JPH07135997A - アミラーゼ活性測定用試薬 - Google Patents
アミラーゼ活性測定用試薬Info
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- JPH07135997A JPH07135997A JP30978493A JP30978493A JPH07135997A JP H07135997 A JPH07135997 A JP H07135997A JP 30978493 A JP30978493 A JP 30978493A JP 30978493 A JP30978493 A JP 30978493A JP H07135997 A JPH07135997 A JP H07135997A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 保存安定性を有する液状のアミラーゼ活性測
定用試薬を提供する。 【構成】 ３−ケトブチリデン−β−２−クロロ−４−
ニトロフェニルマルトペンタオサイド（Ｂ−Ｇ５−β−
ＣＮＰ）からアミラーゼにより生成されるβ−２−クロ
ロ−４−ニトロフェニルマルトトリオサイド（又はマル
トサイド）をα−及びβ−グルコシダーゼで２−クロロ
−４−ニトロフェノールに変え、その増加量を測定する
試薬において、Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ含有第一試薬（ｐ
Ｈ４〜７）とα−及びβ−グルコシダーゼ含有第二試薬
（ｐＨ６〜８）とからなり、第一及び／又は第二試薬に
Ｃａ2+及び塩素イオンを存在させる。 【効果】 液状で長期間安定に保存しておき、使用に際
して溶解操作の必要なく、そのまま自動分析機などに適
用できる。
定用試薬を提供する。 【構成】 ３−ケトブチリデン−β−２−クロロ−４−
ニトロフェニルマルトペンタオサイド（Ｂ−Ｇ５−β−
ＣＮＰ）からアミラーゼにより生成されるβ−２−クロ
ロ−４−ニトロフェニルマルトトリオサイド（又はマル
トサイド）をα−及びβ−グルコシダーゼで２−クロロ
−４−ニトロフェノールに変え、その増加量を測定する
試薬において、Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ含有第一試薬（ｐ
Ｈ４〜７）とα−及びβ−グルコシダーゼ含有第二試薬
（ｐＨ６〜８）とからなり、第一及び／又は第二試薬に
Ｃａ2+及び塩素イオンを存在させる。 【効果】 液状で長期間安定に保存しておき、使用に際
して溶解操作の必要なく、そのまま自動分析機などに適
用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アミラーゼ活性測定用
試薬に関する。より詳細には、長期間安定なアミラーゼ
活性測定用の改良された液状試薬に関する。
試薬に関する。より詳細には、長期間安定なアミラーゼ
活性測定用の改良された液状試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミラーゼはデンプンを加水分解する酵
素の総称で、α−、β−及びγ−アミラーゼがある。ヒ
トのアミラーゼはα−アミラーゼのみで、その大部分は
唾液及び膵液に由来する。その他で報告されている器官
には、肺、肝、腎、小腸、心筋、乳腺及び脂肪組織など
があるが、これらのアミラーゼ量は非常に少ない。Ｗｏ
ｈｌｇｅｍｕｔｈが血中及び尿中のアミラーゼ活性測定
法を開発してから、それが臨床的に応用され、１９２９
年にはＥｌｍａｎらにより急性膵炎時の高アミラーゼ血
症が報告された。その後、耳下腺炎の他、肺癌など異所
性アミラーゼ産生腫瘍の診断にも応用されている。
素の総称で、α−、β−及びγ−アミラーゼがある。ヒ
トのアミラーゼはα−アミラーゼのみで、その大部分は
唾液及び膵液に由来する。その他で報告されている器官
には、肺、肝、腎、小腸、心筋、乳腺及び脂肪組織など
があるが、これらのアミラーゼ量は非常に少ない。Ｗｏ
ｈｌｇｅｍｕｔｈが血中及び尿中のアミラーゼ活性測定
法を開発してから、それが臨床的に応用され、１９２９
年にはＥｌｍａｎらにより急性膵炎時の高アミラーゼ血
症が報告された。その後、耳下腺炎の他、肺癌など異所
性アミラーゼ産生腫瘍の診断にも応用されている。
【０００３】従来から、種々のアミラーゼ活性測定法が
提案されてきた。例えば、下記の式（１）及び式（２）
の反応で生成される２−クロロ−４−ニトロフェノール
（以下、ＣＮＰと称することがある）の増加速度を測定
することにより、アミラーゼ活性を求める測定方法があ
る。
提案されてきた。例えば、下記の式（１）及び式（２）
の反応で生成される２−クロロ−４−ニトロフェノール
（以下、ＣＮＰと称することがある）の増加速度を測定
することにより、アミラーゼ活性を求める測定方法があ
る。
【０００４】
【数１】
【０００５】前記の式（１）及び式（２）において、Ｂ
−Ｇ５−β−ＣＮＰは３−ケトブチリデン−β−２−ク
ロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオサイドであ
り、Ｇ３−β−ＣＮＰはβ−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニルマルトトリオサイドであり、Ｇ２−β−ＣＮＰは
β−２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトサイドであ
る。
−Ｇ５−β−ＣＮＰは３−ケトブチリデン−β−２−ク
ロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオサイドであ
り、Ｇ３−β−ＣＮＰはβ−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニルマルトトリオサイドであり、Ｇ２−β−ＣＮＰは
β−２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトサイドであ
る。
【０００６】また、下記の式（３）、式（４）及び式
（５）の反応で生成されるキノイド色素の増加速度を測
定することにより、アミラーゼ活性を求める測定方法も
知られている。
（５）の反応で生成されるキノイド色素の増加速度を測
定することにより、アミラーゼ活性を求める測定方法も
知られている。
【０００７】
【数２】
【０００８】前記の式（３）〜式（５）において、ＣＭ
Ｓはカルボキシメチルスターチであり、ＧＡはグルコア
ミラーゼであり、ＧＯＤはグルコースオキシダーゼであ
り、ＰＯＤはペルオキシダーゼであり、４ＡＡＰは４−
アミノアンチピリンであり、ＥＳＰＴはＮ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｍ−トルイジンである。
Ｓはカルボキシメチルスターチであり、ＧＡはグルコア
ミラーゼであり、ＧＯＤはグルコースオキシダーゼであ
り、ＰＯＤはペルオキシダーゼであり、４ＡＡＰは４−
アミノアンチピリンであり、ＥＳＰＴはＮ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｍ−トルイジンである。
【０００９】更に、下記の式（６）及び式（７）の反応
で生成されるＣＮＰの増加速度を測定して、アミラーゼ
活性を求める測定方法も知られている。
で生成されるＣＮＰの増加速度を測定して、アミラーゼ
活性を求める測定方法も知られている。
【００１０】
【数３】
【００１１】前記の式（６）及び式（７）において、Ｇ
５−β−ＣＮＰはβ−２−クロロ−４−ニトロフェニル
マルトペンタオサイドであり、Ｇ３はマルトトリオース
であり、Ｇ２−β−ＣＮＰはβ−２−クロロ−４−ニト
ロフェニルマルトサイドであり、ＣＮＰは２−クロロ−
４−ニトロフェノールである。
５−β−ＣＮＰはβ−２−クロロ−４−ニトロフェニル
マルトペンタオサイドであり、Ｇ３はマルトトリオース
であり、Ｇ２−β−ＣＮＰはβ−２−クロロ−４−ニト
ロフェニルマルトサイドであり、ＣＮＰは２−クロロ−
４−ニトロフェノールである。
【００１２】更にまた、下記の式（８）及び式（９）の
反応で生成されるｐＮＰの増加速度を測定して、アミラ
ーゼ活性を求める測定方法も知られている。
反応で生成されるｐＮＰの増加速度を測定して、アミラ
ーゼ活性を求める測定方法も知られている。
【００１３】
【数４】
【００１４】前記の式（８）及び式（９）において、３
ｐＮＰ−Ｇ７はｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオサイ
ドであり、ｐＮＰ−Ｇ４はｐ−ニトロフェニルマルトテ
トラオサイドであり、ｐＮＰ−Ｇ３はｐ−ニトロフェニ
ルマルトトリオサイドであり、ｐＮＰはｐ−ニトロフェ
ノールである。
ｐＮＰ−Ｇ７はｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオサイ
ドであり、ｐＮＰ−Ｇ４はｐ−ニトロフェニルマルトテ
トラオサイドであり、ｐＮＰ−Ｇ３はｐ−ニトロフェニ
ルマルトトリオサイドであり、ｐＮＰはｐ−ニトロフェ
ノールである。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】上記の各種測定方法の
うち、式（１）及び式（２）の反応系を用いたアミラー
ゼ活性測定法は、基質の構造が明確で、化学量論的に反
応が進み、しかも反応生成物がアミラーゼの至適ｐＨ
７．０付近で１００％に近いイオン化率を得られるの
で、高感度で再現性が良好な測定を行うことができる優
れた方法である。しかしながら、従来、この反応系を利
用するアミラーゼ活性測定用試薬では、長期間安定に保
存することのできる液状試薬は開発されていなかった。
すなわち、従来は、試薬構成成分の安定性を主目的とし
て、凍結乾燥体の形で大部分が供給されていたので、そ
の凍結乾燥体から、検査現場で測定用試薬を調製して用
いていた。しかし、臨床検査の現場における作業性や効
率の向上のため、近年は特に、調製工程を必要としない
で直接検査工程で使用することのできる液状形態での試
薬供給が求められていた。
うち、式（１）及び式（２）の反応系を用いたアミラー
ゼ活性測定法は、基質の構造が明確で、化学量論的に反
応が進み、しかも反応生成物がアミラーゼの至適ｐＨ
７．０付近で１００％に近いイオン化率を得られるの
で、高感度で再現性が良好な測定を行うことができる優
れた方法である。しかしながら、従来、この反応系を利
用するアミラーゼ活性測定用試薬では、長期間安定に保
存することのできる液状試薬は開発されていなかった。
すなわち、従来は、試薬構成成分の安定性を主目的とし
て、凍結乾燥体の形で大部分が供給されていたので、そ
の凍結乾燥体から、検査現場で測定用試薬を調製して用
いていた。しかし、臨床検査の現場における作業性や効
率の向上のため、近年は特に、調製工程を必要としない
で直接検査工程で使用することのできる液状形態での試
薬供給が求められていた。
【００１６】しかしながら、この系で使用する酵素や基
質を溶液状態で長期間安定に保存することができ、しか
も、アミラーゼの至適ｐＨであるｐＨ７．０付近に反応
ｐＨを設定することは極めて困難だと思われた。即ち、
α−アミラーゼの至適ｐＨであるｐＨ７．０付近ではα
−グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼは安定性を保て
るが、基質であるＢ−Ｇ５−β−ＣＮＰが水解され、ア
グリコンのＣＮＰが生成し、吸光度の上昇が見られるた
め、長期保存ができない。本発明者らはこうした問題点
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、基質の安定化を図
るために、（ａ）ｐＨを酸性にした基質含有試薬と、
（ｂ）アミラーゼ反応時ｐＨをｐＨ７．０付近になるよ
うに設定した酵素含有試薬との２試薬に分けて構成する
ことにより、前記の目的を達成することができることを
見出した。本発明は、こうした知見に基づくものであ
る。
質を溶液状態で長期間安定に保存することができ、しか
も、アミラーゼの至適ｐＨであるｐＨ７．０付近に反応
ｐＨを設定することは極めて困難だと思われた。即ち、
α−アミラーゼの至適ｐＨであるｐＨ７．０付近ではα
−グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼは安定性を保て
るが、基質であるＢ−Ｇ５−β−ＣＮＰが水解され、ア
グリコンのＣＮＰが生成し、吸光度の上昇が見られるた
め、長期保存ができない。本発明者らはこうした問題点
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、基質の安定化を図
るために、（ａ）ｐＨを酸性にした基質含有試薬と、
（ｂ）アミラーゼ反応時ｐＨをｐＨ７．０付近になるよ
うに設定した酵素含有試薬との２試薬に分けて構成する
ことにより、前記の目的を達成することができることを
見出した。本発明は、こうした知見に基づくものであ
る。
【００１７】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、３−
ケトブチリデン−β−２−クロロ−４−ニトロフェニル
マルトペンタオサイド（Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ）を基質
としてアミラーゼによって生成されるβ−２−クロロ−
４−ニトロフェニルマルトトリオサイド（Ｇ３−β−Ｃ
ＮＰ）又はβ−２−クロロ−４−ニトロフェニルマルト
サイド（Ｇ２−β−ＣＮＰ）を更にα−グルコシダーゼ
及びβ−グルコシダーゼによって２−クロロ−４−ニト
ロフェノール（ＣＮＰ）及びグルコースに変え、前記の
２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）量の増加
量を測定することからなる前記アミラーゼの測定法の試
薬において、少なくとも３−ケトブチリデン−β−２−
クロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオサイド（Ｂ
−Ｇ５−β−ＣＮＰ）を含有する第一試薬と、少なくと
もα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼを含有す
る第二試薬とからなり、第一試薬のｐＨが４〜７（特に
は４．０〜７．０）であり、第二試薬のｐＨが６〜８
（特には６．０〜８．０）であり、前記第一試薬及び／
又は第二試薬にＣａ2+イオン及び塩素イオンを存在さ
せ、そしてそれぞれ液状試薬であることを特徴とする、
アミラーゼ活性測定用試薬に関する。
ケトブチリデン−β−２−クロロ−４−ニトロフェニル
マルトペンタオサイド（Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ）を基質
としてアミラーゼによって生成されるβ−２−クロロ−
４−ニトロフェニルマルトトリオサイド（Ｇ３−β−Ｃ
ＮＰ）又はβ−２−クロロ−４−ニトロフェニルマルト
サイド（Ｇ２−β−ＣＮＰ）を更にα−グルコシダーゼ
及びβ−グルコシダーゼによって２−クロロ−４−ニト
ロフェノール（ＣＮＰ）及びグルコースに変え、前記の
２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）量の増加
量を測定することからなる前記アミラーゼの測定法の試
薬において、少なくとも３−ケトブチリデン−β−２−
クロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオサイド（Ｂ
−Ｇ５−β−ＣＮＰ）を含有する第一試薬と、少なくと
もα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼを含有す
る第二試薬とからなり、第一試薬のｐＨが４〜７（特に
は４．０〜７．０）であり、第二試薬のｐＨが６〜８
（特には６．０〜８．０）であり、前記第一試薬及び／
又は第二試薬にＣａ2+イオン及び塩素イオンを存在さ
せ、そしてそれぞれ液状試薬であることを特徴とする、
アミラーゼ活性測定用試薬に関する。
【００１８】以下、本発明をより詳細に説明する。本発
明の液状試薬は、前記の式（１）及び式（２）の反応を
利用してＣＮＰを生成させ、その増加速度を測定するこ
とにより、アミラーゼ活性を求める測定方法に用いるも
のである。アミラーゼ測定で使用する酵素や基質を安定
な条件で、なおかつ、反応ｐＨを、アミラーゼの至適ｐ
ＨであるｐＨ７．０付近に設定するために、まずｐＨを
酸性にした基質含有試薬（第一試薬）を調製する。基質
含有試薬のｐＨはｐＨ７以下が適当であり、特にｐＨ
４．０〜ｐＨ７．０が好ましい。ｐＨ７より高いと基質
の安定性が悪くなり、ｐＨ４より低いと保存中に基質が
塩析しやすくなる。また、アミラーゼ反応時ｐＨがｐＨ
７（特にｐＨ７．０）付近になるように設定するため、
この基質含有試薬には緩衝能の弱い緩衝液を用いるのが
好ましい。酸性条件下で緩衝能の弱い緩衝液は特に限定
されず、任意の緩衝液を用いることができる。また、基
質含有試薬の緩衝液に、酸性条件下で緩衝能の強い緩衝
液を用いることもできるが、その場合は、できるだけ低
濃度（具体的には０．１〜１００ｍＭ、特に１〜１０ｍ
Ｍ）で使用するのが好ましい。緩衝能の強い緩衝液とし
ては、例えば、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液又は酒石酸緩衝液等を挙げることができる。
明の液状試薬は、前記の式（１）及び式（２）の反応を
利用してＣＮＰを生成させ、その増加速度を測定するこ
とにより、アミラーゼ活性を求める測定方法に用いるも
のである。アミラーゼ測定で使用する酵素や基質を安定
な条件で、なおかつ、反応ｐＨを、アミラーゼの至適ｐ
ＨであるｐＨ７．０付近に設定するために、まずｐＨを
酸性にした基質含有試薬（第一試薬）を調製する。基質
含有試薬のｐＨはｐＨ７以下が適当であり、特にｐＨ
４．０〜ｐＨ７．０が好ましい。ｐＨ７より高いと基質
の安定性が悪くなり、ｐＨ４より低いと保存中に基質が
塩析しやすくなる。また、アミラーゼ反応時ｐＨがｐＨ
７（特にｐＨ７．０）付近になるように設定するため、
この基質含有試薬には緩衝能の弱い緩衝液を用いるのが
好ましい。酸性条件下で緩衝能の弱い緩衝液は特に限定
されず、任意の緩衝液を用いることができる。また、基
質含有試薬の緩衝液に、酸性条件下で緩衝能の強い緩衝
液を用いることもできるが、その場合は、できるだけ低
濃度（具体的には０．１〜１００ｍＭ、特に１〜１０ｍ
Ｍ）で使用するのが好ましい。緩衝能の強い緩衝液とし
ては、例えば、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液又は酒石酸緩衝液等を挙げることができる。
【００１９】前記の第一試薬に含有させるＢ−Ｇ５−β
−ＣＮＰは、反応条件により適宜設定し得るが、少なく
とも１．０ｍＭ以上であれば良く、好ましくは３．０ｍ
Ｍ以上含有させる。
−ＣＮＰは、反応条件により適宜設定し得るが、少なく
とも１．０ｍＭ以上であれば良く、好ましくは３．０ｍ
Ｍ以上含有させる。
【００２０】本発明では、更に、前記の基質含有試薬
（第一試薬）と混合した場合にアミラーゼ反応時ｐＨが
ｐＨ７（特にｐＨ７．０）付近になるように設定した酵
素含有試薬（第二試薬）を調製する。アミラーゼ活性測
定に使用する酵素であるα−グルコシダーゼ及びβ−グ
ルコシダーゼは中性付近で安定なため、酵素含有試薬そ
れ自体のｐＨもｐＨ７付近に設定する。ここで、基質含
有試薬（第一試薬）は緩衝能は少ないものの、酸性であ
るため、酵素含有試薬（第二試薬）にはｐＨ７（特にｐ
Ｈ７．０）付近に緩衝能のある緩衝液を用いる。具体的
には、ｐＨ６〜ｐＨ８（特にｐＨ６．０〜ｐＨ８．
０）、好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。このｐＨ
範囲を外れるとα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダ
ーゼが不安定になる。酵素含有試薬（第二試薬）で用い
ることのできる緩衝液としては、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’
ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液、リン酸緩衝液、
種々のグッド緩衝液等を挙げることができる。
（第一試薬）と混合した場合にアミラーゼ反応時ｐＨが
ｐＨ７（特にｐＨ７．０）付近になるように設定した酵
素含有試薬（第二試薬）を調製する。アミラーゼ活性測
定に使用する酵素であるα−グルコシダーゼ及びβ−グ
ルコシダーゼは中性付近で安定なため、酵素含有試薬そ
れ自体のｐＨもｐＨ７付近に設定する。ここで、基質含
有試薬（第一試薬）は緩衝能は少ないものの、酸性であ
るため、酵素含有試薬（第二試薬）にはｐＨ７（特にｐ
Ｈ７．０）付近に緩衝能のある緩衝液を用いる。具体的
には、ｐＨ６〜ｐＨ８（特にｐＨ６．０〜ｐＨ８．
０）、好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。このｐＨ
範囲を外れるとα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダ
ーゼが不安定になる。酵素含有試薬（第二試薬）で用い
ることのできる緩衝液としては、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’
ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液、リン酸緩衝液、
種々のグッド緩衝液等を挙げることができる。
【００２１】本発明の第二試薬に用いられる酵素として
は特に制限されないが、例えば、微生物〔例えば、サッ
カロマイス（Saccharomycessp ）〕由来のα−グルコシ
ダーゼや、スウィートアーモンド（Sweet almond）由来
のβ−グルコシダーゼを挙げることができる。これら酵
素の添加量としては、５００Ｕ以上、好ましくは１００
０〜１００００Ｕを適宜選択して用いればよい。
は特に制限されないが、例えば、微生物〔例えば、サッ
カロマイス（Saccharomycessp ）〕由来のα−グルコシ
ダーゼや、スウィートアーモンド（Sweet almond）由来
のβ−グルコシダーゼを挙げることができる。これら酵
素の添加量としては、５００Ｕ以上、好ましくは１００
０〜１００００Ｕを適宜選択して用いればよい。
【００２２】本発明の試薬には、アミラーゼ酵素保護剤
であるカルシウムイオン、及びα−アミラーゼの賦活剤
である塩素イオンを同時にあるいは別々に前記第一試薬
及び第二試薬の両方あるいはどちらか一方に存在させる
必要がある。カルシウムイオン及び塩素イオンは任意の
形で含有させることができるが、例えば、塩化カルシウ
ム、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウム等を好適に
用いられ、これらを単独あるいは複数組合せて、濃度と
して０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１．０〜１００ｍ
Ｍの範囲で用いることができる。
であるカルシウムイオン、及びα−アミラーゼの賦活剤
である塩素イオンを同時にあるいは別々に前記第一試薬
及び第二試薬の両方あるいはどちらか一方に存在させる
必要がある。カルシウムイオン及び塩素イオンは任意の
形で含有させることができるが、例えば、塩化カルシウ
ム、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウム等を好適に
用いられ、これらを単独あるいは複数組合せて、濃度と
して０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１．０〜１００ｍ
Ｍの範囲で用いることができる。
【００２３】本発明の試薬には、前記の必須成分の他
に、一般的に添加される成分、例えばＥＤＴＡ等のキレ
ート剤、アジ化物等の防腐剤、及び各種界面活性剤等を
適宜添加して使用することができる。
に、一般的に添加される成分、例えばＥＤＴＡ等のキレ
ート剤、アジ化物等の防腐剤、及び各種界面活性剤等を
適宜添加して使用することができる。
【００２４】
【作用】このように構成された本発明のアミラーゼ活性
測定用試薬を用いた場合、被検検体にアミラーゼが含ま
れていると、第一試薬中のＢ−Ｇ５−β−ＣＮＰ（アミ
ラーゼの基質）が、カルシウムイオン（アミラーゼ酵素
保護剤）及び塩素イオン（アミラーゼ酵素賦活剤）の作
用と相まって、Ｇ３−β−ＣＮＰ又はＧ２−β−ＣＮＰ
に加水分解される。更に、Ｇ３−β−ＣＮＰ又はＧ２−
β−ＣＮＰは、共役酵素であるα−グルコシダーゼ及び
β−グルコシダーゼにより、最終的に、グルコースとＣ
ＮＰに加水分解される。この反応で生成されるＣＮＰの
増加速度を通常の方法で測定し、アミラーゼ活性を求め
ることができる。更に本発明の液状試薬は、長期保存可
能なもので、臨床検査分野への効果は絶大である。
測定用試薬を用いた場合、被検検体にアミラーゼが含ま
れていると、第一試薬中のＢ−Ｇ５−β−ＣＮＰ（アミ
ラーゼの基質）が、カルシウムイオン（アミラーゼ酵素
保護剤）及び塩素イオン（アミラーゼ酵素賦活剤）の作
用と相まって、Ｇ３−β−ＣＮＰ又はＧ２−β−ＣＮＰ
に加水分解される。更に、Ｇ３−β−ＣＮＰ又はＧ２−
β−ＣＮＰは、共役酵素であるα−グルコシダーゼ及び
β−グルコシダーゼにより、最終的に、グルコースとＣ
ＮＰに加水分解される。この反応で生成されるＣＮＰの
増加速度を通常の方法で測定し、アミラーゼ活性を求め
ることができる。更に本発明の液状試薬は、長期保存可
能なもので、臨床検査分野への効果は絶大である。
【００２５】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：基質の安定性 （１）試薬調製 ｐＨ値がそれぞれ３．５、４．０、５．０、６．０、
７．０、及び７．５の各１０ｍＭコハク酸−ＮａＯＨ緩
衝液に、Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ（３．７ミリモル）及び
塩化ナトリウム（５０ミリモル）を溶解し、全量を１リ
ットルとして第一試薬を調製した。また、サッカロマイ
ス由来α−グルコシダーゼ（６０００Ｕ）、スウィート
アーモンド（Sweet almond）由来β- グルコシダーゼ
（１００００Ｕ）、ＥＤＴＡ２Ｎａ（０．５ミリモ
ル）、及び塩化カルシウム２水和物（１．０ミリモル）
を、０．１Ｍピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタン
スルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、全量を１
リットルとして第二試薬を調製した。これらの各試薬を
１０℃にて保存し、保存当日、１週間後、２週間後、３
週間後、１ヶ月後、２ヶ月後及び３ヶ月後の試薬安定性
を以下の試験により確認した。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：基質の安定性 （１）試薬調製 ｐＨ値がそれぞれ３．５、４．０、５．０、６．０、
７．０、及び７．５の各１０ｍＭコハク酸−ＮａＯＨ緩
衝液に、Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ（３．７ミリモル）及び
塩化ナトリウム（５０ミリモル）を溶解し、全量を１リ
ットルとして第一試薬を調製した。また、サッカロマイ
ス由来α−グルコシダーゼ（６０００Ｕ）、スウィート
アーモンド（Sweet almond）由来β- グルコシダーゼ
（１００００Ｕ）、ＥＤＴＡ２Ｎａ（０．５ミリモ
ル）、及び塩化カルシウム２水和物（１．０ミリモル）
を、０．１Ｍピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタン
スルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、全量を１
リットルとして第二試薬を調製した。これらの各試薬を
１０℃にて保存し、保存当日、１週間後、２週間後、３
週間後、１ヶ月後、２ヶ月後及び３ヶ月後の試薬安定性
を以下の試験により確認した。
【００２６】（２）試験操作 生理食塩水５μｌに第二試薬２００μｌを添加して、３
７℃で５分間加温した後、各第一試薬２００μｌを加
え、３７℃で５分間加温した後の波長４０５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。結果を図１に示す。図１から明ら
かなとおり、ｐＨ４〜７の範囲に保持した第一試薬（基
質含有試薬）は良好な安定性を示し、アミラーゼ測定用
試薬として用いることができる。前記のｐＨ範囲を超え
ると、保存期間の長期化に伴って初期吸光度が高くなる
ので、長期保存用アミラーゼ測定用試薬としては不適当
になる。
７℃で５分間加温した後、各第一試薬２００μｌを加
え、３７℃で５分間加温した後の波長４０５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。結果を図１に示す。図１から明ら
かなとおり、ｐＨ４〜７の範囲に保持した第一試薬（基
質含有試薬）は良好な安定性を示し、アミラーゼ測定用
試薬として用いることができる。前記のｐＨ範囲を超え
ると、保存期間の長期化に伴って初期吸光度が高くなる
ので、長期保存用アミラーゼ測定用試薬としては不適当
になる。
【００２７】実施例２：α−アミラーゼ活性の測定 （１）試薬調製 ｐＨ５．０の各１０ｍＭコハク酸−ＮａＯＨ緩衝液に、
Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ（３．７ミリモル）及び塩化ナト
リウム（５０ミリモル）を溶解し、全量を１リットルと
して第一試薬を調製した。また、第二試薬は実施例１と
同様のものを調製した。これらの各試薬を１０℃にて保
存し、保存当日、１ヶ月後、２ヶ月後及び３ヶ月後に、
下記の試験操作によりアミラーゼ活性を測定した。
Ｂ−Ｇ５−β−ＣＮＰ（３．７ミリモル）及び塩化ナト
リウム（５０ミリモル）を溶解し、全量を１リットルと
して第一試薬を調製した。また、第二試薬は実施例１と
同様のものを調製した。これらの各試薬を１０℃にて保
存し、保存当日、１ヶ月後、２ヶ月後及び３ヶ月後に、
下記の試験操作によりアミラーゼ活性を測定した。
【００２８】（２）試験操作 アミラーゼ活性値既知の管理血清５μｌに第二試薬２０
０μｌを添加して、３７℃で５分間加温した後、第一試
薬２００μｌを加え、３７℃で加温し、第一試薬添加後
３分〜５分間の波長４０５ｎｍにおける吸光度変化量を
求め、下記の式よりアミラーゼ活性を求めた。結果を表
１に示す。
０μｌを添加して、３７℃で５分間加温した後、第一試
薬２００μｌを加え、３７℃で加温し、第一試薬添加後
３分〜５分間の波長４０５ｎｍにおける吸光度変化量を
求め、下記の式よりアミラーゼ活性を求めた。結果を表
１に示す。
【００２９】
【数５】 式中の０．０１６５は、ＣＮＰのモル分子吸光度係数で
ある。
ある。
【００３０】
【表１】 保存当日 １ヶ月後 ２ヶ月後 ３ヶ月後 管理血清Ａ (アミラーセ゛活性=79U/l) 72 U/l 74 U/l 73 U/l 76 U/l 管理血清Ｂ (アミラーセ゛活性=170U/l) 170 U/l 170 U/l 174 U/l 172 U/l
【００３１】表１から明らかなとおり、本発明による試
薬は、長期間保存後に使用しても試薬性能の低下が認め
られず、検体中のアミラーゼ活性を精度良く測定するこ
とができる。
薬は、長期間保存後に使用しても試薬性能の低下が認め
られず、検体中のアミラーゼ活性を精度良く測定するこ
とができる。
【００３２】
【発明の効果】本発明のアミラーゼ測定用試薬は、液状
のままで、暗所又は明所にて、常温ないし低温下で長期
間（少なくとも半年以上）にわたって安定に貯蔵するこ
とができる。従って、臨床検査を実施する現場で長期に
保存しておき、使用に際しては、溶解操作の必要もな
く、そのまま自動分析機などに適用することができる。
のままで、暗所又は明所にて、常温ないし低温下で長期
間（少なくとも半年以上）にわたって安定に貯蔵するこ
とができる。従って、臨床検査を実施する現場で長期に
保存しておき、使用に際しては、溶解操作の必要もな
く、そのまま自動分析機などに適用することができる。
【図１】実施例１で調製した各種ｐＨの第一試薬の保存
安定性を示すグラフである。
安定性を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】 ３−ケトブチリデン−β−２−クロロ−
４−ニトロフェニルマルトペンタオサイドを基質として
アミラーゼによって生成されるβ−２−クロロ−４−ニ
トロフェニルマルトトリオサイド又はβ−２−クロロ−
４−ニトロフェニルマルトサイドを更にα−グルコシダ
ーゼ及びβ−グルコシダーゼによって２−クロロ−４−
ニトロフェノール及びグルコースに変え、前記の２−ク
ロロ−４−ニトロフェノール量の増加量を測定すること
からなる前記アミラーゼの測定法の試薬において、少な
くとも３−ケトブチリデン−β−２−クロロ−４−ニト
ロフェニルマルトペンタオサイドを含有する第一試薬
と、少なくともα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダ
ーゼを含有する第二試薬とからなり、第一試薬のｐＨが
４〜７であり、第二試薬のｐＨが６〜８であり、前記第
一試薬及び／又は第二試薬にＣａ2+イオン及び塩素イオ
ンを存在させ、そしてそれぞれ液状試薬であることを特
徴とする、アミラーゼ活性測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30978493A JP3511211B2 (ja) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | アミラーゼ活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30978493A JP3511211B2 (ja) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | アミラーゼ活性測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135997A true JPH07135997A (ja) | 1995-05-30 |
| JP3511211B2 JP3511211B2 (ja) | 2004-03-29 |
Family
ID=17997208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30978493A Expired - Fee Related JP3511211B2 (ja) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | アミラーゼ活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3511211B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008501786A (ja) * | 2004-06-10 | 2008-01-24 | コトデ，インコーポレイテッド | 皮膚美白及びしわ改善用の皮膚外用剤組成物 |
-
1993
- 1993-11-15 JP JP30978493A patent/JP3511211B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008501786A (ja) * | 2004-06-10 | 2008-01-24 | コトデ，インコーポレイテッド | 皮膚美白及びしわ改善用の皮膚外用剤組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3511211B2 (ja) | 2004-03-29 |
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