求項１記
載のアッセイ。 - 【請求項１１】 尿中のトリプシンインヒビタを測定す
るための試験具の製造方法であって、吸収性材料のパッ
ドを、トリプシン及びポリカルボン酸キレート化剤の水
溶液と接触させたのち、試験片を乾燥させ、それをトリ
プシンの基質の溶媒溶液と接触させ、続いて乾燥させる
工程を含む方法。 - 【請求項１２】 請求項１１の溶媒溶液が、非イオン性
ポリオキシアルキル界面活性剤を含む、請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１３】 該界面活性剤がエチレングリコール単
位を含む、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 該トリプシン基質が３−（Ｎα−トシ
ル−ＮG−ニトロ−Ｌ−アルギニルオキシ）−５−フェ
ニルピロールである、請求項１１記載の方法。
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|---|---|---|---|
| US20403200P | 2000-05-15 | 2000-05-15 | |
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|---|---|---|---|
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