JP3761925B2 - 安定なプラスミン溶液 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、血液凝固線溶因子の測定試薬等に有用な安定なプラスミン溶液に関する。
【0002】
【従来の技術】
生体内における酵素反応は、その活性化物質やその反応を阻害する阻害物質により制御・調整され、機能の調節が図られている。例えば、血液凝固機構においては、血管損傷部位以外での血液凝固反応や、過度の凝固亢進・線溶亢進を阻害する酵素阻害物質が存在し、これにより血液凝固・線溶の制御・調節が行われている。血栓形成の進展状態を検査する血液学的検査においては、酵素阻害物質の測定は重要であり、凝固・線溶の状態を示す良い指標となることから、アンチトロンビンIII(ATIII)、α2−プラスミンインヒビター(α2PI)などの酵素阻害物質の測定が行われている。
【0003】
これらのうち、α2PIは、血液の線維素溶解現象を調節する線溶阻止因子の中でも最も重要な因子であることが明らかにされ、生体内の線溶亢進状態を知るための指標として注目されている。また、その血液中レベルは汎発性血管内血液凝固症(DIC)、肝疾患で顕著に低下するなど種々の疾患、症状により変動するため、これら疾患のスクリーニング、病体解析、予後判定及び線溶療法時の薬効判定の指標となっている。
【0004】
従来、このような酵素阻害物質の測定法としては、測定対象である酵素阻害物質と過剰量の酵素とを反応させ、残存する酵素を測定することにより酵素阻害物質を測定することが行われている。例えば、生体試料(検体)中のα2PI量を測定する場合には、α2PIが酵素プラスミンを阻害することを利用して、一定量のプラスミンを検体中のα2PIと反応させた後、残存するプラスミンの活性を測定することにより、α2PI量を求めることが行われている。そして、この場合に、プラスミンの活性は、発色性合成基質の加水分解速度を吸光度変化をもって測定する方法などにより求められている。
【0005】
しかし、このような酵素阻害物質の多くはセリンプロテアーゼインヒビターであり、このような酵素阻害物質を測定するための酵素はセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼの多くは、自己の分子内に自己の基質となる部位が存在するため、溶液中で速やかに分解を起こし、プロテアーゼ活性あるいはプロテアーゼインヒビターとの結合活性の低下が認められることがある。例えば、α2PIの測定に用いられるプラスミンは、ヒト由来のものでは、37℃に1時間放置するとプロテアーゼ活性の72%が失活し、H鎖、L鎖共に分解が生じる(K.N.N.Reddy,Biochem.Biophys.Res.Commun.,92,1016−1022(1980))。
【0006】
一方、プラスミンのプロテアーゼ活性は、フィブリノーゲン、ε−アミノカプロン酸、高イオン強度、グリセロールの添加(J.Jespersen,Thromb.Res.,37,395−404(1986))、更に、ε−アミノカプロン酸やリジンの添加(K.N.N.Reddy,Progress inFibrinolysis,374−379(1981))等により、安定性が向上することが知られている。
しかしながら、これらの方法では極めて短時間の安定化が図れるのみであり、例えば37℃で1時間放置すると、活性は著しく低下してしまう。また、50%グリセロールのように、プロテアーゼ活性の安定性が比較的保てるものであっても、プロテアーゼインヒビターとの結合活性が低下するなどの問題があった(M.Shimokawa,Analytical Science,10,533−536(1994))。
【0007】
このため、このような酵素阻害物質の測定試薬は、プラスミンを溶液状態で保存できないことから、凍結乾燥品として製造されており、測定の際には用時調製が必要であり、経済性や操作性、迅速性などの点で問題があった。
また、従来用いられているプラスミン溶液では、粘性が高いことや、プラスミン活性及びプラスミンのα2PI結合活性が著しく低下するため、α2PIの測定試薬として自動分析機器に応用することは困難であった。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、プラスミンを溶液状態で保存してもプラスミン活性及びプラスミンのα2PIとの結合活性が、長期間安定に維持できるプラスミン溶液を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは鋭意研究を行った結果、プラスミンが基質を切断することにより生じる特定のアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いれば、プラスミンが長期間安定で、α2PI測定用試薬等として有用なプラスミン溶液が得られることを見出し、本発明を完成した。
【0010】
すなわち、本発明は、プラスミン、グリシルグリシン及び多価アルコール(全組成中に5〜30%)を含有するプラスミン溶液を提供するものである。
【0011】
本発明で用いられるプラスミンとしては、メチオニル型(そのN末がメチオニンである)、グルタミル型(そのN末がグルタミン酸である)、リジル型(そのN末がリジンである)などのいずれでも良く、クロモジェニックス社などから市販されているものを使用することができる。これらのプラスミンは単独又は混合物として用いることができ、活性として0.1〜10nkat/ml、特に0.3〜5nkat/mlとなるような範囲で用いるのが好ましい。なお、1nkatは、1秒間に1nmolのプラスミン合成基質(S−2251)を分解するプラスミン量をいう。
【0012】
本発明で用いられるアミノ酸のオリゴペプチドとしては、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びメチオニンから選ばれるアミノ酸の1種又は2種以上を組合わせたジペプチド、トリペプチド等が挙げられる。これらのうち、1種のアミノ酸からなるジペプチド又はトリペプチドが好ましく、特にグリシルグリシン、グリシルグリシルグリシン、アラニルアラニンが好ましい。
【0013】
これらのオリゴペプチドは、1種又は2種以上を組合わせて用いることができる。オリゴペプチドは、全組成中に1〜20重量%(以下、単に%で示す)、特に5〜20%配合するのが好ましい。また、溶液中のプラスミンに対して1〜2000mg/nkat、特に10〜700mg/nkatの範囲で配合するのが好ましい。
【0014】
また、これらのオリゴペプチドと、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びメチオニンから選ばれる1種又は2種以上のアミノ酸を組合わせて用いることができ、より安定なプラスミン溶液を得ることができる。この場合には、これらのアミノ酸は全組成中に1〜20%、特に5〜20%配合するのが好ましい。
【0015】
本発明のプラスミン溶液には、更に多価アルコールを配合することができ、より安定なプラスミン溶液を得ることができる。ここで、多価アルコールとしては、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等が好ましい。多価アルコールを配合する場合には、全組成中に1〜50%、特に5〜30%配合するのが好ましい。
【0016】
本発明のプラスミン溶液は、α2PIの測定試薬、プラスミンの標準液等として有用なものである。測定試薬とする場合には、通常用いられる発色性合成基質を使用することにより、検体中のα2PIを精度良く定量することができる。発色性合成基質としては、特に制限されず、例えばクロモジェニック社製のS−2251(H−D−Val−Leu−Lys−パラニトロアニリン)、S−2403(Glu−Phe−Lys−パラニトロアニリン)などを好適に使用することができる。
【0017】
【発明の効果】
本発明のプラスミン溶液は、長期間保存してもプラスミン活性及びα2PIとの結合活性が低下することなく、安定に維持され、α2PIの測定試薬等として有用である。また、溶液の状態で安定に保存することができるため、測定時にそのまま使用することができ、経済性及び操作性に優れ、簡便かつ迅速に測定を行うことができる。更に、粘性が低いため、自動分析機器にも好適に使用することができる。
【0018】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0019】
実施例1
下記組成の第1試薬250μl に、正常血漿検体(所定量のα2PIを含む)又は生理食塩液をそれぞれ3μl 加え、37℃で5分間反応させ、次いで下記組成の第2試薬100μl を添加した後、波長405nmでの吸光度の1分間当たりの変化量を測定した。生理食塩液を用いた時の吸光度の変化量はプラスミン活性を示し、プラスミンの合成基質(S−2251)を加水分解する力価を示している。また、生理食塩液のプラスミン活性から正常血漿検体を反応させた時のプラスミンの残存活性を減じた値がプラスミンのα2PI結合活性を示している。
なお、第2試薬のそれぞれのプラスミン溶解液は、表2に示す添加物を添加した20%グリセロール溶液を用いた。これら溶液は水酸化ナトリウム又は塩酸でpH7.4に調整し、プラスミンを溶解した後、半分を用いて作成当日に測定を行い、残り半分は密閉して37℃で4日間放置した後測定を行った。なお、比較として、50%グリセロール及び20%グリセロールを用いた。結果を表2に示す。
【0020】
【表1】
【0021】
【表2】
【0022】
表2の結果から明らかなように、グリシルグリシンを含有する本発明のプラスミン溶液は、プラスミン活性及びα2PI結合活性が低下することなく、安定に維持された。また、プラスミン溶液の粘性も低いものであった。
【0023】
実施例2
表3に示す組成の各種プラスミン溶液を用い、実施例1と同様にして、製造時及び37℃で2日間保存した後のプラスミン活性及びプラスミンのα2PI結合活性を測定した。結果を表3に示す。
【0024】
【表3】
【0025】
表3の結果から明らかなように、グリシルグリシンを含有する本発明のプラスミン溶液は、プラスミン活性及びα2PI結合活性が低下することなく、安定に維持された。また、プラスミン溶液の粘性も低いものであった。
【0026】
実施例3
表4に示す組成の各種プラスミン溶液を用い、実施例1と同様にして、製造時及び37℃で25日間保存した後のプラスミン活性及びプラスミンのα2PI結合活性を測定した。なお、生理食塩液及び正常血漿検体の液量は5μl とした。結果を表4に示す。
【0027】
【表4】
【0028】
表4の結果から明らかなように、グリシルグリシンを含有する本発明のプラスミン溶液は、プラスミン活性及びα2PI結合活性が低下することなく、安定に維持された。また、プラスミン溶液の粘性も低いものであった。
【0029】
実施例4
表5に示す組成の各種プラスミン溶液を用い、実施例1と同様にして、製造時及び37℃で9日間保存した後のプラスミン活性及びプラスミンα2PI結合活性を測定した。なお、生理食塩液及び正常血漿液検体の液量は5μl とした。結果を表5に示す。
【0030】
【表5】
【0031】
表5の結果から明らかなように、グリシルグリシンを含有する本発明のプラスミン溶液は、プラスミン活性及びα2PI結合活性が低下することなく、安定に維持された。
また、No.2の10%グリシルグリシン及び10%グリセロールを含有するプラスミン溶液の粘度は、VISCOMATE(ヤマイチ電機工業社製)を用いて25℃において測定したときに1.89cpであった。これに対し、50%グリセロールを含有するプラスミン溶液の25℃における粘度は6.98cpであった。本発明のプラスミン溶液は粘性も低いものであり、自動分析機器にも使用可能である。
【0032】
実施例5
10%グリセロールを含む10%グリシルグリシンのプラスミン溶液を用い、実施例1と同様にして、0〜200%濃度のα2PI検体(n=2測定)及び50又は100%濃度のα2PI検体(n=10測定)の活性測定を行い、検量線性及び再現性の検討をした。なお、検量線性の検討では、正常血漿検体の原液を200%濃度のα2PIとして設定したため、検体量は10μlとした。また、再現性の検討では、正常血漿検体の原液を100%濃度のα2PIとして設定したため、検体量は5μlとした。結果を図1及び表6に示す。
【0033】
【表6】
【0034】
図1の結果より、検量線性は良好であり、表6の結果より、再現性も良好であった。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例5において、検量線性を検討したときの、α2PI濃度と測定値(ΔAbs/min)の関係を示す図である。
Claims (4)
- プラスミン、グリシルグリシン及び多価アルコール(全組成中に5〜30%)を含有するプラスミン溶液。
- 更に、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びメチオニンから選ばれる1種以上のアミノ酸を含有する請求項1記載のプラスミン溶液。
- プラスミン溶液に、グリシルグリシン及び多価アルコール(全組成中に5〜30%)を添加することを特徴とするプラスミン溶液の安定化方法。
- 更に、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びメチオニンから選ばれる1種以上のアミノ酸を添加する請求項3記載のプラスミン溶液の安定化方法。
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-
1995
- 1995-06-26 JP JP15933095A patent/JP3761925B2/ja not_active Expired - Lifetime
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