JP3404731B2 - ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬 - Google Patents
ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬Info
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- JP3404731B2 JP3404731B2 JP00923796A JP923796A JP3404731B2 JP 3404731 B2 JP3404731 B2 JP 3404731B2 JP 00923796 A JP00923796 A JP 00923796A JP 923796 A JP923796 A JP 923796A JP 3404731 B2 JP3404731 B2 JP 3404731B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ロイシンアミノペ
プチダーゼ（以下、ＬＡＰと略す）活性の測定試薬に関
する。より詳しくは、ＬＡＰ活性の測定において、基質
として用いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドまたは
その塩の安定化に関するものである。
プチダーゼ（以下、ＬＡＰと略す）活性の測定試薬に関
する。より詳しくは、ＬＡＰ活性の測定において、基質
として用いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドまたは
その塩の安定化に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＬＡＰは、Ｎ末端がロイシンであるペプ
チドを加水分解する酵素であり、生体内の各組織に広く
分布する。血清中のＬＡＰ活性値の測定は肝機能障害、
肝胆道疾患、糖尿病、転移性肝癌、膵頭部癌などにおけ
る診断や予後の観察に欠かすことのできない重要な検査
項目の一つである。
チドを加水分解する酵素であり、生体内の各組織に広く
分布する。血清中のＬＡＰ活性値の測定は肝機能障害、
肝胆道疾患、糖尿病、転移性肝癌、膵頭部癌などにおけ
る診断や予後の観察に欠かすことのできない重要な検査
項目の一つである。
【０００３】ＬＡＰの測定方法としては、Ｌ−ロイシン
−β−ナフチルアミドを基質とし、ＬＡＰにより遊離す
るβ−ナフチルアミンを発色して測定する方法が用いら
れてきたが、この方法は反応過程が複雑で、かつ厳密な
操作を必要とすることなど検査法としては不便であるこ
とや、標準物質であるβ−ナフチルアミンが発癌物質で
あるなどの問題があった。
−β−ナフチルアミドを基質とし、ＬＡＰにより遊離す
るβ−ナフチルアミンを発色して測定する方法が用いら
れてきたが、この方法は反応過程が複雑で、かつ厳密な
操作を必要とすることなど検査法としては不便であるこ
とや、標準物質であるβ−ナフチルアミンが発癌物質で
あるなどの問題があった。
【０００４】ＧＳＣＣ（German Society for Clinical
Chemistry）では、基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニト
ロアニリドを用いる試薬処方がＬＡＰの測定方法として
推奨されている。しかし、この基質は水に難溶であると
いう欠点があった。このため、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニト
ロアニリドを無機酸の塩あるいは有機酸の塩に変えて可
溶化する方法（特開昭５０−１０５６１８号公報）が提
案されている。しかしながら、これらの基質を溶解状態
で保存すると、酸素が存在しなくても分解して（以下こ
れを非酵素的分解とよぶ。）、発色物質のｐ−ニトロア
ニリンを遊離するという問題がある。
Chemistry）では、基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニト
ロアニリドを用いる試薬処方がＬＡＰの測定方法として
推奨されている。しかし、この基質は水に難溶であると
いう欠点があった。このため、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニト
ロアニリドを無機酸の塩あるいは有機酸の塩に変えて可
溶化する方法（特開昭５０−１０５６１８号公報）が提
案されている。しかしながら、これらの基質を溶解状態
で保存すると、酸素が存在しなくても分解して（以下こ
れを非酵素的分解とよぶ。）、発色物質のｐ−ニトロア
ニリンを遊離するという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記事情に鑑
みてなされたもので、ＬＡＰ活性の測定に基質として用
いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドの保存中の非酵
素的な分解を抑制し、経時安定性を高めることを目的と
する。
みてなされたもので、ＬＡＰ活性の測定に基質として用
いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドの保存中の非酵
素的な分解を抑制し、経時安定性を高めることを目的と
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｌ−ロイシン
−ｐ−ニトロアニリドまたはその塩を基質として用いる
ＬＡＰ活性測定用試薬の基質を含む溶液中のｐＨが２〜
５に調製されていることを特徴とするＬＡＰ活性測定用
試薬を要旨とする。すなわち、本発明はL−ロイシン−p
−ニトロアニリドまたはその塩を含み、ｐHが２〜５に
調製されている溶液およびｐＨ７．０〜８．０で緩衝能
を有する溶液からなることを特徴とするロイシンアミノ
ペプチダーゼ活性測定用試薬である。本発明の試薬を用
いれば、基質の非酵素的な分解を抑制することができ、
精度よく測定することができる。
−ｐ−ニトロアニリドまたはその塩を基質として用いる
ＬＡＰ活性測定用試薬の基質を含む溶液中のｐＨが２〜
５に調製されていることを特徴とするＬＡＰ活性測定用
試薬を要旨とする。すなわち、本発明はL−ロイシン−p
−ニトロアニリドまたはその塩を含み、ｐHが２〜５に
調製されている溶液およびｐＨ７．０〜８．０で緩衝能
を有する溶液からなることを特徴とするロイシンアミノ
ペプチダーゼ活性測定用試薬である。本発明の試薬を用
いれば、基質の非酵素的な分解を抑制することができ、
精度よく測定することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明において、ロイシンアミノ
ペプチダーゼ活性測定試薬は基質を含む溶液と測定時の
ｐＨを調整する溶液の２試薬で構成される。このため、
基質としては溶解性に優れるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロ
アニリドの塩を使用することが好ましい。この塩の種類
としては塩酸、硫酸等の無機酸の塩および酢酸等の有機
酸の塩のいずれであってもよい。また、ＬＡＰ活性を測
定するための感度を保持するために基質の含有量は、２
〜１２０ｍＭ／１であることが好ましい。２ｍＭより少
ないと反応性が悪くなり、１２０ｍＭより多いとブラン
クでの吸光度が高すぎて充分な測定範囲が得られない。
ペプチダーゼ活性測定試薬は基質を含む溶液と測定時の
ｐＨを調整する溶液の２試薬で構成される。このため、
基質としては溶解性に優れるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロ
アニリドの塩を使用することが好ましい。この塩の種類
としては塩酸、硫酸等の無機酸の塩および酢酸等の有機
酸の塩のいずれであってもよい。また、ＬＡＰ活性を測
定するための感度を保持するために基質の含有量は、２
〜１２０ｍＭ／１であることが好ましい。２ｍＭより少
ないと反応性が悪くなり、１２０ｍＭより多いとブラン
クでの吸光度が高すぎて充分な測定範囲が得られない。
【０００８】本発明においてＬ−ロイシン−ｐ−ニトロ
アニリドを含む水溶液のｐＨを２〜５に調整する方法と
しては、緩衝液を使用する。例えば、塩化カリウム−塩
酸緩衝液、塩化ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐ−トルエン
スルホン酸−ｐ−ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩
衝液、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−
クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−リン酸２ナトリ
ウム緩衝液、β−β’−ジメチルグルタル酸−水酸化ナ
トリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク
酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸水素カリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液などが挙げられ、これらの緩衝
液を用いて基質を含む溶液中のｐＨを２〜５にする。こ
の範囲から外れると基質の非酵素的な分解が大きくなる
ため好ましくない。また、ｐＨ２より低いと反応時のｐ
Ｈのコントロールに影響を与えるため好ましくなく、ｐ
Ｈ５より高いと基質の溶解性が低下するため好ましくな
い。
アニリドを含む水溶液のｐＨを２〜５に調整する方法と
しては、緩衝液を使用する。例えば、塩化カリウム−塩
酸緩衝液、塩化ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐ−トルエン
スルホン酸−ｐ−ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩
衝液、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−
クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−リン酸２ナトリ
ウム緩衝液、β−β’−ジメチルグルタル酸−水酸化ナ
トリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク
酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸水素カリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液などが挙げられ、これらの緩衝
液を用いて基質を含む溶液中のｐＨを２〜５にする。こ
の範囲から外れると基質の非酵素的な分解が大きくなる
ため好ましくない。また、ｐＨ２より低いと反応時のｐ
Ｈのコントロールに影響を与えるため好ましくなく、ｐ
Ｈ５より高いと基質の溶解性が低下するため好ましくな
い。
【０００９】本発明における測定時のｐＨを調整する溶
液には、ｐＨ７．０〜８．０で緩衝能を有するものを使
用する。例えば、ＭＯＰＳ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥ
Ｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒ
ｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝
液、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝
液などが挙げられる。これらの緩衝液の濃度としては２
０ｍＭ〜１Ｍであることが好ましい。
液には、ｐＨ７．０〜８．０で緩衝能を有するものを使
用する。例えば、ＭＯＰＳ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥ
Ｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒ
ｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝
液、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝
液などが挙げられる。これらの緩衝液の濃度としては２
０ｍＭ〜１Ｍであることが好ましい。
【００１０】
基質であるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドの保存中
の非酵素的な分解の抑制効果を検討するため、温度６０
℃の恒温器中でシミュレーション試験を行った。なお、
測定試料は生理食塩水を用い、第１試薬は１００ｍＭの
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）を使用し、第２試薬は１
２ｍＭのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩を精
製水に溶解し、塩化ナトリウム−塩酸緩衝液でｐＨの調
整を行ったものを使用した。測定は第１試薬２５０μｌ
と生理食塩水８μｌを３７℃で５分間あらかじめインキ
ュベートした後、第２試薬１２５μｌを加えて、さらに
１分間インキュベートを行い、吸光度を測定した。その
結果を表１に示す。吸光度の測定は主波長４０５ｎｍ、
副波長５０５ｎｍで行い、表中の数値は吸光度（mAbs）
を表す。
の非酵素的な分解の抑制効果を検討するため、温度６０
℃の恒温器中でシミュレーション試験を行った。なお、
測定試料は生理食塩水を用い、第１試薬は１００ｍＭの
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）を使用し、第２試薬は１
２ｍＭのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩を精
製水に溶解し、塩化ナトリウム−塩酸緩衝液でｐＨの調
整を行ったものを使用した。測定は第１試薬２５０μｌ
と生理食塩水８μｌを３７℃で５分間あらかじめインキ
ュベートした後、第２試薬１２５μｌを加えて、さらに
１分間インキュベートを行い、吸光度を測定した。その
結果を表１に示す。吸光度の測定は主波長４０５ｎｍ、
副波長５０５ｎｍで行い、表中の数値は吸光度（mAbs）
を表す。
【００１１】
【表１】
【００１２】表１に示す通り、ｐＨ２〜ｐＨ５において
基質溶液の吸光度の上昇は抑えられ、基質の非酵素的な
分解を抑制する効果が顕著に現れた。
基質溶液の吸光度の上昇は抑えられ、基質の非酵素的な
分解を抑制する効果が顕著に現れた。
【００１３】〔実施例２〕
実施例１における測定試料を管理血清に置き換え、基質
液中のｐＨがＬＡＰ活性値に及ぼす影響について検討を
行った。測定は第１試薬２５０μｌと管理血清８μｌを
３７℃で５分間あらかじめインキュベートした後、第２
試薬１２５μｌを加えて、さらにインキュベートを行
い、１分後から５分後までの吸光度の変化を測定して、
ｐ−ニトロアニリンの分子吸光係数からＬＡＰ活性値を
求めた。この結果を表２に示す。なお、表中の数値は国
際単位（IU／L）で表す。
液中のｐＨがＬＡＰ活性値に及ぼす影響について検討を
行った。測定は第１試薬２５０μｌと管理血清８μｌを
３７℃で５分間あらかじめインキュベートした後、第２
試薬１２５μｌを加えて、さらにインキュベートを行
い、１分後から５分後までの吸光度の変化を測定して、
ｐ−ニトロアニリンの分子吸光係数からＬＡＰ活性値を
求めた。この結果を表２に示す。なお、表中の数値は国
際単位（IU／L）で表す。
【００１４】
【表２】
【００１５】表２の結果から、ｐＨ２〜ｐＨ５の場合
は、２週間経過後でも血清中のＬＡＰ活性値はほぼ同じ
値であった。一方、ｐＨ２より低い場合およびｐＨ５よ
り高い場合ではＬＡＰ活性値が低下しており、保存中の
基質分解による影響が見られた。
は、２週間経過後でも血清中のＬＡＰ活性値はほぼ同じ
値であった。一方、ｐＨ２より低い場合およびｐＨ５よ
り高い場合ではＬＡＰ活性値が低下しており、保存中の
基質分解による影響が見られた。
【００１６】
【発明の効果】本発明のように、基質であるＬ−ロイシ
ン−ｐ−ニトロアニリドを含む溶液中のｐＨを２〜５に
維持することで、基質の非酵素的な分解を効果的に抑制
することができる。このため従来のように保存条件を冷
蔵保存に依存することなく、常温での保存ができるた
め、輸送や保管において扱いやすく、経済的にも安価な
試薬を提供することが可能である。
ン−ｐ−ニトロアニリドを含む溶液中のｐＨを２〜５に
維持することで、基質の非酵素的な分解を効果的に抑制
することができる。このため従来のように保存条件を冷
蔵保存に依存することなく、常温での保存ができるた
め、輸送や保管において扱いやすく、経済的にも安価な
試薬を提供することが可能である。
Claims (2)
- 【請求項１】 L−ロイシン−p−ニトロアニリドまたは
その塩を含み、ｐHが２〜５に調製されている溶液およ
びｐＨ７．０〜８．０で緩衝能を有する溶液からなるこ
とを特徴とするロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用
試薬。 - 【請求項２】 前記Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド
の含有量が２〜１２０ｍＭ／１であることを特徴とする
請求項１記載のロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用
試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00923796A JP3404731B2 (ja) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00923796A JP3404731B2 (ja) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09191898A JPH09191898A (ja) | 1997-07-29 |
| JP3404731B2 true JP3404731B2 (ja) | 2003-05-12 |
Family
ID=11714802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00923796A Expired - Fee Related JP3404731B2 (ja) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3404731B2 (ja) |
-
1996
- 1996-01-23 JP JP00923796A patent/JP3404731B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09191898A (ja) | 1997-07-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |