JPH1175896A - タンパク質分解酵素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キット - Google Patents
タンパク質分解酵素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キットInfo
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速かつ簡便に高感度でＵＴＩを測定するこ
とが可能な測定方法を提供する。 【解決手段】 尿試料、緩衝液、トリプシン溶液および
基質溶液を混合し、トリプシンの活性を測定することに
より前記尿試料中のＵＴＩ濃度を測定する方法におい
て、前記基質として、Ｌ−ＢＡＰＮＡのみの基質溶液を
用い、前記界面活性剤を前記緩衝液および酵素液の少な
くとも一方に配合する。界面活性剤の配合割合は、酵素
反応液全体の約１重量％である。界面活性剤としては、
例えば、ホ゜リオキシエチレン（40）オクチルフェニルエーテル、ホ゜リオキシエチレン
（10）オクチルフェニルエーテル、3−［（3−コラミト゛フ゜ロヒ゜ル）シ゛メチルアン
モニオ］−フ゜ロハ゜ンスルホン酸、3−［（3−コラミト゛フ゜ロヒ゜ル）シ゛メチルア
ンモニオ］−2−ハイト゛ロキシフ゜ロハ゜ンスルホン酸およびホ゜リオキシエチレンソルヒ゛
タンモノラウレートが使用できる。図１のグラフに示すように、
Ｌ−ＢＡＰＮＡを用いれば、測定感度が向上する。
とが可能な測定方法を提供する。 【解決手段】 尿試料、緩衝液、トリプシン溶液および
基質溶液を混合し、トリプシンの活性を測定することに
より前記尿試料中のＵＴＩ濃度を測定する方法におい
て、前記基質として、Ｌ−ＢＡＰＮＡのみの基質溶液を
用い、前記界面活性剤を前記緩衝液および酵素液の少な
くとも一方に配合する。界面活性剤の配合割合は、酵素
反応液全体の約１重量％である。界面活性剤としては、
例えば、ホ゜リオキシエチレン（40）オクチルフェニルエーテル、ホ゜リオキシエチレン
（10）オクチルフェニルエーテル、3−［（3−コラミト゛フ゜ロヒ゜ル）シ゛メチルアン
モニオ］−フ゜ロハ゜ンスルホン酸、3−［（3−コラミト゛フ゜ロヒ゜ル）シ゛メチルア
ンモニオ］−2−ハイト゛ロキシフ゜ロハ゜ンスルホン酸およびホ゜リオキシエチレンソルヒ゛
タンモノラウレートが使用できる。図１のグラフに示すように、
Ｌ−ＢＡＰＮＡを用いれば、測定感度が向上する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質分解酵
素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キットに
関する。
素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キットに
関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、尿中トリプシンインヒビター（Ｕ
ＴＩ）が、生体の状態を表す指標として注目され、臨床
医学の分野において様々な研究がされている。ＵＴＩ
は、例えば、生体が炎症や外科手術等の内的外的ストレ
スに晒された場合や感染症に罹った場合に尿中に出現す
ることが知られている（「尿中トリプシンインヒビター
の臨床的意義」 桑島士郎ら、JAPANESE JOURNAL OF IN
FLAMMATION REVIEW ARTICLE，VOL9，NO．3，MAY 1989)
。
ＴＩ）が、生体の状態を表す指標として注目され、臨床
医学の分野において様々な研究がされている。ＵＴＩ
は、例えば、生体が炎症や外科手術等の内的外的ストレ
スに晒された場合や感染症に罹った場合に尿中に出現す
ることが知られている（「尿中トリプシンインヒビター
の臨床的意義」 桑島士郎ら、JAPANESE JOURNAL OF IN
FLAMMATION REVIEW ARTICLE，VOL9，NO．3，MAY 1989)
。
【０００３】しかしながら、このような有用性を指摘さ
れながら、従来のＵＴＩの測定方法は、感度が十分でな
いため、ＵＴＩを臨床医学などの分野において十分に活
用できていなかった。
れながら、従来のＵＴＩの測定方法は、感度が十分でな
いため、ＵＴＩを臨床医学などの分野において十分に活
用できていなかった。
【０００４】すなわち、ＵＴＩは、その量に応じてトリ
プシン活性を阻害するため、その測定はトリプシン活性
の阻害程度を測定することにより行われる。この測定と
しては、例えば、尿試料、トリプシンを含有する酵素液
および緩衝液を混合し、これに基質溶液を添加して酵素
反応を測定する方法があげられる。また、この測定の際
に、通常、トリプシン活性化剤であるカルシウムが使用
され、通常、カルシウムは前記緩衝液中に配合される。
プシン活性を阻害するため、その測定はトリプシン活性
の阻害程度を測定することにより行われる。この測定と
しては、例えば、尿試料、トリプシンを含有する酵素液
および緩衝液を混合し、これに基質溶液を添加して酵素
反応を測定する方法があげられる。また、この測定の際
に、通常、トリプシン活性化剤であるカルシウムが使用
され、通常、カルシウムは前記緩衝液中に配合される。
【０００５】この測定において、基質として、ベンゾイ
ル−アルギニン−ｐ-ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）が
広く使用されている。この基質はトリプシンにより切断
されると発色し、これを吸光度の変化量として分光光度
計で測定することにより、トリプシンの活性が測定され
るのである。しかし、この合成基質は難溶性であり１．
０ｇ／Ｌ以上の濃度の基質溶液を調製することは困難で
あるため、酵素活性は基質濃度に依存し、トリプシンの
活性を向上させることが難しかった。一方、ＵＴＩは極
めて少量でトリプシンを阻害する。前述のようにＵＴＩ
の測定は、トリプシン活性の阻害程度の測定であるか
ら、トリプシン活性が高感度で測定できなければ、ＵＴ
Ｉの測定も高感度で行うことはできない。
ル−アルギニン−ｐ-ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）が
広く使用されている。この基質はトリプシンにより切断
されると発色し、これを吸光度の変化量として分光光度
計で測定することにより、トリプシンの活性が測定され
るのである。しかし、この合成基質は難溶性であり１．
０ｇ／Ｌ以上の濃度の基質溶液を調製することは困難で
あるため、酵素活性は基質濃度に依存し、トリプシンの
活性を向上させることが難しかった。一方、ＵＴＩは極
めて少量でトリプシンを阻害する。前述のようにＵＴＩ
の測定は、トリプシン活性の阻害程度の測定であるか
ら、トリプシン活性が高感度で測定できなければ、ＵＴ
Ｉの測定も高感度で行うことはできない。
【０００６】この問題を解決するために、ＢＡＰＮＡを
極性有機溶媒に溶解し、これを水で約２倍に希釈して基
質溶液が調製されていた。しかし、これらの有機溶媒の
使用により、前記測定方法の自動分析機への適用が難し
くなり、また前記有機溶媒によって、自動分析装置一般
に使用されるプラスチックセルを傷めるおそれもある。
さらに、前記有機溶媒が、トリプシン等のタンパク質分
解酵素の活性を阻害する可能もある。この他、前記有機
溶媒を使用して基質溶液を調製したとしても、これを長
期間保存したり冷蔵保存すると、前記基質が結晶析出す
るおそれがある。このため、従来の測定方法では、ＢＡ
ＰＮＡ等の難溶性基質を前記有機溶媒を用いて溶解する
場合、測定毎に基質溶液を調製し、その後直ちに測定す
る必要があった。また、有機溶媒を用いて基質溶液を調
製したとしても、ＵＴＩの測定感度は十分ではなかっ
た。
極性有機溶媒に溶解し、これを水で約２倍に希釈して基
質溶液が調製されていた。しかし、これらの有機溶媒の
使用により、前記測定方法の自動分析機への適用が難し
くなり、また前記有機溶媒によって、自動分析装置一般
に使用されるプラスチックセルを傷めるおそれもある。
さらに、前記有機溶媒が、トリプシン等のタンパク質分
解酵素の活性を阻害する可能もある。この他、前記有機
溶媒を使用して基質溶液を調製したとしても、これを長
期間保存したり冷蔵保存すると、前記基質が結晶析出す
るおそれがある。このため、従来の測定方法では、ＢＡ
ＰＮＡ等の難溶性基質を前記有機溶媒を用いて溶解する
場合、測定毎に基質溶液を調製し、その後直ちに測定す
る必要があった。また、有機溶媒を用いて基質溶液を調
製したとしても、ＵＴＩの測定感度は十分ではなかっ
た。
【０００７】そこで、本発明の目的は、極性有機溶媒を
用いることなく高感度でタンパク質分解酵素阻害物質を
簡便かつ迅速に測定できる測定方法を提供することであ
る。
用いることなく高感度でタンパク質分解酵素阻害物質を
簡便かつ迅速に測定できる測定方法を提供することであ
る。
【０００８】前記目的を達成するために、本発明者ら
は、下記に示す第１番目の測定方法、第２番目の測定方
法および第３番目の測定方法を開発した。
は、下記に示す第１番目の測定方法、第２番目の測定方
法および第３番目の測定方法を開発した。
【０００９】すなわち、第１番目の測定方法は、試料、
タンパク質分解酵素および基質を液中で混合し、前記酵
素の活性を測定することにより前記試料中のタンパク質
分解酵素阻害物質を測定する方法であって、前記基質と
して、基質中のアミノ酸残基がＬ型のみである基質を溶
解した基質溶液を用いる方法である。
タンパク質分解酵素および基質を液中で混合し、前記酵
素の活性を測定することにより前記試料中のタンパク質
分解酵素阻害物質を測定する方法であって、前記基質と
して、基質中のアミノ酸残基がＬ型のみである基質を溶
解した基質溶液を用いる方法である。
【００１０】すなわち、一般に、タンパク質分解酵素の
活性の測定において用いられる合成基質は、Ｄ，Ｌ複合
体であるが、この合成基質に対し、アミノ酸残基がＬ型
のみである基質は、溶解性に優れ、有機溶媒を用いるこ
となく水やお湯で十分量を溶解できる。この原因は明ら
かでないが、この事実は、本発明者らが確認したもので
ある。例えば、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡは温水を用いても１
ｇ／Ｌ以上の濃度で溶解させることは困難であるが、Ｌ
−ＢＡＰＮＡは、温水に１０ｇ／Ｌの高濃度で溶解させ
ることができる。さらに、アミノ酸残基がＬ型のみであ
る基質を用いることで、タンパク質分解酵素の活性を向
上することもできる。この原因も明らかではないが、本
発明者らは、酵素反応に寄与しないＤ型が排除されるこ
とによりＬ型の濃度が相対的に増加したという理由だけ
でなく、Ｄ型アミノ酸残基の酵素阻害も排除されたため
と推察している。
活性の測定において用いられる合成基質は、Ｄ，Ｌ複合
体であるが、この合成基質に対し、アミノ酸残基がＬ型
のみである基質は、溶解性に優れ、有機溶媒を用いるこ
となく水やお湯で十分量を溶解できる。この原因は明ら
かでないが、この事実は、本発明者らが確認したもので
ある。例えば、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡは温水を用いても１
ｇ／Ｌ以上の濃度で溶解させることは困難であるが、Ｌ
−ＢＡＰＮＡは、温水に１０ｇ／Ｌの高濃度で溶解させ
ることができる。さらに、アミノ酸残基がＬ型のみであ
る基質を用いることで、タンパク質分解酵素の活性を向
上することもできる。この原因も明らかではないが、本
発明者らは、酵素反応に寄与しないＤ型が排除されるこ
とによりＬ型の濃度が相対的に増加したという理由だけ
でなく、Ｄ型アミノ酸残基の酵素阻害も排除されたため
と推察している。
【００１１】つぎに、本発明の第２番目の測定方法は、
試料、タンパク質分解酵素、基質および界面活性剤を液
中で混合し、前記酵素の酵素活性を測定することにより
前記試料中のタンパク質分解酵素阻害物質を測定する方
法であって、前記界面活性剤が前記液中への配合前にお
いて前記基質と共存しないという方法である。
試料、タンパク質分解酵素、基質および界面活性剤を液
中で混合し、前記酵素の酵素活性を測定することにより
前記試料中のタンパク質分解酵素阻害物質を測定する方
法であって、前記界面活性剤が前記液中への配合前にお
いて前記基質と共存しないという方法である。
【００１２】すなわち、この測定方法では、界面活性剤
を用いることによりタンパク質分解酵素活性を向上さ
せ、この結果、その阻害物質の測定感度を向上させる。
ただし、酵素反応液調製前において、界面活性剤を基質
溶液中に配合するなどして基質と共存させてはいけな
い。したがって、界面活性剤は、緩衝液若しくは酵素液
等の基質溶液とは別の試薬液に配合するか、または別個
に酵素反応液に配合する必要がある。このような態様で
界面活性剤を配合することでタンパク質分解酵素の活性
が向上する理由は、明らかでないが、その向上は顕著で
ある。
を用いることによりタンパク質分解酵素活性を向上さ
せ、この結果、その阻害物質の測定感度を向上させる。
ただし、酵素反応液調製前において、界面活性剤を基質
溶液中に配合するなどして基質と共存させてはいけな
い。したがって、界面活性剤は、緩衝液若しくは酵素液
等の基質溶液とは別の試薬液に配合するか、または別個
に酵素反応液に配合する必要がある。このような態様で
界面活性剤を配合することでタンパク質分解酵素の活性
が向上する理由は、明らかでないが、その向上は顕著で
ある。
【００１３】なお、本発明において、酵素反応液とは、
酵素および基質が存在し、酵素反応が生起する液をい
う。したがって、酵素および基質が共存しても、ｐＨ等
の調整により酵素反応が生じない液は、酵素反応液とは
いわない。
酵素および基質が存在し、酵素反応が生起する液をい
う。したがって、酵素および基質が共存しても、ｐＨ等
の調整により酵素反応が生じない液は、酵素反応液とは
いわない。
【００１４】つぎに、本発明の第３番目の測定方法は、
試料、タンパク質分解酵素、基質および界面活性剤を液
中で混合し、前記酵素の酵素活性を測定することにより
前記試料中のタンパク質分解酵素阻害物質を測定する方
法であって、前記基質として、アミノ酸残基がＬ型のみ
である基質を溶解した基質溶液を用い、前記界面活性剤
が前記液中への配合前において前記基質溶液中には存在
しない測定方法である。
試料、タンパク質分解酵素、基質および界面活性剤を液
中で混合し、前記酵素の酵素活性を測定することにより
前記試料中のタンパク質分解酵素阻害物質を測定する方
法であって、前記基質として、アミノ酸残基がＬ型のみ
である基質を溶解した基質溶液を用い、前記界面活性剤
が前記液中への配合前において前記基質溶液中には存在
しない測定方法である。
【００１５】すなわち、この第３番目の測定方法は、前
記第１番目の測定方法と前記第２番目の測定方法とを組
み合わせた方法であり、測定感度が極めて高い方法であ
る。
記第１番目の測定方法と前記第２番目の測定方法とを組
み合わせた方法であり、測定感度が極めて高い方法であ
る。
【００１６】本発明の測定方法において、界面活性剤の
酵素反応液中の濃度は０．０１〜２％であることが好ま
しく、さらに好ましくは、０．０５〜０．５％である。
酵素反応液中の濃度は０．０１〜２％であることが好ま
しく、さらに好ましくは、０．０５〜０．５％である。
【００１７】本発明の測定方法において、前記基質は、
前記の式（化１）で表される基質であることが好まし
い。この基質としては、α-ベンゾイル−Ｌ-アルギニン
−ｐ-ニトロアニリドが好ましい。
前記の式（化１）で表される基質であることが好まし
い。この基質としては、α-ベンゾイル−Ｌ-アルギニン
−ｐ-ニトロアニリドが好ましい。
【００１８】本発明の測定方法において、界面活性剤
は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノ
パルミテート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモ
ノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）オクチル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレン（４０）オクチ
ルフェニルエーテル、１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシド、スクロースモノラウレート、３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−プ
ロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ］−２−ハイドロキシプロパンスルホ
ン酸、臭化セチルトリメチルアンモニウム、水酸化ベン
ジルトリメチルアンモニウムからなる群から選択された
少なくとも一つであることが好ましい。
は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノ
パルミテート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモ
ノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）オクチル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレン（４０）オクチ
ルフェニルエーテル、１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシド、スクロースモノラウレート、３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−プ
ロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ］−２−ハイドロキシプロパンスルホ
ン酸、臭化セチルトリメチルアンモニウム、水酸化ベン
ジルトリメチルアンモニウムからなる群から選択された
少なくとも一つであることが好ましい。
【００１９】本発明の測定方法において、タンパク質分
解酵素がトリプシンであり、試料が尿であり、タンパク
質分解酵素阻害物質が尿中トリプシンインヒビター（Ｕ
ＴＩ）であり、カルシウム存在下で酵素活性を測定する
ことが好ましい。
解酵素がトリプシンであり、試料が尿であり、タンパク
質分解酵素阻害物質が尿中トリプシンインヒビター（Ｕ
ＴＩ）であり、カルシウム存在下で酵素活性を測定する
ことが好ましい。
【００２０】つぎに、本発明のタンパク質分解酵素阻害
物質の測定キットは、前記３種類の本発明の測定方法に
対応して、以下に示す第１番目、第２番目および第３番
目の３種類の測定キットがある。
物質の測定キットは、前記３種類の本発明の測定方法に
対応して、以下に示す第１番目、第２番目および第３番
目の３種類の測定キットがある。
【００２１】まず、前記第１番目の測定キットは、タン
パク質分解酵素および基質を備えたタンパク質分解酵素
阻害物質の測定キットであって、前記基質が、アミノ酸
残基がＬ型のみである基質を溶解した基質溶液である。
パク質分解酵素および基質を備えたタンパク質分解酵素
阻害物質の測定キットであって、前記基質が、アミノ酸
残基がＬ型のみである基質を溶解した基質溶液である。
【００２２】また、前記第２番目の測定キットは、タン
パク質分解酵素、基質および界面活性剤を備えたタンパ
ク質分解酵素阻害物質の測定キットであって、前記３試
薬の混合前において前記界面活性剤が前記基質と共存し
ていない。
パク質分解酵素、基質および界面活性剤を備えたタンパ
ク質分解酵素阻害物質の測定キットであって、前記３試
薬の混合前において前記界面活性剤が前記基質と共存し
ていない。
【００２３】そして、前記第３番目の測定キットは、タ
ンパク質分解酵素、基質および界面活性剤を備えたタン
パク質分解酵素阻害物質の測定キットであって、前記基
質は、光学活性がＬ型のアミノ酸残基のみからなる基質
を溶解した基質溶液であり、前記界面活性剤が前記基質
溶液中に存在していない。
ンパク質分解酵素、基質および界面活性剤を備えたタン
パク質分解酵素阻害物質の測定キットであって、前記基
質は、光学活性がＬ型のアミノ酸残基のみからなる基質
を溶解した基質溶液であり、前記界面活性剤が前記基質
溶液中に存在していない。
【００２４】このような本発明の測定キットを使用する
ことにより、タンパク質分解酵素阻害物質を迅速かつ簡
便に高感度で測定できる。
ことにより、タンパク質分解酵素阻害物質を迅速かつ簡
便に高感度で測定できる。
【００２５】本発明の測定キットにおいて、緩衝液（Ｒ
１）、タンパク質分解酵素液（Ｒ２）、基質溶液（Ｒ
３）を備えた、タンパク質分解酵素阻害物質の測定キッ
トであって、緩衝液（Ｒ１）およびタンパク質分解酵素
液（Ｒ２）の少なくとも一方の液中に界面活性剤が含有
されていることが好ましい。
１）、タンパク質分解酵素液（Ｒ２）、基質溶液（Ｒ
３）を備えた、タンパク質分解酵素阻害物質の測定キッ
トであって、緩衝液（Ｒ１）およびタンパク質分解酵素
液（Ｒ２）の少なくとも一方の液中に界面活性剤が含有
されていることが好ましい。
【００２６】この測定キットにおいて、前記Ｒ１、Ｒ２
およびＲ３は、それぞれ独立していてもよく、前記三種
類の液のうちいずれか二種類の液の混合液と他の一種の
液との組み合わせであってもよい。具体的には下記の三
通りの組み合わせがある。 （１） Ｒ１とＲ２との混合液＋Ｒ３ （２） Ｒ１とＲ３との混合液＋Ｒ２ （３） Ｒ２とＲ３との混合液＋Ｒ１
およびＲ３は、それぞれ独立していてもよく、前記三種
類の液のうちいずれか二種類の液の混合液と他の一種の
液との組み合わせであってもよい。具体的には下記の三
通りの組み合わせがある。 （１） Ｒ１とＲ２との混合液＋Ｒ３ （２） Ｒ１とＲ３との混合液＋Ｒ２ （３） Ｒ２とＲ３との混合液＋Ｒ１
【００２７】なお、上記組み合わせ（３）において、例
えば、ｐＨの調整等により酵素反応を制御すれば、酵素
と基質とを混合することができる。
えば、ｐＨの調整等により酵素反応を制御すれば、酵素
と基質とを混合することができる。
【００２８】本発明の測定キットにおいて、界面活性剤
の濃度が、酵素反応液中で０．０１〜２％の濃度範囲と
なるように調整されていることが好ましい。さらに、
０．０５〜０．５％に調整されていることが好ましい。
の濃度が、酵素反応液中で０．０１〜２％の濃度範囲と
なるように調整されていることが好ましい。さらに、
０．０５〜０．５％に調整されていることが好ましい。
【００２９】本発明の測定キットにおいて、好ましい基
質および界面活性剤は、本発明の測定方法の箇所で述べ
たものと同じである。
質および界面活性剤は、本発明の測定方法の箇所で述べ
たものと同じである。
【００３０】本発明の測定キットにおいて、さらにカル
シウムを備え、測定対象試料が尿であり、タンパク質分
解酵素がトリプシンであり、タンパク質分解酵素阻害物
質が尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）であること
が好ましい。このキットにより、ＵＴＩの測定を迅速か
つ簡便に高感度で行うことが可能になる。
シウムを備え、測定対象試料が尿であり、タンパク質分
解酵素がトリプシンであり、タンパク質分解酵素阻害物
質が尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）であること
が好ましい。このキットにより、ＵＴＩの測定を迅速か
つ簡便に高感度で行うことが可能になる。
【００３１】
【発明の実施の形態】つぎに、本発明を詳しく説明す
る。
る。
【００３２】本発明のタンパク質分解酵素阻害物質の測
定方法は、例えば、タンパク質分解酵素液と、アミノ酸
残基がＬ型のみの基質を用いた基質溶液と、緩衝液とを
用いて実施できる。
定方法は、例えば、タンパク質分解酵素液と、アミノ酸
残基がＬ型のみの基質を用いた基質溶液と、緩衝液とを
用いて実施できる。
【００３３】前記酵素としては、例えば、トリプシンが
あげられる。このトリプシンは、特に限定するものでな
く、例えば、牛膵臓由来のトリプシン、ブタ膵臓由来の
トリプシンがあげられる。また、トリプシン濃度は、そ
の比活性等により適宜決定されるが、酵素液全体に対
し、通常、１〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０〜１０
０ｍｇ／Ｌである。また、この酵素液は、トリプシンの
自己消化を防止する目的で、塩酸または緩衝液によりｐ
Ｈ２．０〜３．５に調整してもよい。
あげられる。このトリプシンは、特に限定するものでな
く、例えば、牛膵臓由来のトリプシン、ブタ膵臓由来の
トリプシンがあげられる。また、トリプシン濃度は、そ
の比活性等により適宜決定されるが、酵素液全体に対
し、通常、１〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０〜１０
０ｍｇ／Ｌである。また、この酵素液は、トリプシンの
自己消化を防止する目的で、塩酸または緩衝液によりｐ
Ｈ２．０〜３．５に調整してもよい。
【００３４】なお、トリプシン以外のタンパク質分解酵
素としては、例えば、キモトリプシンがあげられる。そ
して、キモトリプシンに使用する基質としては、例え
ば、ベンゾイル−Ｌ-チロシン−ｐ-ニトロアニリドがあ
げられる。
素としては、例えば、キモトリプシンがあげられる。そ
して、キモトリプシンに使用する基質としては、例え
ば、ベンゾイル−Ｌ-チロシン−ｐ-ニトロアニリドがあ
げられる。
【００３５】基質溶液は、アミノ酸残基がＬ型の基質の
溶液である。前記基質の好ましいものは、先に述べたと
おりであるが、この他に、例えば、Ｚ−グリシン−グリ
シン−Ｌ-ロイシン−ｐ-ニトロアニリド、サクシニル−
Ｌ-アラニン−Ｌ-アラニン−Ｌ-アラニン−ｐ-ニトロア
ニリドがあげられる。このような、アミノ酸残基がＬ型
のみの合成基質は、一般に市販されており（例えば、シ
グマ社から市販のもの）、またＤ，Ｌ複合体を光学活性
クロマトグラフィー等で分割することによっても得るこ
とできる。基質濃度は、通常、１〜１０ｇ／Ｌの範囲で
ある。また、この基質溶液の調製に用いる溶媒は、通
常、水（精製水等）であるが、後述する緩衝液でもよ
い。また、基質溶液は、例えば、水等の前記溶媒を加温
し、これに基質を加えることにより調製できる。
溶液である。前記基質の好ましいものは、先に述べたと
おりであるが、この他に、例えば、Ｚ−グリシン−グリ
シン−Ｌ-ロイシン−ｐ-ニトロアニリド、サクシニル−
Ｌ-アラニン−Ｌ-アラニン−Ｌ-アラニン−ｐ-ニトロア
ニリドがあげられる。このような、アミノ酸残基がＬ型
のみの合成基質は、一般に市販されており（例えば、シ
グマ社から市販のもの）、またＤ，Ｌ複合体を光学活性
クロマトグラフィー等で分割することによっても得るこ
とできる。基質濃度は、通常、１〜１０ｇ／Ｌの範囲で
ある。また、この基質溶液の調製に用いる溶媒は、通
常、水（精製水等）であるが、後述する緩衝液でもよ
い。また、基質溶液は、例えば、水等の前記溶媒を加温
し、これに基質を加えることにより調製できる。
【００３６】つぎに、前記緩衝液は、特に制限するもの
ではなく、例えば、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等
があげられる。この緩衝液は、常法により調製される。
この緩衝液のｐＨは、これを用いる酵素の最適ｐＨによ
り決定されるが、例えば、トリプシンに使用する場合、
ｐＨ７〜８が好ましい。また、トリプシンインヒビター
を測定する場合は、通常、カルシウムを緩衝液中に配合
する。その割合は、通常、０．０１〜０．５重量％であ
る。
ではなく、例えば、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等
があげられる。この緩衝液は、常法により調製される。
この緩衝液のｐＨは、これを用いる酵素の最適ｐＨによ
り決定されるが、例えば、トリプシンに使用する場合、
ｐＨ７〜８が好ましい。また、トリプシンインヒビター
を測定する場合は、通常、カルシウムを緩衝液中に配合
する。その割合は、通常、０．０１〜０．５重量％であ
る。
【００３７】そして、本発明では、界面活性剤を使用す
ることが一つの特徴であるが、その種類は問わず、イオ
ン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性
剤のいずれも使用できる。また、その使用量も界面活性
剤の種類により最適範囲が適宜決定される。
ることが一つの特徴であるが、その種類は問わず、イオ
ン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性
剤のいずれも使用できる。また、その使用量も界面活性
剤の種類により最適範囲が適宜決定される。
【００３８】前記イオン性界面活性剤としては、例え
ば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、水酸化ベンジ
ルトリメチルアンモニウムがあげられる。この使用量
は、通常、０．０１〜２重量％である。
ば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、水酸化ベンジ
ルトリメチルアンモニウムがあげられる。この使用量
は、通常、０．０１〜２重量％である。
【００３９】前記非イオン性界面活性剤としては、例え
ば、ポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエー
テル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５、ナカライテ
スク社製）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェ
ニルエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、ナ
カライテスク社製）、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレート（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、ナカライテ
スク社製）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレー
ト（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ナカライテスク社製）が
あげられる。この使用量は、通常、０．０１〜２重量％
である。
ば、ポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエー
テル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５、ナカライテ
スク社製）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェ
ニルエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、ナ
カライテスク社製）、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレート（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、ナカライテ
スク社製）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレー
ト（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ナカライテスク社製）が
あげられる。この使用量は、通常、０．０１〜２重量％
である。
【００４０】前記両性界面活性剤としては、例えば、３
−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−
プロパンスルホン酸（例えば、ＣＨＡＰＳ、同仁化学社
製）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモ
ニオ］−２−ハイドロキシプロパンスルホン酸（例え
ば、ＣＨＡＰＳＯ、同仁化学社製）があげられる。この
使用量は、通常、０．０１〜２重量％である。
−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−
プロパンスルホン酸（例えば、ＣＨＡＰＳ、同仁化学社
製）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモ
ニオ］−２−ハイドロキシプロパンスルホン酸（例え
ば、ＣＨＡＰＳＯ、同仁化学社製）があげられる。この
使用量は、通常、０．０１〜２重量％である。
【００４１】この界面活性剤は、通常、緩衝液中に配合
されるが、これに限定されず、酵素液に配合されたり、
若しくは界面活性剤溶液として単独で酵素反応液に配合
される場合もある。但し、基質溶液に配合することはで
きない。基質溶液に配合して酵素反応液調製前に基質と
共存させると、タンパク質分解酵素の活性を向上させる
ことができないからである。
されるが、これに限定されず、酵素液に配合されたり、
若しくは界面活性剤溶液として単独で酵素反応液に配合
される場合もある。但し、基質溶液に配合することはで
きない。基質溶液に配合して酵素反応液調製前に基質と
共存させると、タンパク質分解酵素の活性を向上させる
ことができないからである。
【００４２】つぎに、本発明の測定方法は、例えば、Ｕ
ＴＩを測定対象とした場合、つぎのようにして行われ
る。
ＴＩを測定対象とした場合、つぎのようにして行われ
る。
【００４３】すなわち、まず、尿試料、緩衝液および酵
素液の三者を混合する。この割合（体積比）は、通常、
尿試料：緩衝液：酵素液＝１：５〜２０：２〜１０の範
囲に設定される。ついで、これをインキュベーションす
る。このインキュベーションの条件は、通常、２５〜３
７℃で１〜５分間である。そして、これに、前記基質溶
液を配合し、前記酵素と基質を反応させる。この配合割
合は、通常、全反応液に対し、体積比５〜３０％の範囲
である。この反応条件は、通常、２５〜３７℃で１〜２
０分間である。また、このときの反応液のｐＨは、酵素
の種類等により異なるが、この例のトリプシンの場合、
ｐＨ７〜８が好ましい。そして、所定の方法により、酵
素反応を検出し、酵素活性を測定する。この反応におい
て、前記尿試料中のＵＴＩの量に応じ、酵素反応が阻害
される。したがって、予め、既知のＵＴＩを用いて検量
線を作成しておけば、酵素活性の測定により、ＵＴＩの
量を測定することができる。前記酵素反応の検出方法と
しては、例えば、ＢＡＰＮＡ等のような基質として酵素
反応により発色するものを用いた場合は、この発色の程
度を分光光度計等により測定する方法があげられる。こ
の他に、反応生成物の濃度を測定することにより、酵素
活性を測定することもできる。
素液の三者を混合する。この割合（体積比）は、通常、
尿試料：緩衝液：酵素液＝１：５〜２０：２〜１０の範
囲に設定される。ついで、これをインキュベーションす
る。このインキュベーションの条件は、通常、２５〜３
７℃で１〜５分間である。そして、これに、前記基質溶
液を配合し、前記酵素と基質を反応させる。この配合割
合は、通常、全反応液に対し、体積比５〜３０％の範囲
である。この反応条件は、通常、２５〜３７℃で１〜２
０分間である。また、このときの反応液のｐＨは、酵素
の種類等により異なるが、この例のトリプシンの場合、
ｐＨ７〜８が好ましい。そして、所定の方法により、酵
素反応を検出し、酵素活性を測定する。この反応におい
て、前記尿試料中のＵＴＩの量に応じ、酵素反応が阻害
される。したがって、予め、既知のＵＴＩを用いて検量
線を作成しておけば、酵素活性の測定により、ＵＴＩの
量を測定することができる。前記酵素反応の検出方法と
しては、例えば、ＢＡＰＮＡ等のような基質として酵素
反応により発色するものを用いた場合は、この発色の程
度を分光光度計等により測定する方法があげられる。こ
の他に、反応生成物の濃度を測定することにより、酵素
活性を測定することもできる。
【００４４】つぎに、本発明の測定キットは、例えば、
前記Ｒ１の緩衝液、前記Ｒ２の酵素液および前記Ｒ３の
基質溶液を備えるものがあげられる。これらの試薬（Ｒ
１，Ｒ２，Ｒ３）の調製は、本発明の測定方法の説明に
おいて述べた方法により行うことができ、また各組成お
よびその割合等は、測定方法の箇所で述べたとおりであ
る。この測定キットを用いることにより、ＵＴＩ等のタ
ンパク質分解酵素阻害物質の測定を簡便にかつ迅速に行
うことができる。
前記Ｒ１の緩衝液、前記Ｒ２の酵素液および前記Ｒ３の
基質溶液を備えるものがあげられる。これらの試薬（Ｒ
１，Ｒ２，Ｒ３）の調製は、本発明の測定方法の説明に
おいて述べた方法により行うことができ、また各組成お
よびその割合等は、測定方法の箇所で述べたとおりであ
る。この測定キットを用いることにより、ＵＴＩ等のタ
ンパク質分解酵素阻害物質の測定を簡便にかつ迅速に行
うことができる。
【００４５】つぎに、実施例について説明する。
【００４６】（実施例１）緩衝液（Ｒ１）、酵素液（Ｒ
２）および基質溶液（Ｒ３）を前述の方法により調製し
た。その組成を下記に示す。
２）および基質溶液（Ｒ３）を前述の方法により調製し
た。その組成を下記に示す。
【００４７】 （緩衝液Ｒ１：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １５０ｍｇ／Ｌ
【００４８】 （酵素液Ｒ２） トリプシン（シグマ社製） ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４９】（基質液Ｒ３）約７０℃に加温した水に、
１ｇ／Ｌの割合でＬ−ＢＡＰＮＡ（ペプチド研究所製、
以下同じ）を溶解することにより調製した。
１ｇ／Ｌの割合でＬ−ＢＡＰＮＡ（ペプチド研究所製、
以下同じ）を溶解することにより調製した。
【００５０】（操作方法）生理食塩水（０．８５％）を
試料とし、Ｌ−ＢＡＰＮＡ、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡの反応
タイムコースを比較した。前記試料２０μｌ、緩衝液
（Ｒ１）２００μｌおよび酵素液（Ｒ２）１００μｌを
混合し、３７℃で５分間保温した後、前記基質溶液（Ｒ
３）１００μｌを添加して、反応を開始した。そして、
３７℃に保温して２分間の吸光度（４０５ｎｍ）変化を
自動分析装置で測定し、相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求
めた。この結果を、図１のグラフに示す。また、Ｄ，Ｌ
−ＢＡＰＮＡ（シグマ社製、以下同じ）を用いた他は、
前記と同一の条件および操作により測定を行った。この
結果も、図１のグラフに示す。
試料とし、Ｌ−ＢＡＰＮＡ、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡの反応
タイムコースを比較した。前記試料２０μｌ、緩衝液
（Ｒ１）２００μｌおよび酵素液（Ｒ２）１００μｌを
混合し、３７℃で５分間保温した後、前記基質溶液（Ｒ
３）１００μｌを添加して、反応を開始した。そして、
３７℃に保温して２分間の吸光度（４０５ｎｍ）変化を
自動分析装置で測定し、相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求
めた。この結果を、図１のグラフに示す。また、Ｄ，Ｌ
−ＢＡＰＮＡ（シグマ社製、以下同じ）を用いた他は、
前記と同一の条件および操作により測定を行った。この
結果も、図１のグラフに示す。
【００５１】図１のグラフから、Ｌ−ＢＡＰＮＡを用い
ると、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡを用いた場合より測定感度が
向上することがわかる。
ると、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡを用いた場合より測定感度が
向上することがわかる。
【００５２】（実施例２）下記に示すように、４種類の
界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５、ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳの４種類）
を用いてＵＴＩの測定をそれぞれ行った。以下に試薬
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）の組成および操作方法を示す。
界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５、ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳの４種類）
を用いてＵＴＩの測定をそれぞれ行った。以下に試薬
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）の組成および操作方法を示す。
【００５３】 （緩衝液Ｒ１：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １５０ｍｇ／Ｌ 界面活性剤 ０．１、０．４重量％ 但し、界面活性剤の酵素反応液中の濃度（最終濃度）
は、前記濃度の１／２となる。また、対照（Ｒｅｆ）と
して界面活性剤濃度０重量％の緩衝液も調製し実験に供
した。
は、前記濃度の１／２となる。また、対照（Ｒｅｆ）と
して界面活性剤濃度０重量％の緩衝液も調製し実験に供
した。
【００５４】 （酵素液Ｒ２：ｐＨ３．０） トリプシン ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５５】（基質液Ｒ３）約７０℃に加温した水に、
４．０ｇ／Ｌの割合でＬ−ＢＡＰＮＡを溶解することに
より調製した。
４．０ｇ／Ｌの割合でＬ−ＢＡＰＮＡを溶解することに
より調製した。
【００５６】（操作方法）ＵＴＩ（ミラクリッド、持田
製薬社製、以下同じ）の生理食塩水溶液として、０Ｕ／
ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌおよび２０Ｕ／ｍｌの
４種類の濃度のものを用意し、これを試料とした。つぎ
に、前記試料２０μｌ、緩衝液（Ｒ１）２００μｌおよ
び酵素液（Ｒ２）１００μｌを混合し、３７℃で５分間
保温した後、前記基質溶液（Ｒ３）１００μｌを添加し
て、反応を開始した。そして、３７℃に保温して２分間
の吸光度（４０５ｎｍ）変化を自動分析装置で測定し、
相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求めた。この結果を、各界
面活性剤ごとに図２の４つのグラフに示す。
製薬社製、以下同じ）の生理食塩水溶液として、０Ｕ／
ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌおよび２０Ｕ／ｍｌの
４種類の濃度のものを用意し、これを試料とした。つぎ
に、前記試料２０μｌ、緩衝液（Ｒ１）２００μｌおよ
び酵素液（Ｒ２）１００μｌを混合し、３７℃で５分間
保温した後、前記基質溶液（Ｒ３）１００μｌを添加し
て、反応を開始した。そして、３７℃に保温して２分間
の吸光度（４０５ｎｍ）変化を自動分析装置で測定し、
相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求めた。この結果を、各界
面活性剤ごとに図２の４つのグラフに示す。
【００５７】図２の４つのグラフに示すように、界面活
性剤を緩衝液中に配合して使用すると、ＵＴＩの測定感
度が向上することが分かる。また、一般に、界面活性剤
の濃度を上げればＵＴＩ測定感度も向上する傾向が確認
できた。
性剤を緩衝液中に配合して使用すると、ＵＴＩの測定感
度が向上することが分かる。また、一般に、界面活性剤
の濃度を上げればＵＴＩ測定感度も向上する傾向が確認
できた。
【００５８】（実施例３）下記に示すように、界面活性
剤を添加する試薬の種類を変えて、ＵＴＩの測定を行っ
た。
剤を添加する試薬の種類を変えて、ＵＴＩの測定を行っ
た。
【００５９】 処方Ａ：緩衝液Ｒ１に界面活性剤を添加 （緩衝液Ｒ１：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １５０ｍｇ／Ｌ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５ ２ｇ／Ｌ 但し、界面活性剤の酵素反応液中の濃度（最終濃度）
は、前記濃度は０．１重量％となる。以下の処方Ｂおよ
び処方Ｃも同じである。 （酵素液Ｒ２：ｐＨ３．０） トリプシン ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ （基質液Ｒ３）約７０℃に加温した水に、４．０ｇ／Ｌ
の割合でＬ−ＢＡＰＮＡを溶解することにより調製し
た。
は、前記濃度は０．１重量％となる。以下の処方Ｂおよ
び処方Ｃも同じである。 （酵素液Ｒ２：ｐＨ３．０） トリプシン ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ （基質液Ｒ３）約７０℃に加温した水に、４．０ｇ／Ｌ
の割合でＬ−ＢＡＰＮＡを溶解することにより調製し
た。
【００６０】 処方Ｂ：酵素液Ｒ２に界面活性剤を添加 （緩衝液Ｒ１：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １５０ｍｇ／Ｌ （酵素液Ｒ２：ｐＨ３．０） トリプシン ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５ ４ｇ／Ｌ （基質液Ｒ３）約７０℃に加温した水に、４．０ｇ／Ｌ
の割合でＬ−ＢＡＰＮＡを溶解することにより調製し
た。
の割合でＬ−ＢＡＰＮＡを溶解することにより調製し
た。
【００６１】 処方Ｃ：基質溶液Ｒ３に界面活性剤を添加 （緩衝液Ｒ１：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １５０ｍｇ／Ｌ （酵素液Ｒ２：ｐＨ３．０） トリプシン ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ （基質液Ｒ３）約７０℃に加温した水に、Ｌ−ＢＡＰＮ
Ａ（４．０ｇ／Ｌ）およびＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５
（４ｇ／Ｌ）を溶解することにより調製した。
Ａ（４．０ｇ／Ｌ）およびＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５
（４ｇ／Ｌ）を溶解することにより調製した。
【００６２】 処方Ｄ：界面活性剤無添加 （緩衝液Ｒ１：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １５０ｍｇ／Ｌ （酵素液Ｒ２：ｐＨ３．０） トリプシン ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ （基質液Ｒ３）約７０℃に加温した水に、Ｌ−ＢＡＰＮ
Ａ（４．０ｇ／Ｌ）を溶解することにより調製した。
Ａ（４．０ｇ／Ｌ）を溶解することにより調製した。
【００６３】（操作方法）ＵＴＩの生理食塩水溶液とし
て、０Ｕ／ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌ、および２
０Ｕ／ｍｌの４種類の濃度のものを用意し、これを試料
とした。つぎに、前記試料２０μｌ、緩衝液（Ｒ１）２
００μｌおよび酵素液（Ｒ２）１００μｌを混合し、３
７℃で５分間保温した後、前記基質溶液（Ｒ３）１００
μｌを添加して、反応を開始した。そして、３７℃に保
温して２分間の吸光度（４０５ｎｍ）変化を自動分析装
置で測定し、相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求めた。この
結果を、図３のグラフに示す。
て、０Ｕ／ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌ、および２
０Ｕ／ｍｌの４種類の濃度のものを用意し、これを試料
とした。つぎに、前記試料２０μｌ、緩衝液（Ｒ１）２
００μｌおよび酵素液（Ｒ２）１００μｌを混合し、３
７℃で５分間保温した後、前記基質溶液（Ｒ３）１００
μｌを添加して、反応を開始した。そして、３７℃に保
温して２分間の吸光度（４０５ｎｍ）変化を自動分析装
置で測定し、相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求めた。この
結果を、図３のグラフに示す。
【００６４】図３のグラフに示すように、緩衝液Ｒ１お
よび酵素液Ｒ２に添加した処方Ａ，Ｂでは、無添加の処
方Ｄに比べ、ＵＴＩの測定感度が向上したことが分か
る。しかし、基質溶液Ｒ３に添加した処方Ｃでは、無添
加の処方Ｄに比べ、ＵＴＩの測定感度が低下した。この
ことから、酵素反応液調製前において基質と共存させな
ければ、界面活性剤を添加するとＵＴＩの測定感度は向
上するといえる。
よび酵素液Ｒ２に添加した処方Ａ，Ｂでは、無添加の処
方Ｄに比べ、ＵＴＩの測定感度が向上したことが分か
る。しかし、基質溶液Ｒ３に添加した処方Ｃでは、無添
加の処方Ｄに比べ、ＵＴＩの測定感度が低下した。この
ことから、酵素反応液調製前において基質と共存させな
ければ、界面活性剤を添加するとＵＴＩの測定感度は向
上するといえる。
【００６５】（実施例４）下記に示すように、基質溶液
Ｒ３の組成を変えてＵＴＩの測定を行った。また、緩衝
液Ｒ１および酵素液Ｒ２の組成も下記に示す。
Ｒ３の組成を変えてＵＴＩの測定を行った。また、緩衝
液Ｒ１および酵素液Ｒ２の組成も下記に示す。
【００６６】 （緩衝液Ｒ１：ｐＨ８．１） トリエタノールアミン塩酸塩 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １５０ｍｇ／Ｌ
【００６７】 （酵素液Ｒ２：ｐＨ３．０） トリプシン ５０ｍｇ／Ｌ ＨＣｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６８】（基質液Ｒ３） ・処方（０） 約７０℃に加温した水に、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡ（１．０
ｇ／Ｌ）を溶解することにより調製した。 ・処方（１） まず、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡをＤＭＳＯに溶解し、これを
界面活性剤（ＣＨＡＰＳＯ）水溶液で希釈することによ
り調製した。なお、前記各成分の溶液中の最終濃度は、
Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡが４ｇ／Ｌ、ＤＭＳＯが１０重量
％、ＣＨＡＰＳＯが１重量％である。 ・処方（２） Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡに代えてＬ−ＢＡＰＮＡを用いた他
は、処方（１）と同様に調製した。 ・処方（３） Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡに代えてＬ−ＢＡＰＮＡを４ｇ／Ｌ
の割合で用いた他は、処方（０）と同様に調製した。 ・処方（４） 約７０℃に加温した水に、Ｌ−ＢＡＰＮＡ（４．０ｇ／
Ｌ）を溶解することにより調製した。そして、この処方
（４）では、ＣＨＡＰＳＯを緩衝液Ｒ１に０．５重量％
の割合で添加した。
ｇ／Ｌ）を溶解することにより調製した。 ・処方（１） まず、Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡをＤＭＳＯに溶解し、これを
界面活性剤（ＣＨＡＰＳＯ）水溶液で希釈することによ
り調製した。なお、前記各成分の溶液中の最終濃度は、
Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡが４ｇ／Ｌ、ＤＭＳＯが１０重量
％、ＣＨＡＰＳＯが１重量％である。 ・処方（２） Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡに代えてＬ−ＢＡＰＮＡを用いた他
は、処方（１）と同様に調製した。 ・処方（３） Ｄ，Ｌ−ＢＡＰＮＡに代えてＬ−ＢＡＰＮＡを４ｇ／Ｌ
の割合で用いた他は、処方（０）と同様に調製した。 ・処方（４） 約７０℃に加温した水に、Ｌ−ＢＡＰＮＡ（４．０ｇ／
Ｌ）を溶解することにより調製した。そして、この処方
（４）では、ＣＨＡＰＳＯを緩衝液Ｒ１に０．５重量％
の割合で添加した。
【００６９】（操作方法）ＵＴＩの生理食塩水溶液とし
て、０Ｕ／ｍｌ、６．２５Ｕ／ｍｌ、１２．５Ｕ／ｍ
ｌ、２５Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍｌ
の６種類の濃度のものを用意し、これを試料とした。つ
ぎに、前記試料２０μｌ、緩衝液（Ｒ１）２００μｌお
よび酵素液（Ｒ２）１００μｌを混合し、３７℃で５分
間保温した後、前記基質溶液（Ｒ３）１００μｌを添加
して、反応を開始した。そして、３７℃に保温して２分
間の吸光度（４０５ｎｍ）変化を自動分析装置で測定
し、相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求めた。この結果を、
図４のグラフに示す。
て、０Ｕ／ｍｌ、６．２５Ｕ／ｍｌ、１２．５Ｕ／ｍ
ｌ、２５Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍｌ
の６種類の濃度のものを用意し、これを試料とした。つ
ぎに、前記試料２０μｌ、緩衝液（Ｒ１）２００μｌお
よび酵素液（Ｒ２）１００μｌを混合し、３７℃で５分
間保温した後、前記基質溶液（Ｒ３）１００μｌを添加
して、反応を開始した。そして、３７℃に保温して２分
間の吸光度（４０５ｎｍ）変化を自動分析装置で測定
し、相対吸光度（△Ｏ．Ｄ．）を求めた。この結果を、
図４のグラフに示す。
【００７０】図４のグラフＡは、５つの処方（０、１、
２、３、４）の結果を全て示したグラフであり、同図グ
ラフＢは処方（１）および処方（４）を示したグラフで
ある。これらから分かるように、従来法である３つの処
方（０、１、２）に比較して、本発明の処方である処方
（３）および処方（４）によったＵＴＩ測定感度は高か
った。特に、Ｌ−ＢＡＰＮＡを用い、界面活性剤を緩衝
液Ｒ１に配合した処方（４）のＵＴＩ測定感度は極めて
高かった。
２、３、４）の結果を全て示したグラフであり、同図グ
ラフＢは処方（１）および処方（４）を示したグラフで
ある。これらから分かるように、従来法である３つの処
方（０、１、２）に比較して、本発明の処方である処方
（３）および処方（４）によったＵＴＩ測定感度は高か
った。特に、Ｌ−ＢＡＰＮＡを用い、界面活性剤を緩衝
液Ｒ１に配合した処方（４）のＵＴＩ測定感度は極めて
高かった。
【００７１】
【発明の効果】以上のように、本発明のタンパク質分解
酵素阻害物質の測定方法によれば、ＤＭＳＯ等の有機溶
媒を用いる以上に基質濃度を高めることができ、また測
定感度も向上することができる。このため、本発明の測
定方法の適用により、タンパク質分解酵素阻害物質を迅
速かつ簡便に高感度で測定できるため、例えば、感染症
等の有用な指標となりうるＵＴＩを臨床医療等の分野で
十分に活用することが可能となる。また、前述のよう
に、本発明の測定方法は、有機溶媒を用いることがない
ため基質溶液の調製工程の簡略化ができ、またプラスチ
ックセルの損傷も生じず、さらに有機溶媒を用いないこ
とは材料コストの低減にもつながる。このため、本発明
の測定方法は、自動分析機を用いた検査等に容易にしか
も低コストで適用することができる。
酵素阻害物質の測定方法によれば、ＤＭＳＯ等の有機溶
媒を用いる以上に基質濃度を高めることができ、また測
定感度も向上することができる。このため、本発明の測
定方法の適用により、タンパク質分解酵素阻害物質を迅
速かつ簡便に高感度で測定できるため、例えば、感染症
等の有用な指標となりうるＵＴＩを臨床医療等の分野で
十分に活用することが可能となる。また、前述のよう
に、本発明の測定方法は、有機溶媒を用いることがない
ため基質溶液の調製工程の簡略化ができ、またプラスチ
ックセルの損傷も生じず、さらに有機溶媒を用いないこ
とは材料コストの低減にもつながる。このため、本発明
の測定方法は、自動分析機を用いた検査等に容易にしか
も低コストで適用することができる。
【図１】本発明の測定方法の一実施例において、Ｌ−Ｂ
ＡＰＮＡおよびＤ，Ｌ−ＢＡＰＮＡを用いて感度比較を
行った結果を示すグラフである。
ＡＰＮＡおよびＤ，Ｌ−ＢＡＰＮＡを用いて感度比較を
行った結果を示すグラフである。
【図２】本発明の測定方法のその他の実施例において、
各種界面活性剤を用いてＵＴＩの測定を行った結果を示
すグラフである。
各種界面活性剤を用いてＵＴＩの測定を行った結果を示
すグラフである。
【図３】本発明の測定方法のさらにその他の実施例にお
いて、界面活性剤を添加する試薬の種類を変えてＵＴＩ
の測定を行った結果を示すグラフである。
いて、界面活性剤を添加する試薬の種類を変えてＵＴＩ
の測定を行った結果を示すグラフである。
【図４】グラフＡおよびグラフＢは、本発明の測定方法
の一実施例において、基質溶液を５種類の処方で調製し
てＵＴＩの測定を行った結果を示すグラフである。
の一実施例において、基質溶液を５種類の処方で調製し
てＵＴＩの測定を行った結果を示すグラフである。
Claims (17)
- 【請求項１】 試料、タンパク質分解酵素および基質を
液中で混合し、前記酵素の活性を測定することにより前
記試料中のタンパク質分解酵素阻害物質を測定する方法
であって、前記基質として、基質中のアミノ酸残基がＬ
型のみである基質を溶解した基質溶液を用いるタンパク
質分解酵素阻害物質の測定方法。 - 【請求項２】 試料、タンパク質分解酵素、基質および
界面活性剤を液中で混合し、前記酵素の酵素活性を測定
することにより前記試料中のタンパク質分解酵素阻害物
質を測定する方法であって、前記界面活性剤が前記液中
への配合前において前記基質と共存しないタンパク質分
解酵素阻害物質の測定方法。 - 【請求項３】 試料、タンパク質分解酵素、基質および
界面活性剤を液中で混合し、前記酵素の活性を測定する
ことにより前記試料中のタンパク質分解酵素阻害物質を
測定する方法であって、前記基質として、基質中のアミ
ノ酸残基がＬ型のみである基質を溶解した基質溶液を用
い、前記界面活性剤が前記液中への配合前において前記
基質溶液中には存在しないタンパク質分解酵素阻害物質
の測定方法。 - 【請求項４】 界面活性剤の酵素反応液中の濃度が０．
０１〜２％である請求項２または３記載の測定方法。 - 【請求項５】 基質が、下記の式（化１）で表される基
質である請求項１または３記載の測定方法。 （化１） 保護基−（Ｌ型アミノ酸残基）n−ｐ-ニトロアニリド ［前記式において、ｎは１〜５の整数である。］ - 【請求項６】 基質が、α-ベンゾイル−Ｌ-アルギニン
−ｐ-ニトロアニリドである請求項５記載の測定方法。 - 【請求項７】 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタン
モノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステ
アレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモ
ノオレート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエ
チレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシ
エチレン（３０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキ
シエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル、１−Ｏ
−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、スクロー
スモノラウレート、３−［（３−コラミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ］−プロパンスルホン酸、３−［（３
−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイ
ドロキシプロパンスルホン酸、臭化セチルトリメチルア
ンモニウム、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムか
らなる群から選択された少なくとも一つである請求項２
〜４のいずれか一項に記載の測定方法。 - 【請求項８】 タンパク質分解酵素がトリプシンであ
り、試料が尿であり、タンパク質分解酵素阻害物質が尿
中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）であり、カルシウ
ム存在下で酵素活性を測定する請求項１〜７のいずれか
一項に記載の測定方法。 - 【請求項９】 タンパク質分解酵素および基質を備えた
タンパク質分解酵素阻害物質の測定キットであって、前
記基質が、基質中のアミノ酸残基がＬ型のみである基質
を溶解した基質溶液であるタンパク質分解酵素阻害物質
の測定キット。 - 【請求項１０】 タンパク質分解酵素、基質および界面
活性剤を備えたタンパク質分解酵素阻害物質の測定キッ
トであって、前記３試薬の混合前において前記界面活性
剤が前記基質と共存しないタンパク質分解酵素阻害物質
の測定キット。 - 【請求項１１】 タンパク質分解酵素、基質および界面
活性剤を備えたタンパク質分解酵素阻害物質の測定キッ
トであって、前記基質は、基質中のアミノ酸残基がＬ型
のみである基質を溶解した基質溶液であり、前記界面活
性剤が前記基質溶液中に存在しないタンパク質分解酵素
阻害物質の測定キット。 - 【請求項１２】 緩衝液（Ｒ１）、タンパク質分解酵素
液（Ｒ２）、基質溶液（Ｒ３）を備えたタンパク質分解
酵素阻害物質の測定キットであって、前記緩衝液（Ｒ
１）およびタンパク質分解酵素液（Ｒ２）の少なくとも
一方の液中に界面活性剤が含有されている請求項１０ま
たは１１記載の測定キット。 - 【請求項１３】 界面活性剤の濃度が、酵素反応液中で
０．０１〜２％の濃度範囲となるように調整されている
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の測定キット。 - 【請求項１４】 基質が、下記の式（化１）で表される
基質である請求項９または１１記載の測定キット。 （化１） 保護基−（Ｌ型アミノ酸残基）n−ｐ-ニトロアニリド ［前記式において、ｎは１〜５の整数である。］ - 【請求項１５】 基質が、α-ベンゾイル−Ｌ-アルギニ
ン−ｐ-ニトロアニリドである請求項１４記載の測定キ
ット。 - 【請求項１６】 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノス
テアレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタン
モノオレート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシ
エチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキ
シエチレン（３０）オクチルフェニルエーテル、ポリオ
キシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル、１−
Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、スクロ
ースモノラウレート、３−［（３−コラミドプロピル）
ジメチルアンモニオ］−プロパンスルホン酸、３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２
−ハイドロキシプロパンスルホン酸、臭化セチルトリメ
チルアンモニウム、水酸化ベンジルトリメチルアンモニ
ウムからなる群から選択された少なくとも一つである請
求項１０〜１３のいずれか一項に記載の測定キット。 - 【請求項１７】 カルシウムをさらに備え、測定対象試
料が尿であり、タンパク質分解酵素がトリプシンであ
り、タンパク質分解酵素阻害物質が尿中トリプシンイン
ヒビター（ＵＴＩ）である請求項９〜１６のいずれか一
項に記載の測定キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23485097A JP3626982B2 (ja) | 1997-08-29 | 1997-08-29 | タンパク質分解酵素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キット |
| US09/135,915 US6130055A (en) | 1997-08-29 | 1998-08-18 | Method for measuring the concentration or the activity of protease inhibitor |
| EP98306748A EP0902091A3 (en) | 1997-08-29 | 1998-08-24 | Method and kit for measuring the concentration or the activity of a protease inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23485097A JP3626982B2 (ja) | 1997-08-29 | 1997-08-29 | タンパク質分解酵素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1175896A true JPH1175896A (ja) | 1999-03-23 |
| JP3626982B2 JP3626982B2 (ja) | 2005-03-09 |
Family
ID=16977343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23485097A Expired - Fee Related JP3626982B2 (ja) | 1997-08-29 | 1997-08-29 | タンパク質分解酵素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6130055A (ja) |
| EP (1) | EP0902091A3 (ja) |
| JP (1) | JP3626982B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6770764B2 (en) | 2000-05-15 | 2004-08-03 | Bayer Corporation | Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same |
| US6955921B2 (en) | 2001-04-30 | 2005-10-18 | Bayer Corporation | Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same |
| JP2010540925A (ja) * | 2007-10-01 | 2010-12-24 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | カスケード酵素免疫測定法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4472823B2 (ja) * | 2000-02-04 | 2010-06-02 | パナソニック株式会社 | クロマトグラフィー試験片、及びその製造方法 |
| IL140994A (en) * | 2000-05-15 | 2005-12-18 | Bayer Ag | Urinary trypsin inhibitor assay containing a chelating agent |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1160311A1 (ru) * | 1983-10-21 | 1985-06-07 | Институт Биофизики Со Ан Ссср | Способ определени активности ингибиторов протеаз |
| CA1254119A (en) * | 1984-07-20 | 1989-05-16 | Lloyd A. Schick | Single step protease inhibitor assay |
| DE3531778A1 (de) * | 1985-09-06 | 1987-03-12 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von proteaseinhibitoren |
| JPH07102137B2 (ja) * | 1988-07-19 | 1995-11-08 | 塩野義製薬株式会社 | 修飾ヒトｐｓｔｉ |
| US5073487A (en) * | 1989-01-30 | 1991-12-17 | Athens Research And Technology, Inc. | Rapid assay for functional human α1 -proteinase inhibitor |
| WO1993009233A2 (en) * | 1991-10-31 | 1993-05-13 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Inc. | Recombinant amyloid precursor protein inhibitor domain and treatment of various disease states |
| WO1993025220A1 (en) * | 1992-06-05 | 1993-12-23 | Reid Thomas J Iii | Test for quantitative thrombin time |
| US5354491A (en) * | 1992-08-14 | 1994-10-11 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergent compositions containing protease and certain β-aminoalkylboronic acids and esters |
| FR2711371B1 (fr) * | 1993-10-18 | 1995-12-29 | Aetsrn | Procédé de préparation d'un concentré d'inter-alpha-trypsine inhibiteur à usage thérapeutique et concentré obtenu. |
| JPH07155198A (ja) * | 1993-12-03 | 1995-06-20 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 尿中ペプシノーゲンの測定方法 |
| DE19512937A1 (de) * | 1995-04-06 | 1996-10-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neuer Inhibitor des Erythrina caffra Typs und dessen Verwendung zur Reinigung von Serinproteasen |
| US5780265A (en) * | 1995-06-05 | 1998-07-14 | Genentech, Inc. | Kunitz type plasma kallikrein inhibitors |
| EP0814167A1 (en) * | 1996-06-21 | 1997-12-29 | Kabushiki Kaisha Kyoto Daiichi Kagaku | A method for measuring the concentration of protease inhibitors, kit for use in such a method and method for dissolving a sunstrate |
-
1997
- 1997-08-29 JP JP23485097A patent/JP3626982B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-08-18 US US09/135,915 patent/US6130055A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-24 EP EP98306748A patent/EP0902091A3/en not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|---|
| US6770764B2 (en) | 2000-05-15 | 2004-08-03 | Bayer Corporation | Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same |
| US6955921B2 (en) | 2001-04-30 | 2005-10-18 | Bayer Corporation | Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same |
| JP2010540925A (ja) * | 2007-10-01 | 2010-12-24 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | カスケード酵素免疫測定法 |
| US8642356B2 (en) | 2007-10-01 | 2014-02-04 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Cascade enzyme-linked immunosorbent assay |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3626982B2 (ja) | 2005-03-09 |
| EP0902091A3 (en) | 2001-01-10 |
| US6130055A (en) | 2000-10-10 |
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