JPH06181798A - 酵素阻害物質の測定法 - Google Patents
酵素阻害物質の測定法Info
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- JPH06181798A JPH06181798A JP35671692A JP35671692A JPH06181798A JP H06181798 A JPH06181798 A JP H06181798A JP 35671692 A JP35671692 A JP 35671692A JP 35671692 A JP35671692 A JP 35671692A JP H06181798 A JPH06181798 A JP H06181798A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 臨床検査などの分野で使用され、アンチトロ
ンビン-IIIなどの酵素阻害物質の測定法を提供すること
を目的とする。 【構成】 本発明は、測定対象である酵素阻害物質と過
剰の酵素とを反応させ、残存する酵素を測定することに
より酵素阻害物質を測定する方法であって、反応系に当
該酵素に対する阻害物質であって且つ測定対象である酵
素阻害物質とは異なる第２の酵素阻害物質、又は測定対
象である酵素阻害物質に対する阻害物質を添加すること
からなる。本発明の方法によれば、検体を希釈すること
なく酵素阻害物質を測定することができるので、操作性
に優れ、簡便且つ迅速に測定を行うことができ、自動分
析にも適用することができるという効果を奏する。
ンビン-IIIなどの酵素阻害物質の測定法を提供すること
を目的とする。 【構成】 本発明は、測定対象である酵素阻害物質と過
剰の酵素とを反応させ、残存する酵素を測定することに
より酵素阻害物質を測定する方法であって、反応系に当
該酵素に対する阻害物質であって且つ測定対象である酵
素阻害物質とは異なる第２の酵素阻害物質、又は測定対
象である酵素阻害物質に対する阻害物質を添加すること
からなる。本発明の方法によれば、検体を希釈すること
なく酵素阻害物質を測定することができるので、操作性
に優れ、簡便且つ迅速に測定を行うことができ、自動分
析にも適用することができるという効果を奏する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素阻害物質の測定法に
関し、より詳細には、臨床検査などの分野で利用され、
操作性、測定精度などを改善した酵素阻害物質の測定法
に関する。
関し、より詳細には、臨床検査などの分野で利用され、
操作性、測定精度などを改善した酵素阻害物質の測定法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内における酵素反応は、その活性化
物質や反応を阻害する阻害物質により巧妙に制御・調整
され、機能の調節が図られている。例えば、血液凝固機
構においては、血管損傷部位以外での血液凝固反応や、
過度の凝固亢進・線溶亢進を阻害する酵素阻害物質が存
在し、これにより血液凝固・線溶の制御・調節が行われ
ている。血栓形成の進展状態を検査する凝血学的検査に
おいては酵素阻害物質の測定は重要であり、凝固・線溶
の状態を示すよい指標となることから、アンチトロンビ
ン-III（以下、ＡＴ−IIIという）、α1−アンチトリプ
シン、α1−アンチキモトリプシン、α2−プラスミンイ
ンヒビターなどの酵素阻害物質の測定が行われている。
特に、ＡＴ−IIIの測定は重要であり、肝硬変、急性・
慢性肝炎等の肝疾患、動脈硬化症、循環器疾患、広汎性
血管内凝固(DIC)などの診断に用いられる。このような
酵素阻害物質の測定法（定量法）としては、測定対象で
ある酵素阻害物質と過剰の酵素とを反応させ、残存する
酵素を測定することにより酵素阻害物質を測定すること
が行われている。例えば、生体試料（検体）中のＡＴ−
IIIを測定する場合には、ＡＴ−IIIが酵素トロンビンを
阻害することを利用して、一定量のトロンビンを検体中
のＡＴ−IIIと反応させ、残存するトロンビンの活性を
測定することにより、ＡＴ−IIIを測定することが行わ
れている。この際、トロンビン活性の測定は、発色性合
成基質の加水分解速度を吸光度変化をもって測定する方
法、天然基質であるフィブリノゲンのフィブリンへの転
換速度を凝固時間をもって測定する方法などが用いられ
る。
物質や反応を阻害する阻害物質により巧妙に制御・調整
され、機能の調節が図られている。例えば、血液凝固機
構においては、血管損傷部位以外での血液凝固反応や、
過度の凝固亢進・線溶亢進を阻害する酵素阻害物質が存
在し、これにより血液凝固・線溶の制御・調節が行われ
ている。血栓形成の進展状態を検査する凝血学的検査に
おいては酵素阻害物質の測定は重要であり、凝固・線溶
の状態を示すよい指標となることから、アンチトロンビ
ン-III（以下、ＡＴ−IIIという）、α1−アンチトリプ
シン、α1−アンチキモトリプシン、α2−プラスミンイ
ンヒビターなどの酵素阻害物質の測定が行われている。
特に、ＡＴ−IIIの測定は重要であり、肝硬変、急性・
慢性肝炎等の肝疾患、動脈硬化症、循環器疾患、広汎性
血管内凝固(DIC)などの診断に用いられる。このような
酵素阻害物質の測定法（定量法）としては、測定対象で
ある酵素阻害物質と過剰の酵素とを反応させ、残存する
酵素を測定することにより酵素阻害物質を測定すること
が行われている。例えば、生体試料（検体）中のＡＴ−
IIIを測定する場合には、ＡＴ−IIIが酵素トロンビンを
阻害することを利用して、一定量のトロンビンを検体中
のＡＴ−IIIと反応させ、残存するトロンビンの活性を
測定することにより、ＡＴ−IIIを測定することが行わ
れている。この際、トロンビン活性の測定は、発色性合
成基質の加水分解速度を吸光度変化をもって測定する方
法、天然基質であるフィブリノゲンのフィブリンへの転
換速度を凝固時間をもって測定する方法などが用いられ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来、上記の方法にて
酵素阻害物質が測定されているが、血液検体中には酵素
阻害物質が多く含まれており、特にＡＴ−IIIは多量
（約２５ｍｇ／ｄｌ）に存在するため、通常の検体量
（５〜５０μｌ）で測定しようとするには検体を希釈す
る必要がある。検体を希釈する操作は煩雑で、測定の迅
速化、簡便化を図る上では、検体を希釈しないで測定で
きる方が好ましい。しかし、検体を希釈しないで測定し
ようとすれば、検体量を極端に少なくする必要がある
が、一般にサンプリング量が少なくなるにしたがって測
定の再現性が低下し、また２μｌ以下のサンプリングは
実質的に不可能である。一方、非希釈検体を通常のサン
プリング量用いて測定する場合には、酵素（トロンビ
ン）が消費されてしまい、残存トロンビンに基づいて検
体中のＡＴ−III量を測定することができない。また、
それを回避するためにトロンビンを増加させると、残存
トロンビン量が多くなり、残存トロンビンの測定に際し
て、反応速度が大きくなり過ぎ、前記の合成基質を用い
る方法では吸光度が３以上となり測定不可能となった
り、フィブリノーゲン基質を用いる方法においては凝固
時間が著しく短くなり測定不能となる。
酵素阻害物質が測定されているが、血液検体中には酵素
阻害物質が多く含まれており、特にＡＴ−IIIは多量
（約２５ｍｇ／ｄｌ）に存在するため、通常の検体量
（５〜５０μｌ）で測定しようとするには検体を希釈す
る必要がある。検体を希釈する操作は煩雑で、測定の迅
速化、簡便化を図る上では、検体を希釈しないで測定で
きる方が好ましい。しかし、検体を希釈しないで測定し
ようとすれば、検体量を極端に少なくする必要がある
が、一般にサンプリング量が少なくなるにしたがって測
定の再現性が低下し、また２μｌ以下のサンプリングは
実質的に不可能である。一方、非希釈検体を通常のサン
プリング量用いて測定する場合には、酵素（トロンビ
ン）が消費されてしまい、残存トロンビンに基づいて検
体中のＡＴ−III量を測定することができない。また、
それを回避するためにトロンビンを増加させると、残存
トロンビン量が多くなり、残存トロンビンの測定に際し
て、反応速度が大きくなり過ぎ、前記の合成基質を用い
る方法では吸光度が３以上となり測定不可能となった
り、フィブリノーゲン基質を用いる方法においては凝固
時間が著しく短くなり測定不能となる。
【０００４】図１は、上記の関係を示す概念図である。
横軸は検体中のＡＴ−III濃度を示し、縦軸は反応速度
（即ち、残存トロンビンと発色性合成基質又はフィブリ
ノーゲン基質との反応速度）を示す。図中、Ａは理想的
な検量線を示す。一方、Ｂは、酵素量はＡと同じにする
と共に非希釈検体を用い、検体量を通常のサンプリング
量として測定したケースを示し、検体中の総計ＡＴ−II
I量が多いので、ＡＴ−III濃度の低い範囲でトロンビン
が消費されてしまい、残存トロンビン活性がなくなり、
測定できる範囲が狭くなる。また、Ｃは、検体量はＡと
同じにしてトロンビン量を増加させたケースで、残存ト
ロンビン量が多くなるので、測定不可能な反応速度の範
囲が生じ、この場合も測定できる範囲が狭くなる。更
に、Ｄは検体量及び酵素量を増加させたケースで、この
場合も残存トロンビン量が多くなり、測定できる範囲が
狭くなる。このように、酵素阻害物質の測定に際し、測
定の操作性、迅速性を改善する上からは検体を希釈しな
いで測定することが好ましいが、従来の方法においては
非希釈検体を用いて測定を行うことは不可能であった。
本発明はかかる問題を解決するためになされたもので、
検体を希釈することなく酵素阻害物質を測定（定量）で
きる方法を提供することを目的とする。
横軸は検体中のＡＴ−III濃度を示し、縦軸は反応速度
（即ち、残存トロンビンと発色性合成基質又はフィブリ
ノーゲン基質との反応速度）を示す。図中、Ａは理想的
な検量線を示す。一方、Ｂは、酵素量はＡと同じにする
と共に非希釈検体を用い、検体量を通常のサンプリング
量として測定したケースを示し、検体中の総計ＡＴ−II
I量が多いので、ＡＴ−III濃度の低い範囲でトロンビン
が消費されてしまい、残存トロンビン活性がなくなり、
測定できる範囲が狭くなる。また、Ｃは、検体量はＡと
同じにしてトロンビン量を増加させたケースで、残存ト
ロンビン量が多くなるので、測定不可能な反応速度の範
囲が生じ、この場合も測定できる範囲が狭くなる。更
に、Ｄは検体量及び酵素量を増加させたケースで、この
場合も残存トロンビン量が多くなり、測定できる範囲が
狭くなる。このように、酵素阻害物質の測定に際し、測
定の操作性、迅速性を改善する上からは検体を希釈しな
いで測定することが好ましいが、従来の方法においては
非希釈検体を用いて測定を行うことは不可能であった。
本発明はかかる問題を解決するためになされたもので、
検体を希釈することなく酵素阻害物質を測定（定量）で
きる方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、検体を希
釈することなく酵素阻害物質を測定する方法を鋭意研究
した結果、残存酵素活性を低減させるか又は酵素阻害物
質の活性を低減させることにより、簡便且つ高精度で酵
素阻害物質を測定できることを見出して本発明を完成さ
せた。即ち、本発明の酵素阻害物質の測定法は、測定対
象である酵素阻害物質と過剰の酵素とを反応させ、残存
する酵素を測定することにより酵素阻害物質を測定する
方法において、反応系に当該酵素に対する阻害物質であ
って且つ測定対象である酵素阻害物質とは異なる第２の
酵素阻害物質、又は測定対象である酵素阻害物質に対す
る阻害物質を添加することからなる。従来の方法では、
図１のＡのような検量線を得るために検体を希釈する
か、又はＢ若しくはＣの条件において、反応条件を酵素
や阻害物質の反応至適条件でない環境で測定する方法が
取られていた。この場合には、他の共存するマクログロ
ブリンなどの影響を受ける等、特異性に欠ける測定とな
る。それに対し、本発明の方法は、非希釈検体を用いな
がらも、測定可能な範囲が広く、図１のＡのような理想
的な検量線が得られる測定法を提供するものである。
釈することなく酵素阻害物質を測定する方法を鋭意研究
した結果、残存酵素活性を低減させるか又は酵素阻害物
質の活性を低減させることにより、簡便且つ高精度で酵
素阻害物質を測定できることを見出して本発明を完成さ
せた。即ち、本発明の酵素阻害物質の測定法は、測定対
象である酵素阻害物質と過剰の酵素とを反応させ、残存
する酵素を測定することにより酵素阻害物質を測定する
方法において、反応系に当該酵素に対する阻害物質であ
って且つ測定対象である酵素阻害物質とは異なる第２の
酵素阻害物質、又は測定対象である酵素阻害物質に対す
る阻害物質を添加することからなる。従来の方法では、
図１のＡのような検量線を得るために検体を希釈する
か、又はＢ若しくはＣの条件において、反応条件を酵素
や阻害物質の反応至適条件でない環境で測定する方法が
取られていた。この場合には、他の共存するマクログロ
ブリンなどの影響を受ける等、特異性に欠ける測定とな
る。それに対し、本発明の方法は、非希釈検体を用いな
がらも、測定可能な範囲が広く、図１のＡのような理想
的な検量線が得られる測定法を提供するものである。
【０００６】本発明の方法は、図１のＤのような条件下
の反応系において酵素に対する第２の酵素阻害物質を添
加して酵素活性を低減させるか（以下、第１の方法とい
う）又は図１のＢのような条件下の反応系において測定
対象である酵素阻害物質に対する阻害物質を添加して当
該酵素阻害物質の活性を低減させる（以下、第２の方法
という）ことにより、図１のＡのような理想的な検量線
を与える条件に修正して、酵素阻害物質の測定を行うも
のである。
の反応系において酵素に対する第２の酵素阻害物質を添
加して酵素活性を低減させるか（以下、第１の方法とい
う）又は図１のＢのような条件下の反応系において測定
対象である酵素阻害物質に対する阻害物質を添加して当
該酵素阻害物質の活性を低減させる（以下、第２の方法
という）ことにより、図１のＡのような理想的な検量線
を与える条件に修正して、酵素阻害物質の測定を行うも
のである。
【０００７】以下、本発明の方法をより詳細に説明する
が、上記の第１の方法においては、まず図１のＤの条件
を予め設定しておく。即ち、検体量を増加させても残存
する酵素が測定可能な量存在する酵素量を用い、検体中
の酵素阻害物質と反応させた後に、第２の酵素阻害物質
を添加して残存する酵素活性を低減させて測定する方法
である。添加された第２の酵素阻害物質により酵素活性
が阻害され、その結果、図１のＡの条件が得られるよう
になる。
が、上記の第１の方法においては、まず図１のＤの条件
を予め設定しておく。即ち、検体量を増加させても残存
する酵素が測定可能な量存在する酵素量を用い、検体中
の酵素阻害物質と反応させた後に、第２の酵素阻害物質
を添加して残存する酵素活性を低減させて測定する方法
である。添加された第２の酵素阻害物質により酵素活性
が阻害され、その結果、図１のＡの条件が得られるよう
になる。
【０００８】より具体的に、酵素阻害物質ＡＴ−IIIを
測定する場合をもって説明すると、実際には、通常の方
法では酵素活性が大きくなりすぎて、測定できない量の
トロンビンを用い、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝
液等）中で、検体中のＡＴ−IIIとトロンビンとを反応
させた後、残存トロンビン活性を測定する時に、第２の
酵素阻害物質としてトロンビンの阻害物質（例えば、ア
ルガトロバン、ベンザミジン類、ＤＡＰＡ、ヒルジン
等）を適当量添加する。これにより、トロンビン活性が
減少し、測定可能な範囲を広げることができる。トロン
ビン活性の測定は、従来の方法と同様にして行うことが
でき、残存トロンビン活性は検体中のＡＴ−III量と逆
比例することから、トロンビン活性を測定することによ
り、検体中のＡＴ−III濃度（活性）が測定できる。こ
のように、第２の酵素阻害物質（トロンビン阻害物質）
を使えば、再現性のよいサンプリング容量の検体量で、
しかも検体を希釈する必要もなくＡＴ−IIIを測定でき
る。上記はトロンビンとトロンビン阻害物質を用いるＡ
Ｔ−IIIの測定例を示したが、この方法は他の酵素阻害
物質にも利用できる。その例を表１に示す。
測定する場合をもって説明すると、実際には、通常の方
法では酵素活性が大きくなりすぎて、測定できない量の
トロンビンを用い、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝
液等）中で、検体中のＡＴ−IIIとトロンビンとを反応
させた後、残存トロンビン活性を測定する時に、第２の
酵素阻害物質としてトロンビンの阻害物質（例えば、ア
ルガトロバン、ベンザミジン類、ＤＡＰＡ、ヒルジン
等）を適当量添加する。これにより、トロンビン活性が
減少し、測定可能な範囲を広げることができる。トロン
ビン活性の測定は、従来の方法と同様にして行うことが
でき、残存トロンビン活性は検体中のＡＴ−III量と逆
比例することから、トロンビン活性を測定することによ
り、検体中のＡＴ−III濃度（活性）が測定できる。こ
のように、第２の酵素阻害物質（トロンビン阻害物質）
を使えば、再現性のよいサンプリング容量の検体量で、
しかも検体を希釈する必要もなくＡＴ−IIIを測定でき
る。上記はトロンビンとトロンビン阻害物質を用いるＡ
Ｔ−IIIの測定例を示したが、この方法は他の酵素阻害
物質にも利用できる。その例を表１に示す。
【０００９】
【表１】
【００１０】用いる酵素とその阻害物質（第２の酵素阻
害物質）は特に限定されないが、測定対象物質を特異的
に測定できる酵素とその阻害物質を組み合わせればよ
い。なお、使用する酵素及び第２の酵素阻害物質の種類
によっては、測定対象の酵素阻害物質と酵素を反応させ
る際に、第２の酵素阻害物質を共存させることも可能で
ある。
害物質）は特に限定されないが、測定対象物質を特異的
に測定できる酵素とその阻害物質を組み合わせればよ
い。なお、使用する酵素及び第２の酵素阻害物質の種類
によっては、測定対象の酵素阻害物質と酵素を反応させ
る際に、第２の酵素阻害物質を共存させることも可能で
ある。
【００１１】本発明の第２の測定法は、測定対象である
酵素阻害物質の活性を当該酵素阻害物質の阻害物質によ
り低減させることを要旨とするもので、例えば、図１の
Ｂの条件を設定しておいて、測定対象である検体中の酵
素阻害物質の阻害活性を、当該酵素阻害物質に対する阻
害物質より低減させて測定する方法である。添加された
阻害物質により測定対象である酵素阻害物質の活性が阻
害され、その結果、図１のＡの条件が得られるようにな
る。より具体的には、例えば、ＡＴ−IIIを測定する場
合、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）中で、検
体中のＡＴ−IIIと酵素を反応させる際に、ＡＴ−IIIに
特異的な阻害物質（例えば、抗ＡＴ−III抗体等）を共
存させてＡＴ−III活性を低下させる。その結果、ＡＴ
−III測定に必要な範囲にわたってトロンビン活性が残
存するので、図１のＡのような条件下に測定を行うこと
ができ、検体を希釈することなくＡＴ−IIIを測定する
ことが可能となる。なお、この際、ＡＴ−IIIとその阻
害剤を反応させた後に、酵素を反応させてもよい。残存
トロンビン活性の測定は、従来の方法と同様にして行う
ことができる。ＡＴ−IIIなどの測定対象酵素阻害物質
の活性を低下させるには、化学物質等を添加する方法
や、ｐＨ調整剤によるｐＨの変化によっても可能である
が、この場合には、酵素阻害物質以外の物質に影響され
るおそれがある。従って、酵素阻害物質の活性を特異的
に低下させることが重要であり、当該酵素阻害物質に対
する抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗
体）が好適に使用される。
酵素阻害物質の活性を当該酵素阻害物質の阻害物質によ
り低減させることを要旨とするもので、例えば、図１の
Ｂの条件を設定しておいて、測定対象である検体中の酵
素阻害物質の阻害活性を、当該酵素阻害物質に対する阻
害物質より低減させて測定する方法である。添加された
阻害物質により測定対象である酵素阻害物質の活性が阻
害され、その結果、図１のＡの条件が得られるようにな
る。より具体的には、例えば、ＡＴ−IIIを測定する場
合、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）中で、検
体中のＡＴ−IIIと酵素を反応させる際に、ＡＴ−IIIに
特異的な阻害物質（例えば、抗ＡＴ−III抗体等）を共
存させてＡＴ−III活性を低下させる。その結果、ＡＴ
−III測定に必要な範囲にわたってトロンビン活性が残
存するので、図１のＡのような条件下に測定を行うこと
ができ、検体を希釈することなくＡＴ−IIIを測定する
ことが可能となる。なお、この際、ＡＴ−IIIとその阻
害剤を反応させた後に、酵素を反応させてもよい。残存
トロンビン活性の測定は、従来の方法と同様にして行う
ことができる。ＡＴ−IIIなどの測定対象酵素阻害物質
の活性を低下させるには、化学物質等を添加する方法
や、ｐＨ調整剤によるｐＨの変化によっても可能である
が、この場合には、酵素阻害物質以外の物質に影響され
るおそれがある。従って、酵素阻害物質の活性を特異的
に低下させることが重要であり、当該酵素阻害物質に対
する抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗
体）が好適に使用される。
【００１２】本発明の方法は、上記で説明した例に限定
されるものではなく、適宜変更して実施することができ
る。測定対象である酵素阻害物質も、血液中の酵素阻害
物質に限られるものではなく、種々の酵素阻害物質の測
定に本発明の方法は適用することができる。また、測定
に際しての反応条件（例えば、反応温度、反応時間、反
応系のｐＨ、溶媒等）は、測定対象である酵素阻害物
質、酵素、第２の酵素阻害物質、測定対象である酵素阻
害物質に対する阻害物質（抗体等）などの種類により、
適宜選択することができる。
されるものではなく、適宜変更して実施することができ
る。測定対象である酵素阻害物質も、血液中の酵素阻害
物質に限られるものではなく、種々の酵素阻害物質の測
定に本発明の方法は適用することができる。また、測定
に際しての反応条件（例えば、反応温度、反応時間、反
応系のｐＨ、溶媒等）は、測定対象である酵素阻害物
質、酵素、第２の酵素阻害物質、測定対象である酵素阻
害物質に対する阻害物質（抗体等）などの種類により、
適宜選択することができる。
【００１３】
【発明の効果】以上のように、本発明の方法によれば、
検体を希釈することなく酵素阻害物質を測定することが
でき、しかも高い測定精度が得られる。従って、本発明
は操作性に優れ、簡便且つ迅速に酵素阻害物質を測定で
き、特に自動分析に好適に使用することができるという
効果を奏する。
検体を希釈することなく酵素阻害物質を測定することが
でき、しかも高い測定精度が得られる。従って、本発明
は操作性に優れ、簡便且つ迅速に酵素阻害物質を測定で
き、特に自動分析に好適に使用することができるという
効果を奏する。
【００１４】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ 下記組成の第１試薬２４０μｌに、所定量のＡＴ−III
を含む血漿検体を３、６、９μｌ及び１０倍希釈した検
体１５μｌをそれぞれ加え、５分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬６０μｌを添加後、波長７３
０ｎｍでの吸光度の１分間当りの増加速度（反応速度）
を測定し、検体中のＡＴ−III活性（％）と反応速度と
の関係を求めた。その結果を図２に示す。この図は、い
わゆるＡＴ−III活性測定の検量線を示しており、検体
量が増加するに従って、測定範囲が狭くなっていること
が判る。このように検体を希釈しないで測定しようとす
れば、測定範囲が狭くなり不都合であることが判る。 第１試薬 トロンビン １Ｕ／ｍｌ ヘパリン ２Ｕ／ｍｌ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)- m-トルイジン ナトリウム塩(カップラー) １０ｍＭ ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０） 第２試薬 フェリシアン化カリウム ２０ｍＭ Ｄ−フェニルアラニル−プロリル− アルギニル−モルホリノアニリン（合成基質） １ｍＭ ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ 下記組成の第１試薬２４０μｌに、所定量のＡＴ−III
を含む血漿検体を３、６、９μｌ及び１０倍希釈した検
体１５μｌをそれぞれ加え、５分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬６０μｌを添加後、波長７３
０ｎｍでの吸光度の１分間当りの増加速度（反応速度）
を測定し、検体中のＡＴ−III活性（％）と反応速度と
の関係を求めた。その結果を図２に示す。この図は、い
わゆるＡＴ−III活性測定の検量線を示しており、検体
量が増加するに従って、測定範囲が狭くなっていること
が判る。このように検体を希釈しないで測定しようとす
れば、測定範囲が狭くなり不都合であることが判る。 第１試薬 トロンビン １Ｕ／ｍｌ ヘパリン ２Ｕ／ｍｌ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)- m-トルイジン ナトリウム塩(カップラー) １０ｍＭ ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０） 第２試薬 フェリシアン化カリウム ２０ｍＭ Ｄ−フェニルアラニル−プロリル− アルギニル−モルホリノアニリン（合成基質） １ｍＭ ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
【００１５】実施例２ 検体量を６μｌとし、第１試薬中のトロンビン濃度を１
０Ｕ／ｍｌとした他は実施例１と同様に操作し、トロン
ビン阻害物質であるアルガトロバンを第２試薬中に１０
μｇ／ｍｌ添加若しくは無添加で、実施例１と同様に反
応速度を測定し、検体中のＡＴ−III活性（％）と反応
速度との関係を求めた。その結果を図３に示す。図中、
●は本発明の方法（アルガトロバン添加）による測定結
果を、○は従来法（アルガトロバン無添加）による測定
結果を示す。図３に示されるように、アルガトロバンを
添加しない場合には、残存トロンビン活性が大きく、測
定不能の範囲が広いが、アルガトロバンを添加した場合
には、検体量を６μｌとしても図２の検体を希釈した場
合と同様な検量線が得られ、ＡＴ−IIIの広い濃度範囲
にわたって測定できることが判る。
０Ｕ／ｍｌとした他は実施例１と同様に操作し、トロン
ビン阻害物質であるアルガトロバンを第２試薬中に１０
μｇ／ｍｌ添加若しくは無添加で、実施例１と同様に反
応速度を測定し、検体中のＡＴ−III活性（％）と反応
速度との関係を求めた。その結果を図３に示す。図中、
●は本発明の方法（アルガトロバン添加）による測定結
果を、○は従来法（アルガトロバン無添加）による測定
結果を示す。図３に示されるように、アルガトロバンを
添加しない場合には、残存トロンビン活性が大きく、測
定不能の範囲が広いが、アルガトロバンを添加した場合
には、検体量を６μｌとしても図２の検体を希釈した場
合と同様な検量線が得られ、ＡＴ−IIIの広い濃度範囲
にわたって測定できることが判る。
【００１６】実施例３ 検体量を３μｌとし、第１試薬中にヤギ抗ＡＴ−III抗
体を４００μｇ／ｍｌ添加又は無添加で、実施例１と同
様に反応速度を測定し、検体中のＡＴ−III活性（％）
と反応速度との関係を求めた。その結果を図４に示す。
図中、●は本発明の方法（抗体添加）による測定結果
を、○は従来法（抗体無添加）による測定結果を示す。
図４に示されるように、抗体無添加では実施例１と同じ
く測定範囲が狭いが、抗体添加により、広い範囲でＡＴ
−IIIを測定できることが判る。
体を４００μｇ／ｍｌ添加又は無添加で、実施例１と同
様に反応速度を測定し、検体中のＡＴ−III活性（％）
と反応速度との関係を求めた。その結果を図４に示す。
図中、●は本発明の方法（抗体添加）による測定結果
を、○は従来法（抗体無添加）による測定結果を示す。
図４に示されるように、抗体無添加では実施例１と同じ
く測定範囲が狭いが、抗体添加により、広い範囲でＡＴ
−IIIを測定できることが判る。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来法において、検体中のＡＴ−III濃度と残
存酵素活性（反応速度）との関係を示す概念図である。
存酵素活性（反応速度）との関係を示す概念図である。
【図２】実施例１において、検体量を変化させた場合に
おける検体中のＡＴ−III活性と残存酵素活性（反応速
度）との関係を示す図である。
おける検体中のＡＴ−III活性と残存酵素活性（反応速
度）との関係を示す図である。
【図３】実施例２における検体中のＡＴ−III活性と残
存酵素活性（反応速度）との関係を示す図である。図
中、●は本発明の方法による測定結果を、○は従来法に
よる測定結果を示す。
存酵素活性（反応速度）との関係を示す図である。図
中、●は本発明の方法による測定結果を、○は従来法に
よる測定結果を示す。
【図４】実施例３における検体中のＡＴ−III活性と残
存酵素活性（反応速度）との関係を示す図である。図
中、●は本発明の方法による測定結果を、○は従来法に
よる測定結果を示す。
存酵素活性（反応速度）との関係を示す図である。図
中、●は本発明の方法による測定結果を、○は従来法に
よる測定結果を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 測定対象である酵素阻害物質と過剰
の酵素とを反応させ、残存する酵素を測定することによ
り酵素阻害物質を測定する方法において、反応系に当該
酵素に対する阻害物質であって且つ測定対象である酵素
阻害物質とは異なる第２の酵素阻害物質、又は測定対象
である酵素阻害物質に対する阻害物質を添加することを
特徴とする酵素阻害物質の測定法。 - 【請求項２】 測定対象である酵素阻害物質と酵素
との反応後、第２の酵素阻害物質を添加し、残存酵素を
測定する請求項１記載の酵素阻害物質の測定法。 - 【請求項３】 測定対象である酵素阻害物質に対す
る阻害物質により当該酵素阻害物質を低減させて酵素と
反応させ、残存酵素を測定する請求項１記載の酵素阻害
物質の測定法。 - 【請求項４】 測定対象である酵素阻害物質が、ア
ンチトロンビン-III、α1−アンチトリプシン、α1−ア
ンチキモトリプシン又はα2−プラスミンインヒビター
である請求項１から３のいずれかに記載の酵素阻害物質
の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35671692A JP3188005B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | 酵素阻害物質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35671692A JP3188005B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | 酵素阻害物質の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181798A true JPH06181798A (ja) | 1994-07-05 |
| JP3188005B2 JP3188005B2 (ja) | 2001-07-16 |
Family
ID=18450428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35671692A Expired - Fee Related JP3188005B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | 酵素阻害物質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3188005B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092728A3 (en) * | 2003-04-07 | 2005-06-02 | Praecis Pharm Inc | Methods of measuring the ability of a test compound to inactivate a biological target in cells of a subject |
| JP2011069718A (ja) * | 2009-09-25 | 2011-04-07 | Sekisui Medical Co Ltd | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
-
1992
- 1992-12-22 JP JP35671692A patent/JP3188005B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092728A3 (en) * | 2003-04-07 | 2005-06-02 | Praecis Pharm Inc | Methods of measuring the ability of a test compound to inactivate a biological target in cells of a subject |
| JP2011069718A (ja) * | 2009-09-25 | 2011-04-07 | Sekisui Medical Co Ltd | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3188005B2 (ja) | 2001-07-16 |
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