JP3773595B2 - アンチトロンビンｉｉｉ 活性測定方法及び測定用試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は被検試料、特には生体液試料、例えば、血漿中等のアンチトロンビンIII 活性の測定方法及び測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンチトロンビンIII （以下、ＡＴIII ともいう）は血漿中に存在するセリンプロテアーゼ阻害物質である。その阻害活性はヘパリンと結合することにより大幅に促進されること（ヘパリンコファクター活性）が知られており、生体中で機能するにはヘパリンとの結合が重要であると考えられている。ＡＴIII は生体中においてＸａ因子やセリンプロテアーゼの一種であるトロンビンを阻害することによって血液凝固の制御に大きな役割を果たしている。従って、血漿中に含まれるＡＴIII 濃度を測定することは生体中の血液凝固阻止能の評価や、凝固／線溶系の動態を調べる上で大きな意義をもつ。また、ＡＴIII は肝臓で合成されるので、肝機能低下の指標としても用いることができる。
【０００３】
ＡＴIII の測定には、大きく分けて２通りの方法が従来から用いられている。一つは特異的抗体を使用した抗原測定法である。この抗原測定法では、トロンビン阻害活性を消失したＡＴIII 分子又は遺伝的変異等により正常に機能しないＡＴIII と正常なＡＴIII とを区別することができない。
【０００４】
もう一つはトロンビン等の酵素に対する阻害作用を利用した活性測定法である。現在汎用されている活性測定方法は、既知量のトロンビン及びヘパリン混合液に対して血漿サンプルを添加し、一定時間インキュベートした後に残存するトロンビン活性を発色性合成基質により定量し、減少したトロンビン活性量からサンプル中のＡＴIII 濃度を算出する方法である。このため、活性測定法の方が血漿中のＡＴIII による有効な抗凝固能を、より正確に反映しているものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この活性測定法には以下のような問題点がある。第１の問題点は、血漿中のトロンビン阻害物質であるヘパリンコファクターII（以下、ＨＣIIともいう）による正の干渉が挙げられる。実際、幾つかの活性測定系において測定値の１０〜２０％がＡＴIII ではなくＨＣIIに由来するものであることが報告されている〔Ｂｏｈｎｅｒら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７１，３，２８０−２８３（１９９４）及びＴｒａｎら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，５７１−５７６（１９８５）〕。ＨＣIIによる干渉を回避する方法として、ＨＣIIと反応しない酵素Ｘａ因子を使用する方法〔Ｄｅｍｅｒｓら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６９，３，２３１−２３５（１９９３）〕や、ＡＴIII とＨＣIIとのヘパリンに対する親和性の差を利用して、反応液中に高濃度の塩を添加する方法〔特開平７−８２９８号公報、並びに臨床検査機器・試薬１７巻６号別冊１０１３−１０２０（１９９４）〕等が提案されている。
【０００６】
第２の問題点は、ＡＴIII のヘパリン非依存的なトロンビン阻害活性による正の干渉である。この干渉を強く受けると、ヘパリン結合能をもたないか、又はヘパリンによる促進効果を受けられない分子異常ＡＴIII であって、かつトロンビンとの反応部位が正常である分子異常ＡＴIII を正常ＡＴIII として測定してしまうからである。例えば、ヘパリン結合能欠損異常ＡＴIII 〔ＡＴIII Ｎａｇａｓａｋｉ：岡嶋ら，Ｂｌｏｏｄ，８１，５，１３００〜１３０５（１９９３）〕のＡＴIII 活性を不当に高値と評価してしまう可能性がある。
【０００７】
この問題は、被検試料を希釈することなしにＡＴIII 活性を測定することと関連する。すなわち、ＡＴIII 活性にはヘパリン依存的活性と非依存的活性とがあり、生体内ではヘパリン依存的活性の方が非依存的活性よりも１０００倍程度大きいと考えられ〔Ｊ．Ｂ．Ｃ．，Ｖｏｌ．２４８，１８，６４９０−６５０５（１９７３）〕、臨床的にもヘパリン依存的活性の定量の方が意義深い。従来、被検試料を希釈する方法においては、ＡＴIII 、ヘパリン、及びトロンビンが反応する環境を生体内とほぼ同一に設定しており、ヘパリン非依存的活性による正の干渉は殆ど問題とならなかった。
これに対して、被検試料を希釈することなしにＡＴIII を測定しようとすると、相対的にヒトロンビン分子数に対してＡＴIII 分子数が大過剰となり、反応する環境を生体内とほぼ同一に設定するためには、反応液中に高濃度のトロンビンが必要である。しかし、その条件では、反応液の吸光度が、分光光度計の測定可能範囲を超えてしまうため、自動分析などには不都合であった。この解決法の１つに、高濃度のトロンビンを使用する代わりに、ＡＴIII とトロンビンとの結合反応を抑制する方法があり、例えば、反応液中に高濃度の塩を添加する方法（特開平７−８２９８号公報）が提案されている。しかし、この方法では、ヘパリン依存的活性を非依存的活性よりも強く抑制するので、ヘパリン非依存的活性を定量してしまうという問題点がある。従って、非希釈法における抑制方法は、ヘパリン依存的活性と非依存的活性とを同等に抑制するか、又は非依存的活性に対してより強く働き、非依存的活性の正の干渉がないものである必要がある。
【０００８】
すなわち、本発明の目的は、被検試料を希釈せずに用いることのできるＡＴIII 活性測定方法において、前記の種々の干渉（特には、ＨＣIIによる正の干渉及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉）を実質的に受けることなく、ＡＴIII 活性を一層正確に測定することのできる手段を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記の目的は、本発明による、アンチトロンビンIIIを含む被検試料に、ヘパリン及び既知濃度のトロンビンを添加して複合体を形成させた後、残存するトロンビン活性を検出することにより被検試料中のアンチトロンビンIII活性を測定する方法において、前記複合体を形成させる反応前又は反応時にアルカリ金属塩及び式（１）：
ＨＯＣＨ ２ −〔Ｃ（ＯＨ）Ｈ〕ｎ−ＣＨ ２ ＯＨ （１）
（式中、ｎは０又は１〜４の整数である）
で表される多価アルコールを共存させ、前記式（１）で表される多価アルコールの反応時の終濃度を１０容量％−６０容量％とすることを特徴とする、アンチトロンビンIII活性測定方法によって達成することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
本発明を用いて測定することのできる被検試料は、ＡＴIII を含有する試料であれば特に限定されないが、特には生体液試料、例えば、血液、血漿、又は血清である。
【００１１】
本発明に用いることのできる多価アルコールは、好ましくは式：
ＨＯＣＨ2 −〔Ｃ（ＯＨ）Ｈ〕ｎ−ＣＨ2 ＯＨ
（式中、ｎは０又は１〜４の整数である）で表される化合物であり、例えば、エチレングリコール、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、及びソルビトールなどを挙げることができる。エチレングリコールが特に好ましい。
【００１２】
本発明においては、セリンプロテアーゼ・ＡＴIII ・ヘパリン複合体を形成させる反応前又は反応時に、更にアルカリ金属塩を共存させることができる。
前記アルカリ金属塩は、アルカリ金属と有機酸又は好ましくは無機酸との塩である。ナトリウム、カリウム又はリチウムのハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物、臭化物若しくはヨウ化物）、硫酸塩又はリン酸塩が好ましく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、又はリン酸リチウム等を用いることができる。これらの塩の１種又は複数種を組み合わせて用いることができる。
アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）を共存させる場合には、０．３Ｍ以下の濃度範囲で使用することができる。
【００１３】
本発明では、ヘパリンとＡＴIII との複合体を形成することのできる反応系において、例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５Ｍ〜０．１８Ｍの存在下で、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度１０〜６０容量％、好ましくは２０容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ＨＣIIによる正の干渉を抑制することができる。この場合、ｐＨは特に限定されることはないが、通常、ｐＨ６〜９の範囲で使用することができる。
また、前記反応系において、例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．２〜８．５の場合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度１０容量％以上、好ましくは２０容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制することができる。実際には、個々のｐＨ値に応じて、多価アルコールの適切な使用量範囲が存在し、その範囲は適宜決定することができる。例えば、多価アルコール（特にエチレングリコール）を、ｐＨ約７．０では１０容量％以上、好ましくは１５容量％〜４０容量％の範囲で、また、ｐＨ約８．０では２０容量％以上、好ましくは２５容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制することができる。なお、ｐＨ約６以下の条件下では、多価アルコールの存在の有無に関わらず、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉は、実質的に検出されない。
【００１４】
実際には、前記のＨＣIIによる正の干渉の抑制効果、及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉の抑制効果が得られる条件下で、更に、ＡＴIII 濃度とセリンプロテアーゼの検出手段（例えば、吸光度）との間に濃度依存的相対関係を示すｐＨ値と多価アルコール使用量とを、簡単な予備試験によって適宜決定することができる。
例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．０〜７．０の場合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度１５容量％〜４０容量％の範囲で使用することが好ましい。また、例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ７．５〜９．０の場合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度２５容量％〜６０容量％の範囲で使用することが好ましい。
【００１５】
本発明では、被検試料中に共存するヘパリンコファクターIIの干渉を、多価アルコールの添加によって排除する。すなわち、一般にアンチトロンビンIII やヘパリンコファクターIIは、それぞれヘパリンと結合して複合体を形成することによってセリンプロテアーゼ活性（例えば、トロンビン活性）を阻害することができるが、ヘパリンに対する親和性は、反応の場の多価アルコール濃度によって異なる。
ヘパリンコファクターIIは、多価アルコール不在下においては、ヘパリンと結合して、ヘパリン・ヘパリンコファクターII複合体を形成し、更には、トロンビン・ヘパリン・ヘパリンコファクターII複合体を形成する。一方、多価アルコールの存在下においては、ヘパリンとヘパリンコファクターIIとトロンビンとは、複合体を形成しない。
それに対して、アンチトロンビンIII は、多価アルコールの存在下においてもヘパリン結合能を示す。従って、トロンビン、ヘパリン、及び被検アンチトロンビンIII を反応させる場に、多価アルコールを存在させることにより、ヘパリンコファクターIIにはトロンビン活性を阻害させず、アンチトロンビンIII のみによってトロンビン活性を阻害させる環境とすることができる。この結果、ヘパリンコファクターIIの干渉を受けないアンチトロンビンIII 測定系を成立させることができる。
【００１６】
セリンプロテアーゼとしてトロンビンを用いる場合には、前記の各反応は、以下の式（１）〜（３）で表すことができる。
III ・ヘパリン複合体
前記の各反応後、残存するトロンビン活性（残存トロンビン活性）を従来公知の合成基質法やフィブリン形成の阻害時間法等によって測定する。一方、被検試料として生理食塩水などを使用し、試薬中に含まれている全トロンビンの活性（全トロンビン活性）を測定し、それらの測定値から、以下の計算式によってアンチトロンビンIII 活性を求めることができる。
ＡAT＝ＡTA−ＡTB
（式中、ＡATはアンチトロンビンIII 活性、ＡTAは全トロンビン活性、そしてＡTBは残存トロンビン活性を表す）
【００１７】
なお、本発明方法においては、通常の公知ＡＴIII 活性測定法と同様に、セリンプロテアーゼとして、例えばトロンビン又は第Ｘ因子を用いることができる。また、ヘパリンとしては、特にその由来は限定されず、また、高分子ヘパリンあるいは低分子ヘパリンのいずれも用いることができる。
【００１８】
本発明方法においては、多価アルコールの存在下で被検試料とヘパリン及びセリンプロテアーゼとを接触させて複合体を形成させた後に、当業界で公知の任意の方法により残存セリンプロテアーゼ活性を測定することができる。例えば、合成基質法を用いて残存トロンビン活性を測定する場合は、前記反応終了後、基質含有溶液を添加して、トロンビン活性を測定すればよい。この合成基質としては公知の任意の基質を適宜選択して用いることができ、例えば、トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド、アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド等を用いることができる。これら合成基質より誘導される発色物質を分光学的に検出する。また、残存トロンビン活性を、第ＸIII 因子存在下にフィブリノゲンをフィブリンに転換する活性として凝固時間を測定することにより求めることもできる。
【００１９】
一方、セリンプロテアーゼとして第Ｘ因子を用いる場合は、被検試料とへパリンと第Ｘ因子とを接触させてヘパリン・ＡＴIII ・第Ｘ因子複合体を形成させた後、残存する第Ｘ因子に対して、第Ｘ因子に特異的な合成基質（例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド等）を含有する溶液を前記複合体形成反応後に添加して、基質から誘導される発色物質を分光学的に検出する。
前記と同様に、公知の任意の方法によりブランク試験としての全トロンビン活性を測定することができる。
【００２０】
更に、本発明は、ＡＴIII 活性測定用試薬にも関する。本発明による試薬は、ヘパリン及びセリンプロテアーゼを含有する通常のＡＴIII 活性測定用試薬に、多価アルコールを含有させ、更に場合によりアルカリ金属塩を含有させることからなり、これにより、ヘパリンコファクターIIの影響を受けずに精度よくアンチトロンビンIII 活性を測定するための試薬を提供することができる。ＡＴIII 活性測定用試薬が二試薬系からなる場合には、第一試薬及び／又は第二試薬に前記と同様の多価アルコールを含有させることができる。例えば、セリンプロテアーゼとしてトロンビンを用い、残存トロンビン活性を合成基質法にて測定するための試薬組成としては、その反応の手順を考慮してヘパリン、トロンビン及び多価アルコールからなる第一試薬と、合成基質を含む第二試薬から構成するのが好ましい。あるいは、第一試薬にヘパリンと多価アルコール、第二試薬にトロンビン（必要に応じて多価アルコール）、第三試薬に合成基質をそれぞれ含有させて構成してもよい。
【００２１】
前記の二試薬系の場合、第一試薬中のヘパリンの濃度範囲は従来公知の第一試薬の濃度範囲と同じでよく、例えば０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。また、トロンビンも従来公知の第一試薬の濃度範囲で同じでよく、例えば０．０１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜５Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。多価アルコールは試薬添加量や測定系の条件により調整すればよく、例えば、トロンビンとヘパリンとＡＴIII とが複合体を形成する反応の場に、例えば、アルカリ金属塩（特にはＮａＣｌ）を０．０５〜０．１８Ｍの濃度で共存させる場合には、多価アルコール濃度が１０〜６０容量％、好ましくは２０〜６０容量％の量となるように試薬濃度を調整して構成すればよい。
【００２２】
前記の構成を有する第一試薬を精製水あるいは適当な緩衝液に溶解して用いることができる。緩衝液としては、構成成分を安定に保つことができ、且つＡＴIII との複合体形成を阻害しないもの、更には残存トロンビンと合成基質との反応を阻害しないものであれば特に限定はされない。具体的には、トリス緩衝液、グッド緩衝液、ヘペス緩衝液等、従来公知の緩衝液から適宜選択して用いることができる。更に粉末状として供する場合には、例えば、トロンビン０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０Ｕ／ｍｌを公知の手段で凍結乾燥して粉末状とし、その粉末状組成物の溶解液として０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１００Ｕ／ｍｌのヘパリン及び前記濃度の多価アルコールを含む緩衝液を別途調製し、使用時にトロンビンを溶解して用いることもできる。
【００２３】
前記の二試薬系の場合、第二試薬の基質としては、従来公知の第二試薬に含まれている基質を従来公知の第二試薬と同様の濃度で用いることができる。具体的には、トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド、アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド等の合成基質を好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜５０ｍＭの濃度となるように調整する。これらを精製水あるいは前記と同様の緩衝液に溶解して用いる。更に、基質物質の安定性等を考慮して、これらを公知の手段より凍結乾燥品の形で保存することもできる。
【００２４】
セリンプロテアーゼとして第Ｘ因子を用いる場合には、前記と同様に従来公知の試薬に多価アルコールを前記の濃度となるように添加すればよい。また、基質も、例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−アルギニル−パラニトロアニリド、又はＮ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド等の公知の基質を用いればよい。
また、残存するトロンビン活性を、第ＸIII 因子存在下にフィブリンをフィブリノゲンに転換する活性として凝固時間を測定することにより求める場合にも、従来の公知試薬に多価アルコールを前記の濃度となるように添加して構成することができる。
【００２５】
ＨＣIIによる干渉の回避、及び高濃度のＡＴIII を含む被検試料の測定を実施する方法として、反応液中に高濃度の塩を添加する方法が提案されているが（特開平７−８２９８号公報）、ヘパリン依存的活性を非依存的活性よりも強く抑制するので、ヘパリン非依存的活性を定量してしまうという欠点があった。多価アルコール（例えば、エチレングリコール）を共存させる本発明方法は、ＨＣIIによる干渉の回避、高濃度のＡＴIII を含む被検試料の測定、及びヘパリン非依存的ＡＴIII 活性の抑制を、同時に満たすことができるという点で、従来法とは異なる新規な方法であり、且つ優れている。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例においては、測定機器には自動分析装置ＬＰＩＡ２００（商品名；三菱化学製）を用いた。ＡＴIII 活性測定用試薬は、Ｒ１試薬（トロンビン１８０ｍＵ／ｍｌ、ヘパリン２０ｕｎｉｔ／ｍｌ、及びウシ血清アルブミン０．３５ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液）と、Ｒ２試薬〔６ｍＭトロンビン活性検出用合成基質Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド（日東紡製：以下、ＮＳ１５００と称する）〕とからなる。但し、以下の各実施例の内容に応じて、ＮａＣｌ及び／又はエチレングリコールをＲ１試薬に適宜添加して使用した。また、各実施例で用いるｐＨ条件に応じて、Ｒ１試薬中のトリス緩衝液の代わりに２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳと称する）緩衝液、クエン酸緩衝液、又はリン酸緩衝液を使用した。なお、実施例における濃度（エチレングリコール，ＮａＣｌ）は、全て最終濃度（検体＋Ｒ１＋Ｒ２）で表記した。
測定は以下の手順で実施した。すなわち、Ｒ１試薬２３６μｌに生理食塩水２４μｌを添加し、更に、被検試料（例えば、無希釈血漿検体）又は生理食塩水（ブランク用）３μｌを添加し、３７℃で５分間インキュベートを行った。次いで、Ｒ２試薬４０μｌを添加し、反応液を３７℃に維持したまま、４０５ｎｍの吸光度変化を１０分間測定した。生理食塩水を添加した場合の１０分間の吸光度変化と、被検試料を添加した場合の１０分間の吸光度変化との差から、被検試料中のＡＴIII 活性を算出した。
【００２７】
実施例１：血漿全体のトロンビン阻害活性に占めるＨＣ II の比率
正常プール血漿１４０μｌに対し、過剰量（１００μｌ）の抗ヒトＡＴIII ウサギ抗体（Ｄａｋｏ社）を添加し、室温で３０分間インキュベートすることにより不活化処理を実施した。このとき残留したトロンビン阻害活性は、ＨＣIIに由来することを抗ＨＣII特異抗体による吸収で確認した。
この残留したＨＣIIによるトロンビン阻害活性に関し、反応液中のＮａＣｌ濃度とエチレングリコール濃度との関係について調べた（図１〜図３及び表１〜３）。なお、本実施例においては、反応条件に応じて、ＮａＣｌの終濃度が０．０４Ｍ〜０．３９Ｍになるように、更に、エチレングリコールの終濃度が１２容量％又は２４容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ及びエチレングリコールを添加した。また、Ｒ１試薬の緩衝液には、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）を使用した。
【００２８】
比較例として、エチレングリコール濃度が０％の場合の結果を、図１及び表１に示す。
図１において、実線ａは、生理食塩水を添加したときの１０分間の吸光度変化の値（以下、Δａと称する）を直線で結んだものであり、反応液中の全トロンビン活性を示す。また、破線ｂは、不活化処理を実施したプール血漿を添加したときの１０分間の吸光度変化の値（Δｂと称する）を直線で結んだものであり、ＨＣIIにより阻害された反応液中の残存トロンビン活性を示す。更に、一点鎖線ｃは、正常プール血漿を添加したときの１０分間の吸光度変化の値（Δｃと称する）を直線で結んだものであり、血漿により阻害された反応液中の残存トロンビン活性を示す。
表１において、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）であり、（ｂ）は「ＨＣIIによるトロンビン活性阻害率」（以下、αb と称する）であり、算出式：αb ＝１００×（Δａ−Δｂ）／Δａにより求めた。また、（ｃ）は「血漿によるトロンビン活性阻害率」（以下、αC と称する）であり、算出式：αC ＝１００×（Δａ−Δｃ）／Δａにより求めた。更には、（ｄ）は「血漿による阻害に占めるＨＣIIの比率」であり、算出式：αb ／αC により求めた。
表１に示すように、ＨＣIIによるトロンビン阻害活性は反応液中のＮａＣｌ濃度に依存することが認められた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
エチレングリコール濃度が１２％（Ｖ／Ｖ）の場合の結果を図２及び表２に示し、エチレングリコール濃度が２４％（Ｖ／Ｖ）の場合の結果を図３及び表３に示す。表中、（ａ）〜（ｄ）は表１と同じ意味である。
反応液にエチレングリコールを添加すると、ＨＣIIによるトロンビン阻害活性は抑制される傾向を示し（図２及び表２）、エチレングリコール濃度が２４％の場合、反応液中のＮａＣｌ濃度に関係なくＨＣIIによるトロンビン阻害活性は、ほぼ完全に消失した（図３及び表３）。２４％以上のエチレングリコール存在下でも同様の結果を得た。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
同様の操作を、ｐＨ値及びエチレングリコール濃度を変化させて実施した。ｐＨ値が６．５の場合の結果を図４に、ｐＨ値が７．０の場合の結果を図５に、ｐＨ値が７．５の場合の結果を図６に、ｐＨ値が８．０の場合の結果を図７に、そしてｐＨ値が８．５の場合の結果を図８にそれぞれ示す。図４〜図８において、実線ａ、破線ｂ、及び一点鎖線ｃは図１〜図３と同じ意味である。また、（１）で示すグラフはエチレングリコール濃度が０％の場合の結果を示し、同様に（２）で示すグラフはエチレングリコール濃度が８％、（３）で示すグラフはエチレングリコール濃度が１６％、そして（４）で示すグラフはエチレングリコール濃度が２４％の場合の結果を示し、（１）〜（４）で示す各グラフの横軸は、反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）であり、縦軸は、１０分間の吸光度変化である。
図４〜図８に示すように、塩化ナトリウム０．２Ｍ以下の存在下で、エチレングリコールの終濃度が１６容量％又は２４容量％、好ましくは２４容量％の場合に、ＨＣIIによるトロンビン阻害活性が抑制されることが判明した。
【００３４】
実施例２：ＡＴ III によるトロンビン阻害活性に対するエチレングリコールの抑制効果
最終反応液量３００μｌ（自動分析装置における典型的な試薬分注量）に対して、無希釈血漿サンプルを３μｌ（多くの自動分析装置における最小サンプル量）分注した場合における、ＡＴIII 活性測定系の検量線の形状、及びそれに対するＲ１試薬へのエチレングリコールの効果を調べた。検量線の形状は反応液中のＮａＣｌ濃度及びｐＨにも左右されるので、ここでは、ＮａＣｌ終濃度が０．１５Ｍで、しかもエチレングリコール終濃度が０〜４０容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ及びエチレングリコールを添加し、Ｒ１試薬の緩衝液としてクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した場合について示す。
結果を図９〜図１４に示す。ＡＴIII 濃度は、健常人血漿に含まれるＡＴIII 濃度の平均値を１００％として示し、ＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたって調べた。図９に示すように、エチレングリコール非添加時には検量線は作成不可能だが、エチレングリコールの添加によりトロンビン阻害活性が抑制され、２４容量％以上の場合（図１２〜図１４）、無希釈の血漿サンプルに対してＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線が作成可能となった。
【００３５】
同様の操作を、Ｒ１試薬に添加するＮａＣｌ濃度、及びＲ１試薬のｐＨを変化させて実施した。ＮａＣｌ濃度が０．０５Ｍの場合の結果を表４に、そしてＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍの場合の結果を表５にそれぞれ示す。表中、記号○は、適正な検量線を作成することができる可能性があることを示し、記号−は、最適ではないものの検量線を成立させ得ることを示し、そして記号×は、検量線が作成不可能であることを示す。表４及び表５に示すように、ｐＨ値とエチレングリコール使用量とを適宜選択することにより、無希釈の血漿に対してＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線が作成可能となることが判明した。
【００３６】
【表４】
【００３７】
【表５】
【００３８】
また、同様の操作を、エチレングリコールの代わりに、グリセロール、ソルビトール、又はキシリトールを使用して実施したところ、エチレングリコールの場合と同様にトロンビン阻害活性を抑制することが判明した。
【００３９】
実施例３：ヘパリンが関与しないトロンビン阻害活性の測定値に与える影響
最終反応液量３００μｌに対し、無希釈血漿サンプル３μｌを分注した条件における、ＡＴIII 活性測定値に対する、ＡＴIII とヘパリンとの相互作用に依存しない阻害活性の影響を調べた。具体的には、Ｒ１試薬中に、ヘパリン濃度が０単位／ｍｌ（図１５）及び１９単位／ｍｌの場合（図１６）における、それぞれＲ１試薬中にＮａＣｌを０．０４〜０．７２Ｍを添加したときのＡＴIII によるトロンビン阻害量を調べた。なお、Ｒ１試薬の緩衝液としては３８ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。
図１５及び図１６において、実線ａは、生理食塩水（ブランク）を添加したときの１０分間の吸光度変化の値を示し、破線ｃは、無希釈正常プール血漿を添加したときの１０分間の吸光度変化の値を示す。トロンビン阻害率（％）は、式：
（トロンビン阻害率）＝１００×（Ｈａ−Ｈｃ）／Ｈａ
（式中、Ｈａは、図１５又は図１６における実線ａの高さを意味し、Ｈｃは、図１５又は図１６における実線ｃの高さを意味する）により、算出することができる。
【００４０】
図１５に示すように、無希釈の正常プール血漿サンプルを添加した場合、反応液にヘパリンが存在しなくても血漿中のＡＴIII により全トロンビン活性の約１０％が阻害された。
図１５及び図１６から算出した、ヘパリンの関与しないトロンビン阻害率（Ａ）、及びヘパリン存在下でのトロンビン阻害率（Ｂ）を表６に示す。表中、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）である。なお、ＮａＣｌ濃度が０．１６Ｍ又は０．２２Ｍの場合、ヘパリン依存的な阻害活性は測定レンジ以上であり、Ａ／Ｂ比は無視することができる。ヘパリン共存下におけるトロンビン阻害活性はＮａＣｌにより抑制されるのに対し（図１６）、ヘパリンの関与しない阻害活性はＮａＣｌの添加では殆ど抑制されなかった（図１５）。従って、０．５ＭのＮａＣｌ存在下では血漿サンプルを無希釈で測定することができるが、ヘパリン結合能のない変異ＡＴIII についても図１５に相当するトロンビン阻害活性（表６のＡ／Ｂ比より約２０％）の分だけ、実際よりも高めの測定値を与えることになる。なお、両条件における阻害活性は、サンプルを抗ＡＴIII 抗体で処理することにより完全に消失する。
【００４１】
【表６】
【００４２】
実施例４：ヘパリンが関与しないＡＴ III によるトロンビン阻害活性に対するエチレングリコールの抑制効果
実施例３に見られる、ヘパリン非存在下で検出されるＡＴIII によるトロンビン阻害活性に対する、反応液中に添加するエチレングリコールの効果を調べた。具体的には、ヘパリンを含まないＲ１試薬に対して、ＮａＣｌ終濃度０．１３Ｍ及びエチレングリコール終濃度０〜２４容量％になるように、ＮａＣｌ及びエチレングリコールを添加した場合について、無希釈正常プール血漿によるトロンビン阻害率を測定した。なお、Ｒ１試薬の緩衝液としては、３８ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
結果を表７に示す。
【００４３】
【表７】
【００４４】
この結果、ｐＨ７．０でＮａＣｌ濃度が０．１３Ｍの場合では、エチレングリコール濃度が１６％（Ｖ／Ｖ）の条件で完全に抑制する効果が見られた。抑制に必要なエチレングリコール濃度は、反応液のｐＨにより異なっており、例えば、ｐＨ８．０でＮａＣｌ濃度が０．１３Ｍの条件では２４％（Ｖ／Ｖ）以上のとき完全に抑制することができる。この特性を利用し、反応液に多価アルコール（例えば、エチレングリコール）を２４％以上存在させることにより、無希釈の血漿サンプルでもヘパリン依存ＡＴIII 活性を正確に測定することができる。従って、この反応条件では前記の変異ＡＴIII を含む検体についても本来のヘパリン依存ＡＴIII 活性測定値を与えることが期待でき、正確な測定が可能となるものである。
同様の操作を、エチレングリコールの代わりにグリセロールを用いて実施したところ、同様にヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制することができた。なお、グリセロールの場合には、エチレングリコールに比べて高い濃度を必要とした。
【００４５】
【発明の効果】
被検試料中のヘパリンコファクターIIの妨害及びアンチトロンビンIII のヘパリン非依存的なトロンビン阻害活性の影響を受けずに、アンチトロンビンIII 活性を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エチレングリコール濃度が０％（Ｖ／Ｖ）の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図２】エチレングリコール濃度が１２％（Ｖ／Ｖ）の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図３】エチレングリコール濃度が２４％（Ｖ／Ｖ）の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図４】ｐＨ６．５の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図５】ｐＨ７．０の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図６】ｐＨ７．５の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図７】ｐＨ８．０の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図８】ｐＨ８．５の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図９】エチレングリコール濃度が０％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１０】エチレングリコール濃度が８％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１１】エチレングリコール濃度が１６％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１２】エチレングリコール濃度が２４％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１３】エチレングリコール濃度が３２％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１４】エチレングリコール濃度が４０％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１５】ヘパリン非存在下におけるトロンピン阻害活性を示すグラフである。
【図１６】ヘパリン存在下におけるトロンピン阻害活性を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は被検試料、特には生体液試料、例えば、血漿中等のアンチトロンビンIII 活性の測定方法及び測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンチトロンビンIII （以下、ＡＴIII ともいう）は血漿中に存在するセリンプロテアーゼ阻害物質である。その阻害活性はヘパリンと結合することにより大幅に促進されること（ヘパリンコファクター活性）が知られており、生体中で機能するにはヘパリンとの結合が重要であると考えられている。ＡＴIII は生体中においてＸａ因子やセリンプロテアーゼの一種であるトロンビンを阻害することによって血液凝固の制御に大きな役割を果たしている。従って、血漿中に含まれるＡＴIII 濃度を測定することは生体中の血液凝固阻止能の評価や、凝固／線溶系の動態を調べる上で大きな意義をもつ。また、ＡＴIII は肝臓で合成されるので、肝機能低下の指標としても用いることができる。
【０００３】
ＡＴIII の測定には、大きく分けて２通りの方法が従来から用いられている。一つは特異的抗体を使用した抗原測定法である。この抗原測定法では、トロンビン阻害活性を消失したＡＴIII 分子又は遺伝的変異等により正常に機能しないＡＴIII と正常なＡＴIII とを区別することができない。
【０００４】
もう一つはトロンビン等の酵素に対する阻害作用を利用した活性測定法である。現在汎用されている活性測定方法は、既知量のトロンビン及びヘパリン混合液に対して血漿サンプルを添加し、一定時間インキュベートした後に残存するトロンビン活性を発色性合成基質により定量し、減少したトロンビン活性量からサンプル中のＡＴIII 濃度を算出する方法である。このため、活性測定法の方が血漿中のＡＴIII による有効な抗凝固能を、より正確に反映しているものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この活性測定法には以下のような問題点がある。第１の問題点は、血漿中のトロンビン阻害物質であるヘパリンコファクターII（以下、ＨＣIIともいう）による正の干渉が挙げられる。実際、幾つかの活性測定系において測定値の１０〜２０％がＡＴIII ではなくＨＣIIに由来するものであることが報告されている〔Ｂｏｈｎｅｒら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７１，３，２８０−２８３（１９９４）及びＴｒａｎら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，５７１−５７６（１９８５）〕。ＨＣIIによる干渉を回避する方法として、ＨＣIIと反応しない酵素Ｘａ因子を使用する方法〔Ｄｅｍｅｒｓら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６９，３，２３１−２３５（１９９３）〕や、ＡＴIII とＨＣIIとのヘパリンに対する親和性の差を利用して、反応液中に高濃度の塩を添加する方法〔特開平７−８２９８号公報、並びに臨床検査機器・試薬１７巻６号別冊１０１３−１０２０（１９９４）〕等が提案されている。
【０００６】
第２の問題点は、ＡＴIII のヘパリン非依存的なトロンビン阻害活性による正の干渉である。この干渉を強く受けると、ヘパリン結合能をもたないか、又はヘパリンによる促進効果を受けられない分子異常ＡＴIII であって、かつトロンビンとの反応部位が正常である分子異常ＡＴIII を正常ＡＴIII として測定してしまうからである。例えば、ヘパリン結合能欠損異常ＡＴIII 〔ＡＴIII Ｎａｇａｓａｋｉ：岡嶋ら，Ｂｌｏｏｄ，８１，５，１３００〜１３０５（１９９３）〕のＡＴIII 活性を不当に高値と評価してしまう可能性がある。
【０００７】
この問題は、被検試料を希釈することなしにＡＴIII 活性を測定することと関連する。すなわち、ＡＴIII 活性にはヘパリン依存的活性と非依存的活性とがあり、生体内ではヘパリン依存的活性の方が非依存的活性よりも１０００倍程度大きいと考えられ〔Ｊ．Ｂ．Ｃ．，Ｖｏｌ．２４８，１８，６４９０−６５０５（１９７３）〕、臨床的にもヘパリン依存的活性の定量の方が意義深い。従来、被検試料を希釈する方法においては、ＡＴIII 、ヘパリン、及びトロンビンが反応する環境を生体内とほぼ同一に設定しており、ヘパリン非依存的活性による正の干渉は殆ど問題とならなかった。
これに対して、被検試料を希釈することなしにＡＴIII を測定しようとすると、相対的にヒトロンビン分子数に対してＡＴIII 分子数が大過剰となり、反応する環境を生体内とほぼ同一に設定するためには、反応液中に高濃度のトロンビンが必要である。しかし、その条件では、反応液の吸光度が、分光光度計の測定可能範囲を超えてしまうため、自動分析などには不都合であった。この解決法の１つに、高濃度のトロンビンを使用する代わりに、ＡＴIII とトロンビンとの結合反応を抑制する方法があり、例えば、反応液中に高濃度の塩を添加する方法（特開平７−８２９８号公報）が提案されている。しかし、この方法では、ヘパリン依存的活性を非依存的活性よりも強く抑制するので、ヘパリン非依存的活性を定量してしまうという問題点がある。従って、非希釈法における抑制方法は、ヘパリン依存的活性と非依存的活性とを同等に抑制するか、又は非依存的活性に対してより強く働き、非依存的活性の正の干渉がないものである必要がある。
【０００８】
すなわち、本発明の目的は、被検試料を希釈せずに用いることのできるＡＴIII 活性測定方法において、前記の種々の干渉（特には、ＨＣIIによる正の干渉及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉）を実質的に受けることなく、ＡＴIII 活性を一層正確に測定することのできる手段を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記の目的は、本発明による、アンチトロンビンIIIを含む被検試料に、ヘパリン及び既知濃度のトロンビンを添加して複合体を形成させた後、残存するトロンビン活性を検出することにより被検試料中のアンチトロンビンIII活性を測定する方法において、前記複合体を形成させる反応前又は反応時にアルカリ金属塩及び式（１）：
ＨＯＣＨ ２ −〔Ｃ（ＯＨ）Ｈ〕ｎ−ＣＨ ２ ＯＨ （１）
（式中、ｎは０又は１〜４の整数である）
で表される多価アルコールを共存させ、前記式（１）で表される多価アルコールの反応時の終濃度を１０容量％−６０容量％とすることを特徴とする、アンチトロンビンIII活性測定方法によって達成することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
本発明を用いて測定することのできる被検試料は、ＡＴIII を含有する試料であれば特に限定されないが、特には生体液試料、例えば、血液、血漿、又は血清である。
【００１１】
本発明に用いることのできる多価アルコールは、好ましくは式：
ＨＯＣＨ2 −〔Ｃ（ＯＨ）Ｈ〕ｎ−ＣＨ2 ＯＨ
（式中、ｎは０又は１〜４の整数である）で表される化合物であり、例えば、エチレングリコール、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、及びソルビトールなどを挙げることができる。エチレングリコールが特に好ましい。
【００１２】
本発明においては、セリンプロテアーゼ・ＡＴIII ・ヘパリン複合体を形成させる反応前又は反応時に、更にアルカリ金属塩を共存させることができる。
前記アルカリ金属塩は、アルカリ金属と有機酸又は好ましくは無機酸との塩である。ナトリウム、カリウム又はリチウムのハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物、臭化物若しくはヨウ化物）、硫酸塩又はリン酸塩が好ましく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、又はリン酸リチウム等を用いることができる。これらの塩の１種又は複数種を組み合わせて用いることができる。
アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）を共存させる場合には、０．３Ｍ以下の濃度範囲で使用することができる。
【００１３】
本発明では、ヘパリンとＡＴIII との複合体を形成することのできる反応系において、例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５Ｍ〜０．１８Ｍの存在下で、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度１０〜６０容量％、好ましくは２０容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ＨＣIIによる正の干渉を抑制することができる。この場合、ｐＨは特に限定されることはないが、通常、ｐＨ６〜９の範囲で使用することができる。
また、前記反応系において、例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．２〜８．５の場合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度１０容量％以上、好ましくは２０容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制することができる。実際には、個々のｐＨ値に応じて、多価アルコールの適切な使用量範囲が存在し、その範囲は適宜決定することができる。例えば、多価アルコール（特にエチレングリコール）を、ｐＨ約７．０では１０容量％以上、好ましくは１５容量％〜４０容量％の範囲で、また、ｐＨ約８．０では２０容量％以上、好ましくは２５容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制することができる。なお、ｐＨ約６以下の条件下では、多価アルコールの存在の有無に関わらず、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉は、実質的に検出されない。
【００１４】
実際には、前記のＨＣIIによる正の干渉の抑制効果、及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉の抑制効果が得られる条件下で、更に、ＡＴIII 濃度とセリンプロテアーゼの検出手段（例えば、吸光度）との間に濃度依存的相対関係を示すｐＨ値と多価アルコール使用量とを、簡単な予備試験によって適宜決定することができる。
例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．０〜７．０の場合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度１５容量％〜４０容量％の範囲で使用することが好ましい。また、例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ７．５〜９．０の場合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃度２５容量％〜６０容量％の範囲で使用することが好ましい。
【００１５】
本発明では、被検試料中に共存するヘパリンコファクターIIの干渉を、多価アルコールの添加によって排除する。すなわち、一般にアンチトロンビンIII やヘパリンコファクターIIは、それぞれヘパリンと結合して複合体を形成することによってセリンプロテアーゼ活性（例えば、トロンビン活性）を阻害することができるが、ヘパリンに対する親和性は、反応の場の多価アルコール濃度によって異なる。
ヘパリンコファクターIIは、多価アルコール不在下においては、ヘパリンと結合して、ヘパリン・ヘパリンコファクターII複合体を形成し、更には、トロンビン・ヘパリン・ヘパリンコファクターII複合体を形成する。一方、多価アルコールの存在下においては、ヘパリンとヘパリンコファクターIIとトロンビンとは、複合体を形成しない。
それに対して、アンチトロンビンIII は、多価アルコールの存在下においてもヘパリン結合能を示す。従って、トロンビン、ヘパリン、及び被検アンチトロンビンIII を反応させる場に、多価アルコールを存在させることにより、ヘパリンコファクターIIにはトロンビン活性を阻害させず、アンチトロンビンIII のみによってトロンビン活性を阻害させる環境とすることができる。この結果、ヘパリンコファクターIIの干渉を受けないアンチトロンビンIII 測定系を成立させることができる。
【００１６】
セリンプロテアーゼとしてトロンビンを用いる場合には、前記の各反応は、以下の式（１）〜（３）で表すことができる。
前記の各反応後、残存するトロンビン活性（残存トロンビン活性）を従来公知の合成基質法やフィブリン形成の阻害時間法等によって測定する。一方、被検試料として生理食塩水などを使用し、試薬中に含まれている全トロンビンの活性（全トロンビン活性）を測定し、それらの測定値から、以下の計算式によってアンチトロンビンIII 活性を求めることができる。
ＡAT＝ＡTA−ＡTB
（式中、ＡATはアンチトロンビンIII 活性、ＡTAは全トロンビン活性、そしてＡTBは残存トロンビン活性を表す）
【００１７】
なお、本発明方法においては、通常の公知ＡＴIII 活性測定法と同様に、セリンプロテアーゼとして、例えばトロンビン又は第Ｘ因子を用いることができる。また、ヘパリンとしては、特にその由来は限定されず、また、高分子ヘパリンあるいは低分子ヘパリンのいずれも用いることができる。
【００１８】
本発明方法においては、多価アルコールの存在下で被検試料とヘパリン及びセリンプロテアーゼとを接触させて複合体を形成させた後に、当業界で公知の任意の方法により残存セリンプロテアーゼ活性を測定することができる。例えば、合成基質法を用いて残存トロンビン活性を測定する場合は、前記反応終了後、基質含有溶液を添加して、トロンビン活性を測定すればよい。この合成基質としては公知の任意の基質を適宜選択して用いることができ、例えば、トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド、アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド等を用いることができる。これら合成基質より誘導される発色物質を分光学的に検出する。また、残存トロンビン活性を、第ＸIII 因子存在下にフィブリノゲンをフィブリンに転換する活性として凝固時間を測定することにより求めることもできる。
【００１９】
一方、セリンプロテアーゼとして第Ｘ因子を用いる場合は、被検試料とへパリンと第Ｘ因子とを接触させてヘパリン・ＡＴIII ・第Ｘ因子複合体を形成させた後、残存する第Ｘ因子に対して、第Ｘ因子に特異的な合成基質（例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド等）を含有する溶液を前記複合体形成反応後に添加して、基質から誘導される発色物質を分光学的に検出する。
前記と同様に、公知の任意の方法によりブランク試験としての全トロンビン活性を測定することができる。
【００２０】
更に、本発明は、ＡＴIII 活性測定用試薬にも関する。本発明による試薬は、ヘパリン及びセリンプロテアーゼを含有する通常のＡＴIII 活性測定用試薬に、多価アルコールを含有させ、更に場合によりアルカリ金属塩を含有させることからなり、これにより、ヘパリンコファクターIIの影響を受けずに精度よくアンチトロンビンIII 活性を測定するための試薬を提供することができる。ＡＴIII 活性測定用試薬が二試薬系からなる場合には、第一試薬及び／又は第二試薬に前記と同様の多価アルコールを含有させることができる。例えば、セリンプロテアーゼとしてトロンビンを用い、残存トロンビン活性を合成基質法にて測定するための試薬組成としては、その反応の手順を考慮してヘパリン、トロンビン及び多価アルコールからなる第一試薬と、合成基質を含む第二試薬から構成するのが好ましい。あるいは、第一試薬にヘパリンと多価アルコール、第二試薬にトロンビン（必要に応じて多価アルコール）、第三試薬に合成基質をそれぞれ含有させて構成してもよい。
【００２１】
前記の二試薬系の場合、第一試薬中のヘパリンの濃度範囲は従来公知の第一試薬の濃度範囲と同じでよく、例えば０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。また、トロンビンも従来公知の第一試薬の濃度範囲で同じでよく、例えば０．０１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜５Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。多価アルコールは試薬添加量や測定系の条件により調整すればよく、例えば、トロンビンとヘパリンとＡＴIII とが複合体を形成する反応の場に、例えば、アルカリ金属塩（特にはＮａＣｌ）を０．０５〜０．１８Ｍの濃度で共存させる場合には、多価アルコール濃度が１０〜６０容量％、好ましくは２０〜６０容量％の量となるように試薬濃度を調整して構成すればよい。
【００２２】
前記の構成を有する第一試薬を精製水あるいは適当な緩衝液に溶解して用いることができる。緩衝液としては、構成成分を安定に保つことができ、且つＡＴIII との複合体形成を阻害しないもの、更には残存トロンビンと合成基質との反応を阻害しないものであれば特に限定はされない。具体的には、トリス緩衝液、グッド緩衝液、ヘペス緩衝液等、従来公知の緩衝液から適宜選択して用いることができる。更に粉末状として供する場合には、例えば、トロンビン０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０Ｕ／ｍｌを公知の手段で凍結乾燥して粉末状とし、その粉末状組成物の溶解液として０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１００Ｕ／ｍｌのヘパリン及び前記濃度の多価アルコールを含む緩衝液を別途調製し、使用時にトロンビンを溶解して用いることもできる。
【００２３】
前記の二試薬系の場合、第二試薬の基質としては、従来公知の第二試薬に含まれている基質を従来公知の第二試薬と同様の濃度で用いることができる。具体的には、トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド、アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド等の合成基質を好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜５０ｍＭの濃度となるように調整する。これらを精製水あるいは前記と同様の緩衝液に溶解して用いる。更に、基質物質の安定性等を考慮して、これらを公知の手段より凍結乾燥品の形で保存することもできる。
【００２４】
セリンプロテアーゼとして第Ｘ因子を用いる場合には、前記と同様に従来公知の試薬に多価アルコールを前記の濃度となるように添加すればよい。また、基質も、例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−アルギニル−パラニトロアニリド、又はＮ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド等の公知の基質を用いればよい。
また、残存するトロンビン活性を、第ＸIII 因子存在下にフィブリンをフィブリノゲンに転換する活性として凝固時間を測定することにより求める場合にも、従来の公知試薬に多価アルコールを前記の濃度となるように添加して構成することができる。
【００２５】
ＨＣIIによる干渉の回避、及び高濃度のＡＴIII を含む被検試料の測定を実施する方法として、反応液中に高濃度の塩を添加する方法が提案されているが（特開平７−８２９８号公報）、ヘパリン依存的活性を非依存的活性よりも強く抑制するので、ヘパリン非依存的活性を定量してしまうという欠点があった。多価アルコール（例えば、エチレングリコール）を共存させる本発明方法は、ＨＣIIによる干渉の回避、高濃度のＡＴIII を含む被検試料の測定、及びヘパリン非依存的ＡＴIII 活性の抑制を、同時に満たすことができるという点で、従来法とは異なる新規な方法であり、且つ優れている。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例においては、測定機器には自動分析装置ＬＰＩＡ２００（商品名；三菱化学製）を用いた。ＡＴIII 活性測定用試薬は、Ｒ１試薬（トロンビン１８０ｍＵ／ｍｌ、ヘパリン２０ｕｎｉｔ／ｍｌ、及びウシ血清アルブミン０．３５ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液）と、Ｒ２試薬〔６ｍＭトロンビン活性検出用合成基質Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド（日東紡製：以下、ＮＳ１５００と称する）〕とからなる。但し、以下の各実施例の内容に応じて、ＮａＣｌ及び／又はエチレングリコールをＲ１試薬に適宜添加して使用した。また、各実施例で用いるｐＨ条件に応じて、Ｒ１試薬中のトリス緩衝液の代わりに２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳと称する）緩衝液、クエン酸緩衝液、又はリン酸緩衝液を使用した。なお、実施例における濃度（エチレングリコール，ＮａＣｌ）は、全て最終濃度（検体＋Ｒ１＋Ｒ２）で表記した。
測定は以下の手順で実施した。すなわち、Ｒ１試薬２３６μｌに生理食塩水２４μｌを添加し、更に、被検試料（例えば、無希釈血漿検体）又は生理食塩水（ブランク用）３μｌを添加し、３７℃で５分間インキュベートを行った。次いで、Ｒ２試薬４０μｌを添加し、反応液を３７℃に維持したまま、４０５ｎｍの吸光度変化を１０分間測定した。生理食塩水を添加した場合の１０分間の吸光度変化と、被検試料を添加した場合の１０分間の吸光度変化との差から、被検試料中のＡＴIII 活性を算出した。
【００２７】
実施例１：血漿全体のトロンビン阻害活性に占めるＨＣ II の比率
正常プール血漿１４０μｌに対し、過剰量（１００μｌ）の抗ヒトＡＴIII ウサギ抗体（Ｄａｋｏ社）を添加し、室温で３０分間インキュベートすることにより不活化処理を実施した。このとき残留したトロンビン阻害活性は、ＨＣIIに由来することを抗ＨＣII特異抗体による吸収で確認した。
この残留したＨＣIIによるトロンビン阻害活性に関し、反応液中のＮａＣｌ濃度とエチレングリコール濃度との関係について調べた（図１〜図３及び表１〜３）。なお、本実施例においては、反応条件に応じて、ＮａＣｌの終濃度が０．０４Ｍ〜０．３９Ｍになるように、更に、エチレングリコールの終濃度が１２容量％又は２４容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ及びエチレングリコールを添加した。また、Ｒ１試薬の緩衝液には、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）を使用した。
【００２８】
比較例として、エチレングリコール濃度が０％の場合の結果を、図１及び表１に示す。
図１において、実線ａは、生理食塩水を添加したときの１０分間の吸光度変化の値（以下、Δａと称する）を直線で結んだものであり、反応液中の全トロンビン活性を示す。また、破線ｂは、不活化処理を実施したプール血漿を添加したときの１０分間の吸光度変化の値（Δｂと称する）を直線で結んだものであり、ＨＣIIにより阻害された反応液中の残存トロンビン活性を示す。更に、一点鎖線ｃは、正常プール血漿を添加したときの１０分間の吸光度変化の値（Δｃと称する）を直線で結んだものであり、血漿により阻害された反応液中の残存トロンビン活性を示す。
表１において、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）であり、（ｂ）は「ＨＣIIによるトロンビン活性阻害率」（以下、αb と称する）であり、算出式：αb ＝１００×（Δａ−Δｂ）／Δａにより求めた。また、（ｃ）は「血漿によるトロンビン活性阻害率」（以下、αC と称する）であり、算出式：αC ＝１００×（Δａ−Δｃ）／Δａにより求めた。更には、（ｄ）は「血漿による阻害に占めるＨＣIIの比率」であり、算出式：αb ／αC により求めた。
表１に示すように、ＨＣIIによるトロンビン阻害活性は反応液中のＮａＣｌ濃度に依存することが認められた。
【００２９】
【表１】
エチレングリコール濃度が１２％（Ｖ／Ｖ）の場合の結果を図２及び表２に示し、エチレングリコール濃度が２４％（Ｖ／Ｖ）の場合の結果を図３及び表３に示す。表中、（ａ）〜（ｄ）は表１と同じ意味である。
反応液にエチレングリコールを添加すると、ＨＣIIによるトロンビン阻害活性は抑制される傾向を示し（図２及び表２）、エチレングリコール濃度が２４％の場合、反応液中のＮａＣｌ濃度に関係なくＨＣIIによるトロンビン阻害活性は、ほぼ完全に消失した（図３及び表３）。２４％以上のエチレングリコール存在下でも同様の結果を得た。
【００３１】
【表２】
【表３】
同様の操作を、ｐＨ値及びエチレングリコール濃度を変化させて実施した。ｐＨ値が６．５の場合の結果を図４に、ｐＨ値が７．０の場合の結果を図５に、ｐＨ値が７．５の場合の結果を図６に、ｐＨ値が８．０の場合の結果を図７に、そしてｐＨ値が８．５の場合の結果を図８にそれぞれ示す。図４〜図８において、実線ａ、破線ｂ、及び一点鎖線ｃは図１〜図３と同じ意味である。また、（１）で示すグラフはエチレングリコール濃度が０％の場合の結果を示し、同様に（２）で示すグラフはエチレングリコール濃度が８％、（３）で示すグラフはエチレングリコール濃度が１６％、そして（４）で示すグラフはエチレングリコール濃度が２４％の場合の結果を示し、（１）〜（４）で示す各グラフの横軸は、反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）であり、縦軸は、１０分間の吸光度変化である。
図４〜図８に示すように、塩化ナトリウム０．２Ｍ以下の存在下で、エチレングリコールの終濃度が１６容量％又は２４容量％、好ましくは２４容量％の場合に、ＨＣIIによるトロンビン阻害活性が抑制されることが判明した。
【００３４】
実施例２：ＡＴ III によるトロンビン阻害活性に対するエチレングリコールの抑制効果
最終反応液量３００μｌ（自動分析装置における典型的な試薬分注量）に対して、無希釈血漿サンプルを３μｌ（多くの自動分析装置における最小サンプル量）分注した場合における、ＡＴIII 活性測定系の検量線の形状、及びそれに対するＲ１試薬へのエチレングリコールの効果を調べた。検量線の形状は反応液中のＮａＣｌ濃度及びｐＨにも左右されるので、ここでは、ＮａＣｌ終濃度が０．１５Ｍで、しかもエチレングリコール終濃度が０〜４０容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ及びエチレングリコールを添加し、Ｒ１試薬の緩衝液としてクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した場合について示す。
結果を図９〜図１４に示す。ＡＴIII 濃度は、健常人血漿に含まれるＡＴIII 濃度の平均値を１００％として示し、ＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたって調べた。図９に示すように、エチレングリコール非添加時には検量線は作成不可能だが、エチレングリコールの添加によりトロンビン阻害活性が抑制され、２４容量％以上の場合（図１２〜図１４）、無希釈の血漿サンプルに対してＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線が作成可能となった。
【００３５】
同様の操作を、Ｒ１試薬に添加するＮａＣｌ濃度、及びＲ１試薬のｐＨを変化させて実施した。ＮａＣｌ濃度が０．０５Ｍの場合の結果を表４に、そしてＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍの場合の結果を表５にそれぞれ示す。表中、記号○は、適正な検量線を作成することができる可能性があることを示し、記号−は、最適ではないものの検量線を成立させ得ることを示し、そして記号×は、検量線が作成不可能であることを示す。表４及び表５に示すように、ｐＨ値とエチレングリコール使用量とを適宜選択することにより、無希釈の血漿に対してＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線が作成可能となることが判明した。
【００３６】
【表４】
【表５】
また、同様の操作を、エチレングリコールの代わりに、グリセロール、ソルビトール、又はキシリトールを使用して実施したところ、エチレングリコールの場合と同様にトロンビン阻害活性を抑制することが判明した。
【００３９】
実施例３：ヘパリンが関与しないトロンビン阻害活性の測定値に与える影響
最終反応液量３００μｌに対し、無希釈血漿サンプル３μｌを分注した条件における、ＡＴIII 活性測定値に対する、ＡＴIII とヘパリンとの相互作用に依存しない阻害活性の影響を調べた。具体的には、Ｒ１試薬中に、ヘパリン濃度が０単位／ｍｌ（図１５）及び１９単位／ｍｌの場合（図１６）における、それぞれＲ１試薬中にＮａＣｌを０．０４〜０．７２Ｍを添加したときのＡＴIII によるトロンビン阻害量を調べた。なお、Ｒ１試薬の緩衝液としては３８ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。
図１５及び図１６において、実線ａは、生理食塩水（ブランク）を添加したときの１０分間の吸光度変化の値を示し、破線ｃは、無希釈正常プール血漿を添加したときの１０分間の吸光度変化の値を示す。トロンビン阻害率（％）は、式：
（トロンビン阻害率）＝１００×（Ｈａ−Ｈｃ）／Ｈａ
（式中、Ｈａは、図１５又は図１６における実線ａの高さを意味し、Ｈｃは、図１５又は図１６における実線ｃの高さを意味する）により、算出することができる。
【００４０】
図１５に示すように、無希釈の正常プール血漿サンプルを添加した場合、反応液にヘパリンが存在しなくても血漿中のＡＴIII により全トロンビン活性の約１０％が阻害された。
図１５及び図１６から算出した、ヘパリンの関与しないトロンビン阻害率（Ａ）、及びヘパリン存在下でのトロンビン阻害率（Ｂ）を表６に示す。表中、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）である。なお、ＮａＣｌ濃度が０．１６Ｍ又は０．２２Ｍの場合、ヘパリン依存的な阻害活性は測定レンジ以上であり、Ａ／Ｂ比は無視することができる。ヘパリン共存下におけるトロンビン阻害活性はＮａＣｌにより抑制されるのに対し（図１６）、ヘパリンの関与しない阻害活性はＮａＣｌの添加では殆ど抑制されなかった（図１５）。従って、０．５ＭのＮａＣｌ存在下では血漿サンプルを無希釈で測定することができるが、ヘパリン結合能のない変異ＡＴIII についても図１５に相当するトロンビン阻害活性（表６のＡ／Ｂ比より約２０％）の分だけ、実際よりも高めの測定値を与えることになる。なお、両条件における阻害活性は、サンプルを抗ＡＴIII 抗体で処理することにより完全に消失する。
【００４１】
【表６】
実施例４：ヘパリンが関与しないＡＴ III によるトロンビン阻害活性に対するエチレングリコールの抑制効果
実施例３に見られる、ヘパリン非存在下で検出されるＡＴIII によるトロンビン阻害活性に対する、反応液中に添加するエチレングリコールの効果を調べた。具体的には、ヘパリンを含まないＲ１試薬に対して、ＮａＣｌ終濃度０．１３Ｍ及びエチレングリコール終濃度０〜２４容量％になるように、ＮａＣｌ及びエチレングリコールを添加した場合について、無希釈正常プール血漿によるトロンビン阻害率を測定した。なお、Ｒ１試薬の緩衝液としては、３８ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
結果を表７に示す。
【００４３】
【表７】
この結果、ｐＨ７．０でＮａＣｌ濃度が０．１３Ｍの場合では、エチレングリコール濃度が１６％（Ｖ／Ｖ）の条件で完全に抑制する効果が見られた。抑制に必要なエチレングリコール濃度は、反応液のｐＨにより異なっており、例えば、ｐＨ８．０でＮａＣｌ濃度が０．１３Ｍの条件では２４％（Ｖ／Ｖ）以上のとき完全に抑制することができる。この特性を利用し、反応液に多価アルコール（例えば、エチレングリコール）を２４％以上存在させることにより、無希釈の血漿サンプルでもヘパリン依存ＡＴIII 活性を正確に測定することができる。従って、この反応条件では前記の変異ＡＴIII を含む検体についても本来のヘパリン依存ＡＴIII 活性測定値を与えることが期待でき、正確な測定が可能となるものである。
同様の操作を、エチレングリコールの代わりにグリセロールを用いて実施したところ、同様にヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制することができた。なお、グリセロールの場合には、エチレングリコールに比べて高い濃度を必要とした。
【００４５】
【発明の効果】
被検試料中のヘパリンコファクターIIの妨害及びアンチトロンビンIII のヘパリン非依存的なトロンビン阻害活性の影響を受けずに、アンチトロンビンIII 活性を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エチレングリコール濃度が０％（Ｖ／Ｖ）の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図２】エチレングリコール濃度が１２％（Ｖ／Ｖ）の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図３】エチレングリコール濃度が２４％（Ｖ／Ｖ）の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図４】ｐＨ６．５の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図５】ｐＨ７．０の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図６】ｐＨ７．５の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図７】ｐＨ８．０の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図８】ｐＨ８．５の場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図９】エチレングリコール濃度が０％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１０】エチレングリコール濃度が８％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１１】エチレングリコール濃度が１６％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１２】エチレングリコール濃度が２４％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１３】エチレングリコール濃度が３２％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１４】エチレングリコール濃度が４０％の場合の検量線を示すグラフである。
【図１５】ヘパリン非存在下におけるトロンピン阻害活性を示すグラフである。
【図１６】ヘパリン存在下におけるトロンピン阻害活性を示すグラフである。
Claims (2)
- アンチトロンビンIIIを含む被検試料に、ヘパリン及び既知濃度のトロンビンを添加して複合体を形成させた後、残存するトロンビン活性を検出することにより被検試料中のアンチトロンビンIII活性を測定する方法において、前記複合体を形成させる反応前又は反応時にアルカリ金属塩及び式（１）：
ＨＯＣＨ ２ −〔Ｃ（ＯＨ）Ｈ〕ｎ−ＣＨ ２ ＯＨ （１）
（式中、ｎは０又は１〜４の整数である）
で表される多価アルコールを共存させ、前記式（１）で表される多価アルコールの反応時の終濃度を１０容量％−６０容量％とすることを特徴とする、アンチトロンビンIII活性測定方法。 - 前記式（１）で表される多価アルコールがエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。
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