JPH1183849A

JPH1183849A - 尿中有形成分の分析方法及びその分析試薬

Info

Publication number: JPH1183849A
Application number: JP24883597A
Authority: JP
Inventors: Junya Inoue; 淳也井上; Mikiko Nishizaki; 未希子西崎
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 1999-03-26

Abstract

(57)【要約】【課題】安価な分析装置で、尿中の有形成分の分析精
度を向上させることを目的とする。【解決手段】尿中有形成分を、１以上の緑色光源で励
起可能な染料（アストラゾンピンクＦＧ、ＮＫ−１０
５５、ＮＫ−３４２、ＮＫ−３４６８及びＮＫ−３４８
３のスチリル系染料、ＮＫ−７３７及びＮＫ−１０４
６のシアニン系染料、ブリリアントピンクＢ、エリス
ロシンＢ、ピロニンＹ、ピロニンＢ、エチルエオシン及
びＮＫＸ−１３２５のキサンテン系染料、メロシアニ
ン系染料のＮＫ−１０５０、ナイルレッド、ベーシッ
クバイオレット４０、ベーシックレッド３６、ロサゼイ
ンＢ、ギムサ染料及びベーシックバイオレット２７）で
染色し、染色された尿中有形成分をフローセルに一個ず
つ流して緑色の励起光を照射し、この有形成分からの散
乱光と蛍光とを測定する尿中有形成分の分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、尿中有形成分の分
析方法及びその分析試薬に関し、より詳細には、緑色光
源を使用したフローサイトメトリーを応用した尿中の有
形成分の光学的分析方法及びその分析試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】腎・尿
路系の感染症、炎症性病変、変性病変、結石症、腫瘍な
どの疾患では、それぞれの疾患に応じて、尿中に種々の
有形成分が出現する。有形成分としては、赤血球、白血
球、上皮細胞、円柱、細菌、酵母、結晶、粘液糸などが
挙げられる。尿中のこれらの成分を分析することは腎・
尿路系の疾患の早期発見や異常部位の推定をする上で特
に重要である。例えば、赤血球の測定は、腎臓の糸球体
から尿道に至る経路における出血の有無を判定する上で
重要であり、白血球の出現は、腎盂腎炎などの腎疾患の
疑いが考えられ、炎症、感染症を早期発見することがで
きる。また、円柱や赤血球の形態を調べることにより、
その由来部位を推定することもできる。

【０００３】従来から、尿中の有形成分の分析は、顕微
鏡により目視検査が広く行われている。まず、尿を遠心
分離して濃縮し、その沈渣物を場合によっては染色後、
顕微鏡スライド上に積載し、顕微鏡下で分類・計数を行
うものである。また近年では、フラットシースフローと
画像処理技術とを組み合わせた自動測定装置が開発され
ている。これは、シース液を外層とし、きわめて偏平な
流れに調節された尿試料液をビデオカメラで撮影し、こ
の静止画面を画像処理することにより、試料液中の有形
成分の像を切り出して表示するものである。その表示を
検査技師が見ながら有形成分を判別し、分類処理が行わ
れる。

【０００４】さらに、尿中の有形成分を自動分類、計数
するものとして、特開平４−３３７４５９号公報では、
フローサイトメトリーを応用した尿中の細胞分析用試薬
およびその方法が開示されている。その試薬は、蛍光染
料、浸透圧補償剤及び緩衝剤を含み、さらに、種々の蛍
光染料、浸透圧補償剤、緩衝剤を含有しており、実施例
には、蛍光染料としてニュートラルレッド、オーラミン
Ｏを使用した試薬が記載されている。

【０００５】ところで尿検体は、採取後時間が経過する
とともに有形成分の変性、細菌数の増加などの変化が起
きるため、採取後なるべく早いうちに検査することが望
まれる。顕微鏡による目視検査では、尿検体の遠心、濃
縮等の前処理に手間や時間がかかる上、鏡検作業は検査
技師にとって大きな負担になる。また、観察細胞数が少
ないため検査精度が低い。

【０００６】一方、画像処理技術を利用した自動測定装
置においては、鏡検作業に比べれば負担が軽減される点
では有利であるものの、有形成分の判別は検査技師が行
わなければならず、処理速度も遅いため検体数の多い場
合には必ずしも満足できるものではない。また、目視検
査、画像処理による自動測定装置のいずれの方法におい
ても、有形成分の判別には熟練を要する。

【０００７】特開平４−３３７４５９号公報記載のフロ
ーサイトメトリーを尿分析に応用した方法では、迅速に
測定が行える点で有利であるが、さらに検討を重ねた結
果、以下の問題点があることが判明した。

【０００８】(1) 尿中に結晶が出現すると赤血球との弁
別が困難になる。 (2) 無晶性塩類が多数出現した検体は、他の細胞成分の
分類が困難になる。 (3) 特開平４−３３７４５９号公報の実施例に示された
pH8.5のオーラミンＯ含有試薬では、ヘモグロビンや蛋
白を含む尿検体を測定すると、ヘモグロビンや蛋白が染
料と結合し、微小沈殿物となって析出して測定ができな
くなることがある。 (4) (3)はpHを酸性にすることによって解決することが
できるが、染色性が悪くなり、酵母が出現すると赤血球
との弁別が困難になる。

【０００９】(5) 尿をフローサイトメータで分析すると
きには、尿中に存在する有形成分の量が少ないことから
希釈倍率を低く抑えなければならない。しかし、希釈倍
率を低くすると、尿中にビタミン類や抗生物質のような
薬剤等の蛍光を発する物質が排泄される場合には、尿自
身の背後蛍光（バックグラウンドノイズ）が無視できな
くなり、有形成分の蛍光信号強度が得られない場合があ
る。また、ニュートラルレッドを使用した場合には、細
胞と結合していない染料による背後蛍光の影響が大き
い。

【００１０】これらの問題は、特開平８−１７０９６０
号公報において提案されている青色波長で励起可能な２
つの蛍光染料を含有する試薬又は赤色波長で励起可能な
蛍光染料とを含む試薬を使用することにより解決され
た。

【００１１】しかし、青色波長で励起可能な蛍光染料を
使用する場合には、青色波長用光源として高価なアルゴ
ンレーザを使用することが必要となり、装置の低価格化
を考えたときに、その価格がネックとなる。

【００１２】また、光源として赤色波長用光源のものを
採用すれば、装置の低価格化を図ることができる。しか
し、赤色波長で励起可能な蛍光染料を用いたとき、蛍光
強度−前方散乱光強度のスキャッタグラム上で、ダメー
ジを受けた白血球と細菌とが同時に多量に出現する場合
には、それらの出現位置がオーバーラップしやすく、ア
ルゴンレーザーを使用して測定する場合と比較してそれ
らの分離が困難になるという問題がある。

【００１３】なお、光源として緑色波長用光源を使用す
る方法は、例えば特開平７−３３３２２０号公報に記載
されているが、この方法は網状赤血球を測定する方法を
開示するのみであり、尿中に出現する多種多様な有形成
分の分析方法に使用することについては記載されていな
い。また、この方法によれば、網状赤血球を染色するた
めに３０分間程度以上かかるため、自動化されたフロー
サイトメトリによる測定に適用するには実用的でない等
の問題もある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来フロ
ーサイトメトリにより、尿中有形成分を測定する際に使
用されていなかった緑色光源で励起可能な染料を採用す
ることにより、上記のような問題点を解決できることを
見いだし本発明の完成に至った。

【００１５】すなわち、本発明によれば、尿中有形成分
を、緑色光源で励起可能な以下の群：アストラゾンピ
ンクＦＧ、ＮＫ−１０５５、ＮＫ−３４２、ＮＫ−３４
６８及びＮＫ−３４８３からなるスチリル系染料、ＮＫ−７３７及びＮＫ−１０４６からなるシアニン系
染料、ブリリアントピンクＢ、エリスロシンＢ、ピロニン
Ｙ、ピロニンＢ、エチルエオシン及びＮＫＸ−１３２５
からなるキサンテン系染料、メロシアニン系染料であるＮＫ−１０５０、ナイルレッド、ベーシックバイオレット４０、ベーシ
ックレッド３６、ロサゼインＢ、ギムサ染料及びベーシ
ックバイオレット２７からなる染料から選択される少なくとも１つの染料で染色し、染色さ
れた尿中有形成分をフローセルに一個ずつ流して緑色の
励起光を照射し、この有形成分からの散乱光と蛍光とを
測定する尿中有形成分の分析方法が提供される。

【００１６】また、本発明によれば、尿中有形成分を、
緑色光源で励起可能なシアニン系染料とナイルレッドと
を含む染色液を用いて染色し、染色された尿中有形成分
をフローセルに一個ずつ流して緑色の励起光を照射し、
この有形成分からの散乱光と蛍光とを測定する尿中有形
成分の分析方法が提供される。

【００１７】さらに、本発明によれば、上述した緑色光
源で励起可能な群から選択される少なくとも１つの染料
を含む尿中有形成分の分析試薬、又は緑色光源で励起可
能なシアニン系染料とナイルレッドとを含む尿中有形成
分の分析試薬がそれぞれ提供される。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明における分析方法において
は、まず、尿中有形成分を緑色光源で励起可能な染料で
染色する。ここで、測定対象とする尿中有形成分として
は、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、細菌、酵母など
が挙げられる。

【００１９】緑色光源で励起可能な染料とは、緑色Ｈｅ
−Ｎｅレーザ光（５４３．５ｎｍ程度）を照射した場合
に、励起して蛍光を放出しうる染料を意味する。このよ
うな染料としては、例えば、後述するようなスチリル系
染料、シアニン系染料、キサンテン系染料、メロシアニ
ン系染料からなる群から選択される１種以上の染料が挙
げられる。具体的には、例えば、

【００２０】

【化１】

【００２１】

【化２】

【００２２】

【化３】

【００２３】

【化４】

【００２４】また、上記の他に使用できる染料の例とし
ては、次のものが挙げられる。

【００２５】

【化５】

【００２６】これらの染料は単独で使用してもよいし、
同系の染料を２種以上組み合わせて使用してもよいし、
異なる系の染料を２種以上組み合わせて使用してもよ
い。なかでも、シアニン系染料から選択される１種以上
の染料とナイルレッドとを組み合わせて使用することが
好ましく、特に、シアニン系染料のアストラバイオレッ
トとナイルレッドとを組み合わせて使用することがより
好ましい。

【００２７】ナイルレッドと組み合わせることができる
シアニン系色素の具体例は、以下の通りである。

【００２８】

【化６】

【００２９】なお、上記染料は株式会社日本感光色素研
究所等から市販品として入手可能である。

【００３０】尿中有形成分を緑色光源で励起可能な染料
で染色する方法自体は、特に限定されるものではなく、
公知の方法により行うことができる。例えば、まず、原
尿を緑色光源で励起可能な染料を含有する試薬に混合す
る。この際、試薬は尿中に含まれる有形成分を染色する
とともに、原尿と混合することによって２〜１００倍、
好ましくは２〜２０倍に希釈される。なお、原尿の希釈
倍率は、２〜１６倍程度がより好ましく、４〜１０倍程
度が特に好ましい。また、尿中に無晶性塩類が含まれて
いる場合には、この無晶性塩類を短時間で溶解させるた
めに、試薬を予め３０〜５０℃に、さらに好ましくは33
〜37℃に加温しておくのがよい。試薬と原尿との混合
は、室温から５０℃の範囲で、さらに好ましくは33〜37
℃で、５〜１２０秒間、さらに好ましくは10〜30秒間行
うのがよい。

【００３１】なお、試薬が、例えば、染色液と希釈液と
からなる２液構成の場合には、染色液と希釈液とを予め
混合した後原尿を加えるか、または尿と希釈液とを混合
した後染色液を加える。２液構成の場合、尿の最終の希
釈倍率が４〜１０倍となるように両者を混合することが
好ましい。またこの場合においても、無晶性塩類を短時
間で溶解させるために、希釈液を予め３０〜５０℃に、
好ましくは33〜37℃に加温しておくのがよい。

【００３２】試薬と混合された尿を尿試料として、有形
成分を一個ずつフローセルに流す。フローセルに流され
た有形成分には、緑色の励起光が照射される。これによ
り、有形成分が散乱光と蛍光とを放出するため、これら
の散乱光と蛍光とを測定することによって、尿中に含有
されている有形成分の分析をすることができる。

【００３３】ここで、散乱光としては、測定対象によっ
て前方散乱光、側方散乱光、後方散乱光のいずれか１種
又は２種以上を組み合わせて測定してもよく、さらに、
前方散乱光として低角散乱光、高角散乱光等のいずれを
測定してもよい。また、蛍光とは、測定対象によって、
前方蛍光、側方蛍光、後方蛍光のいずれか１種又は２種
以上を組み合わせて測定してもよい。

【００３４】また、円柱については、散乱光パルス幅
（長さ情報を反映）と蛍光パルス幅（有形成分の内部情
報を反映）とを組み合わせることによって、図９に示す
ように、精度よく検出することができる。

【００３５】本発明において用いられるフローサイトメ
ータの一例を図１０に基づいて説明する。まず、弁１及
び２を所定時間開けることにより、廃液チャンバからの
引圧により吸引ノズル３から試薬により染色された有形
成分が含まれた尿試料液が弁１及び２に満たされる。シ
リンジ４が一定流量で液を押し出すことにより、試料用
ノズル６から試料液が吐出されると同時に、弁８を開け
ることによりフローセル５のチャンバー７にシース液が
供給される。これによって試料は図１０に示されるよう
に、チャンバー７の内径にしたがって細く絞られシース
フローを形成し、オリフィス１１を通過する。オリフィ
ス１１の形状は内径の一辺が１００〜３００μｍの角柱
形状をし、材質は光学硝子（石英硝子も含む）でできて
いる。このようにシースフローを形成することによって
粒子（有形成分）を１個ずつオリフィス１１の中心を一
列に整列して流すことができる。なお、オリフィス１１
を通過した尿試料液とシース液とはチャンバー２５に設
けた回収管１４を通って排出される。

【００３６】オリフィス１１のほぼ中心のサンプル流２
６へレーザ１７から発振したレーザ光がコンデンサレン
ズ１８で楕円状に絞られて照射される。レーザ光の形状
は尿試料の流れの方向には血球粒子径と同程度、例えば
１０μｍ前後と狭く、尿試料の流れ方向及び照射光軸方
向と直交する方向の形状は、血球粒子径より十分広く、
例えば１５０〜３００μｍ程度である。サンプル流２６
に照射されたレーザ光で粒子（有形成分）に当たらずそ
のままフローセル５を透過した透過光はビームストッパ
１９で遮光される。粒子（有形成分）に照射され、狭い
角度で発せられる前方散乱光及び前方蛍光はコレクター
レンズ２０により集光され、遮光板３０のピンホール２
１を通過する。そして、ダイクロイックミラー２２に到
達する。散乱光より長波長の蛍光はそのまま高率でダイ
クロイックミラー２２を透過し、フィルター２３でさら
に散乱光が除かれた後にフォトマルチプライヤーチュー
ブ（ＰＭＴ）２４で検出され、電気信号２７に変換され
て出力される。散乱光はダイクロイックミラー２２で反
射されフォトダイオード３１で受光されて電気信号２８
に変換されて出力される。

【００３７】本発明の尿中有形成分の分析用試薬は、緑
色光源で励起可能な染料を１種以上含有する。染料の例
は、上述したとおりであり、この場合の染料の濃度は、
特に限定されるものではなく、用いる染料、原尿の希釈
倍率、対象とする尿試料（有形成分の種類）等により適
宜調整することができる。例えば、分析用試薬中０．１
〜５００ｐｐｍ程度の濃度、より好ましくは０．５〜１
００ｐｐｍ程度の濃度が挙げられる。

【００３８】緩衝剤としては、安定した蛍光強度が得ら
れるように測定試料のpHを一定の範囲に保つために用い
られる。pHは、赤血球の溶血を抑制するためにpH5.0〜
9.0の範囲に調整される。なお、尿中に含有される結晶
成分のうち、特に無晶性塩類は、通常、種々の水溶液、
例えば、生理食塩水、希塩酸、希酢酸、水酸化カリウム
水溶液等で希釈することによって溶解することが可能で
あるが、なかには酸性及びアルカリ性で析出するものが
それぞれある。従って、pHは、中性付近であれば無晶性
塩を析出しにくいので、pH6.5〜7.5が好ましく、pH6.8
〜7.2がより好ましい。

【００３９】緩衝剤としては、従来公知のものを使用す
ることができる。例えば、トリス及びビス−トリス（Bi
s-Tris）, トライシン（Tricine）, バイシン（Bicin
e）, MES, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES,
HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO,HEPPSO, EPPS, TAPS等の
グッド緩衝剤として知られている緩衝剤を挙げることが
できる。中でも、HEPESが好ましい。これら緩衝剤はそ
れぞれの緩衝能に応じて、尿検体を希釈したときにpHが
一定の範囲内になる濃度で用いることが好ましく、その
濃度は、通常、20〜500mM、好ましくは50〜200mMであ
る。

【００４０】浸透圧補償剤は、赤血球の溶血を防ぐ目的
と安定した蛍光強度を得るために加えられる。尿の浸透
圧は、50〜1300mOsm／kg・H₂O と広範囲にわたって分布
している。分析用試薬の浸透圧が低すぎると赤血球の溶
血が早期に進行してしまい、逆に高すぎると細胞の損傷
が大きくなるので浸透圧は100〜600mOsm／kg・H₂O が好
ましく、150〜500mOsm ／kg・H₂O がより好ましい。

【００４１】浸透圧補償剤としては、無機塩類やプロピ
オン酸塩等の有機塩類、糖類などが用いられる。無機塩
類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチ
ウム等、プロピオン酸塩としては、プロピオン酸ナトリ
ウム、プロピオン酸カリウム、プロピオン酸アンモニウ
ム等、その他の有機塩類としてはシュウ酸塩、酢酸塩
等、糖類としてはソルビトール、グルコース、マンニト
ール等が挙げられる。

【００４２】また、キレート剤は、一般に尿沈渣でよく
観察される無晶性塩類（例えば、リン酸アンモニウム・
マグネシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、尿
酸塩等）を溶解するために用いられる。つまり、キレー
ト剤を添加すると、無晶性塩類を構成する成分が水溶性
のキレート化合物を作って除去される。なお、キレート
剤の添加によっても十分に溶解しない成分（例えば尿酸
塩）がある場合には、さらに希釈及び／又は加温により
溶解することができる。よって、キレート剤としては、
脱カルシウム、脱マグネシウム剤であればよく、例え
ば、EDTA塩，トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,
N',N'-四酢酸・１水和物(CyDTA), ジヒドロキシエチル
グリシン(DHEG), ジアミノプロパノール四酢酸(DPTA-O
H), エチレンジアミン二酢酸(EDDA), エチレンジアミン
二プロピオン酸二塩酸塩(EDDP), グリコールエーテルジ
アミン四酢酸(GEDTA), 1,6-ヘキサメチレンジアミン-N,
N,N',N'-四酢酸(HDTA), ヒドロキシエチルイミノ二酢酸
(HIDA), メチル-EDTA, ニトリロ三酢酸(NTA), ニトリロ
三プロピオン酸(NTP), ニトリロトリスメチレンホスホ
ン酸三ナトリウム塩(NTPO), エチレンジアミン-N,N'-ビ
ス（メチレンホスホン酸）半水和物(EDDPO)等が挙げら
れる。好適には、EDTA塩，CyDTA, GEDTAが用いられる。
キレート剤は、０．０５〜５w/w ％の濃度範囲で使用す
ることができ、好適には０．１〜１w/w ％である。な
お、ここでいう脱カルシウム、脱マグネシウム剤とは、
カルシウム、マグネシウムイオンと結合して、水溶性の
化合物を形成するものを意味する。

【００４３】無晶性塩類は、健常人の尿中にも認められ
るため、これらを分析することの臨床的意義は低い。し
たがって、他の臨床的に意義のある有形成分（赤血球、
白血球、細菌、酵母様真菌、円柱など）を精度よく検出
するためには、無晶性塩類は予め溶解しておくのが好ま
しい。しかし、大きな結晶やシュウ酸カルシウムなどは
キレート剤の添加や加温処理によっても溶解速度が遅
く、短時間では完全には溶解しない。また、シスチン、
ロイシン、チロジン、コレステリン、2,8DHAのような病
的な結晶は、これらの操作によっても溶解しにくい。こ
のため、残った結晶が赤血球領域にオーバーラップし、
赤血球を正確に測定できなくなることがある。そこで、
これらの結晶が、赤血球の測定に影響を与えないように
するため、特に赤血球の蛍光強度を強くすることが好ま
しい。例えば、シアニン系染料、とくにアストラバイオ
レットとナイルレッドとを組み合わせることによって、
緑色光源を用いた場合でも、結晶と赤血球とを弁別する
ことができる。

【００４４】本発明の試薬は、特定の染料、緩衝剤、浸
透圧補償剤及びキレート剤等を含有する１液構成として
もよいが、染料を含有する染色液と、緩衝剤、浸透圧補
償剤及びキレート剤等を含有する希釈液との２液の形態
であってもよい。染色液と希釈液との２液構成とする場
合には、染料は水溶液中で不安定なものが多いため、染
色液として染料を水溶性有機溶媒に溶解させることで保
存安定性を高めることができる。この場合の使用可能な
水溶性有機溶媒としては、低級アルカノール、低級アル
キレングリコールまたは低級アルキレングリコールモノ
低級アルキルエーテルが好ましい。具体的には、メタノ
ール、エタノール、ｎ−プロパノール、エチレングリコ
ール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコー
ル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレン
グリコールモノエチルエーテルなどを使用することがで
きる。中でもメタノール、エタノール、エチレングリコ
ール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール
が好ましく、尿中の細胞への影響や粘性などを考慮する
とエチレングリコール及びエタノール、又はそれらの混
合物がもっとも好ましい。

【００４５】さらに、染色液には、これら染料の安定化
剤を加えてもよい。なお、この場合の安定化剤として
は、当該分野で通常用いられる安定化剤を使用すること
ができる。また、希釈液には、長期保存中の細菌の繁殖
を防止するために抗菌剤を添加してもよい。用いる抗菌
剤の種類は特に制限されず、トリアジン系抗菌剤、ＢＩ
Ｔ（ベンツイソチアゾロン）のようなチアゾール系抗菌
剤、ＰＴＯ（ピリチオン）のようなピリジン系抗菌剤な
どが使用可能であるが、これらの抗菌剤は、測定系に悪
影響を与えない濃度で添加するのがよい。なお、上記安
定化剤や抗菌剤は、１液構成の試薬に添加してもよい。

【００４６】

【実施例】本発明の尿中有形成分の分析方法及び分析試
薬の実施例を以下に説明する。

【００４７】実施例１以下の処方により希釈液及び染色液を調製した。・希釈液緩衝剤 HEPES 50mM NaOH pH7.2 になる量浸透圧補償剤プロピオン酸ナトリウム 220mOsm/kg・H₂O になる量キレート剤 EDTA-3K 0.4W/W％

【００４８】・染色液蛍光染料ブリリアントピンクＢ 2000ppm 溶媒は、エチレングリコールを使用した。

【００４９】尿４００μｌを上記希釈液１１６０μｌで
希釈したのち、上記染色液４０μｌを加え（尿の最終希
釈倍率４倍）、35℃で10秒間染色し、緑色Ｈｅ−Ｎｅレ
ーザを光源とするフローサイトメータで前方散乱光と側
方（９０°）蛍光とを測定した。本実施例では、蛍光は
側方蛍光を測定したが、図１０に示したように、前方蛍
光を測定してもよい。

【００５０】図１に、赤血球（ＲＢＣ）と白血球（ＷＢ
Ｃ）の出現した検体を用いて測定した結果を示す。

【００５１】また、対象として、アルゴンレーザを光源
とするフローサイトメータＵＦ−１００（東亞医用電子
株式会社）を使用し、希釈液及び染色液を以下の処方
（特開平８−１７０９６０号の実施例１に記載の処方）
に従って調製し、同じ検体を、上記と同じ反応条件で反
応させ、前方散乱光と前方蛍光ＴＯを測定した。その結
果を図２に示す。

【００５２】・希釈液緩衝剤 HEPES 50mM NaOH pH7.0 になる量浸透圧補償剤プロピオン酸ナトリウム 150mOsm/kg・H₂O になる量キレート剤 EDTA-3K 0.4W/W％

【００５３】・染色液第１色素ＤｉＯＣ６（３） 400ppm 第２色素エチジウムブロマイド 1600ppm 溶媒は、エチレングリコールを使用した。アルゴンレー
ザを用いたときと同様に、尿中の赤血球と白血球を測定
できることが確認できた。

【００５４】実施例２実施例１の色素をブリリアントピンクＢからロサゼイン
Ｂに変更する以外は実施例１と同様にして、同様の尿検
体を測定した。その結果を図３に示す。図３から明らか
なように、同様に、尿中の赤血球と白血球が測定でき
た。

【００５５】実施例３実施例１の色素をナイルレッドに変更した以外は実施例
１と同様にして、同様の尿検体を測定した。その結果を
図４に示す。図４から明らかなように、同様に、尿中の
赤血球と白血球が測定できた。

【００５６】実施例４以下の処方により希釈液及び染色液を調製した。

【００５７】・希釈液緩衝剤 HEPES 50mM NaOH pH7.0になる量浸透圧補償剤プロピオン酸ナトリウム 210mOsm/kg・H₂O になる量キレート剤 EDTA-3K 0.4W/W ％

【００５８】・染色液蛍光染料アストラバイオレット（シアニン系染料） 800ppm ナイルレッド 40ppm 溶媒は、エタノール（１０w/w ％）＋エチレングリコー
ル（９０w/w ％）であった。

【００５９】実施例１と同様にして、赤血球とシュウ酸
カルシウム結晶とを含む検体を測定した。その結果を図
５に示す。図５から明らかなように、２つの色素を組み
合わせて使用することによって、アストラバイオレット
８００ｐｐｍのみの場合（図６）及びナイルレッド４０
ｐｐｍのみの場合（図７）と比較して、赤血球の蛍光強
度が増加し、赤血球と結晶とを明瞭に弁別することがで
きた。

【００６０】なお、本実施例の試薬を用いて、尿中の有
形成分を測定したときのスキャッタグラムの模式図を図
８に示す。

【００６１】実施例５：従来法との相関実施例４の試薬を用いて白血球、円柱、赤血球、上皮細
胞、細菌を測定した際に得られたデータと、対照として
特開平８−１７０９６０号の実施例１と同様の試薬を用
いて、青色光源（アルゴンレーザ）を光源とするフロー
サイトメータ（ＵＦ−１００、東亞医用電子株式会社）
で測定したデータとの相関関係を調べた。その結果を図
１１〜図１５に示す。なお、図１１は白血球、図１２は
円柱、図１３は赤血球、図１４は上皮細胞、図１５は細
菌を測定した際の相関データである。これらの結果によ
れば、相関係数は０．８９〜０．９７と良好な値を示し
ており、青色光源を用いた場合にかなり近い精度で尿中
有形成分の分析が行えることを確認した。

【００６２】

【発明の効果】本発明の尿中有形成分の分析方法及び分
析用試薬によれば、緑色光源を用いて測定を行うことが
できる。また、緑色光源で励起可能な染料を用いるた
め、青色光源を用いた装置で分析する方法に比較して、
高価なアルゴンレーザーを用いた装置を使用する必要が
なくなるために、装置の低価格化を実現することができ
る。さらに、緑色光源を用いた場合でも、シアニン系色
素とナイルレッドとを組み合わせることによって、赤血
球と結晶とを明瞭に弁別することが可能になり、尿中に
同時に多種の有形成分が出現しても、それらの有形成分
を精度よく弁別することができるようになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１の試薬を用いて、赤血球と白
血球とを含む尿検体の前方散乱光（縦軸）と側方蛍光
（横軸）とを測定した場合のスキャッタグラムを示す。

【図２】本発明の実施例１において、対照としてアルゴ
ンレーザを光源とするフローサイトメータを用いて、赤
血球と白血球とを含む尿検体の前方散乱光（縦軸）と側
方蛍光（横軸）とを測定した場合のスキャッタグラムの
模式図である。

【図３】本発明の実施例２の試薬を用いて、赤血球と白
血球とを含む尿検体の前方散乱光（縦軸）と側方蛍光
（横軸）とを測定した場合のスキャッタグラムを示す。

【図４】本発明の実施例３の試薬を用いて、赤血球と白
血球とを含む尿検体の前方散乱光（縦軸）と側方蛍光
（横軸）とを測定した場合のスキャッタグラムを示す。

【図５】本発明の実施例４において、蛍光色素としてア
ストラバイオレットとナイルレッドとを含有する染色液
を用いて、赤血球とシュウ酸カルシウム結晶とを含む尿
検体の前方散乱光（縦軸）と側方蛍光（横軸）とを測定
した場合のスキャッタグラムを示す。

【図６】本発明の実施例４において、蛍光色素としてア
ストラバイオレットのみを含有する染色液を用いて、赤
血球とシュウ酸カルシウム結晶とを含む尿検体の前方散
乱光（縦軸）と側方蛍光（横軸）とを測定した場合のス
キャッタグラムを示す。

【図７】本発明の実施例４において、蛍光色素としてナ
イルレッドのみを含有する染色液を用いて、赤血球とシ
ュウ酸カルシウム結晶とを含む尿検体の前方散乱光（縦
軸）と側方蛍光（横軸）とを測定した場合のスキャッタ
グラムを示す。

【図８】本発明の実施例４の試薬を用いて、尿中の有形
成分の前方散乱光（縦軸）と側方蛍光（横軸）とを測定
した場合のスキャッタグラムを示す。

【図９】本発明の尿中有形成分分析用試薬を用いて測定
した場合の散乱光パルス幅と蛍光パルス幅との関係を示
すスキャッタグラムを示す。

【図１０】本発明の尿中有形成分分析用試薬を用いて尿
中の有形成分を測定する場合に好適に用いられるフロー
サイトメータの一例を示す概略模式図である。

【図１１】本発明の実施例５において、白血球の相関を
示したデータである。

【図１２】本発明の実施例５において、円柱の相関を示
したデータである。

【図１３】本発明の実施例５において、赤血球の相関を
示したデータである。

【図１４】本発明の実施例５において、上皮細胞の相関
を示したデータである。

【図１５】本発明の実施例５において、細菌の相関を示
したデータである。

【符号の説明】

ＷＢＣ白血球ＲＢＣ赤血球ＹＥＡＳＴ酵母様真菌ＸＴＬシュウ酸カルシウム結晶

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】尿中有形成分を、緑色光源で励起可能な
以下の群：アストラゾンピンクＦＧ、ＮＫ−１０５５、ＮＫ−３
４２、ＮＫ−３４６８及びＮＫ−３４８３からなるスチ
リル系染料、ＮＫ−７３７及びＮＫ−１０４６からなるシアニン系
染料、ブリリアントピンクＢ、エリスロシンＢ、ピロニン
Ｙ、ピロニンＢ、エチルエオシン及びＮＫＸ−１３２５
からなるキサンテン系染料、メロシアニン系染料であるＮＫ−１０５０、ナイルレッド、ベーシックバイオレット４０、ベーシ
ックレッド３６、ロサゼインＢ、ギムサ染料及びベーシ
ックバイオレット２７からなる染料から選択される少なくとも１つの染料で染色し、染色さ
れた尿中有形成分をフローセルに一個ずつ流して緑色の
励起光を照射し、この有形成分からの散乱光と蛍光とを
測定することを特徴とする尿中有形成分の分析方法。
【請求項２】尿中有形成分を、緑色光源で励起可能な
シアニン系染料とナイルレッドとを含む染色液を用いて
染色し、染色された尿中有形成分をフローセルに一個ず
つ流して緑色の励起光を照射し、この有形成分からの散
乱光と蛍光とを測定することを特徴とする尿中有形成分
の分析方法。
【請求項３】緑色光源で励起可能な以下の群：アストラゾンピンクＦＧ、ＮＫ−１０５５、ＮＫ−３
４２、ＮＫ−３４６８及びＮＫ−３４８３からなるスチ
リル系染料、ＮＫ−７３７及びＮＫ−１０４６からなるシアニン系
染料、ブリリアントピンクＢ、エリスロシンＢ、ピロニン
Ｙ、ピロニンＢ、エチルエオシン及びＮＫＸ−１３２５
からなるキサンテン系染料、メロシアニン系染料であるＮＫ−１０５０、ナイルレッド、ベーシックバイオレット４０、ベーシ
ックレッド３６、ロサゼインＢ、ギムサ染料及びベーシ
ックバイオレット２７からなる染料から選択される少なくとも１つの染料を含む尿中有形成
分の分析試薬。
【請求項４】緑色光源で励起可能なシアニン系染料と
ナイルレッドとを含む尿中有形成分の分析試薬。
【請求項５】さらに、pHを5.0〜9.0に保つための緩衝
剤、浸透圧を100mOsm/Kg・H₂O 〜600mOsm/Kg・H₂O に保
つための浸透圧補償剤及びキレート剤の少なくとも１種
以上の成分を含有する請求項３又は４記載の分析試薬。