JP3059433B2 - 尿中トリプシンインヒビタ―の測定方法およびそれに用いる測定キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、尿中トリプシンイ
ンヒビターの測定方法およびそれに用いる測定キットに
関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、尿中トリプシンインヒビター（Ｕ
ＴＩ）が、生体の状態を表わす指標として注目され、臨
床医学の分野において様々な研究がされている。ＵＴＩ
は、例えば、生体が炎症や外科手術等の内的および外的
ストレスに晒された場合や感染症に罹った場合に、尿中
に出現することが知られている（「尿中トリプシンイン
ヒビターの臨床的意義」、桑島士郎ら、JAPANESE JOURN
AL OF INFLAMMATION REVIEW ARTICLE，VOL9，NO．3，MA
Y 1989）。なお、ＵＴＩは、最初、尿中でその存在が確
認されたが、その後の研究により、血液等の他の体液中
にも存在することが明らかになっている。

【０００３】ＵＴＩは、その量に応じてトリプシン活性
を阻害するため、その測定は、トリプシン活性の阻害程
度を測定することによって行われる。一般的には、試
料、緩衝液およびトリプシンを含有する酵素液を混合
し、これに基質溶液を添加して、酵素反応を測定するこ
とにより、試料中のＵＴＩによるトリプシン活性の阻害
程度を測定する。通常、この測定において、トリプシン
活性化剤であるカルシウムが、前記緩衝液に配合され
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、ＵＴＩ
は、生体の状態を表わす指標としてその重要性が指摘さ
れているものの、疾患特異性が低いという問題がある。

【０００５】例えば、本発明者らが、炎症の代表的な指
標であるＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）を用い、尿中のＵ
ＴＩ量と炎症との相関関係を調べたところ、ＣＲＰが陰
性であるにもかかわらず、ＵＴＩの測定値が高くなる場
合があることが分かった。このＵＴＩ測定値が高い尿試
料をさらに調べたところ、これらの試料の大半におい
て、腎症の指標であるアルブミンが陽性であった。この
ことは、ＵＴＩが、炎症だけでなく、腎症の場合にも尿
中に増加することを意味し、これではＵＴＩを炎症の特
異的指標若しくは腎症の特異的指標として用いることが
できない。

【０００６】さらに、本発明者らの研究結果によると、
従来のＵＴＩの測定方法では、尿中に存在するＵＴＩ量
を正確に測定できていないということも分かった。

【０００７】そこで、本発明の目的は、生体の状態を表
わす指標としてのＵＴＩの臨床的有用性を高めることが
でき、かつ正確にＵＴＩ量を測定できるＵＴＩの測定方
法およびそれに用いる測定キットを提供することであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明のＵＴＩの測定方法（方法Ａ）は、尿試料中
の尿中トリプシンインヒビターの量を測定する方法であ
って、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を有することを特徴
とする。 （ａ）尿試料にトリプシン以外のプロテアーゼを添加
し、前記プロテアーゼと 前記尿試料中のα１−アンチト
リプシンとを反応させて複合体を形成させ ることによ
り、前記α１−アンチトリプシンを不活性化する工程。 （ｂ）前記不活性化の後、尿試料とトリプシンとを混合
する工程。 （ｃ）前記トリプシンの活性の阻害を測定する工程。 （ｄ）前記阻害から尿試料中の尿中トリプシンインヒビ
ターの量を決定する工程。

【０００９】本発明者らは、前述の調査結果をさらに綿
密に検討し、研究を続けた結果、腎症において、従来の
測定方法によるＵＴＩの測定値が高くなるのは、血液中
のα１−ＡＴが尿中に漏出することが原因であることを
突き止めた。腎症において、アルブミンのような腎前性
タンパク質が尿中に出現するのは、腎糸球体基底膜のバ
リヤー機能が低下するためである。また、α１−ＡＴ
は、ＵＴＩと同様にトリプシン活性阻害機能を有し、血
液中に多量に含まれ（血液中におけるトリプシン阻害物
質の約９０％を占める）、その分子量や等電点がアルブ
ミンと類似している。したがって、腎症であれば、アル
ブミンと共に、血液中のα１−ＡＴも尿中に漏出するは
ずである。このため、従来の測定方法では、ＵＴＩのト
リプシン活性阻害に加え、血液中から尿中に漏出したα
１−ＡＴのトリプシン活性阻害も測定しているのであ
る。さらに、腎症では、尿中のＵＴＩ濃度もほとんど増
加しないことを突き止めた。すなわち、α１−ＡＴによ
る影響を排除すれば、ＵＴＩを正確に測定することがで
きるばかりでなく、尿中のＵＴＩを炎症特有の指標とし
て用いることができるのである。本発明者らは、このよ
うな研究結果および着想に基づき、前記本発明の測定方
法に到達したのである。

【００１０】

【００１１】

【００１２】α１−ＡＴは、プロテアーゼ阻害活性部位
が一つしかない。これに対し、ＵＴＩは、プロテアーゼ
活性阻害部位を二つ有しており、阻害するプロテアーゼ
は各阻害部位で異なる。したがって、試料にトリプシン
以外のプロテアーゼを添加して、前記試料中のα１−Ａ
Ｔと複合体を形成させて、α１−ＡＴを不活性にした場
合、前記試料中に共存するＵＴＩも前記プロテアーゼと
反応して複合体を形成したとしても、もう一方のトリプ
シン活性阻害部位が残っている。この状態でトリプシン
の酵素活性を測定しても、ＵＴＩはトリプシンの活性を
阻害することができるため、α１−ＡＴの影響なくＵＴ
Ｉを測定することができる。前記トリプシン以外のプロ
テアーゼとしては、トリプシンの基質を分解しないもの
が好ましく、また、トリプシンを阻害しないものが好ま
しい。

【００１３】α１−ＡＴは、セリンプロテアーゼインヒ
ビターであるから、前記トリプシン以外のプロテアーゼ
は、セリンプロテアーゼが好ましいが、本発明は、これ
に限定されない。α１−ＡＴは、システインプロテアー
ゼ等とも反応するからである。前記トリプシン以外のプ
ロテアーゼの好ましい具体例としては、エラスターゼ、
ズブチリシン、キモトリプシン、カテプシン、プラスミ
ン、トロンビン、カリクレインおよびウロキナーゼ等が
あげられる。これらのプロテアーゼのなかで、より好ま
しいのは、エラスターゼ、ズブチリシンであり、特に好
ましくは、コストの点から、ズブチリシンである。前記
トリプシン以外のプロテアーゼは、１種類を用いてもよ
いし、２種類以上を併用してもよい。

【００１４】方法Ａにおいて、前記トリプシン以外のプ
ロテアーゼの添加割合は、試料１ｍｌに対し０．３３×
１０^-9〜１６．６×１０^-9ｍｏｌの範囲が好ましく、特
に好ましくは３．３×１０^-9〜１０．０×１０^-9ｍｏｌ
の範囲である。０．３３×１０^-9ｍｏｌより少ないと、
試料中のα１−ＡＴを完全に不活性化できないおそれが
ある。なお、この方法Ａにおいて、トリプシン以外のプ
ロテアーゼの添加量をｍｏｌで表したのは、以下の理由
による。通常、酵素の添加量は、その活性を基準にした
ユニット単位で表される。しかし、前述のように、方法
Ａでは、酵素の活性を問題とせず、α１−ＡＴとトリプ
シン以外のプロテアーゼとの複合体を形成させるのだか
ら、その数が問題となる。したがって、前記トリプシン
以外のプロテアーゼの添加量は、分子数を表す「ｍｏ
ｌ」で表すことが好ましい。なお、前記プロテアーゼの
分子量がわかればグラム単位（ｇ）で表示することがで
き、実際に、この方法Ａを実施する場合、グラム単位に
換算して使用することが好ましい。この場合、前記添加
量は、試料１ｍｌに対し１０〜５００μｇの範囲が好ま
しく、特に好ましくは、１００〜３００μｇの範囲であ
る。

【００１５】 また、前記トリプシン以外のプロテアー
ゼとして前記ズブチリシンまたはエラスターゼを使用す
る場合も、前記添加割合と同様の範囲であることが好ま
しい。また、グラム単位で表した添加量の割合も同様で
ある。

【００１６】本発明の測定方法において、試料に酸化剤
を添加することにより、前記試料中のα１−ＡＴを不活
性化するという方法（方法Ｂ）を併用してもよい。

【００１７】α１−ＡＴにおける、トリプシンとの反応
部位は、３５８番目のメチオニン残基である。したがっ
て、酸化剤により、このメチオニン残基をメチオニンス
ルホキシドに酸化すると、α１−ＡＴは、不活性化され
る。

【００１８】この方法Ｂにおいて、前記酸化剤は、過マ
ンガン酸、過マンガン酸塩、酸素酸、酸素酸塩、金属塩
類、酸化物および過酸化物等が好ましく、特に好ましく
は、ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ素、硫酸銅および三塩化
鉄である。なお、前記酸化剤は、１種類を用いてもよい
が、十分な効果が得られることから、２種類以上を併用
することが好ましい。

【００１９】方法Ｂにおいて、前記酸化剤の添加割合
は、試料１ｍｌに対し０．００５〜０．５ｍｍｏｌの範
囲であることが好ましく、特に好ましくは、０．０１〜
０．１ｍｍｏｌの範囲である。０．００５ｍｍｏｌより
少ないと、試料中のα１−ＡＴを完全に不活性化できな
いおそれがある。

【００２０】本発明の測定方法において、前記トリプシ
ンとしては、特に制限されず、例えば、牛膵臓由来のト
リプシン、ブタ膵臓由来のトリプシン等が使用できる。

【００２１】本発明の測定方法において、使用される基
質としては、特に制限されず、例えば、カゼイン、アル
ブミン等の天然のタンパク質の他、合成基質等があげら
れる。前記合成基質としては、例えば、Ｎα−ベンゾイ
ル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）、
Ｎα−ベンゾイル−リジン−ｐ−ニトロアニリド、ｔ−
ブトキシカルボニル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
ド、ｔ−ブトキシカルボニル−リジン−ｐ−ニトロアニ
リド等が使用できる。これらの合成基質は、トリプシン
により分解されると発色物質を生成する。これらの基質
の中で好ましいのは、ＢＡＰＮＡである。

【００２２】本発明の測定方法において、使用される緩
衝液としては、特に制限されず、例えば、トリエタノー
ルアミン塩酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝
液、グッド緩衝液等があげられる。

【００２３】

【００２４】つぎに、本発明のＵＴＩ測定キットは、方
法Ａに対応して、以下に示すように、測定キットＡがあ
る。

【００２５】前記測定キットＡは、トリプシン、基質お
よびトリプシン以外のプロテアーゼを備える。この測定
キットを用いれば、方法Ａによる本発明の測定方法を容
易かつ迅速に実施できる。

【００２６】前記測定キットＡにおいて、前記トリプシ
ン以外のプロテアーゼは、前記方法Ａと同様に、セリン
プロテアーゼが好ましいが、これに限定されない。前記
トリプシン以外のプロテアーゼの好ましい具体例として
は、エラスターゼ、ズブチリシン、キモトリプシン、カ
テプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレインおよ
びウロキナーゼ等があげられる。このなかで、特に好ま
しいプロテアーゼは、エラスターゼ、ズブチリシンであ
る。前記トリプシン以外のプロテアーゼは、１種類を用
いてもよいし、２種類以上を併用してもよい。

【００２７】前記測定キットＡは、トリプシン溶液（Ｒ
１）、基質溶液（Ｒ２）およびトリプシン以外のプロテ
アーゼ溶液（Ｒ３）を備え、これらに加え、緩衝液（Ｒ
４）を有していてもよい。これらの試薬（Ｒ１、Ｒ２、
Ｒ３およびＲ４）の調製は、方法Ａによる本発明の測定
方法の説明において述べる方法により行うことができ、
また各組成およびその割合等は、前記測定方法の箇所で
述べるとおりである。

【００２８】この測定キットＡにおいて、試薬Ｒ１、Ｒ
２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してもよく、また
これらの組み合わせであってもよい。具体的には下記の
ように２液系および３液系の組み合わせがある。 （１）３液系：Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３とＲ４の混合液 （２）２液系：Ｒ１＋Ｒ２とＲ３とＲ４の混合液

【００２９】また、前記方法Ｂに対応した測定キットＢ
は、トリプシン、基質および酸化剤を備える。この測定
キットＢを用いれば、方法Ｂによる測定方法を容易かつ
迅速に実施することができる。

【００３０】前記測定キットＢにおいて、前記酸化剤
は、前記方法Ｂと同様に、過マンガン酸、過マンガン酸
塩、酸素酸、酸素酸塩、金属塩類、酸化物および過酸化
物等が好ましく、特に好ましくはヨウ素酸ナトリウム、
ヨウ素、硫酸銅および三塩化鉄である。前記酸化剤は、
１種類を用いてもよいが、２種類以上を併用することが
好ましい。

【００３１】前記測定キットＢは、トリプシン溶液（Ｒ
１）、基質溶液（Ｒ２）および酸化剤溶液（Ｒ５）を備
え、これらに加え、緩衝液（Ｒ４）を有していてもよ
い。これらの試薬（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ４）の調
製は、方法Ｂによる本発明の測定方法の説明において述
べる方法により行うことができ、また各組成およびその
割合等は、前記測定方法の箇所で述べるとおりである。

【００３２】この測定キットＢにおいて、試薬Ｒ１、Ｒ
２、Ｒ５およびＲ４は、それぞれ独立してもよく、また
これらの組み合わせであってもよい。具体的には下記の
ような３液系の組み合わせがある。 ３液系：Ｒ１＋Ｒ５＋Ｒ２とＲ４の混合液

【００３３】

【００３４】

【発明の実施の形態】方法Ａによる本発明の測定方法
は、例えば、トリプシンを含有する酵素液（トリプシン
溶液）と、基質溶液と、トリプシン以外のプロテアーゼ
とを用いて実施できる。

【００３５】前記トリプシン以外のプロテアーゼは、そ
のまま使用してもよいが、操作の簡便性等の点から、前
記プロテアーゼを含有する溶液として用いることが好ま
しい。前記プロテアーゼ溶液の調製に用いる溶媒は、通
常、緩衝液であり、特に前記緩衝液が好ましい。

【００３６】前記緩衝液は、常法により調製される。前
記緩衝液のｐＨは、トリプシンの最適ｐＨであるｐＨ７
〜８の範囲が好ましい。また、トリプシン活性化剤とし
て、通常、緩衝液中にカルシウムを配合する。その配合
割合は、通常、前記緩衝液に対して０．０１〜０．５重
量％の範囲である。

【００３７】前記トリプシン溶液の濃度は、前記トリプ
シン溶液全体に対し、通常、１３，０００〜１０，００
０，０００Ｕ／リットルの範囲であり、好ましくは１３
０，０００〜２，０００，０００Ｕ／リットルの範囲で
ある。なお、この活性（Ｕ）は、トリプシン活性の測定
において、基質としてＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニ
ンエチルエステル（ＢＡＥＥ）を用いた場合の値であ
る。また、前記トリプシン溶液の濃度をグラム単位を用
いて表す場合、その比活性等により適宜決定されるが、
前記トリプシン溶液全体に対し、通常、１〜５００ｍｇ
／リットルの範囲であり、好ましくは１０〜１００ｍｇ
／リットルの範囲である。また、このトリプシン溶液
は、トリプシンの自己消化を防止する目的で、例えば、
塩酸、緩衝液等によりｐＨ２．０〜３．５の範囲に調整
してもよい。

【００３８】前記基質溶液の濃度は、通常、１〜１０ｇ
／リットルの範囲である。前記基質溶液の調製に用いる
溶媒は、通常、水（精製水等）であるが、前記緩衝液で
もよい。また、前記合成基質は、水溶液等には難溶であ
るため、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等
の有機溶媒に溶解してから、水等で希釈することが好ま
しい。

【００３９】つぎに、方法Ａによる本発明の測定方法に
ついて、尿を試料とした場合を例として、以下に説明す
る。

【００４０】すなわち、まず、尿試料にトリプシン以外
のプロテアーゼを混合して不活性化処理する。前記プロ
テアーゼは、尿試料に直接添加してもよいが、操作の迅
速性、簡便性の点から、先に述べたように前記プロテア
ーゼを含有する緩衝液（プロテアーゼ溶液）を調製し、
これと尿試料とを混合することが好ましい。この混合割
合（体積比）は、前記プロテアーゼ溶液の濃度により異
なるが、前記濃度が０．０１ｍＭの場合、通常、前記尿
試料：前記プロテアーゼ溶液＝１：５〜１：２０の範囲
に設定される。このように前記プロテアーゼの添加によ
り尿試料中のα１−ＡＴは、室温において直ぐに不活性
となるが、２５〜３７℃で１〜８００秒間インキュベー
ションすることが好ましい。

【００４１】つづいて、前記処理済尿試料にトリプシン
溶液を配合する。この配合割合（体積比）は、通常、前
記処理済尿試料：前記トリプシン溶液＝１：１〜５：１
の範囲に設定される。通常、この混合液を２５〜３７℃
で１〜５分間インキュベーションする。そして、これに
前記基質溶液を配合し、前記トリプシンと前記基質とを
反応させる。前記基質溶液の配合割合は、通常、全反応
液に対し、５〜３０体積％の範囲である。この反応条件
は、通常、２５〜３７℃で１〜２０分間である。また、
このときの前記反応液のｐＨは、トリプシンの最適ｐＨ
であるｐＨ７〜８の範囲が好ましい。そして、所定の方
法により、トリプシンの酵素反応を検出し、その酵素活
性を測定する。この反応において、前記尿試料中のα１
−ＡＴが予め不活性にされているため、ＵＴＩ量に応
じ、トリプシンの酵素反応が阻害されて、正確なＵＴＩ
量を測定できる。前記トリプシンの酵素反応の検出方法
としては、例えば、ＢＡＰＮＡ等の酵素反応により発色
する基質を用いた場合は、この発色程度を分光光度計等
により測定する方法があげられる。この他に、酵素反応
生成物の濃度を測定することにより、その酵素活性を測
定することもできる。

【００４２】なお、方法Ａによる本発明の測定方法にお
いて、試料と前記トリプシン溶液とが接触する前に、試
料中のα１−ＡＴのトリプシン活性阻害能が不活性化さ
れていればよい。このため、試料の前記プロテアーゼ処
理は、前記方法に限定されず、前記プロテアーゼ溶液、
試料および基質溶液を、順序を問わずに混合できる。そ
して、この混合液にトリプシン溶液を添加することによ
り、トリプシンの酵素反応を開始する。

【００４３】つぎに、方法Ｂによる本発明の測定方法
は、例えば、トリプシンを含有する酵素溶液（トリプシ
ン溶液）と、基質溶液と、酸化剤とを用いて実施でき
る。なお、後述する酸化剤以外は、特に示さない限り、
前記方法Ａによる測定方法と同様のものを用いることが
でき、また同様にして調製できる。

【００４４】前記酸化剤は、そのまま使用してもよい
が、操作の簡便性等の点から、酸化剤溶液として使用す
ることが好ましい。前記酸化剤溶液の調製に用いる溶媒
は、通常、その酸化力を維持するために、水が好まし
い。また、前記酸化剤溶液は、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）等のその他の成分を含んでいてもよい。例
えば、ＥＤＴＡを添加すれば、金属と錯体を形成するた
め、沈殿物の生成を防止できる。

【００４５】つぎに、方法Ｂによる測定方法について、
尿を試料とした場合を例として、以下に説明する。

【００４６】すなわち、まず、尿試料に酸化剤を混合し
て不活性化処理する。前記酸化剤は、尿試料に直接添加
してもよいが、操作の迅速性、簡便性の点から、先に述
べたように前記酸化剤溶液を調製し、これと尿試料とを
混合することが好ましい。この混合の割合（体積比）
は、前記酸化剤溶液の濃度により異なるが、前記濃度が
０．１ｍｍｏｌ／ｍｌの場合、通常、前記尿試料：前記
酸化剤溶液＝１：５〜１：２０の範囲に設定される。こ
のように前記酸化剤の添加により尿試料中のα１−ＡＴ
は、室温において直ぐに不活性となるが、２５〜３７℃
で１０〜６００秒間インキュベーションすることが好ま
しい。

【００４７】つづいて、前記処理済尿試料、緩衝液およ
びトリプシン溶液を混合する。この混合の割合（体積
比）は、通常、前記処理済尿試料：前記緩衝液：前記ト
リプシン溶液＝１：１〜５：１の範囲に設定される。前
記混合を行った後は、前述の方法Ａによる測定方法と同
様にして、トリプシンの酵素反応を行い、これを検出し
て酵素活性を測定する。この反応において、前記尿試料
中のα１−ＡＴが酸化剤により予め不活性にされている
から、ＵＴＩ量に応じ、トリプシンの酵素反応が阻害さ
れて、正確なＵＴＩ量を測定できる。

【００４８】なお、方法Ｂによる測定方法において、試
料と前記トリプシン溶液とが接触する前に、試料中のα
１−ＡＴのトリプシン活性阻害能が酸化剤により不活性
化されていればよい。このため、試料の前記酸化剤処理
は、前記方法に限定されず、前記酸化剤溶液、試料およ
び基質溶液を、順序を問わずに混合できる。そして、こ
の混合液にトリプシン溶液を添加することにより、トリ
プシンの酵素反応を開始する。ただし、前記酸化剤の添
加は、その操作の簡便性等から、先に述べたように、試
料の前処理として行うことが特に好ましい。

【００４９】また、本発明の測定方法において、前述の
ように、方法Ａにより、α１−ＡＴを不活性化するだけ
でなく、方法Ａおよび方法Ｂの併用により、α１−ＡＴ
を不活性化してもよい。

【００５０】この場合、例えば、試料をトリプシン以外
のプロテアーゼと酸化剤とで、順次処理してもよいし、
試料に前記両者を同時に添加して処理してもよい。この
ように方法Ａおよび方法Ｂを併用する場合は、試料１ｍ
ｌに対し、前記プロテアーゼを０．３３×１０^-9〜１
６．６×１０^-9ｍｏｌの範囲および酸化剤を０．００５
〜０．５ｍｍｏｌの範囲で添加することが好ましい。

【００５１】

【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明
する。

【００５２】（実施例Ａ−１）この実施例Ａ−１は、ト
リプシン以外のプロテアーゼとしてズブチリシンを用
い、これを種々濃度で尿試料に添加してα１−ＡＴを不
活性化し、トリプシン活性阻害程度をＵＴＩ量として求
めた例である。この実施例Ａ−１における緩衝液、トリ
プシン溶液および基質溶液は、前述の方法により調製し
た。その組成およびＵＴＩ測定の操作方法を下記に示
す。

【００５３】 （緩衝液：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／リットル ＣａＣl₂・２Ｈ₂Ｏ １５０ｍｇ／リットル ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５（ナカライテスク社製） ２．０ｇ／リットル

【００５４】 （トリプシン溶液：ｐＨ３．０） トリプシン（１４，９００Ｕ／ｍｇ、シグマ社製）５０ｍｇ／リットル ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／リットル

【００５５】（基質溶液）約７０℃に加温した水に、４
ｇ／リットルの割合でＬ−ＢＡＰＮＡ（ペプチド研究所
社製）を溶解することにより調製した。

【００５６】（ズブチリシン）枯草菌由来ズブチリシン
（ベーリンガー・マンハイム社製）

【００５７】（α１−ＡＴ）ヒト血清由来α１−ＡＴ
（ＡＲＴ社製）

【００５８】（試料１、２、３）試料１は、α１−ＡＴ
を健常者尿に１４ｍｇ／１００ｍｌの濃度になるように
添加した試料（α１−ＡＴ添加尿）である。試料２は、
尿タンパク質陽性患者の血清と健常者尿とを、体積比が
前記血清：前記尿＝１：７になるように混合した試料
（血清添加尿）である。前記尿タンパク質陽性患者と
は、血清中のＣＲＰおよび血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）
が陰性であり、尿中のＵＴＩが陽性（従来法による）で
ある患者のことである（以下、同じ）。試料３は、健常
者尿である。

【００５９】（操作方法）前記試料１、２、３に対し、
ズブチリシンを所定濃度（０ｍｇ／１００ｍｌ、０．４
ｍｇ／１００ｍｌ、０．８ｍｇ／１００ｍｌ、１．２ｍ
ｇ／１００ｍｌ、１．６ｍｇ／１００ｍｌ、２ｍｇ／１
００ｍｌ、２．４ｍｇ／１００ｍｌ、３．２ｍｇ／１０
０ｍｌ、４ｍｇ／１００ｍｌ）になるように直接添加し
た。そして、このズブチリシン処理後の尿試料２０μ
ｌ、緩衝液２００μｌおよびトリプシン溶液１００μｌ
を混合し、３７℃で５分間保温した。この混合液に前記
基質溶液１００μｌを添加して、酵素反応を開始した。
そして、前記反応液を３７℃で保温して、前記反応液の
２分間の吸光度（４０５ｎｍ）変化を日立７０７０型自
動分析装置（日立製作所社製）で測定し、その相対吸光
度（△Ｏ．Ｄ．）を求めた。この相対吸光度から、予め
作成した検量線を用いて、トリプシン活性阻害程度をＵ
ＴＩ量として求めた。なお、前記検量線は、ＵＴＩ標準
物質（ユーティニン、メクト社製）を生理食塩水に溶解
した標準液を用い、前述と同様に測定して作成した。こ
のＵＴＩの測定は、各試料について３回ずつ行った。こ
の結果を図１のグラフに示す。

【００６０】図１に示すように、前記α１−ＡＴ添加尿
（試料１）では、ズブチリシンの添加量を増加するに従
い、ＵＴＩ量が減少し、ズブチリシンを試料に対し０．
４ｍｇ／１００ｍｌ（試料１ｍｌに対し０．１３×１０
^-9ｍｏｌ）以上になるように添加すると、ＵＴＩ量は一
定となり、健常者尿（試料３）のＵＴＩ量とほぼ同量に
なった。このことから、健常者尿に添加したα１−ＡＴ
が完全に不活性化されたことが分かる。また、同様に前
記血清添加尿についても、ズブチリシンを試料に対し
１．６ｍｇ／１００ｍｌ（試料１ｍｌに対し０．５３×
１０^-9ｍｏｌ）以上になるように添加することにより、
前記血清由来のα１−ＡＴが不活性化されたことがわか
る。なお、充分量のズブチリシンを添加した前記血清添
加尿のＵＴＩ量が、健常者尿のＵＴＩ量よりも高い値を
示すのは、添加した前記血清中に存在するＵＴＩによる
ためと考えられる。

【００６１】（実施例Ａ−２）この実施例Ａ−２は、エ
ラスターゼを種々濃度で試料に添加してα１−ＡＴを不
活性にし、トリプシン活性阻害程度をＵＴＩ量として求
めた例である。なお、特に示さない限り、ＵＴＩの測定
操作は、実施例Ａ−１と同じである。

【００６２】（エラスターゼ）ヒト白血球由来エラスタ
ーゼ（ＡＲＴ社製）

【００６３】（試料）尿タンパク質陽性患者の尿（尿タ
ンパク質濃度：５４１ｍｇ／１００ｍｌ）を用いた。

【００６４】（操作方法）前記試料に対し、エラスター
ゼを所定濃度（０ｍｇ／１００ｍｌ、２ｍｇ／１００ｍ
ｌ、４ｍｇ／１００ｍｌ、６ｍｇ／１００ｍｌ、８ｍｇ
／１００ｍｌ、１０ｍｇ／１００ｍｌ）になるように直
接添加した。以後、実施例Ａ−１と同様にしてＵＴＩ量
を求めた。このＵＴＩの測定は、２回ずつ行った。この
結果を、図２のグラフに示す。

【００６５】図２に示すように、エラスターゼ濃度に比
例して、そのＵＴＩ量が減少した。この試料は、炎症を
おこしていない腎症の患者の尿である。従って、エラス
ターゼを添加する前は、ＵＴＩが高い値を示し、エラス
ターゼの濃度を高くするに従い、ＵＴＩの値が低下した
ということは、この尿試料にはα１−ＡＴが存在し、こ
れが、トリプシン活性を阻害しているといえる。また、
このα１−ＡＴは、エラスターゼを添加することにより
不活性化される。この実施例Ａ−２の結果から、本発明
の測定方法によれば、尿中のＵＴＩを炎症特有の指標と
して用いることができるといえる。

【００６６】（実施例Ａ−３）この実施例Ａ−３では、
ズブチリシンによる試料の処理時間とＵＴＩ量との関係
を調べた。なお、特に示さない限り、使用した試料およ
びＵＴＩの測定操作は実施例Ａ−１と同じである。

【００６７】（試料）実施例Ａ−１で用いた試料２（血
清添加尿）を使用した。

【００６８】（ズブチリシン溶液）前記緩衝液に実施例
Ａ−１と同じズブチリシンを２０ｍｇ／１００ｍｌの濃
度になるように添加して調製した。

【００６９】（操作方法）ズブチリシン溶液２００μｌ
と前記試料２０μｌとを混合し、これを種々の時間（２
５秒、５０秒、４２５秒、８００秒）インキュベートし
た。このインキュベート時の温度は、３７℃である。こ
の溶液にトリプシン溶液１００μｌを添加し、以後、実
施例Ａ−１と同様にしてＵＴＩ量を測定した。吸光度の
測定には、日本ロシュＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ自動分析装
置（日本ロシュ社製）を使用した。このＵＴＩの測定
は、５回ずつ行った。この結果を図３のグラフに示す。

【００７０】図３に示すように、ズブチリシンによる試
料中のα１−ＡＴの不活性化処理時間を変えてもＵＴＩ
量に大きな違いは見られず、前記不活性化処理時間が２
５秒で、完全にα１−ＡＴは不活性化された。

【００７１】（実施例Ａ−４、比較例Ａ−１）実施例Ａ
−４および比較例Ａ−１において、ＵＴＩ量と炎症との
相関性を調べた。なお、特に示さない限り、ＵＴＩの測
定操作は実施例Ａ−１と同じである。

【００７２】（試料）実施例Ａ−４および比較例Ａ−１
の試料として、患者尿（検体数：ｎ＝７７）を使用し、
また対照の試料として、同患者の血清（検体数：ｎ＝７
７）を使用した。

【００７３】実施例Ａ−４では、前記試料２０μｌと実
施例Ａ−３で用いたズブチリシン溶液２００μｌとを混
合した後、これに前記トリプシン溶液１００μｌを添加
し、以後、実施例Ａ−１と同様にしてＵＴＩ量を測定し
た。

【００７４】対照として、前記血清（ｎ＝７７）につい
て、ＣＲＰの測定を行った。この測定は、ＣＲＰ測定キ
ット（デンカ生研社製）を用い、その使用方法に準じて
行った。

【００７５】この実施例Ａ−４と対照の結果を図４のグ
ラフに示す。このグラフは、前記ズブチリシン処理後の
尿試料中のＵＴＩ量と前記血清試料中のＣＲＰ濃度との
相関関係を示すグラフであり、図中の式は、前記相関関
係を表す式、Ｒは相関係数をそれぞれ示す。

【００７６】一方、比較例Ａ−１は、トリプシン以外の
プロテアーゼで処理を行わない従来のＵＴＩ測定方法の
例である。この比較例Ａ−１では、前記試料２０μｌ、
前記緩衝液２００μｌおよびトリプシン溶液１００μｌ
を混合し、以後、実施例Ａ−１と同様にしてＵＴＩ量を
測定した。この結果と前記対照の結果を図５のグラフに
示す。このグラフは、前記プロテアーゼ未処理の尿試料
中のＵＴＩ量と前記血清試料中のＣＲＰ濃度との相関関
係を示すグラフであり、図中の式は、前記相関関係を表
す式、Ｒは相関係数をそれぞれ示す。

【００７７】図４および図５のグラフに示すように、実
施例Ａ−４におけるＵＴＩ量とＣＲＰ濃度との相関（Ｒ
＝０．３９）は、比較例Ａ−１における前記相関（Ｒ＝
０．２４）よりも高かった。この結果から、本発明の測
定方法によれば、ＵＴＩの炎症に対する指標としての特
異性を高めることができるといえる。

【００７８】（参考例）この参考例は、尿における尿タ
ンパク質濃度とα１−ＡＴ濃度との関係を調べた例であ
る。

【００７９】（試料）患者尿（検体数：ｎ＝９８）

【００８０】前記各患者尿（ｎ＝９８）について、その
タンパク質量をタンパク質測定キット（和光純薬社製）
を用い、その使用方法（ピロガロールレッド法）に準じ
て測定した。この測定には、日立７０７０型自動分析装
置（日立製作所社製）を使用した。一方、前記各患者尿
（ｎ＝９８）について、そのα１−ＡＴ濃度を、ＥＬＩ
ＳＡ法により測定した。これらの結果を図６のグラフに
示す。このグラフは、前記尿タンパク質濃度と前記尿中
α１−ＡＴとの相関関係を示すグラフであり、図中の式
は、前記相関関係を表す式、Ｒは相関係数をそれぞれ示
す。

【００８１】図６に示すように、尿タンパク質濃度が高
い検体は、尿中のα１−ＡＴ濃度も高い傾向にあり、前
記両者は高い相関性を示している。このことから、尿タ
ンパク質濃度が高くなる腎症では、ＵＴＩと同じトリプ
シン活性阻害能を有するα１−ＡＴが、尿中に漏出して
いることが分かる。つまり、腎症患者の尿においては、
この尿中に漏出したα１−ＡＴがトリプシン活性を阻害
するため、従来法では尿中のＵＴＩ量がみかけ上高くな
るといえる。

【００８２】（実施例Ｂ−１）この実施例Ｂ−１は、種
々の酸化剤を用い、これを尿試料に添加してα１−ＡＴ
を不活性化し、トリプシン活性阻害程度をＵＴＩ量とし
て求めた例である。以下の実施例Ｂ−１〜Ｂ−５も同様
である。この実施例Ｂ−１における緩衝液、トリプシン
溶液、基質溶液および酸化剤は、前述の方法により調製
した。その組成およびＵＴＩ測定の操作方法を下記に示
す。

【００８３】 （緩衝液：ｐＨ８．３） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／リットル ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ １５０ｍｇ／リットル ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５（ナカライテスク社製） ２．０ｇ／リットル

【００８４】 （トリプシン溶液：ｐＨ３．０） トリプシン（１４，９００Ｕ／ｍｇ、シグマ社製）５０ｍｇ／リットル ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／リットル

【００８５】（基質溶液）約７０℃に加温した水に、４
ｇ／リットルの割合でＬ−ＢＡＰＮＡ（ペプチド研究所
社製）を溶解することにより調製した。

【００８６】（酸化剤溶液）０．０５Ｍ ＮａＩＯ
₃（ナカライテスク社製、以下同じ）および０．０５Ｍ
Ｉ₂（和光純薬社製、以下同じ）をそれぞれ調製し、こ
れらを体積比が１：１の割合になるように混合した。調
製用の溶媒としては、水を使用した。後述の各酸化剤溶
液の調製も、同じく溶媒として水を用いた。

【００８７】（試料）健常者尿と尿タンパク質陽性患者
の血清とを体積比が７：１になるように混合した血清添
加尿を試料とした。また、対照の試料として、生理食塩
水と前記健常者尿とを体積比１：１になるように混合し
たもの（希釈健常者尿）を使用した。

【００８８】（操作方法）まず、前記試料と前記酸化剤
溶液とを体積比が１：１になるように混合した。そし
て、この酸化剤処理後の尿試料２０μｌ、緩衝液２００
μｌおよびトリプシン溶液１００μｌを混合し、３７℃
で５分間保温した。この混合液に前記基質溶液１００μ
ｌを添加して、酵素反応を開始した。そして、前記反応
液を３７℃で保温して、前記反応液の２分間の吸光度
（４０５ｎｍ）変化を日立７０７０型自動分析装置（日
立製作所社製）で測定し、その相対吸光度（△Ｏ．
Ｄ．）を求めた。この相対吸光度から、予め作成した検
量線を用いて、トリプシン活性阻害程度をＵＴＩ量とし
て求めた。なお、前記検量線は、ＵＴＩ標準物質（ユー
ティニン、メクト社製）を生理食塩水に溶解した標準液
を用い、前述と同様に測定して作成した。また、対照例
として、前記希釈健常者尿２０μｌ、緩衝液２００μｌ
およびトリプシン溶液１００μｌを混合し、以後、前記
実施例Ｂ−１と同様にしてＵＴＩ量を測定した。これら
の結果を下記表１に示す。

【００８９】（実施例Ｂ−２）０．１Ｍ ＮａＩＯ₃を
調製し、これと前記０．０５Ｍ Ｉ₂とを、体積比１：
１になるように混合したものを酸化剤溶液として使用し
た以外は、実施例Ｂ−１と同様にして、ＵＴＩ測定の操
作を行った。この結果を下記表１に併せて示す。

【００９０】（実施例Ｂ−３）０．０５Ｍ ＦｅＣｌ₃
・６Ｈ₂Ｏ（和光純薬社製、以下同じ）を調製し、これ
を酸化剤溶液として使用した以外は、実施例Ｂ−１と同
様にして、ＵＴＩ測定の操作を行った。この結果を下記
表１に併せて示す。

【００９１】（実施例Ｂ−４）この実施例Ｂ−４では、
酸化剤溶液に他の成分としてＥＤＴＡを添加した場合の
トリプシン活性阻害程度をＵＴＩ量として求めた。

【００９２】すなわち、０．０５Ｍ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂
Ｏ（ナカライテスク社製）および０．０５Ｍ ＥＤＴＡ
−２Ｎａ・２Ｈ₂Ｏ（ナカライテスク社製、以下同じ）
をそれぞれ調製し、これらを体積比が１：１の割合にな
るように混合したものを酸化剤溶液として使用した。こ
の溶液と実施例Ｂ−１と同じ試料とを混合し、以後、実
施例Ｂ−１と同様にして、ＵＴＩ量を求めた。この結果
を下記表１に併せて示す。

【００９３】（実施例Ｂ−５）前記０．０５Ｍ ＦｅＣ
ｌ₃・６Ｈ₂Ｏと前記０．０５Ｍ ＥＤＴＡ−２Ｎａ・２
Ｈ₂Ｏとを体積比が１：１の割合になるように混合した
ものを酸化剤溶液とした。この溶液と実施例Ｂ−１と同
じ試料とを混合し、以後、実施例Ｂ−１と同様にして、
ＵＴＩ量を求めた。この結果を下記表１に示す。

【００９４】（比較例Ｂ−１）この比較例Ｂ−１は、酸
化剤で処理を行わない従来のＵＴＩ測定方法の例であ
る。この比較例Ｂ−１では、まず、実施例Ｂ−１と同じ
試料（血清添加尿）と生理食塩水とを体積比１：１にな
るよう混合した。そして、この混合液２０μｌ、緩衝液
２００μｌおよびトリプシン溶液１００μｌを混合し、
以後、前記実施例Ｂ−１と同様にしてＵＴＩ量を測定し
た。この結果を下記表１に併せて示す。

【００９５】

【表１】 ＵＴＩ量 α１−ＡＴ （ＩＵ／リットル） の不活性化程度 対照例 １４３ − 実施例Ｂ−１ ５４ ◎ 実施例Ｂ−２ ８５ ◎ 実施例Ｂ−３ ３９４ ○ 実施例Ｂ−４ ３２５ ○ 実施例Ｂ−５ ３２６ ○ 比較例Ｂ−１ １８２６ ×

【００９６】上記表１に示すように、実施例Ｂ−１およ
びＢ−２におけるＵＴＩ量のそれぞれの値は、比較例Ｂ
−１（従来法）のＵＴＩ量の値と比較して大幅に減少
し、対照である前記希釈健常者尿中のＵＴＩ量の値とほ
ぼ同様の値が得られた。また、酸化剤を二種類併用する
と、充分にα１−ＡＴ不活性化の効果が得られることが
分かった。また、実施例Ｂ−３におけるＵＴＩ量の値
も、比較例Ｂ−１（従来法）のＵＴＩ量の値より減少
し、対照である前記希釈健常者尿中のＵＴＩ量の値に近
い値が得られた。そして、ＥＤＴＡを共に添加した実施
例Ｂ−４、Ｂ−５のＵＴＩ量の値も、比較例Ｂ−１（従
来法）のＵＴＩ量の値より減少し、対照である前記希釈
健常者尿中のＵＴＩ量の値に近い値が得られた。

【００９７】（実施例Ｃ−１および比較例Ｃ−１）この
実施例Ｃ−１は、試料に、トリプシン以外のプロテアー
ゼと酸化剤の両方を添加して、トリプシン阻害程度をＵ
ＴＩ量として求めた例である。なお、前記プロテアーゼ
および酸化剤を併用した場合に、α１−ＡＴが充分に不
活性化されたかを評価するために、試料をトリプシン以
外のプロテアーゼのみで処理した場合のＵＴＩ量も求め
た。

【００９８】（緩衝液）実施例Ａ−１と同じ緩衝液を使
用した。

【００９９】（ズブチリシン溶液）前記緩衝液に、実施
例Ａ−１と同じズブチリシンを、０．０２ｍｇ／ｍｌの
濃度になるように添加した。

【０１００】（酸化剤溶液）０．２Ｍ ＣｕＳＯ₄・５
Ｈ₂Ｏおよび０．２Ｍ ＥＤＴＡ−２Ｎａ・２Ｈ₂Ｏをそ
れぞれ調製し、これらを体積比が１：１の割合になるよ
うに混合した。

【０１０１】（試料）健常者尿に対し、患者血清を所定
濃度（０体積％、２０体積％、４０体積％、６０体積
％、８０体積％、１００体積％）になるように混合し、
これらを試料とした。

【０１０２】（操作方法）前記試料と前記酸化剤溶液と
が、体積比２：１の割合になるように混合し（試料１ｍ
ｌに対して酸化剤０．０５ｍｍｏｌ）、この混合液７５
０μｌに前記ズブチリシン溶液２５０μｌを混合した
（試料１ｍｌに対してズブチリシン１３．３×１０^-9ｍ
ｏｌ）。この後、前記実施例Ａ−１と同様にして、前記
トリプシン溶液および前記基質溶液を添加して、ＵＴＩ
量を測定した。このＵＴＩ量の測定は３回ずつ行い、そ
の平均値を求めた。

【０１０３】一方、前記試料と生理食塩水とが、体積比
２：１の割合になるように混合し、この混合液７５０μ
ｌに前記ズブチリシン溶液２５０μｌ（試料１ｍｌに対
してズブチリシン１３．３×１０^-9ｍｏｌ）を混合した
後、前述と同様にしてＵＴＩ量を測定した。

【０１０４】なお、比較例Ｃ−１は、試料をトリプシン
以外のプロテアーゼおよび酸化剤のいずれによっても処
理しない従来のＵＴＩ測定方法の例である。この比較例
では、前記試料を生理食塩水と混合し、ズブチリシン溶
液の代わりに前記緩衝液を添加した以外は、前述と同様
にしてＵＴＩ量を測定した。これらの結果を、図７のグ
ラフに示す。図中において、◇は、ズブチリシンのみで
試料を処理した場合のＵＴＩ量、□は、ズブチリシンお
よび酸化剤で試料を処理した場合のＵＴＩ量、○は、試
料を処理しない比較例Ｃ−１のＵＴＩ量をそれぞれ示
す。

【０１０５】図示のように、比較例Ｃ−１では、α１−
ＡＴの影響により、高いＵＴＩ量を示し、測定範囲を越
えていた。一方、ズブチリシンおよび酸化剤の両方で試
料を処理した場合と、ズブチリシンのみで試料を処理し
た場合とでは、比較例Ｃ−１に比べ、充分にそのＵＴＩ
量が減少し、両者のＵＴＩ量も、ほぼ同様の値を示し
た。このことから、トリプシン以外のプロテアーゼと酸
化剤とを併用しても、十分に試料中のα１−ＡＴを不活
性化できることがわかった。なお、試料中の血清濃度
（体積％）の増加に伴い、ＵＴＩの値が高くなるのは、
血清中に含まれるＵＴＩによるものと推測できる。

【０１０６】

【発明の効果】以上のように、本発明のＵＴＩの測定方
法は、試料の存在下、トリプシン活性を測定することに
より前記試料中のＵＴＩを測定する方法であって、試料
中のα１−ＡＴを不活性化してから、前記トリプシンと
試料とを混合することにより、ＵＴＩ量を正確に測定
し、かつＵＴＩの臨床的指標としての有用性を高めるこ
とができる。例えば、本発明の測定方法により尿中のＵ
ＴＩを測定すれば、腎症患者の尿であっても、ＵＴＩを
正確に測定でき、このことはＵＴＩを炎症の指標として
活用できることを意味する。

【図面の簡単な説明】

【図１】方法Ａによる本発明の測定方法の一実施例にお
いて、ズブチリシンを用いてα１−ＡＴを不活性にし、
ＵＴＩの測定を行った結果を示すグラフである。

【図２】方法Ａによる本発明の測定方法のその他の実施
例において、エラスターゼを用いてα１−ＡＴを不活性
にし、ＵＴＩの測定を行った結果を示すグラフである。

【図３】方法Ａによる本発明の測定方法のさらにその他
の実施例において、ズブチリシンによるα１−ＡＴの不
活性化処理時間を変えて、ＵＴＩの測定を行った結果を
示すグラフである。

【図４】方法Ａによる本発明の測定方法のさらにその他
の実施例において、ズブチリシンを用いてα１−ＡＴを
不活性にし、ＵＴＩの測定を行った結果を示すグラフで
ある。

【図５】比較例において、従来の方法により、ＵＴＩの
測定を行った結果を示すグラフである。

【図６】参考例において、尿中のタンパク質濃度とα１
−ＡＴ濃度との関係を示すグラフである。

【図７】方法Ａと方法Ｂとを併用した本発明の測定方法
のさらにその他の実施例において、ズブチリシンと酸化
剤とを用いてα１−ＡＴを不活性にし、ＵＴＩの測定を
行った結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−11198（ＪＰ，Ａ) ＡＮＮＡＬＥＳ ＤＥ ＢＩＯＬＯＧ ＩＥ ＣＬＩＮＩＱＵＥ，（1989），Ｖ ｏｌ．47，Ｎｏ．５，ｐ．261−267 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 尿試料中の尿中トリプシンインヒビター
   の量を測定する方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の
   工程を有する測定方法。 （ａ）尿試料にトリプシン以外のプロテアーゼを添加
   し、前記プロテアーゼと 前記尿試料中のα１−アンチト
   リプシンとを反応させて複合体を形成させ ることによ
   り、前記α１−アンチトリプシンを不活性化する工程。 （ｂ）前記不活性化の後、尿試料とトリプシンとを混合
   する工程。 （ｃ）前記トリプシンの活性の阻害を測定する工程。 （ｄ）前記阻害から尿試料中の尿中トリプシンインヒビ
   ターの量を決定する工程。
2. 【請求項２】 トリプシン以外のプロテアーゼが、セリ
   ンプロテアーゼである請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 トリプシン以外のプロテアーゼが、エラ
   スターゼ、ズブチリシン、キモトリプシン、カテプシ
   ン、プラスミン、トロンビン、カリクレインおよびウロ
   キナーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプ
   ロテアーゼである請求項１記載の測定方法。
4. 【請求項４】 トリプシン以外のプロテアーゼを、尿試
   料１ｍｌに対し０．３３×１０ ^-9 〜１６．６×１０ ^-9 ｍ
   ｏｌの範囲で添加する請求項１〜３のいずれか一項に記
   載の測定方法。
5. 【請求項５】 トリプシン以外のプロテアーゼを、尿試
   料１ｍｌに対し３．３×１０ ^-9 〜１０．０×１０ ^-9 ｍｏ
   ｌの範囲で添加する請求項１〜３のいずれか一項に記載
   の測定方法。
6. 【請求項６】 トリプシンが、牛膵臓由来のトリプシン
   およびブタ膵臓由来のトリプシンの少なくとも一方であ
   る請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法。
7. 【請求項７】 トリプシン活性の測定に使用される基質
   が、Ｎα−ベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
   ド、Ｎα−ベンゾイル−リジン−ｐ−ニトロアニリド、
   ｔ−ブトキシカルボニル−アルギニン−ｐ−ニトロアニ
   リドおよびｔ−ブトキシカルボニル−リジン−ｐ−ニト
   ロアニリドからなる群から選択された少 なくとも一つの
   合成基質である請求項１〜６のいずれか一項に記載の測
   定方法。
8. 【請求項８】 請求項１記載の測定方法に用いる尿中ト
   リプシンインヒビター測定キットであって、トリプシ
   ン、基質およびトリプシン以外のプロテアーゼを備える
   尿中トリプシンインヒビター測定キット。
9. 【請求項９】 トリプシン以外のプロテアーゼが、セリ
   ンプロテアーゼである請求項８記載の測定キット。
10. 【請求項１０】 トリプシン以外のプロテアーゼが、エ
    ラスターゼ、ズブチリシン、キモトリプシン、カテプシ
    ン、プラスミン、トロンビン、カリクレインおよびウロ
    キナーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプ
    ロテアーゼである請求項８記載の測定キット。