JPH09191898A - ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試薬 - Google Patents
ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試薬Info
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- JPH09191898A JPH09191898A JP923796A JP923796A JPH09191898A JP H09191898 A JPH09191898 A JP H09191898A JP 923796 A JP923796 A JP 923796A JP 923796 A JP923796 A JP 923796A JP H09191898 A JPH09191898 A JP H09191898A
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- reagent
- leucine
- nitroanilide
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 溶液中における基質が非酵素的に分解され
ず、安定したロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試
薬を提供する。 【解決手段】 ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用
試薬の非酵素的分解を抑制するため、基質であるＬ−ロ
イシン−ｐ−ニトロアニリドまたはその塩を含む溶液中
のｐＨを２〜５に維持する。
ず、安定したロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試
薬を提供する。 【解決手段】 ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用
試薬の非酵素的分解を抑制するため、基質であるＬ−ロ
イシン−ｐ−ニトロアニリドまたはその塩を含む溶液中
のｐＨを２〜５に維持する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ロイシンアミノペ
プチダーゼ（以下、ＬＡＰと略す）活性の測定に関す
る。より詳しくは、ＬＡＰ活性の測定において、基質と
して用いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドまたはそ
の塩の安定化に関するものである。
プチダーゼ（以下、ＬＡＰと略す）活性の測定に関す
る。より詳しくは、ＬＡＰ活性の測定において、基質と
して用いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドまたはそ
の塩の安定化に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＬＡＰは、Ｎ末端がロイシンであるペプ
チドを加水分解する酵素であり、生体内の各組織に広く
分布する。血清中のＬＡＰ活性値の測定は肝機能障害、
肝胆道疾患、糖尿病、転移性肝癌、膵頭部癌などにおけ
る診断や予後の観察に欠かすことのできない重要な検査
項目の一つである。
チドを加水分解する酵素であり、生体内の各組織に広く
分布する。血清中のＬＡＰ活性値の測定は肝機能障害、
肝胆道疾患、糖尿病、転移性肝癌、膵頭部癌などにおけ
る診断や予後の観察に欠かすことのできない重要な検査
項目の一つである。
【０００３】ＬＡＰの測定方法としては、Ｌ−ロイシン
−β−ナフチルアミドを基質とし、ＬＡＰにより遊離す
るβ−ナフチルアミンを発色して測定する方法が用いら
れてきたが、この方法は反応過程が複雑で、かつ厳密な
操作を必要とすることなど検査法としては不便であるこ
とや、標準物質であるβ−ナフチルアミンが発癌物質で
あるなどの問題があった。
−β−ナフチルアミドを基質とし、ＬＡＰにより遊離す
るβ−ナフチルアミンを発色して測定する方法が用いら
れてきたが、この方法は反応過程が複雑で、かつ厳密な
操作を必要とすることなど検査法としては不便であるこ
とや、標準物質であるβ−ナフチルアミンが発癌物質で
あるなどの問題があった。
【０００４】ＧＳＣＣ（German Society for Clinical
Chemistry ）では、基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニト
ロアニリドを用いる試薬処方がＬＡＰの測定方法として
推奨されている。しかし、この基質は水に難溶であると
いう欠点があった。このためＬ−ロイシン−ｐ−ニトロ
アニリドを無機酸の塩あるいは有機酸の塩に変えて可溶
化する方法（特開昭５０−１０５６１８号公報）が提案
されている。しかしながら、これらの基質を溶液状態で
保存すると、酵素が存在しなくても分解して（以下これ
を非酵素的分解とよぶ。）発色物質のｐ−ニトロアニリ
ンを遊離するという問題がある。
Chemistry ）では、基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニト
ロアニリドを用いる試薬処方がＬＡＰの測定方法として
推奨されている。しかし、この基質は水に難溶であると
いう欠点があった。このためＬ−ロイシン−ｐ−ニトロ
アニリドを無機酸の塩あるいは有機酸の塩に変えて可溶
化する方法（特開昭５０−１０５６１８号公報）が提案
されている。しかしながら、これらの基質を溶液状態で
保存すると、酵素が存在しなくても分解して（以下これ
を非酵素的分解とよぶ。）発色物質のｐ−ニトロアニリ
ンを遊離するという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記事情に鑑
みてなされたもので、ＬＡＰ活性の測定に基質として用
いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドの保存中の非酵
素的な分解を抑制し、経時安定性を高めることを目的と
する。
みてなされたもので、ＬＡＰ活性の測定に基質として用
いるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドの保存中の非酵
素的な分解を抑制し、経時安定性を高めることを目的と
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明はＬ−ロイシン−
ｐ−ニトロアニリドまたはその塩を基質として用いるＬ
ＡＰ活性測定用試薬の基質を含む溶液中のｐＨが２〜５
に調整されていることを特徴とするＬＡＰ活性測定用試
薬を要旨とする。本発明の試薬を用いれば、基質の非酵
素的な分解を抑制することができ、精度よく測定するこ
とができる。
ｐ−ニトロアニリドまたはその塩を基質として用いるＬ
ＡＰ活性測定用試薬の基質を含む溶液中のｐＨが２〜５
に調整されていることを特徴とするＬＡＰ活性測定用試
薬を要旨とする。本発明の試薬を用いれば、基質の非酵
素的な分解を抑制することができ、精度よく測定するこ
とができる。
【０００７】本発明において試薬は基質を含む溶液と測
定時のｐＨを調整する溶液の２試薬で構成される。この
ため基質としては溶解性に優れるＬ−ロイシン−ｐ−ニ
トロアニリドの塩を使用することが好ましい。この塩の
種類としては塩酸、硫酸等の無機酸の塩および酢酸等の
有機酸の塩のいずれであってもよい。また、ＬＡＰ活性
を測定するための感度を保持するために基質の含有量は
２〜１２０ｍＭ／ｌであることが好ましい。２ｍＭより
少ないと反応性が悪くなり、１２０ｍＭより多いとブラ
ンクでの吸光度が高すぎて充分な測定範囲が得られな
い。
定時のｐＨを調整する溶液の２試薬で構成される。この
ため基質としては溶解性に優れるＬ−ロイシン−ｐ−ニ
トロアニリドの塩を使用することが好ましい。この塩の
種類としては塩酸、硫酸等の無機酸の塩および酢酸等の
有機酸の塩のいずれであってもよい。また、ＬＡＰ活性
を測定するための感度を保持するために基質の含有量は
２〜１２０ｍＭ／ｌであることが好ましい。２ｍＭより
少ないと反応性が悪くなり、１２０ｍＭより多いとブラ
ンクでの吸光度が高すぎて充分な測定範囲が得られな
い。
【０００８】本発明においてＬ−ロイシン−ｐ−ニトロ
アニリドを含む水溶液のｐＨを２〜５に調整する方法と
しては緩衝液を使用する。例えば、塩化カリウム−塩酸
緩衝液、塩化ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐ−トルエンス
ルホン酸−ｐ−ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝
液、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−ク
エン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−リン酸２ナトリウ
ム緩衝液、β−β’−ジメチルグルタル酸−水酸化ナト
リウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸
−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸水素カリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液などが挙げられ、これらの緩衝液
を用いて基質を含む溶液中のｐＨを２〜５にする。この
範囲から外れると基質の非酵素的な分解が大きくなるた
め好ましくない。また、ｐＨ２より低いと反応時のｐＨ
のコントロールに影響を与えるため好ましくなく、ｐＨ
５より高いと基質の溶解性が低下するため好ましくな
い。
アニリドを含む水溶液のｐＨを２〜５に調整する方法と
しては緩衝液を使用する。例えば、塩化カリウム−塩酸
緩衝液、塩化ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐ−トルエンス
ルホン酸−ｐ−ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝
液、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−ク
エン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−リン酸２ナトリウ
ム緩衝液、β−β’−ジメチルグルタル酸−水酸化ナト
リウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸
−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸水素カリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液などが挙げられ、これらの緩衝液
を用いて基質を含む溶液中のｐＨを２〜５にする。この
範囲から外れると基質の非酵素的な分解が大きくなるた
め好ましくない。また、ｐＨ２より低いと反応時のｐＨ
のコントロールに影響を与えるため好ましくなく、ｐＨ
５より高いと基質の溶解性が低下するため好ましくな
い。
【０００９】本発明における測定時のｐＨを調整する溶
液にはｐＨ７．０〜８．０で緩衝能を有するものを使用
する。例えば、ＭＯＰＳ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ
緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒｉ
ｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝
液、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝
液などが挙げられる。これらの緩衝液の濃度としては２
０ｍＭ〜１Ｍであることが好ましい。
液にはｐＨ７．０〜８．０で緩衝能を有するものを使用
する。例えば、ＭＯＰＳ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ
緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒｉ
ｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝
液、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝
液などが挙げられる。これらの緩衝液の濃度としては２
０ｍＭ〜１Ｍであることが好ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下実施例により本発明をさらに
詳細に述べる。 〔実施例１〕基質であるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニ
リドの保存中の非酵素的な分解の抑制効果を検討するた
め、温度６０℃の恒温器中でシミュレーション試験を行
った。なお、測定試料は生理食塩水を用い、第１試薬は
１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）を使用し、
第２試薬は１２ｍＭのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリ
ド塩酸塩を精製水に溶解し、塩化ナトリウム−塩酸緩衝
液でｐＨの調整を行ったものを使用した。測定は第１試
薬２５０μｌと生理食塩水８μｌを３７℃で５分間あら
かじめインキュベートした後、第２試薬１２５μを加え
てさらに１分間インキュベートを行い、吸光度を測定し
た。その結果を表１に示す。吸光度の測定は主波長４０
５ｎｍ、副波長５０５ｎｍで行い、表中の数値は吸光度
（mAbs）を表す。
詳細に述べる。 〔実施例１〕基質であるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニ
リドの保存中の非酵素的な分解の抑制効果を検討するた
め、温度６０℃の恒温器中でシミュレーション試験を行
った。なお、測定試料は生理食塩水を用い、第１試薬は
１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）を使用し、
第２試薬は１２ｍＭのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリ
ド塩酸塩を精製水に溶解し、塩化ナトリウム−塩酸緩衝
液でｐＨの調整を行ったものを使用した。測定は第１試
薬２５０μｌと生理食塩水８μｌを３７℃で５分間あら
かじめインキュベートした後、第２試薬１２５μを加え
てさらに１分間インキュベートを行い、吸光度を測定し
た。その結果を表１に示す。吸光度の測定は主波長４０
５ｎｍ、副波長５０５ｎｍで行い、表中の数値は吸光度
（mAbs）を表す。
【００１１】
【表１】
【００１２】表１に示す通り、ｐＨ２〜ｐＨ５において
基質溶液の吸光度の上昇は抑えられ、基質の非酵素的な
分解を抑制する効果が顕著に現れた。
基質溶液の吸光度の上昇は抑えられ、基質の非酵素的な
分解を抑制する効果が顕著に現れた。
【００１３】〔実施例２〕実施例１における測定試料を
管理血清に置き換え、基質液中のｐＨがＬＡＰ活性値に
及ぼす影響について検討を行った。測定は第１試薬２５
０μｌと管理血清８μｌを３７℃で５分間あらかじめイ
ンキュベートした後、第２試薬１２５μを加えてさらに
インキュベートを行い、１分後から５分後までの吸光度
の変化を測定して、ｐ−ニトロアニリンの分子吸光係数
からＬＡＰ活性値を求めた。この結果を表２に示す。な
お表中の数値は国際単位(IU ／L ）で表す。
管理血清に置き換え、基質液中のｐＨがＬＡＰ活性値に
及ぼす影響について検討を行った。測定は第１試薬２５
０μｌと管理血清８μｌを３７℃で５分間あらかじめイ
ンキュベートした後、第２試薬１２５μを加えてさらに
インキュベートを行い、１分後から５分後までの吸光度
の変化を測定して、ｐ−ニトロアニリンの分子吸光係数
からＬＡＰ活性値を求めた。この結果を表２に示す。な
お表中の数値は国際単位(IU ／L ）で表す。
【００１４】
【表２】
【００１５】表２の結果から、ｐＨ２〜ｐＨ５の場合
は、２週間経過後でも血清中のＬＡＰ活性値はほぼ同じ
値であった。一方、ｐＨ２より低い場合およびｐＨ５よ
り高い場合ではＬＡＰ活性値が低下しており、保存中の
基質分解による影響が見られた。
は、２週間経過後でも血清中のＬＡＰ活性値はほぼ同じ
値であった。一方、ｐＨ２より低い場合およびｐＨ５よ
り高い場合ではＬＡＰ活性値が低下しており、保存中の
基質分解による影響が見られた。
【００１６】
【発明の効果】本発明のように、基質であるＬ−ロイシ
ン−ｐ−ニトロアニリドを含む溶液中のｐＨを２〜５に
維持することで、基質の非酵素的な分解を効果的に抑制
することができる。このため従来のように保存条件を冷
蔵保存に依存することなく、常温での保存ができるた
め、輸送や保管において扱いやすく、経済的にも安価な
試薬を提供することが可能である。
ン−ｐ−ニトロアニリドを含む溶液中のｐＨを２〜５に
維持することで、基質の非酵素的な分解を効果的に抑制
することができる。このため従来のように保存条件を冷
蔵保存に依存することなく、常温での保存ができるた
め、輸送や保管において扱いやすく、経済的にも安価な
試薬を提供することが可能である。
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドまた
はその塩を基質として用いるロイシンアミノペプチダー
ゼ活性測定用試薬の基質を含む溶液中のｐＨが２〜５に
調整されていることを特徴とするロイシンアミノペプチ
ダーゼ活性測定用試薬。 - 【請求項２】 基質を含む溶液中での基質の含有量が２
〜１２０ｍＭ／ｌであることを特徴とする請求項１記載
のロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00923796A JP3404731B2 (ja) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00923796A JP3404731B2 (ja) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09191898A true JPH09191898A (ja) | 1997-07-29 |
| JP3404731B2 JP3404731B2 (ja) | 2003-05-12 |
Family
ID=11714802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00923796A Expired - Fee Related JP3404731B2 (ja) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | ロイシンアミノペプチターゼ活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3404731B2 (ja) |
-
1996
- 1996-01-23 JP JP00923796A patent/JP3404731B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3404731B2 (ja) | 2003-05-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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