JPH1070997A

JPH1070997A - タンパク質分解酵素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キット並びに基質の溶解方法

Info

Publication number: JPH1070997A
Application number: JP15639897A
Authority: JP
Inventors: Seizo Uenoyama; 晴三上野山; Kyoichi Oshiro; 京一大代; Masako Nanbu; 昌子南部; Satoshi Fukunaga; 悟志福永
Original assignee: KDK Corp; Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 1998-03-17

Abstract

(57)【要約】【課題】測定精度および再現性に優れ、操作が簡単で
あり、プラスチックセルの損傷のおそれがない尿中トリ
プシン阻害物質の測定方法を提供する。【解決手段】尿試料、トリプシンを含有する酵素液お
よび緩衝液を混合し、これに基質溶液を添加し酵素反応
を生起させて酵素活性を測定することにより尿中トリプ
シン阻害物質を測定する尿中トリプシン阻害物質の測定
方法であって、前記緩衝液として、反応液中のトリプシ
ン１μｇあたり０．１５μｍｏｌ以上かつ前記尿試料１
ｍｌあたり１００μｍｏｌ以下の範囲の濃度でカルシウ
ムを含有するように調製された緩衝液を用い、前記基質
溶液の調製が、基質を有機溶媒に溶解し、この溶液を水
で希釈する際に、前記有機溶媒および水の少なくとも一
方の液に両性界面活性剤および非イオン性界面活性剤の
少なくとも一方の界面活性剤を添加する調製である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質分解酵
素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キット並
びに基質の溶解方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、尿中トリプシンインヒビター（Ｕ
ＴＩ）をはじめとする尿中トリプシン阻害物質が、生体
の状態を表す指標として注目され、臨床医学の分野にお
いて様々な研究がされている。例えば、前記ＵＴＩは、
生体が炎症や外科手術等の内的外的ストレスに晒された
場合に尿中に出現することが知られている（「尿中トリ
プシンインヒビターの臨床的意義」桑島士郎ら、JAPA
NESE JOURNAL OF INFLAMMATION REVIEW ARTICLE，VOL
9，NO．3，MAY 1989)。

【０００３】前記尿中トリプシン阻害物質は、その量に
応じてトリプシン活性を阻害するため、その測定はトリ
プシン活性の阻害程度を測定することにより行われる。
この測定としては、例えば、尿試料、トリプシンを含有
する酵素液および緩衝液を混合し、これに基質溶液を添
加して酵素反応を測定する方法があげられる。

【０００４】この測定において、基質として、ベンゾイ
ル−アルギニン−ｐ-ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）を
用いることができる。しかし、ＢＡＰＮＡは、難溶性で
あるために、この基質溶液は、まず、ＢＡＰＮＡをジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、これを水で約
２倍に希釈して調製される。また、この測定の際に、通
常、トリプシン活性化剤であるカルシウムが使用され、
通常、カルシウムは前記緩衝液中に配合される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
測定方法では、つぎのような問題がある。

【０００６】まず、緩衝液等に配合するカルシウム濃度
が低い場合、最初から尿試料中に存在するカルシウムの
影響を受け、この結果、トリプシンが活性化され、真の
尿中トリプシン阻害物質濃度より低い値となることがあ
る。また、カルシウムを過剰に添加すると、尿中の炭酸
イオンおよびリン酸イオン等と反応して沈殿物を生じ、
測定に影響を与える。これを除去するために、遠心分離
等の前処理をすればよいが、測定操作が煩雑となる。

【０００７】つぎに、ＤＭＳＯなどの有機溶媒は、自動
分析装置一般に使用されるプラスチックセルを傷める恐
れがあり、このため有機溶媒の使用量が制限される。し
たがって、溶解することができる基質量も制限されるこ
ととなり、この結果、測定感度の向上が困難となり、同
時再現性に限界が生じることとなる。さらに、有機溶媒
の使用によりトリプシンの活性が阻害されるおそれがあ
る。また、有機溶媒の使用により、難溶性であるＢＡＰ
ＮＡを溶解させることは可能となるが、未だ充分ではな
く、基質溶液を長期間保存したり冷蔵保存すると、ＢＡ
ＰＮＡが結晶析出するおそれがある。このため、従来の
測定方法では、ＢＡＰＮＡ等の難溶性基質を有機溶媒を
用いて使用する場合、測定毎に基質溶液を調製し、その
後直ちに測定に供する必要があった。

【０００８】そこで、本発明の目的は、測定精度および
同時再現性に優れ、操作が簡単であり、しかもプラスチ
ックセルの損傷のおそれがないタンパク質分解酵素阻害
物質の測定方法およびそれに用いる測定キット並びに基
質の溶解方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明のタンパク質分解酵素阻害物質の測定方法
は、試料、タンパク質分解酵素、カルシウムおよび基質
を配合して混合し、前記酵素の酵素活性を測定すること
により前記試料中のタンパク質分解酵素阻害物質を測定
する方法であって、前記カルシウムの割合が、前記酵素
１μｇあたり０．１５μｍｏｌ以上かつ前記試料１ｍＬ
あたり１００μｍｏｌ以下の範囲であり、前記基質の配
合方法が、前記基質を有機溶媒に溶解し、この溶液を水
で希釈して基質溶液を調製し、この基質溶液を配合する
方法であって、前記希釈の際に、前記有機溶媒および水
の少なくとも一方の液に両性界面活性剤および非イオン
性界面活性剤の少なくとも一方の界面活性剤を添加する
方法である。

【００１０】このように、本発明の測定方法では、カル
シウムの割合を特定し、かつ基質の配合の際に有機溶媒
を使用するとともに特定の界面活性剤を使用する。すな
わち、例えば、反応液中のカルシウム含量がトリプシン
１μｇあたり０．１５μｍｏｌ以上であれば、トリプシ
ンの活性が一定になるため、尿中に存在するカルシウム
の影響を受けるおそれがなくなる。また、反応液中のカ
ルシウム含量が尿試料１ｍｌあたり１００μｍｏｌ以下
であれば、沈殿物を生じることがなく、測定に悪影響を
及ぼすおそれがなくなり、また遠心分離等の煩雑な操作
が省略可能となる。そして、前記特定の界面活性剤の使
用により、ＤＭＳＯ等の有機溶媒の使用量を少なくし、
かつＢＡＰＮＡ等の難溶性の基質を充分量使用すること
が可能となる。この結果、有機溶媒の量が少ないことか
らプラスチックセルの損傷が防止され、また充分量の基
質を使用できることから、測定精度が向上し同時再現性
が改善されるようになる。また、特定の界面活性剤の使
用により、基質の溶解性も改善されて結晶析出が防止さ
れる。

【００１１】本発明の測定方法では、基質溶液の調製に
おいて、水に代えて、緩衝液を用いてもよく、また有機
溶媒は、ＤＭＳＯを使用することが好ましい。

【００１２】本発明の測定方法において、タンパク質分
解酵素がトリプシンであり、基質が前記式（化１）で表
される基質であることが好ましい。前記基質としては、
特に、α-ベンゾイル−アルギニン−ｐ-ニトロアニリド
が好ましい。しかし、この他に、基質として、例えば、
α-ベンゾイル−リジン−ｐ-ニトロアニリド、ｔ-ブト
キシカルボニル−アルギニン−ｐ-ニトロアニリド、ｔ-
ブトキシカルボニル−リジン−ｐ-ニトロアニリドを使
用することもできる。また、この場合、試料が尿試料で
あり、タンパク質分解酵素阻害物質が尿中トリプシン阻
害物質であることが好ましい。

【００１３】本発明の測定方法において、界面活性剤
は、ベタイン型両性界面活性剤であることが好ましい。

【００１４】本発明の測定方法において、両性界面活性
剤としては、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−１−プロパンスルホン酸および３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２
−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸の少なくとも一
方の両性界面活性剤であることが好ましい。

【００１５】本発明の測定方法において、非イオン性界
面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレー
ト、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、ポ
リオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシ
エチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキ
シエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル、パーフルオロアルキルポリオキシ
エチレンエタノール、フッ化アルキルエステル、ポリエ
チレングリコールモノ−ｐ−ノニルフェニルエーテル、
ポリオキシエチレン（３０）オクチルフェニルエーテ
ル、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）
デオキシコラミド、ｎ−オクチル−β−ｄ−チオグルコ
シドおよびスクロースモノラウレートからなる群から選
択された少なくとも一つの非イオン性界面活性剤が好ま
しい。前記ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル
としては、例えば、ノイゲンＥＡ−８０、ノイゲンＥＡ
−１２０およびノイゲンＥＡ−１４０（全て第一工業製
薬社製）があげられる。前記ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテルとしては、例えば、ソフタノール７０、ソフ
タノール９０およびソフタノール１２０（全て日本触媒
社製）があげられる。前記パーフルオロアルキルポリオ
キシエチレンエタノールとしては、例えば、フロラード
ＦＣ−１７０Ｃ（３Ｍ社製）があげられ、前記フッ化ア
ルキルエステルとしては、例えば、フロラードＦＣ−４
３０（３Ｍ社製）があげられる。前記ポリオキシエチレ
ン（３０）オクチルフェニルエーテルとしては、例え
ば、ＴＲＩＴＯＮＸ−３０５（ナカライテスク社製）
があげられる。

【００１６】本発明の測定方法において、基質溶液の各
組成の割合は、基質溶液全体に対し、基質濃度１〜５０
ｍｍｏｌ／Ｌ、有機溶媒濃度１〜５０重量％、界面活性
剤濃度０．１〜５重量％であることが好ましい。

【００１７】つぎに、本発明のタンパク質分解酵素阻害
物質の測定キットは、タンパク質分解酵素、基質および
カルシウムを備えたタンパク質分解酵素阻害物質の測定
キットであって、前記カルシウムの割合が、前記酵素１
μｇ当たり０．１５μｍｏｌ以上かつ試料１ｍｌあたり
１００μｍｏｌ以下の範囲であり、前記基質が溶液に溶
解されており、この溶液が、有機溶媒および界面活性剤
を含有し、前記界面活性剤が両性界面活性剤および非イ
オン性界面活性剤の少なくとも一方の界面活性剤であ
る。

【００１８】この測定キットを使用することにより、優
れた測定精度および同時再現性で、プラスチックセルの
損傷のおそれがなくタンパク質分解酵素阻害物質を簡単
に測定できる。

【００１９】本発明の測定キットにおいて、前記基質を
溶解した溶液は、基質を有機溶媒に溶解し、これを水で
希釈して調製された溶液であり、前記有機溶媒および水
の少なくとも一方の液に界面活性剤が配合されたもので
あることが好ましい。

【００２０】本発明の測定キットにおいて、タンパク質
分解酵素、基質、カルシウムおよび試料を配合して反応
液を調製した場合、この反応液のｐＨが５〜９の範囲で
あり、前記反応液中の前記酵素濃度が５〜２５０ｍｇ／
Ｌの範囲であり、前記反応液中の基質濃度が０．５〜２
５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましい。

【００２１】本発明の測定キットにおいて、有機溶媒と
してＤＭＳＯが使用され、また、基質として、前記式
（化２）に表される基質を使用することが好ましい。前
記基質としては、特に、α-ベンゾイル−アルギニン−
ｐ-ニトロアニリドが好ましい。

【００２２】本発明の測定キットにおいて、界面活性剤
として好ましいものは、前述した本発明の測定方法であ
げたものと同様である。

【００２３】本発明の測定キットの好ましい態様は、下
記のＲ１の緩衝液、Ｒ２の酵素液およびＲ３の基質溶液
を備え、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の三者の体積割合が、Ｒ
１：Ｒ２：Ｒ３＝３０〜９０：５〜４０：５〜３０の範
囲に設定されていることである。（Ｒ１）前記酵素１μｇあたり０．１５μｍｏｌ以上
かつ尿試料１ｍｌあたり１００μｍｏｌ以下の範囲でカ
ルシウムを含有するように調製した緩衝液。（Ｒ２）タンパク質分解酵素を含有する酵素液。（Ｒ３）基質、有機溶媒および界面活性剤を含有する
基質溶液であって、前記界面活性剤が両性界面活性剤お
よび非イオン性界面活性剤の少なくとも一方の界面活性
剤である基質溶液。

【００２４】なお、本発明の測定キットにおいて、カル
シウムは、前記所定の濃度であれば前記緩衝液Ｒ１の代
わりに、前記酵素液Ｒ２、前記基質溶液Ｒ３に含まれて
いてもよい。また、前記緩衝液Ｒ１と前記酵素液Ｒ２、
前記緩衝液Ｒ１と前記基質溶液Ｒ３、前記酵素液Ｒ２と
前記基質溶液Ｒ３、前記緩衝液Ｒ１と前記酵素液Ｒ２と
前記基質溶液Ｒ３に分けてカルシウムが前記所定濃度で
含まれていてもよい。そして、本発明の測定キットにお
いて、前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して
いてもよく、前記三種類の液のうちいずれか二種類の液
の混合液と他の一種の液との組み合わせであってもよ
い。具体的には下記の三通りの組み合わせがある。（１）Ｒ１とＲ２との混合液＋Ｒ３（２）Ｒ１とＲ３との混合液＋Ｒ２（３）Ｒ２とＲ３との混合液＋Ｒ１

【００２５】なお、上記組み合わせ（３）において、例
えば、ｐＨの調整等により酵素反応を制御すれば、酵素
と基質とを混合することができる。

【００２６】つぎに、本発明の基質の溶解方法は、基質
を有機溶媒に溶解し、この溶液を水で希釈する基質の溶
解方法であって、前記有機溶媒および水の少なくとも一
方の液に、両性界面活性剤および非イオン性界面活性剤
の少なくとも一方の界面活性剤を添加する方法である。

【００２７】本発明の基質の溶解方法は、前記タンパク
質分解酵素の基質に限らず、様々な種類の基質の溶解に
適用できる。

【００２８】この基質の溶解方法において、前述と同様
に、水に代えて、緩衝液を用いてもよく、また、有機溶
媒としては、ＤＭＳＯを使用することが好ましい。

【００２９】本発明の基質の溶解方法において、好まし
く用いられる基質および界面活性剤は、前述と同様であ
る。

【００３０】本発明の基質の溶解方法において、基質溶
液全体に対し、基質濃度が１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、有機
溶媒濃度が１〜５０重量％、界面活性剤濃度が０．１〜
５重量％であることが好ましい。

【００３１】

【発明の実施の形態】つぎに、本発明を詳しく説明す
る。

【００３２】本発明のタンパク質分解酵素阻害物質の測
定方法は、例えば、タンパク質分解酵素液と、有機溶媒
および特定の界面活性剤を用いて調製された基質溶液
と、カルシウム濃度が特定の範囲の緩衝液とを用いて実
施できる。

【００３３】前記酵素としては、例えば、トリプシンが
あげられる。このトリプシンは、特に限定するものでな
く、例えば、牛膵臓由来のトリプシン、ブタ膵臓由来の
トリプシンがあげられる。また、トリプシン濃度は、そ
の比活性等により適宜決定されれるが、酵素液全体に対
し、通常、１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜１
００ｍｇ／Ｌである。また、この酵素液は、トリプシン
の自己消化を防止する目的で、塩酸または緩衝液により
ｐＨ２．０〜３．０に調整してもよい。

【００３４】なお、トリプシン以外のタンパク質分解酵
素としては、例えば、キモトリプシンがあげられる。そ
して、キモトリプシンに使用する基質としては、例え
ば、ベンゾイル−チロシン−ｐ-ニトロアニリドがあげ
られる。

【００３５】つぎに、前記基質溶液の界面活性剤は、先
に述べたように、両性界面活性剤および非イオン性界面
活性剤の少なくとも一方である。また、好ましい界面活
性剤も先に述べたとおりであるが、本発明の効果がさら
に優れたものになるという理由から、特に好ましくは、
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］
−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）および３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２
−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ
Ｏ）の両性スルホベタイン型のものである。本発明にお
いて、前述の界面活性剤は、単独で用いてもよく、若し
くは２種類以上で併用してもよい。

【００３６】また、この基質溶液の基質としては、先に
述べたように、前記式（化１）で表される基質が好まし
く、特に好ましくは、前記α-ベンゾイル−アルギニン
−ｐ-ニトロアニリド等があげられる。

【００３７】また、前記有機溶媒としては、先にあげた
ＤＭＳＯの他に、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）があげられる。

【００３８】本発明において、基質を溶解した有機溶媒
を水若しくは緩衝液で希釈するが、この希釈の際、水若
しくは緩衝液のどちらを用いるか、またはどのような種
類の緩衝液を用いるかは、測定の条件等により適宜選択
される。前記緩衝液としては、例えば、トリエタノール
アミン塩酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液
等があげられる。これらの緩衝液のｐＨは、酵素の種類
等により適宜決定される。

【００３９】本発明の基質溶液の調製は、例えば、以下
のようにして行われる。すなわち、まず、基質を有機溶
媒に溶解する。この場合の濃度は、通常、ＤＭＳＯ１ｍ
ｌに対し、１〜５０ｍｇの範囲である。他方、前記特定
の界面活性剤を水若しくは緩衝液に溶解し、界面活性剤
溶液を調製する。この場合の濃度は、用いる界面活性剤
の種類等により適宜決定するが、通常、水または緩衝液
に対し、０．１〜５重量％の範囲である。そして、前記
有機溶媒を、前記界面活性剤溶液で希釈することによ
り、基質溶液を調製する。この希釈倍率は、通常、２〜
２０倍、好ましくは１０〜２０倍である。なお、界面活
性剤は、通常、水若しくは緩衝液に配合するが、有機溶
媒に配合してもよい。

【００４０】つぎに、この例では、カルシウムは緩衝液
に含有されており、その割合は、先に述べた範囲である
が、好ましくは、前記酵素１μｇあたりカルシウムが
０．２μｍｏｌ以上であり、試料１ｍｌあたりカルシウ
ムが５０μｍｏｌ以下である。この緩衝液のｐＨは、酵
素反応液の前記ｐＨになるような範囲であればよく、好
ましくは、ｐＨが７〜８である。また、この緩衝液の種
類としては、例えば、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等
があげられる。この緩衝液は、常法により調製される。

【００４１】つぎに、本発明の測定方法は、例えば、尿
中トリプシン阻害物質を測定対象とした場合、つぎのよ
うにして行われる。

【００４２】すなわち、まず、尿試料、緩衝液および酵
素液の三者を混合する。この割合（体積比）は、通常、
尿試料：緩衝液：酵素液＝１：５〜１０：２〜５の範囲
に設定される。ついで、これをインキュベーションす
る。このインキュベーションの条件は、通常、２５〜３
７℃で１〜５分間である。そして、これに、前記基質溶
液を配合し、前記酵素と基質を反応させる。この配合割
合は、通常、全反応液に対し、体積比５〜３０％の範囲
である。この反応条件は、通常、２５〜３７℃で１〜１
０分間である。また、このときの反応液のｐＨは、酵素
の種類等により異なるが、この例のトリプシンの場合、
ｐＨ７〜８の範囲である。そして、所定の方法により、
酵素反応を検出し、酵素活性を測定する。この反応にお
いて、前記尿試料中のトリプシン阻害物質の量に応じ、
酵素反応が阻害される。したがって、予め、既知の尿中
トリプシン阻害物質を用いて検量線を作成しておけば、
酵素活性の測定により、尿中トリプシン阻害物質の量を
測定することができる。前記酵素反応の検出方法として
は、例えば、基質として酵素反応が起れば発色するもの
を用いた場合は、この発色の程度を分光光度計等により
測定する方法があげられる。この他に、反応生成物の濃
度を測定することにより、酵素活性を測定することもで
きる。

【００４３】つぎに、本発明の測定キットは、例えば、
前記Ｒ１の緩衝液、前記Ｒ２の酵素液および前記Ｒ３の
基質溶液を備えるものがあげられる。これらの試薬（Ｒ
１，Ｒ２，Ｒ３）の調製は、本発明の測定方法の説明に
おいて述べた方法により行うことができ、また各組成お
よびその割合等は先に述べたとおりである。この測定キ
ットを用いることにより、尿中トリプシン阻害物質等の
タンパク質分解酵素阻害物質の測定を簡便にかつ迅速に
行うことができる。

【００４４】つぎに、本発明の基質の溶解方法におい
て、その対象となる基質は、前記基質の他に、例えば、
Ｚ−グリシン−グリシン−ロイシン−ｐ−ニトロアニリ
ド、サクシニル−アラニン−アラニン−アラニン−ｐ−
ニトロアニリドがあげられる。また、本発明の基質の溶
解方法の対象となる酵素は、特に限定されず、例えば、
トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ズブチリ
シン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、カテプ
シンＢ、エンドペプチターゼ、ウロキナーゼがあげられ
る。

【００４５】本発明の基質の溶解方法の実施方法やその
条件等は、前記測定方法において述べたのと同様であ
る。

【００４６】

【実施例】つぎに、実施例について説明する。

【００４７】（実施例１）以下に示すようにして、Ｒ１
の緩衝液、Ｒ２の酵素液およびＲ３の基質溶液を調製し
た。

【００４８】（Ｒ１の緩衝液）下記の成分を下記に示す
割合で精製水に配合して常法により緩衝液（ｐＨ７．
８）を調製した。トリエタノールアミン塩酸塩０．２ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ₂ ０．００３ｍｏｌ／Ｌ

【００４９】（Ｒ２の酵素液）下記の成分を下記の割合
で配合して常法により酵素液を調製した。牛膵臓由来トリプシン５０ｍｇ／Ｌ（ＴＹＰＥIII 10000〜13000BAEEunits／mg，シグマ社製）塩酸１．２ｍｍｏｌ／Ｌ

【００５０】（Ｒ３の基質溶液）必要量のＢＡＰＮＡを
ＤＭＳＯに溶解し、これを所定の界面活性剤濃度の水溶
液で１０倍に希釈して４種類の基質溶液（ａ〜ｄ）を調
製した。また、対照として、界面活性剤を配合せず、こ
れ以外は上記と同様にして基質溶液を調製した。これら
の組成を以下に示す。

【００５１】基質溶液（ａ）ＢＡＰＮＡ５００ｍｇＤＭＳＯ１０ｍｌＣＨＡＰＳＯ２．６ｇ精製水９０ｍｌ

【００５２】基質溶液（ｂ）ＢＡＰＮＡ５００ｍｇＤＭＳＯ１０ｍｌＣＨＡＰＳＯ１．３ｇ精製水９０ｍｌ

【００５３】基質溶液（ｃ）ＢＡＰＮＡ５００ｍｇＤＭＳＯ１０ｍｌＣＨＡＰＳ２．６ｇ精製水９０ｍｌ

【００５４】基質溶液（ｄ）ＢＡＰＮＡ５００ｍｇＤＭＳＯ１０ｍｌＣＨＡＰＳ１．３ｇ精製水９０ｍｌ

【００５５】基質溶液（対照）ＢＡＰＮＡ５００ｍｇＤＭＳＯ５０ｍｌ精製水５０ｍｌ

【００５６】他方、尿中トリプシンインヒビター（ＵＴ
Ｉ，ミラクリッド、持田製薬社製）の水溶液として、０
Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌおよび２００Ｕ／ｍｌの３種
類の濃度のものを用意し、これを試料とした。

【００５７】つぎに、前記試料０．１４ｍｌ、緩衝液
（Ｒ１）１．８ｍｌおよび酵素液（Ｒ２）０．４８ｍｌ
を混合し、３７℃で１分間保温した後、前記基質溶液
（Ｒ３）０．５８ｍｌを添加して、反応を開始した。そ
して、３７℃に保温して１００秒間の吸光度（４０５ｎ
ｍ）変化を分光光度計で測定し、相対吸光度（△Ｏ．
Ｄ．）を求め、図１のグラフに示すような検量線を作成
した。

【００５８】これらの結果より、基質溶液の調製の際
に、特定の界面活性剤を使用すると、トリプシンの酵素
活性が向上することがわかる。しかも、界面活性剤の配
合量を多くしたほうが、酵素活性もより向上した。

【００５９】また、この実施例の基質溶液の調製におい
て、特定の界面活性剤を用いたことにより、ＤＭＳＯの
使用量を減少させることができ、また充分量の基質を溶
解させることができ、さらに基質の結晶析出も防止でき
た。

【００６０】（実施例２）５人の健常者（Ａ，Ｂ，Ｃ，
Ｄ，Ｅ）から採取した尿を尿試料とし、実施例１と同じ
Ｒ１の緩衝液、Ｒ２の酵素液およびＲ３の基質溶液
（ａ）を用い、実施例１と同様にして、ＵＴＩの測定を
３回行い、実施例１で作製した検量線によりＵＴＩ量を
求めた。その結果を下記の表１に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】上記表１から、この測定により信頼のおけ
るＵＴＩ量の値が得られたことがわかる。また、この測
定において、沈殿が生じるなどの支障はなかった。

【００６３】（実施例３）界面活性剤として、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチ
ンレソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２
３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セ
チルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル、ソフタノール７０（日本触媒社製）、
ソフタノール９０（日本触媒社製）、ソフタノール１２
０（日本触媒社製）、ノイゲンＥＡ−８０（第一工業製
薬社製）、ノイゲンＥＡ−１２０（第一工業製薬社
製）、ノイゲンＥＡ−１４０（第一工業製薬社製）、フ
ロラードＦＣ−１７０Ｃ（３Ｍ社製）、フロラードＦＣ
−４３０（３Ｍ社製）、ポリエチレングリコールモノ−
ｐ−ノニルフェニルエーテル、ＴＲＩＴＯＮＸ−３０
５（ナカライテスク社製）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グ
ルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクチ
ル−β−ｄ−チオグルコシドおよびスクロースモノラウ
レートをそれぞれ用い、１８種類の各基質溶液を前記実
施例と同様にして調製した。なお、基質溶液の組成は以
下のとおりである。

【００６４】ＢＡＰＮＡ５００ｍｇＤＭＳＯ１０ｍｌ界面活性剤２．６ｇ精製水９０ｍｌ

【００６５】つぎに、前記各基質溶液について、基質の
溶解性を調べた。すなわち、調製後２４時間４℃の条件
で前記各基質溶液を放置したところ、基質の結晶析出は
生じなかった。この結果から、前記各種の非イオン性界
面活性剤を用いても、低濃度のＤＭＳＯで充分量の基質
を溶解できることがわかる。なお、この実施例におい
て、非イオン性界面活性剤を添加しない対照実験を行っ
たところ、ＢＡＰＮＡの結晶析出が生じた。

【００６６】つぎに、このようにして作製した、基質溶
液のなかで、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシ
エチンレソルビタンモノラウレートを用いたものをＲ３
の基質溶液とした。そして、実施例１と同様にして検量
線を作成した後、実施例２と同様にして、人から採取し
た尿について、ＵＴＩ量を測定した。この結果、ＵＴＩ
量は、２９．０（Ｕ／ｍｌ）であった。この測定におい
て、沈殿の発生はなく、また得られたＵＴＩ量も信頼の
置ける値であった。

【００６７】

【発明の効果】以上のように、本発明のタンパク質分解
酵素阻害物質の測定方法によれば、測定精度および同時
再現性に優れ、操作が簡単であり、しかもプラスチック
セルの損傷のおそれがない。すなわち、カルシウム濃度
を特定していることから、真の値より低い値がでること
がなく、反応液において測定誤差の原因となる沈殿が生
じることがない。また、特定の界面活性剤の使用によ
り、トリプシン等の酵素活性に悪影響を及ぼす有機溶媒
の使用量を低減させることができ、また充分量の基質を
添加することができ、さらにトリプシン等の酵素活性が
従来より高くなるため、測定感度が向上し、同時再現性
が改善される。また、沈殿が生じないことから遠心分離
等の前処理の必要がなく、基質の溶解性が改善されてい
ることから、一度に大量の基質溶液を調製でき、従来の
ように測定の度に調製していたのに比べ、操作が簡単に
なる。また、本発明の測定キットを用いれば、各試薬の
調製の手間が省略でき、簡単に短時間で測定ができるよ
うになる。そして、本発明の基質の溶解方法は、トリプ
シン等のタンパク質分解酵素の基質に限らず、様々な種
類の基質に対しても適用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例におけるＵＴＩの検量線のグ
ラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者福永悟志京都府京都市南区東九条西明田町57番地株式会社京都第一科学内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料、タンパク質分解酵素、カルシウム
および基質を配合して混合し、前記酵素の酵素活性を測
定することにより前記試料中のタンパク質分解酵素阻害
物質を測定する方法であって、前記カルシウムの割合
が、前記酵素１μｇあたり０．１５μｍｏｌ以上かつ前
記試料１ｍＬあたり１００μｍｏｌ以下の範囲であり、
前記基質の配合方法が、前記基質を有機溶媒に溶解し、
この溶液を水で希釈して基質溶液を調製し、この基質溶
液を配合する方法であって、前記希釈の際に、前記有機
溶媒および水の少なくとも一方の液に両性界面活性剤お
よび非イオン性界面活性剤の少なくとも一方の界面活性
剤を添加する方法であるタンパク質分解酵素阻害物質の
測定方法。
【請求項２】基質溶液の調製において、水に代えて緩
衝液を用いる請求項１記載の測定方法。
【請求項３】基質溶液の調製に用いる有機溶媒が、ジ
メチルスルホキシドである請求項１または２記載の測定
方法。
【請求項４】タンパク質分解酵素がトリプシンであ
り、基質が下記の式（化１）で表される基質である請求
項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。【化１】保護基−（アミノ酸残基）_n−ｐ-ニトロアニリ
ド［前記式において、ｎは１〜５の整数である。］
【請求項５】基質がα-ベンゾイル−アルギニン−ｐ-
ニトロアニリドである請求項４記載の測定方法。
【請求項６】試料が尿試料であり、タンパク質分解酵
素阻害物質が尿中トリプシン阻害物質である請求項４ま
たは５記載の測定方法。
【請求項７】界面活性剤が、ベタイン型両性界面活性
剤である請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定方
法。
【請求項８】両性界面活性剤が、３−［（３−コラミ
ドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスル
ホン酸および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン
酸の少なくとも一方の両性界面活性剤である請求項１〜
７のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項９】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２３）
ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチル
エーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニ
ルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、パーフルオ
ロアルキルポリオキシエチレンエタノール、フッ化アル
キルエステル、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−ノニ
ルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）オク
チルフェニルエーテル、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコ
ンアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクチル−
β−ｄ−チオグルコシドおよびスクロースモノラウレー
トからなる群から選択された少なくとも一つの非イオン
性界面活性剤である請求項１〜８のいずれか一項に記載
の測定方法。
【請求項１０】基質溶液の各組成の割合が、基質溶液
全体に対し、基質濃度１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、有機溶媒
濃度１〜５０重量％、界面活性剤濃度０．１〜５重量％
である請求項１〜９のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１１】タンパク質分解酵素、基質およびカル
シウムを備えたタンパク質分解酵素阻害物質の測定キッ
トであって、前記カルシウムの割合が、前記酵素１μｇ
当たり０．１５μｍｏｌ以上かつ試料１ｍｌあたり１０
０μｍｏｌ以下の範囲であり、前記基質が溶液に溶解さ
れており、この溶液が、有機溶媒および界面活性剤を含
有し、前記界面活性剤が両性界面活性剤および非イオン
性界面活性剤の少なくとも一方の界面活性剤であるタン
パク質分解酵素阻害物質の測定キット。
【請求項１２】基質を溶解した溶液が、基質を有機溶
媒に溶解し、これを水で希釈して調製された溶液であ
り、前記有機溶媒および水の少なくとも一方の液に界面
活性剤が配合された請求項１１記載の測定キット。
【請求項１３】タンパク質分解酵素、基質、カルシウ
ムおよび試料を配合して反応液を調製した場合、この反
応液のｐＨが５〜９の範囲であり、前記反応液中の前記
酵素濃度が５〜２５０ｍｇ／Ｌの範囲であり、前記反応
液中の基質濃度が０．５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であ
る請求項１１または１２記載の測定キット。
【請求項１４】基質を溶解した溶液の有機溶媒がジメ
チルスルホキシドである請求項１１〜１３のいずれか一
項に記載の測定キット。
【請求項１５】タンパク質分解酵素がトリプシンであ
り、基質が下記の式（化２）で表される基質である請求
項１１〜１４のいずれか一項に記載の測定キット。【化２】保護基−（アミノ酸残基）_n−ｐ-ニトロアニリ
ド［前記式において、ｎは１〜５の整数である。］
【請求項１６】基質がα-ベンゾイル−アルギニン−
ｐ-ニトロアニリドである請求項１５記載の測定キッ
ト。
【請求項１７】基質を溶解した溶液の界面活性剤が、
ベタイン型両性界面活性剤である請求項１１〜１６のい
ずれか一項に記載の測定キット。
【請求項１８】基質を溶解した溶液の両性界面活性剤
が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニ
オ］−１−プロパンスルホン酸および３−［（３−コラ
ミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ
−１−プロパンスルホン酸の少なくとも一方の両性界面
活性剤である請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の
測定キット。
【請求項１９】基質を溶解した溶液の非イオン性界面
活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
ト、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリ
オキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシ
エチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン
（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル、パーフルオロアルキルポリオキシエチレン
エタノール、フッ化アルキルエステル、ポリエチレング
リコールモノ−ｐ−ノニルフェニルエーテル、ポリオキ
シエチレン（３０）オクチルフェニルエーテル、Ｎ，Ｎ
−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコ
ラミド、ｎ−オクチル−β−ｄ−チオグルコシドおよび
スクロースモノラウレートからなる群から選択された少
なくとも一つの非イオン性界面活性剤である請求項１１
〜１８のいずれか一項に記載の測定キット。
【請求項２０】下記のＲ１の緩衝液、Ｒ２の酵素液お
よびＲ３の基質溶液を備え、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の三
者の体積割合が、Ｒ１：Ｒ２：Ｒ３＝３０〜９０：５〜
４０：５〜３０の範囲に設定されている請求項１１〜１
９のいずれか一項に記載の測定キット。（Ｒ１）前記酵素１μｇあたり０．１５μｍｏｌ以上
かつ試料１ｍｌあたり１００μｍｏｌ以下の範囲でカル
シウムを含有するように調製した緩衝液。（Ｒ２）タンパク質分解酵素を含有する酵素液。（Ｒ３）基質、有機溶媒および界面活性剤を含有する
基質溶液であって、前記界面活性剤が両性界面活性剤お
よび非イオン性界面活性剤の少なくとも一方の界面活性
剤である基質溶液。
【請求項２１】基質を有機溶媒に溶解し、この溶液を
水で希釈する基質の溶解方法であって、前記有機溶媒お
よび水の少なくとも一方の液に、両性界面活性剤および
非イオン性界面活性剤の少なくとも一方の界面活性剤を
添加する基質の溶解方法。
【請求項２２】水に代えて、緩衝液を用いて希釈する
請求項２１記載の基質の溶解方法。
【請求項２３】有機溶媒が、ジメチルスルホキシドで
ある請求項２１または２２記載の基質の溶解方法。
【請求項２４】基質が下記の式（化３）で表される基
質である請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の基質
の溶解方法。【化３】保護基−（アミノ酸残基）_n−ｐ-ニトロアニリ
ド［前記式において、ｎは１〜５の整数である。］
【請求項２５】界面活性剤が、ベタイン型両性界面活
性剤である請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の基
質の溶解方法。
【請求項２６】両性界面活性剤が、３−［（３−コラ
ミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンス
ルホン酸および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホ
ン酸の少なくとも一方の両性界面活性剤である請求項２
１〜２５のいずれか一項に記載の基質の溶解方法。
【請求項２７】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２
３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セ
チルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、パーフ
ルオロアルキルポリオキシエチレンエタノール、フッ化
アルキルエステル、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−
ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）
オクチルフェニルエーテル、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グ
ルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクチ
ル−β−ｄ−チオグルコシドおよびスクロースモノラウ
レートからなる群から選択された少なくとも一つの非イ
オン性界面活性剤である請求項２１〜２６のいずれか一
項に記載の基質の溶解方法。
【請求項２８】基質溶液全体に対し、基質濃度が１〜
５０ｍｍｏｌ／Ｌ、有機溶媒濃度が１〜５０重量％、界
面活性剤濃度が０．１〜５重量％である請求項２１〜２
７のいずれか一項に記載の基質の溶解方法。