JPH1014599A - アンチトロンビンｉｉｉ 活性測定方法及び測定用試薬 - Google Patents
アンチトロンビンｉｉｉ 活性測定方法及び測定用試薬Info
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- JPH1014599A JPH1014599A JP19698896A JP19698896A JPH1014599A JP H1014599 A JPH1014599 A JP H1014599A JP 19698896 A JP19698896 A JP 19698896A JP 19698896 A JP19698896 A JP 19698896A JP H1014599 A JPH1014599 A JP H1014599A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヘパリンコファクターIIによる正の干渉及び
ヘパリン非依存的アンチトロンビンIII （ＡＴIII ）に
よる正の干渉を実質的に受けることなく、ＡＴIII 活性
を一層正確に測定することのできる手段を提供する。 【解決手段】 ＡＴIII を含む被検試料に既知濃度のセ
リンプロテアーゼ及びヘパリンを添加して複合体を形成
させた後、残存するセリンプロテアーゼ活性を検出する
ことにより被検試料中のＡＴIII 活性を測定する方法に
おいて、前記複合体を形成させる反応前又は反応時に多
価アルコールを共存させる。
ヘパリン非依存的アンチトロンビンIII （ＡＴIII ）に
よる正の干渉を実質的に受けることなく、ＡＴIII 活性
を一層正確に測定することのできる手段を提供する。 【解決手段】 ＡＴIII を含む被検試料に既知濃度のセ
リンプロテアーゼ及びヘパリンを添加して複合体を形成
させた後、残存するセリンプロテアーゼ活性を検出する
ことにより被検試料中のＡＴIII 活性を測定する方法に
おいて、前記複合体を形成させる反応前又は反応時に多
価アルコールを共存させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は被検試料、特には生
体液試料、例えば、血漿中等のアンチトロンビンIII 活
性の測定方法及び測定用試薬に関する。
体液試料、例えば、血漿中等のアンチトロンビンIII 活
性の測定方法及び測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】アンチトロンビンIII （以下、ＡＴIII
ともいう）は血漿中に存在するセリンプロテアーゼ阻害
物質である。その阻害活性はヘパリンと結合することに
より大幅に促進されること（ヘパリンコファクター活
性）が知られており、生体中で機能するにはヘパリンと
の結合が重要であると考えられている。ＡＴIII は生体
中においてＸａ因子やセリンプロテアーゼの一種である
トロンビンを阻害することによって血液凝固の制御に大
きな役割を果たしている。従って、血漿中に含まれるＡ
ＴIII 濃度を測定することは生体中の血液凝固阻止能の
評価や、凝固／線溶系の動態を調べる上で大きな意義を
もつ。また、ＡＴIII は肝臓で合成されるので、肝機能
低下の指標としても用いることができる。
ともいう）は血漿中に存在するセリンプロテアーゼ阻害
物質である。その阻害活性はヘパリンと結合することに
より大幅に促進されること（ヘパリンコファクター活
性）が知られており、生体中で機能するにはヘパリンと
の結合が重要であると考えられている。ＡＴIII は生体
中においてＸａ因子やセリンプロテアーゼの一種である
トロンビンを阻害することによって血液凝固の制御に大
きな役割を果たしている。従って、血漿中に含まれるＡ
ＴIII 濃度を測定することは生体中の血液凝固阻止能の
評価や、凝固／線溶系の動態を調べる上で大きな意義を
もつ。また、ＡＴIII は肝臓で合成されるので、肝機能
低下の指標としても用いることができる。
【０００３】ＡＴIII の測定には、大きく分けて２通り
の方法が従来から用いられている。一つは特異的抗体を
使用した抗原測定法である。この抗原測定法では、トロ
ンビン阻害活性を消失したＡＴIII 分子又は遺伝的変異
等により正常に機能しないＡＴIII と正常なＡＴIII と
を区別することができない。
の方法が従来から用いられている。一つは特異的抗体を
使用した抗原測定法である。この抗原測定法では、トロ
ンビン阻害活性を消失したＡＴIII 分子又は遺伝的変異
等により正常に機能しないＡＴIII と正常なＡＴIII と
を区別することができない。
【０００４】もう一つはトロンビン等の酵素に対する阻
害作用を利用した活性測定法である。現在汎用されてい
る活性測定方法は、既知量のトロンビン及びヘパリン混
合液に対して血漿サンプルを添加し、一定時間インキュ
ベートした後に残存するトロンビン活性を発色性合成基
質により定量し、減少したトロンビン活性量からサンプ
ル中のＡＴIII 濃度を算出する方法である。このため、
活性測定法の方が血漿中のＡＴIII による有効な抗凝固
能を、より正確に反映しているものと考えられる。
害作用を利用した活性測定法である。現在汎用されてい
る活性測定方法は、既知量のトロンビン及びヘパリン混
合液に対して血漿サンプルを添加し、一定時間インキュ
ベートした後に残存するトロンビン活性を発色性合成基
質により定量し、減少したトロンビン活性量からサンプ
ル中のＡＴIII 濃度を算出する方法である。このため、
活性測定法の方が血漿中のＡＴIII による有効な抗凝固
能を、より正確に反映しているものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この活性測定
法には以下のような問題点がある。第１の問題点は、血
漿中のトロンビン阻害物質であるヘパリンコファクター
II（以下、ＨＣIIともいう）による正の干渉が挙げられ
る。実際、幾つかの活性測定系において測定値の１０〜
２０％がＡＴIII ではなくＨＣIIに由来するものである
ことが報告されている〔Ｂｏｈｎｅｒら，Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７１，
３，２８０−２８３（１９９４）及びＴｒａｎら，Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，５７１−
５７６（１９８５）〕。ＨＣIIによる干渉を回避する方
法として、ＨＣIIと反応しない酵素Ｘａ因子を使用する
方法〔Ｄｅｍｅｒｓら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６９，３，２３１−２３５
（１９９３）〕や、ＡＴIII とＨＣIIとのヘパリンに対
する親和性の差を利用して、反応液中に高濃度の塩を添
加する方法〔特開平７−８２９８号公報、並びに臨床検
査機器・試薬１７巻６号別冊１０１３−１０２０（１９
９４）〕等が提案されている。
法には以下のような問題点がある。第１の問題点は、血
漿中のトロンビン阻害物質であるヘパリンコファクター
II（以下、ＨＣIIともいう）による正の干渉が挙げられ
る。実際、幾つかの活性測定系において測定値の１０〜
２０％がＡＴIII ではなくＨＣIIに由来するものである
ことが報告されている〔Ｂｏｈｎｅｒら，Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７１，
３，２８０−２８３（１９９４）及びＴｒａｎら，Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，５７１−
５７６（１９８５）〕。ＨＣIIによる干渉を回避する方
法として、ＨＣIIと反応しない酵素Ｘａ因子を使用する
方法〔Ｄｅｍｅｒｓら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６９，３，２３１−２３５
（１９９３）〕や、ＡＴIII とＨＣIIとのヘパリンに対
する親和性の差を利用して、反応液中に高濃度の塩を添
加する方法〔特開平７−８２９８号公報、並びに臨床検
査機器・試薬１７巻６号別冊１０１３−１０２０（１９
９４）〕等が提案されている。
【０００６】第２の問題点は、ＡＴIII のヘパリン非依
存的なトロンビン阻害活性による正の干渉である。この
干渉を強く受けると、ヘパリン結合能をもたないか、又
はヘパリンによる促進効果を受けられない分子異常ＡＴ
III であって、かつトロンビンとの反応部位が正常であ
る分子異常ＡＴIII を正常ＡＴIII として測定してしま
うからである。例えば、ヘパリン結合能欠損異常ＡＴII
I 〔ＡＴIII Ｎａｇａｓａｋｉ：岡嶋ら，Ｂｌｏｏ
ｄ，８１，５，１３００〜１３０５（１９９３）〕のＡ
ＴIII 活性を不当に高値と評価してしまう可能性があ
る。
存的なトロンビン阻害活性による正の干渉である。この
干渉を強く受けると、ヘパリン結合能をもたないか、又
はヘパリンによる促進効果を受けられない分子異常ＡＴ
III であって、かつトロンビンとの反応部位が正常であ
る分子異常ＡＴIII を正常ＡＴIII として測定してしま
うからである。例えば、ヘパリン結合能欠損異常ＡＴII
I 〔ＡＴIII Ｎａｇａｓａｋｉ：岡嶋ら，Ｂｌｏｏ
ｄ，８１，５，１３００〜１３０５（１９９３）〕のＡ
ＴIII 活性を不当に高値と評価してしまう可能性があ
る。
【０００７】この問題は、被検試料を希釈することなし
にＡＴIII 活性を測定することと関連する。すなわち、
ＡＴIII 活性にはヘパリン依存的活性と非依存的活性と
があり、生体内ではヘパリン依存的活性の方が非依存的
活性よりも１０００倍程度大きいと考えられ〔Ｊ．Ｂ．
Ｃ．，Ｖｏｌ．２４８，１８，６４９０−６５０５（１
９７３）〕、臨床的にもヘパリン依存的活性の定量の方
が意義深い。従来、被検試料を希釈する方法において
は、ＡＴIII 、ヘパリン、及びトロンビンが反応する環
境を生体内とほぼ同一に設定しており、ヘパリン非依存
的活性による正の干渉は殆ど問題とならなかった。これ
に対して、被検試料を希釈することなしにＡＴIII を測
定しようとすると、相対的にヒトロンビン分子数に対し
てＡＴIII 分子数が大過剰となり、反応する環境を生体
内とほぼ同一に設定するためには、反応液中に高濃度の
トロンビンが必要である。しかし、その条件では、反応
液の吸光度が、分光光度計の測定可能範囲を超えてしま
うため、自動分析などには不都合であった。この解決法
の１つに、高濃度のトロンビンを使用する代わりに、Ａ
ＴIII とトロンビンとの結合反応を抑制する方法があ
り、例えば、反応液中に高濃度の塩を添加する方法（特
開平７−８２９８号公報）が提案されている。しかし、
この方法では、ヘパリン依存的活性を非依存的活性より
も強く抑制するので、ヘパリン非依存的活性を定量して
しまうという問題点がある。従って、非希釈法における
抑制方法は、ヘパリン依存的活性と非依存的活性とを同
等に抑制するか、又は非依存的活性に対してより強く働
き、非依存的活性の正の干渉がないものである必要があ
る。
にＡＴIII 活性を測定することと関連する。すなわち、
ＡＴIII 活性にはヘパリン依存的活性と非依存的活性と
があり、生体内ではヘパリン依存的活性の方が非依存的
活性よりも１０００倍程度大きいと考えられ〔Ｊ．Ｂ．
Ｃ．，Ｖｏｌ．２４８，１８，６４９０−６５０５（１
９７３）〕、臨床的にもヘパリン依存的活性の定量の方
が意義深い。従来、被検試料を希釈する方法において
は、ＡＴIII 、ヘパリン、及びトロンビンが反応する環
境を生体内とほぼ同一に設定しており、ヘパリン非依存
的活性による正の干渉は殆ど問題とならなかった。これ
に対して、被検試料を希釈することなしにＡＴIII を測
定しようとすると、相対的にヒトロンビン分子数に対し
てＡＴIII 分子数が大過剰となり、反応する環境を生体
内とほぼ同一に設定するためには、反応液中に高濃度の
トロンビンが必要である。しかし、その条件では、反応
液の吸光度が、分光光度計の測定可能範囲を超えてしま
うため、自動分析などには不都合であった。この解決法
の１つに、高濃度のトロンビンを使用する代わりに、Ａ
ＴIII とトロンビンとの結合反応を抑制する方法があ
り、例えば、反応液中に高濃度の塩を添加する方法（特
開平７−８２９８号公報）が提案されている。しかし、
この方法では、ヘパリン依存的活性を非依存的活性より
も強く抑制するので、ヘパリン非依存的活性を定量して
しまうという問題点がある。従って、非希釈法における
抑制方法は、ヘパリン依存的活性と非依存的活性とを同
等に抑制するか、又は非依存的活性に対してより強く働
き、非依存的活性の正の干渉がないものである必要があ
る。
【０００８】すなわち、本発明の目的は、被検試料を希
釈せずに用いることのできるＡＴIII 活性測定方法にお
いて、前記の種々の干渉（特には、ＨＣIIによる正の干
渉及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉）を実
質的に受けることなく、ＡＴIII 活性を一層正確に測定
することのできる手段を提供することにある。
釈せずに用いることのできるＡＴIII 活性測定方法にお
いて、前記の種々の干渉（特には、ＨＣIIによる正の干
渉及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉）を実
質的に受けることなく、ＡＴIII 活性を一層正確に測定
することのできる手段を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記の目的は、本発明に
よる、アンチトロンビンIII を含む被検試料に、ヘパリ
ン及び既知濃度のセリンプロテアーゼを添加して複合体
を形成させた後、残存するセリンプロテアーゼ活性を検
出することにより被検試料中のアンチトロンビンIII 活
性を測定する方法において、前記複合体を形成させる反
応前又は反応時に多価アルコールを共存させることを特
徴とする、アンチトロンビンIII 活性測定方法によって
達成することができる。更に、本発明は、セリンプロテ
アーゼ及びヘパリンを含むアンチトロンビンIII 測定用
試薬に、更に多価アルコールを含有させることを特徴と
する、アンチトロンビンIII 活性測定用試薬にも関す
る。
よる、アンチトロンビンIII を含む被検試料に、ヘパリ
ン及び既知濃度のセリンプロテアーゼを添加して複合体
を形成させた後、残存するセリンプロテアーゼ活性を検
出することにより被検試料中のアンチトロンビンIII 活
性を測定する方法において、前記複合体を形成させる反
応前又は反応時に多価アルコールを共存させることを特
徴とする、アンチトロンビンIII 活性測定方法によって
達成することができる。更に、本発明は、セリンプロテ
アーゼ及びヘパリンを含むアンチトロンビンIII 測定用
試薬に、更に多価アルコールを含有させることを特徴と
する、アンチトロンビンIII 活性測定用試薬にも関す
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳述する。本発明
を用いて測定することのできる被検試料は、ＡＴIII を
含有する試料であれば特に限定されないが、特には生体
液試料、例えば、血液、血漿、又は血清である。
を用いて測定することのできる被検試料は、ＡＴIII を
含有する試料であれば特に限定されないが、特には生体
液試料、例えば、血液、血漿、又は血清である。
【００１１】本発明に用いることのできる多価アルコー
ルは、好ましくは式： ＨＯＣＨ2 −〔Ｃ（ＯＨ）Ｈ〕ｎ−ＣＨ2 ＯＨ （式中、ｎは０又は１〜４の整数である）で表される化
合物であり、例えば、エチレングリコール、グリセロー
ル、エリトリトール、キシリトール、及びソルビトール
などを挙げることができる。エチレングリコールが特に
好ましい。
ルは、好ましくは式： ＨＯＣＨ2 −〔Ｃ（ＯＨ）Ｈ〕ｎ−ＣＨ2 ＯＨ （式中、ｎは０又は１〜４の整数である）で表される化
合物であり、例えば、エチレングリコール、グリセロー
ル、エリトリトール、キシリトール、及びソルビトール
などを挙げることができる。エチレングリコールが特に
好ましい。
【００１２】本発明においては、セリンプロテアーゼ・
ＡＴIII ・ヘパリン複合体を形成させる反応前又は反応
時に、更にアルカリ金属塩を共存させることができる。
前記アルカリ金属塩は、アルカリ金属と有機酸又は好ま
しくは無機酸との塩である。ナトリウム、カリウム又は
リチウムのハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物、
臭化物若しくはヨウ化物）、硫酸塩又はリン酸塩が好ま
しく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リ
チウム、フッ化ナトリウム、フッ化リチウム、ヨウ化ナ
トリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化リチウム、臭化ナト
リウム、臭化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウ
ム、硫酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウ
ム、又はリン酸リチウム等を用いることができる。これ
らの塩の１種又は複数種を組み合わせて用いることがで
きる。アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）を共存
させる場合には、０．３Ｍ以下の濃度範囲で使用するこ
とができる。
ＡＴIII ・ヘパリン複合体を形成させる反応前又は反応
時に、更にアルカリ金属塩を共存させることができる。
前記アルカリ金属塩は、アルカリ金属と有機酸又は好ま
しくは無機酸との塩である。ナトリウム、カリウム又は
リチウムのハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物、
臭化物若しくはヨウ化物）、硫酸塩又はリン酸塩が好ま
しく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リ
チウム、フッ化ナトリウム、フッ化リチウム、ヨウ化ナ
トリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化リチウム、臭化ナト
リウム、臭化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウ
ム、硫酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウ
ム、又はリン酸リチウム等を用いることができる。これ
らの塩の１種又は複数種を組み合わせて用いることがで
きる。アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）を共存
させる場合には、０．３Ｍ以下の濃度範囲で使用するこ
とができる。
【００１３】本発明では、ヘパリンとＡＴIII との複合
体を形成することのできる反応系において、例えば、ア
ルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５Ｍ〜
０．１８Ｍの存在下で、多価アルコール（特にエチレン
グリコール）を終濃度１０〜６０容量％、好ましくは２
０容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ＨＣIIによ
る正の干渉を抑制することができる。この場合、ｐＨは
特に限定されることはないが、通常、ｐＨ６〜９の範囲
で使用することができる。また、前記反応系において、
例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．
０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．２〜８．５の場
合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃
度１０容量％以上、好ましくは２０容量％〜６０容量％
の範囲で使用すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による
正の干渉を抑制することができる。実際には、個々のｐ
Ｈ値に応じて、多価アルコールの適切な使用量範囲が存
在し、その範囲は適宜決定することができる。例えば、
多価アルコール（特にエチレングリコール）を、ｐＨ約
７．０では１０容量％以上、好ましくは１５容量％〜４
０容量％の範囲で、また、ｐＨ約８．０では２０容量％
以上、好ましくは２５容量％〜６０容量％の範囲で使用
すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑
制することができる。なお、ｐＨ約６以下の条件下で
は、多価アルコールの存在の有無に関わらず、ヘパリン
非依存的ＡＴIIIによる正の干渉は、実質的に検出され
ない。
体を形成することのできる反応系において、例えば、ア
ルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．０５Ｍ〜
０．１８Ｍの存在下で、多価アルコール（特にエチレン
グリコール）を終濃度１０〜６０容量％、好ましくは２
０容量％〜６０容量％の範囲で使用すると、ＨＣIIによ
る正の干渉を抑制することができる。この場合、ｐＨは
特に限定されることはないが、通常、ｐＨ６〜９の範囲
で使用することができる。また、前記反応系において、
例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナトリウム）０．
０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．２〜８．５の場
合、多価アルコール（特にエチレングリコール）を終濃
度１０容量％以上、好ましくは２０容量％〜６０容量％
の範囲で使用すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による
正の干渉を抑制することができる。実際には、個々のｐ
Ｈ値に応じて、多価アルコールの適切な使用量範囲が存
在し、その範囲は適宜決定することができる。例えば、
多価アルコール（特にエチレングリコール）を、ｐＨ約
７．０では１０容量％以上、好ましくは１５容量％〜４
０容量％の範囲で、また、ｐＨ約８．０では２０容量％
以上、好ましくは２５容量％〜６０容量％の範囲で使用
すると、ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑
制することができる。なお、ｐＨ約６以下の条件下で
は、多価アルコールの存在の有無に関わらず、ヘパリン
非依存的ＡＴIIIによる正の干渉は、実質的に検出され
ない。
【００１４】実際には、前記のＨＣIIによる正の干渉の
抑制効果、及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干
渉の抑制効果が得られる条件下で、更に、ＡＴIII 濃度
とセリンプロテアーゼの検出手段（例えば、吸光度）と
の間に濃度依存的相対関係を示すｐＨ値と多価アルコー
ル使用量とを、簡単な予備試験によって適宜決定するこ
とができる。例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナト
リウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．０
〜７．０の場合、多価アルコール（特にエチレングリコ
ール）を終濃度１５容量％〜４０容量％の範囲で使用す
ることが好ましい。また、例えば、アルカリ金属塩（特
には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下
で、ｐＨ７．５〜９．０の場合、多価アルコール（特に
エチレングリコール）を終濃度２５容量％〜６０容量％
の範囲で使用することが好ましい。
抑制効果、及びヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干
渉の抑制効果が得られる条件下で、更に、ＡＴIII 濃度
とセリンプロテアーゼの検出手段（例えば、吸光度）と
の間に濃度依存的相対関係を示すｐＨ値と多価アルコー
ル使用量とを、簡単な予備試験によって適宜決定するこ
とができる。例えば、アルカリ金属塩（特には塩化ナト
リウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下で、ｐＨ６．０
〜７．０の場合、多価アルコール（特にエチレングリコ
ール）を終濃度１５容量％〜４０容量％の範囲で使用す
ることが好ましい。また、例えば、アルカリ金属塩（特
には塩化ナトリウム）０．０５〜０．１８Ｍの存在下
で、ｐＨ７．５〜９．０の場合、多価アルコール（特に
エチレングリコール）を終濃度２５容量％〜６０容量％
の範囲で使用することが好ましい。
【００１５】本発明では、被検試料中に共存するヘパリ
ンコファクターIIの干渉を、多価アルコールの添加によ
って排除する。すなわち、一般にアンチトロンビンIII
やヘパリンコファクターIIは、それぞれヘパリンと結合
して複合体を形成することによってセリンプロテアーゼ
活性（例えば、トロンビン活性）を阻害することができ
るが、ヘパリンに対する親和性は、反応の場の多価アル
コール濃度によって異なる。ヘパリンコファクターII
は、多価アルコール不在下においては、ヘパリンと結合
して、ヘパリン・ヘパリンコファクターII複合体を形成
し、更には、トロンビン・ヘパリン・ヘパリンコファク
ターII複合体を形成する。一方、多価アルコールの存在
下においては、ヘパリンとヘパリンコファクターIIとト
ロンビンとは、複合体を形成しない。それに対して、ア
ンチトロンビンIII は、多価アルコールの存在下におい
てもヘパリン結合能を示す。従って、トロンビン、ヘパ
リン、及び被検アンチトロンビンIII を反応させる場
に、多価アルコールを存在させることにより、ヘパリン
コファクターIIにはトロンビン活性を阻害させず、アン
チトロンビンIII のみによってトロンビン活性を阻害さ
せる環境とすることができる。この結果、ヘパリンコフ
ァクターIIの干渉を受けないアンチトロンビンIII 測定
系を成立させることができる。
ンコファクターIIの干渉を、多価アルコールの添加によ
って排除する。すなわち、一般にアンチトロンビンIII
やヘパリンコファクターIIは、それぞれヘパリンと結合
して複合体を形成することによってセリンプロテアーゼ
活性（例えば、トロンビン活性）を阻害することができ
るが、ヘパリンに対する親和性は、反応の場の多価アル
コール濃度によって異なる。ヘパリンコファクターII
は、多価アルコール不在下においては、ヘパリンと結合
して、ヘパリン・ヘパリンコファクターII複合体を形成
し、更には、トロンビン・ヘパリン・ヘパリンコファク
ターII複合体を形成する。一方、多価アルコールの存在
下においては、ヘパリンとヘパリンコファクターIIとト
ロンビンとは、複合体を形成しない。それに対して、ア
ンチトロンビンIII は、多価アルコールの存在下におい
てもヘパリン結合能を示す。従って、トロンビン、ヘパ
リン、及び被検アンチトロンビンIII を反応させる場
に、多価アルコールを存在させることにより、ヘパリン
コファクターIIにはトロンビン活性を阻害させず、アン
チトロンビンIII のみによってトロンビン活性を阻害さ
せる環境とすることができる。この結果、ヘパリンコフ
ァクターIIの干渉を受けないアンチトロンビンIII 測定
系を成立させることができる。
【００１６】セリンプロテアーゼとしてトロンビンを用
いる場合には、前記の各反応は、以下の式（１）〜
（３）で表すことができる。 ＩＩＩ ・ヘパリン複合体 前記の各反応後、残存するトロンビン活性（残存トロン
ビン活性）を従来公知の合成基質法やフィブリン形成の
阻害時間法等によって測定する。一方、被検試料として
生理食塩水などを使用し、試薬中に含まれている全トロ
ンビンの活性（全トロンビン活性）を測定し、それらの
測定値から、以下の計算式によってアンチトロンビンII
I 活性を求めることができる。 ＡAT＝ＡTA−ＡTB （式中、ＡATはアンチトロンビンIII 活性、ＡTAは全ト
ロンビン活性、そしてＡTBは残存トロンビン活性を表
す）
いる場合には、前記の各反応は、以下の式（１）〜
（３）で表すことができる。 ＩＩＩ ・ヘパリン複合体 前記の各反応後、残存するトロンビン活性（残存トロン
ビン活性）を従来公知の合成基質法やフィブリン形成の
阻害時間法等によって測定する。一方、被検試料として
生理食塩水などを使用し、試薬中に含まれている全トロ
ンビンの活性（全トロンビン活性）を測定し、それらの
測定値から、以下の計算式によってアンチトロンビンII
I 活性を求めることができる。 ＡAT＝ＡTA−ＡTB （式中、ＡATはアンチトロンビンIII 活性、ＡTAは全ト
ロンビン活性、そしてＡTBは残存トロンビン活性を表
す）
【００１７】なお、本発明方法においては、通常の公知
ＡＴIII 活性測定法と同様に、セリンプロテアーゼとし
て、例えばトロンビン又は第Ｘ因子を用いることができ
る。また、ヘパリンとしては、特にその由来は限定され
ず、また、高分子ヘパリンあるいは低分子ヘパリンのい
ずれも用いることができる。
ＡＴIII 活性測定法と同様に、セリンプロテアーゼとし
て、例えばトロンビン又は第Ｘ因子を用いることができ
る。また、ヘパリンとしては、特にその由来は限定され
ず、また、高分子ヘパリンあるいは低分子ヘパリンのい
ずれも用いることができる。
【００１８】本発明方法においては、多価アルコールの
存在下で被検試料とヘパリン及びセリンプロテアーゼと
を接触させて複合体を形成させた後に、当業界で公知の
任意の方法により残存セリンプロテアーゼ活性を測定す
ることができる。例えば、合成基質法を用いて残存トロ
ンビン活性を測定する場合は、前記反応終了後、基質含
有溶液を添加して、トロンビン活性を測定すればよい。
この合成基質としては公知の任意の基質を適宜選択して
用いることができ、例えば、トシル−グリシル−プロリ
ル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニ
ルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニ
トロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メ
チルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド、
アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル
−４−ニトロアニリド等を用いることができる。これら
合成基質より誘導される発色物質を分光学的に検出す
る。また、残存トロンビン活性を、第ＸIII 因子存在下
にフィブリノゲンをフィブリンに転換する活性として凝
固時間を測定することにより求めることもできる。
存在下で被検試料とヘパリン及びセリンプロテアーゼと
を接触させて複合体を形成させた後に、当業界で公知の
任意の方法により残存セリンプロテアーゼ活性を測定す
ることができる。例えば、合成基質法を用いて残存トロ
ンビン活性を測定する場合は、前記反応終了後、基質含
有溶液を添加して、トロンビン活性を測定すればよい。
この合成基質としては公知の任意の基質を適宜選択して
用いることができ、例えば、トシル−グリシル−プロリ
ル−アルギニル−パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニ
ルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニ
トロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メ
チルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド、
アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル
−４−ニトロアニリド等を用いることができる。これら
合成基質より誘導される発色物質を分光学的に検出す
る。また、残存トロンビン活性を、第ＸIII 因子存在下
にフィブリノゲンをフィブリンに転換する活性として凝
固時間を測定することにより求めることもできる。
【００１９】一方、セリンプロテアーゼとして第Ｘ因子
を用いる場合は、被検試料とへパリンと第Ｘ因子とを接
触させてヘパリン・ＡＴIII ・第Ｘ因子複合体を形成さ
せた後、残存する第Ｘ因子に対して、第Ｘ因子に特異的
な合成基質（例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−
アルギニル−パラニトロアニリド、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ
−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニル−パラニトロアニリド等）を含有する溶液を前記複
合体形成反応後に添加して、基質から誘導される発色物
質を分光学的に検出する。前記と同様に、公知の任意の
方法によりブランク試験としての全トロンビン活性を測
定することができる。
を用いる場合は、被検試料とへパリンと第Ｘ因子とを接
触させてヘパリン・ＡＴIII ・第Ｘ因子複合体を形成さ
せた後、残存する第Ｘ因子に対して、第Ｘ因子に特異的
な合成基質（例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−
アルギニル−パラニトロアニリド、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ
−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニル−パラニトロアニリド等）を含有する溶液を前記複
合体形成反応後に添加して、基質から誘導される発色物
質を分光学的に検出する。前記と同様に、公知の任意の
方法によりブランク試験としての全トロンビン活性を測
定することができる。
【００２０】更に、本発明は、ＡＴIII 活性測定用試薬
にも関する。本発明による試薬は、ヘパリン及びセリン
プロテアーゼを含有する通常のＡＴIII 活性測定用試薬
に、多価アルコールを含有させ、更に場合によりアルカ
リ金属塩を含有させることからなり、これにより、ヘパ
リンコファクターIIの影響を受けずに精度よくアンチト
ロンビンIII 活性を測定するための試薬を提供すること
ができる。ＡＴIII 活性測定用試薬が二試薬系からなる
場合には、第一試薬及び／又は第二試薬に前記と同様の
多価アルコールを含有させることができる。例えば、セ
リンプロテアーゼとしてトロンビンを用い、残存トロン
ビン活性を合成基質法にて測定するための試薬組成とし
ては、その反応の手順を考慮してヘパリン、トロンビン
及び多価アルコールからなる第一試薬と、合成基質を含
む第二試薬から構成するのが好ましい。あるいは、第一
試薬にヘパリンと多価アルコール、第二試薬にトロンビ
ン（必要に応じて多価アルコール）、第三試薬に合成基
質をそれぞれ含有させて構成してもよい。
にも関する。本発明による試薬は、ヘパリン及びセリン
プロテアーゼを含有する通常のＡＴIII 活性測定用試薬
に、多価アルコールを含有させ、更に場合によりアルカ
リ金属塩を含有させることからなり、これにより、ヘパ
リンコファクターIIの影響を受けずに精度よくアンチト
ロンビンIII 活性を測定するための試薬を提供すること
ができる。ＡＴIII 活性測定用試薬が二試薬系からなる
場合には、第一試薬及び／又は第二試薬に前記と同様の
多価アルコールを含有させることができる。例えば、セ
リンプロテアーゼとしてトロンビンを用い、残存トロン
ビン活性を合成基質法にて測定するための試薬組成とし
ては、その反応の手順を考慮してヘパリン、トロンビン
及び多価アルコールからなる第一試薬と、合成基質を含
む第二試薬から構成するのが好ましい。あるいは、第一
試薬にヘパリンと多価アルコール、第二試薬にトロンビ
ン（必要に応じて多価アルコール）、第三試薬に合成基
質をそれぞれ含有させて構成してもよい。
【００２１】前記の二試薬系の場合、第一試薬中のヘパ
リンの濃度範囲は従来公知の第一試薬の濃度範囲と同じ
でよく、例えば０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは
０．１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。ま
た、トロンビンも従来公知の第一試薬の濃度範囲で同じ
でよく、例えば０．０１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは
０．０５〜５Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。多価
アルコールは試薬添加量や測定系の条件により調整すれ
ばよく、例えば、トロンビンとヘパリンとＡＴIII とが
複合体を形成する反応の場に、例えば、アルカリ金属塩
（特にはＮａＣｌ）を０．０５〜０．１８Ｍの濃度で共
存させる場合には、多価アルコール濃度が１０〜６０容
量％、好ましくは２０〜６０容量％の量となるように試
薬濃度を調整して構成すればよい。
リンの濃度範囲は従来公知の第一試薬の濃度範囲と同じ
でよく、例えば０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは
０．１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。ま
た、トロンビンも従来公知の第一試薬の濃度範囲で同じ
でよく、例えば０．０１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは
０．０５〜５Ｕ／ｍｌの濃度範囲で適宜調整する。多価
アルコールは試薬添加量や測定系の条件により調整すれ
ばよく、例えば、トロンビンとヘパリンとＡＴIII とが
複合体を形成する反応の場に、例えば、アルカリ金属塩
（特にはＮａＣｌ）を０．０５〜０．１８Ｍの濃度で共
存させる場合には、多価アルコール濃度が１０〜６０容
量％、好ましくは２０〜６０容量％の量となるように試
薬濃度を調整して構成すればよい。
【００２２】前記の構成を有する第一試薬を精製水ある
いは適当な緩衝液に溶解して用いることができる。緩衝
液としては、構成成分を安定に保つことができ、且つＡ
ＴIII との複合体形成を阻害しないもの、更には残存ト
ロンビンと合成基質との反応を阻害しないものであれば
特に限定はされない。具体的には、トリス緩衝液、グッ
ド緩衝液、ヘペス緩衝液等、従来公知の緩衝液から適宜
選択して用いることができる。更に粉末状として供する
場合には、例えば、トロンビン０．１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは０．５〜５０Ｕ／ｍｌを公知の手段で凍
結乾燥して粉末状とし、その粉末状組成物の溶解液とし
て０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０
０Ｕ／ｍｌのヘパリン及び前記濃度の多価アルコールを
含む緩衝液を別途調製し、使用時にトロンビンを溶解し
て用いることもできる。
いは適当な緩衝液に溶解して用いることができる。緩衝
液としては、構成成分を安定に保つことができ、且つＡ
ＴIII との複合体形成を阻害しないもの、更には残存ト
ロンビンと合成基質との反応を阻害しないものであれば
特に限定はされない。具体的には、トリス緩衝液、グッ
ド緩衝液、ヘペス緩衝液等、従来公知の緩衝液から適宜
選択して用いることができる。更に粉末状として供する
場合には、例えば、トロンビン０．１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは０．５〜５０Ｕ／ｍｌを公知の手段で凍
結乾燥して粉末状とし、その粉末状組成物の溶解液とし
て０．０１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０
０Ｕ／ｍｌのヘパリン及び前記濃度の多価アルコールを
含む緩衝液を別途調製し、使用時にトロンビンを溶解し
て用いることもできる。
【００２３】前記の二試薬系の場合、第二試薬の基質と
しては、従来公知の第二試薬に含まれている基質を従来
公知の第二試薬と同様の濃度で用いることができる。具
体的には、トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−
パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−
ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニトロアニリド、Ｈ
−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ
−アルギニル−パラニトロアニリド、アルギニル−３−
ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニ
リド等の合成基質を好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、
より好ましくは０．１〜５０ｍＭの濃度となるように調
整する。これらを精製水あるいは前記と同様の緩衝液に
溶解して用いる。更に、基質物質の安定性等を考慮し
て、これらを公知の手段より凍結乾燥品の形で保存する
こともできる。
しては、従来公知の第二試薬に含まれている基質を従来
公知の第二試薬と同様の濃度で用いることができる。具
体的には、トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−
パラニトロアニリド、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−
ピペコリル−Ｌ−アルギニン−パラニトロアニリド、Ｈ
−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ
−アルギニル−パラニトロアニリド、アルギニル−３−
ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニ
リド等の合成基質を好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、
より好ましくは０．１〜５０ｍＭの濃度となるように調
整する。これらを精製水あるいは前記と同様の緩衝液に
溶解して用いる。更に、基質物質の安定性等を考慮し
て、これらを公知の手段より凍結乾燥品の形で保存する
こともできる。
【００２４】セリンプロテアーゼとして第Ｘ因子を用い
る場合には、前記と同様に従来公知の試薬に多価アルコ
ールを前記の濃度となるように添加すればよい。また、
基質も、例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−アル
ギニル−パラニトロアニリド、又はＮ−ベンゾイル−Ｌ
−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニル−パラニトロアニリド等の公知の基質を用いればよ
い。また、残存するトロンビン活性を、第ＸIII 因子存
在下にフィブリンをフィブリノゲンに転換する活性とし
て凝固時間を測定することにより求める場合にも、従来
の公知試薬に多価アルコールを前記の濃度となるように
添加して構成することができる。
る場合には、前記と同様に従来公知の試薬に多価アルコ
ールを前記の濃度となるように添加すればよい。また、
基質も、例えばメシル−Ｄ−ロイシル−グリシル−アル
ギニル−パラニトロアニリド、又はＮ−ベンゾイル−Ｌ
−イソロイシルＬ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニル−パラニトロアニリド等の公知の基質を用いればよ
い。また、残存するトロンビン活性を、第ＸIII 因子存
在下にフィブリンをフィブリノゲンに転換する活性とし
て凝固時間を測定することにより求める場合にも、従来
の公知試薬に多価アルコールを前記の濃度となるように
添加して構成することができる。
【００２５】ＨＣIIによる干渉の回避、及び高濃度のＡ
ＴIII を含む被検試料の測定を実施する方法として、反
応液中に高濃度の塩を添加する方法が提案されているが
（特開平７−８２９８号公報）、ヘパリン依存的活性を
非依存的活性よりも強く抑制するので、ヘパリン非依存
的活性を定量してしまうという欠点があった。多価アル
コール（例えば、エチレングリコール）を共存させる本
発明方法は、ＨＣIIによる干渉の回避、高濃度のＡＴII
I を含む被検試料の測定、及びヘパリン非依存的ＡＴII
I 活性の抑制を、同時に満たすことができるという点
で、従来法とは異なる新規な方法であり、且つ優れてい
る。
ＴIII を含む被検試料の測定を実施する方法として、反
応液中に高濃度の塩を添加する方法が提案されているが
（特開平７−８２９８号公報）、ヘパリン依存的活性を
非依存的活性よりも強く抑制するので、ヘパリン非依存
的活性を定量してしまうという欠点があった。多価アル
コール（例えば、エチレングリコール）を共存させる本
発明方法は、ＨＣIIによる干渉の回避、高濃度のＡＴII
I を含む被検試料の測定、及びヘパリン非依存的ＡＴII
I 活性の抑制を、同時に満たすことができるという点
で、従来法とは異なる新規な方法であり、且つ優れてい
る。
【００２６】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。なお、以下の実施例においては、測定機器には自動
分析装置ＬＰＩＡ２００（商品名；三菱化学製）を用い
た。ＡＴIII 活性測定用試薬は、Ｒ１試薬（トロンビン
１８０ｍＵ／ｍｌ、ヘパリン２０ｕｎｉｔ／ｍｌ、及び
ウシ血清アルブミン０．３５ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭ
トリス緩衝液）と、Ｒ２試薬〔６ｍＭトロンビン活性検
出用合成基質Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチ
ルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド（日
東紡製：以下、ＮＳ１５００と称する）〕とからなる。
但し、以下の各実施例の内容に応じて、ＮａＣｌ及び／
又はエチレングリコールをＲ１試薬に適宜添加して使用
した。また、各実施例で用いるｐＨ条件に応じて、Ｒ１
試薬中のトリス緩衝液の代わりに２−モルホリノエタン
スルホン酸（以下、ＭＥＳと称する）緩衝液、クエン酸
緩衝液、又はリン酸緩衝液を使用した。なお、実施例に
おける濃度（エチレングリコール，ＮａＣｌ）は、全て
最終濃度（検体＋Ｒ１＋Ｒ２）で表記した。測定は以下
の手順で実施した。すなわち、Ｒ１試薬２３６μｌに生
理食塩水２４μｌを添加し、更に、被検試料（例えば、
無希釈血漿検体）又は生理食塩水（ブランク用）３μｌ
を添加し、３７℃で５分間インキュベートを行った。次
いで、Ｒ２試薬４０μｌを添加し、反応液を３７℃に維
持したまま、４０５ｎｍの吸光度変化を１０分間測定し
た。生理食塩水を添加した場合の１０分間の吸光度変化
と、被検試料を添加した場合の１０分間の吸光度変化と
の差から、被検試料中のＡＴIII 活性を算出した。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。なお、以下の実施例においては、測定機器には自動
分析装置ＬＰＩＡ２００（商品名；三菱化学製）を用い
た。ＡＴIII 活性測定用試薬は、Ｒ１試薬（トロンビン
１８０ｍＵ／ｍｌ、ヘパリン２０ｕｎｉｔ／ｍｌ、及び
ウシ血清アルブミン０．３５ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭ
トリス緩衝液）と、Ｒ２試薬〔６ｍＭトロンビン活性検
出用合成基質Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−Ｎ−メチ
ルアラニル−Ｌ−アルギニル−パラニトロアニリド（日
東紡製：以下、ＮＳ１５００と称する）〕とからなる。
但し、以下の各実施例の内容に応じて、ＮａＣｌ及び／
又はエチレングリコールをＲ１試薬に適宜添加して使用
した。また、各実施例で用いるｐＨ条件に応じて、Ｒ１
試薬中のトリス緩衝液の代わりに２−モルホリノエタン
スルホン酸（以下、ＭＥＳと称する）緩衝液、クエン酸
緩衝液、又はリン酸緩衝液を使用した。なお、実施例に
おける濃度（エチレングリコール，ＮａＣｌ）は、全て
最終濃度（検体＋Ｒ１＋Ｒ２）で表記した。測定は以下
の手順で実施した。すなわち、Ｒ１試薬２３６μｌに生
理食塩水２４μｌを添加し、更に、被検試料（例えば、
無希釈血漿検体）又は生理食塩水（ブランク用）３μｌ
を添加し、３７℃で５分間インキュベートを行った。次
いで、Ｒ２試薬４０μｌを添加し、反応液を３７℃に維
持したまま、４０５ｎｍの吸光度変化を１０分間測定し
た。生理食塩水を添加した場合の１０分間の吸光度変化
と、被検試料を添加した場合の１０分間の吸光度変化と
の差から、被検試料中のＡＴIII 活性を算出した。
【００２７】実施例１：血漿全体のトロンビン阻害活性
に占めるＨＣIIの比率 正常プール血漿１４０μｌに対し、過剰量（１００μ
ｌ）の抗ヒトＡＴIII ウサギ抗体（Ｄａｋｏ社）を添加
し、室温で３０分間インキュベートすることにより不活
化処理を実施した。このとき残留したトロンビン阻害活
性は、ＨＣIIに由来することを抗ＨＣII特異抗体による
吸収で確認した。この残留したＨＣIIによるトロンビン
阻害活性に関し、反応液中のＮａＣｌ濃度とエチレング
リコール濃度との関係について調べた（図１〜図３及び
表１〜３）。なお、本実施例においては、反応条件に応
じて、ＮａＣｌの終濃度が０．０４Ｍ〜０．３９Ｍにな
るように、更に、エチレングリコールの終濃度が１２容
量％又は２４容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ
及びエチレングリコールを添加した。また、Ｒ１試薬の
緩衝液には、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）を使用した。
に占めるＨＣIIの比率 正常プール血漿１４０μｌに対し、過剰量（１００μ
ｌ）の抗ヒトＡＴIII ウサギ抗体（Ｄａｋｏ社）を添加
し、室温で３０分間インキュベートすることにより不活
化処理を実施した。このとき残留したトロンビン阻害活
性は、ＨＣIIに由来することを抗ＨＣII特異抗体による
吸収で確認した。この残留したＨＣIIによるトロンビン
阻害活性に関し、反応液中のＮａＣｌ濃度とエチレング
リコール濃度との関係について調べた（図１〜図３及び
表１〜３）。なお、本実施例においては、反応条件に応
じて、ＮａＣｌの終濃度が０．０４Ｍ〜０．３９Ｍにな
るように、更に、エチレングリコールの終濃度が１２容
量％又は２４容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ
及びエチレングリコールを添加した。また、Ｒ１試薬の
緩衝液には、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）を使用した。
【００２８】比較例として、エチレングリコール濃度が
０％の場合の結果を、図１及び表１に示す。図１におい
て、実線ａは、生理食塩水を添加したときの１０分間の
吸光度変化の値（以下、Δａと称する）を直線で結んだ
ものであり、反応液中の全トロンビン活性を示す。ま
た、破線ｂは、不活化処理を実施したプール血漿を添加
したときの１０分間の吸光度変化の値（Δｂと称する）
を直線で結んだものであり、ＨＣIIにより阻害された反
応液中の残存トロンビン活性を示す。更に、一点鎖線ｃ
は、正常プール血漿を添加したときの１０分間の吸光度
変化の値（Δｃと称する）を直線で結んだものであり、
血漿により阻害された反応液中の残存トロンビン活性を
示す。表１において、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度
（Ｍ）であり、（ｂ）は「ＨＣIIによるトロンビン活性
阻害率」（以下、αb と称する）であり、算出式：αb
＝１００×（Δａ−Δｂ）／Δａにより求めた。また、
（ｃ）は「血漿によるトロンビン活性阻害率」（以下、
αC と称する）であり、算出式：αC ＝１００×（Δａ
−Δｃ）／Δａにより求めた。更には、（ｄ）は「血漿
による阻害に占めるＨＣIIの比率」であり、算出式：α
b ／αC により求めた。表１に示すように、ＨＣIIによ
るトロンビン阻害活性は反応液中のＮａＣｌ濃度に依存
することが認められた。
０％の場合の結果を、図１及び表１に示す。図１におい
て、実線ａは、生理食塩水を添加したときの１０分間の
吸光度変化の値（以下、Δａと称する）を直線で結んだ
ものであり、反応液中の全トロンビン活性を示す。ま
た、破線ｂは、不活化処理を実施したプール血漿を添加
したときの１０分間の吸光度変化の値（Δｂと称する）
を直線で結んだものであり、ＨＣIIにより阻害された反
応液中の残存トロンビン活性を示す。更に、一点鎖線ｃ
は、正常プール血漿を添加したときの１０分間の吸光度
変化の値（Δｃと称する）を直線で結んだものであり、
血漿により阻害された反応液中の残存トロンビン活性を
示す。表１において、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度
（Ｍ）であり、（ｂ）は「ＨＣIIによるトロンビン活性
阻害率」（以下、αb と称する）であり、算出式：αb
＝１００×（Δａ−Δｂ）／Δａにより求めた。また、
（ｃ）は「血漿によるトロンビン活性阻害率」（以下、
αC と称する）であり、算出式：αC ＝１００×（Δａ
−Δｃ）／Δａにより求めた。更には、（ｄ）は「血漿
による阻害に占めるＨＣIIの比率」であり、算出式：α
b ／αC により求めた。表１に示すように、ＨＣIIによ
るトロンビン阻害活性は反応液中のＮａＣｌ濃度に依存
することが認められた。
【００２９】
【表１】 （ａ） 0.052 0.091 0.130 0.170 0.209 0.248 0.327 （ｂ） 24% 34% 39% 36% 29% 19% 4% （ｃ） 63% 80% 86% 88% 88% 86% 72% （ｄ） 38% 43% 45% 41% 33% 22% 6%
【００３０】エチレングリコール濃度が１２％（Ｖ／
Ｖ）の場合の結果を図２及び表２に示し、エチレングリ
コール濃度が２４％（Ｖ／Ｖ）の場合の結果を図３及び
表３に示す。表中、（ａ）〜（ｄ）は表１と同じ意味で
ある。反応液にエチレングリコールを添加すると、ＨＣ
IIによるトロンビン阻害活性は抑制される傾向を示し
（図２及び表２）、エチレングリコール濃度が２４％の
場合、反応液中のＮａＣｌ濃度に関係なくＨＣIIによる
トロンビン阻害活性は、ほぼ完全に消失した（図３及び
表３）。２４％以上のエチレングリコール存在下でも同
様の結果を得た。
Ｖ）の場合の結果を図２及び表２に示し、エチレングリ
コール濃度が２４％（Ｖ／Ｖ）の場合の結果を図３及び
表３に示す。表中、（ａ）〜（ｄ）は表１と同じ意味で
ある。反応液にエチレングリコールを添加すると、ＨＣ
IIによるトロンビン阻害活性は抑制される傾向を示し
（図２及び表２）、エチレングリコール濃度が２４％の
場合、反応液中のＮａＣｌ濃度に関係なくＨＣIIによる
トロンビン阻害活性は、ほぼ完全に消失した（図３及び
表３）。２４％以上のエチレングリコール存在下でも同
様の結果を得た。
【００３１】
【表２】 （ａ） 0.052 0.091 0.130 0.170 0.209 0.248 0.32 （ｂ） 6% 13% 12% 11% 7% 3% 1% （ｃ） 21% 34% 41% 43% 44% 40% 30% （ｄ） 29% 38% 29% 25% 16% 8% 3%
【００３２】
【表３】 （ａ） 0.052 0.091 0.130 0.170 0.209 0.248 0.327 （ｂ） <0% 1% 0% 0% <0% <0% <0% （ｃ） 3% 6% 7% 10% 10% 11% 9% （ｄ） <0% 17% 0% 0% <0% <0% <0%
【００３３】同様の操作を、ｐＨ値及びエチレングリコ
ール濃度を変化させて実施した。ｐＨ値が６．５の場合
の結果を図４に、ｐＨ値が７．０の場合の結果を図５
に、ｐＨ値が７．５の場合の結果を図６に、ｐＨ値が
８．０の場合の結果を図７に、そしてｐＨ値が８．５の
場合の結果を図８にそれぞれ示す。図４〜図８におい
て、実線ａ、破線ｂ、及び一点鎖線ｃは図１〜図３と同
じ意味である。また、（１）で示すグラフはエチレング
リコール濃度が０％の場合の結果を示し、同様に（２）
で示すグラフはエチレングリコール濃度が８％、（３）
で示すグラフはエチレングリコール濃度が１６％、そし
て（４）で示すグラフはエチレングリコール濃度が２４
％の場合の結果を示し、（１）〜（４）で示す各グラフ
の横軸は、反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）であり、縦軸
は、１０分間の吸光度変化である。図４〜図８に示すよ
うに、塩化ナトリウム０．２Ｍ以下の存在下で、エチレ
ングリコールの終濃度が１６容量％又は２４容量％、好
ましくは２４容量％の場合に、ＨＣIIによるトロンビン
阻害活性が抑制されることが判明した。
ール濃度を変化させて実施した。ｐＨ値が６．５の場合
の結果を図４に、ｐＨ値が７．０の場合の結果を図５
に、ｐＨ値が７．５の場合の結果を図６に、ｐＨ値が
８．０の場合の結果を図７に、そしてｐＨ値が８．５の
場合の結果を図８にそれぞれ示す。図４〜図８におい
て、実線ａ、破線ｂ、及び一点鎖線ｃは図１〜図３と同
じ意味である。また、（１）で示すグラフはエチレング
リコール濃度が０％の場合の結果を示し、同様に（２）
で示すグラフはエチレングリコール濃度が８％、（３）
で示すグラフはエチレングリコール濃度が１６％、そし
て（４）で示すグラフはエチレングリコール濃度が２４
％の場合の結果を示し、（１）〜（４）で示す各グラフ
の横軸は、反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）であり、縦軸
は、１０分間の吸光度変化である。図４〜図８に示すよ
うに、塩化ナトリウム０．２Ｍ以下の存在下で、エチレ
ングリコールの終濃度が１６容量％又は２４容量％、好
ましくは２４容量％の場合に、ＨＣIIによるトロンビン
阻害活性が抑制されることが判明した。
【００３４】実施例２：ＡＴIII によるトロンビン阻害
活性に対するエチレングリコールの抑制効果 最終反応液量３００μｌ（自動分析装置における典型的
な試薬分注量）に対して、無希釈血漿サンプルを３μｌ
（多くの自動分析装置における最小サンプル量）分注し
た場合における、ＡＴIII 活性測定系の検量線の形状、
及びそれに対するＲ１試薬へのエチレングリコールの効
果を調べた。検量線の形状は反応液中のＮａＣｌ濃度及
びｐＨにも左右されるので、ここでは、ＮａＣｌ終濃度
が０．１５Ｍで、しかもエチレングリコール終濃度が０
〜４０容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ及びエ
チレングリコールを添加し、Ｒ１試薬の緩衝液としてク
エン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した場合について示
す。結果を図９〜図１４に示す。ＡＴIII 濃度は、健常
人血漿に含まれるＡＴIII濃度の平均値を１００％とし
て示し、ＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたって調
べた。図９に示すように、エチレングリコール非添加時
には検量線は作成不可能だが、エチレングリコールの添
加によりトロンビン阻害活性が抑制され、２４容量％以
上の場合（図１２〜図１４）、無希釈の血漿サンプルに
対してＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線
が作成可能となった。
活性に対するエチレングリコールの抑制効果 最終反応液量３００μｌ（自動分析装置における典型的
な試薬分注量）に対して、無希釈血漿サンプルを３μｌ
（多くの自動分析装置における最小サンプル量）分注し
た場合における、ＡＴIII 活性測定系の検量線の形状、
及びそれに対するＲ１試薬へのエチレングリコールの効
果を調べた。検量線の形状は反応液中のＮａＣｌ濃度及
びｐＨにも左右されるので、ここでは、ＮａＣｌ終濃度
が０．１５Ｍで、しかもエチレングリコール終濃度が０
〜４０容量％になるように、Ｒ１試薬にＮａＣｌ及びエ
チレングリコールを添加し、Ｒ１試薬の緩衝液としてク
エン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した場合について示
す。結果を図９〜図１４に示す。ＡＴIII 濃度は、健常
人血漿に含まれるＡＴIII濃度の平均値を１００％とし
て示し、ＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたって調
べた。図９に示すように、エチレングリコール非添加時
には検量線は作成不可能だが、エチレングリコールの添
加によりトロンビン阻害活性が抑制され、２４容量％以
上の場合（図１２〜図１４）、無希釈の血漿サンプルに
対してＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線
が作成可能となった。
【００３５】同様の操作を、Ｒ１試薬に添加するＮａＣ
ｌ濃度、及びＲ１試薬のｐＨを変化させて実施した。Ｎ
ａＣｌ濃度が０．０５Ｍの場合の結果を表４に、そして
ＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍの場合の結果を表５にそれぞ
れ示す。表中、記号○は、適正な検量線を作成すること
ができる可能性があることを示し、記号−は、最適では
ないものの検量線を成立させ得ることを示し、そして記
号×は、検量線が作成不可能であることを示す。表４及
び表５に示すように、ｐＨ値とエチレングリコール使用
量とを適宜選択することにより、無希釈の血漿に対して
ＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線が作成
可能となることが判明した。
ｌ濃度、及びＲ１試薬のｐＨを変化させて実施した。Ｎ
ａＣｌ濃度が０．０５Ｍの場合の結果を表４に、そして
ＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍの場合の結果を表５にそれぞ
れ示す。表中、記号○は、適正な検量線を作成すること
ができる可能性があることを示し、記号−は、最適では
ないものの検量線を成立させ得ることを示し、そして記
号×は、検量線が作成不可能であることを示す。表４及
び表５に示すように、ｐＨ値とエチレングリコール使用
量とを適宜選択することにより、無希釈の血漿に対して
ＡＴIII 濃度０〜２００％の範囲にわたり検量線が作成
可能となることが判明した。
【００３６】
【表４】 エチレングリコール濃度 ｐＨ値 〔％（ｖ／ｖ）〕 ６．５ ７．０ ７．５ ８．０ ８．５ ０ × × × × × １０ × × × × − ２０ ○ × × − − ３０ × ○ ○ − ○ ４０ × × × ○ ○ ５０ × × × − −
【００３７】
【表５】 エチレングリコール濃度 ｐＨ値 〔％（ｖ／ｖ）〕 ６．５ ７．０ ７．５ ８．０ ８．５ ０ × × × × × １０ × × × × × ２０ ○ × × × × ３０ × ○ × × − ４０ × × ○ × − ５０ × × − ○ ○
【００３８】また、同様の操作を、エチレングリコール
の代わりに、グリセロール、ソルビトール、又はキシリ
トールを使用して実施したところ、エチレングリコール
の場合と同様にトロンビン阻害活性を抑制することが判
明した。
の代わりに、グリセロール、ソルビトール、又はキシリ
トールを使用して実施したところ、エチレングリコール
の場合と同様にトロンビン阻害活性を抑制することが判
明した。
【００３９】実施例３：ヘパリンが関与しないトロンビ
ン阻害活性の測定値に与える影響 最終反応液量３００μｌに対し、無希釈血漿サンプル３
μｌを分注した条件における、ＡＴIII 活性測定値に対
する、ＡＴIII とヘパリンとの相互作用に依存しない阻
害活性の影響を調べた。具体的には、Ｒ１試薬中に、ヘ
パリン濃度が０単位／ｍｌ（図１５）及び１９単位／ｍ
ｌの場合（図１６）における、それぞれＲ１試薬中にＮ
ａＣｌを０．０４〜０．７２Ｍを添加したときのＡＴII
I によるトロンビン阻害量を調べた。なお、Ｒ１試薬の
緩衝液としては３８ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用い
た。図１５及び図１６において、実線ａは、生理食塩水
（ブランク）を添加したときの１０分間の吸光度変化の
値を示し、破線ｃは、無希釈正常プール血漿を添加した
ときの１０分間の吸光度変化の値を示す。トロンビン阻
害率（％）は、式： （トロンビン阻害率）＝１００×（Ｈａ−Ｈｃ）／Ｈａ （式中、Ｈａは、図１５又は図１６における実線ａの高
さを意味し、Ｈｃは、図１５又は図１６における実線ｃ
の高さを意味する）により、算出することができる。
ン阻害活性の測定値に与える影響 最終反応液量３００μｌに対し、無希釈血漿サンプル３
μｌを分注した条件における、ＡＴIII 活性測定値に対
する、ＡＴIII とヘパリンとの相互作用に依存しない阻
害活性の影響を調べた。具体的には、Ｒ１試薬中に、ヘ
パリン濃度が０単位／ｍｌ（図１５）及び１９単位／ｍ
ｌの場合（図１６）における、それぞれＲ１試薬中にＮ
ａＣｌを０．０４〜０．７２Ｍを添加したときのＡＴII
I によるトロンビン阻害量を調べた。なお、Ｒ１試薬の
緩衝液としては３８ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用い
た。図１５及び図１６において、実線ａは、生理食塩水
（ブランク）を添加したときの１０分間の吸光度変化の
値を示し、破線ｃは、無希釈正常プール血漿を添加した
ときの１０分間の吸光度変化の値を示す。トロンビン阻
害率（％）は、式： （トロンビン阻害率）＝１００×（Ｈａ−Ｈｃ）／Ｈａ （式中、Ｈａは、図１５又は図１６における実線ａの高
さを意味し、Ｈｃは、図１５又は図１６における実線ｃ
の高さを意味する）により、算出することができる。
【００４０】図１５に示すように、無希釈の正常プール
血漿サンプルを添加した場合、反応液にヘパリンが存在
しなくても血漿中のＡＴIII により全トロンビン活性の
約１０％が阻害された。図１５及び図１６から算出し
た、ヘパリンの関与しないトロンビン阻害率（Ａ）、及
びヘパリン存在下でのトロンビン阻害率（Ｂ）を表６に
示す。表中、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）で
ある。なお、ＮａＣｌ濃度が０．１６Ｍ又は０．２２Ｍ
の場合、ヘパリン依存的な阻害活性は測定レンジ以上で
あり、Ａ／Ｂ比は無視することができる。ヘパリン共存
下におけるトロンビン阻害活性はＮａＣｌにより抑制さ
れるのに対し（図１６）、ヘパリンの関与しない阻害活
性はＮａＣｌの添加では殆ど抑制されなかった（図１
５）。従って、０．５ＭのＮａＣｌ存在下では血漿サン
プルを無希釈で測定することができるが、ヘパリン結合
能のない変異ＡＴIII についても図１５に相当するトロ
ンビン阻害活性（表６のＡ／Ｂ比より約２０％）の分だ
け、実際よりも高めの測定値を与えることになる。な
お、両条件における阻害活性は、サンプルを抗ＡＴIII
抗体で処理することにより完全に消失する。
血漿サンプルを添加した場合、反応液にヘパリンが存在
しなくても血漿中のＡＴIII により全トロンビン活性の
約１０％が阻害された。図１５及び図１６から算出し
た、ヘパリンの関与しないトロンビン阻害率（Ａ）、及
びヘパリン存在下でのトロンビン阻害率（Ｂ）を表６に
示す。表中、（ａ）は反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ）で
ある。なお、ＮａＣｌ濃度が０．１６Ｍ又は０．２２Ｍ
の場合、ヘパリン依存的な阻害活性は測定レンジ以上で
あり、Ａ／Ｂ比は無視することができる。ヘパリン共存
下におけるトロンビン阻害活性はＮａＣｌにより抑制さ
れるのに対し（図１６）、ヘパリンの関与しない阻害活
性はＮａＣｌの添加では殆ど抑制されなかった（図１
５）。従って、０．５ＭのＮａＣｌ存在下では血漿サン
プルを無希釈で測定することができるが、ヘパリン結合
能のない変異ＡＴIII についても図１５に相当するトロ
ンビン阻害活性（表６のＡ／Ｂ比より約２０％）の分だ
け、実際よりも高めの測定値を与えることになる。な
お、両条件における阻害活性は、サンプルを抗ＡＴIII
抗体で処理することにより完全に消失する。
【００４１】
【表６】 （ａ） 0.04 0.10 0.16 0.22 0.34 0.52 0.76 （Ａ） 16% 9% 7% 7% 8% 6% 4% （Ｂ） 51% 92% >100% >100% 90% 22% 4% Ａ／Ｂ比 31% 10% - - 9% 27% 100%
【００４２】実施例４：ヘパリンが関与しないＡＴIII
によるトロンビン阻害活性に対するエチレングリコール
の抑制効果 実施例３に見られる、ヘパリン非存在下で検出されるＡ
ＴIII によるトロンビン阻害活性に対する、反応液中に
添加するエチレングリコールの効果を調べた。具体的に
は、ヘパリンを含まないＲ１試薬に対して、ＮａＣｌ終
濃度０．１３Ｍ及びエチレングリコール終濃度０〜２４
容量％になるように、ＮａＣｌ及びエチレングリコール
を添加した場合について、無希釈正常プール血漿による
トロンビン阻害率を測定した。なお、Ｒ１試薬の緩衝液
としては、３８ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用
いた。結果を表７に示す。
によるトロンビン阻害活性に対するエチレングリコール
の抑制効果 実施例３に見られる、ヘパリン非存在下で検出されるＡ
ＴIII によるトロンビン阻害活性に対する、反応液中に
添加するエチレングリコールの効果を調べた。具体的に
は、ヘパリンを含まないＲ１試薬に対して、ＮａＣｌ終
濃度０．１３Ｍ及びエチレングリコール終濃度０〜２４
容量％になるように、ＮａＣｌ及びエチレングリコール
を添加した場合について、無希釈正常プール血漿による
トロンビン阻害率を測定した。なお、Ｒ１試薬の緩衝液
としては、３８ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用
いた。結果を表７に示す。
【００４３】
【表７】反応液中のエチレングリコール濃度（Ｖ／Ｖ） 0% 8% 16% 24% ヘパリンの関与しないトロンビン阻害率 6% 2% 0% 0%
【００４４】この結果、ｐＨ７．０でＮａＣｌ濃度が
０．１３Ｍの場合では、エチレングリコール濃度が１６
％（Ｖ／Ｖ）の条件で完全に抑制する効果が見られた。
抑制に必要なエチレングリコール濃度は、反応液のｐＨ
により異なっており、例えば、ｐＨ８．０でＮａＣｌ濃
度が０．１３Ｍの条件では２４％（Ｖ／Ｖ）以上のとき
完全に抑制することができる。この特性を利用し、反応
液に多価アルコール（例えば、エチレングリコール）を
２４％以上存在させることにより、無希釈の血漿サンプ
ルでもヘパリン依存ＡＴIII 活性を正確に測定すること
ができる。従って、この反応条件では前記の変異ＡＴII
I を含む検体についても本来のヘパリン依存ＡＴIII 活
性測定値を与えることが期待でき、正確な測定が可能と
なるものである。同様の操作を、エチレングリコールの
代わりにグリセロールを用いて実施したところ、同様に
ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制するこ
とができた。なお、グリセロールの場合には、エチレン
グリコールに比べて高い濃度を必要とした。
０．１３Ｍの場合では、エチレングリコール濃度が１６
％（Ｖ／Ｖ）の条件で完全に抑制する効果が見られた。
抑制に必要なエチレングリコール濃度は、反応液のｐＨ
により異なっており、例えば、ｐＨ８．０でＮａＣｌ濃
度が０．１３Ｍの条件では２４％（Ｖ／Ｖ）以上のとき
完全に抑制することができる。この特性を利用し、反応
液に多価アルコール（例えば、エチレングリコール）を
２４％以上存在させることにより、無希釈の血漿サンプ
ルでもヘパリン依存ＡＴIII 活性を正確に測定すること
ができる。従って、この反応条件では前記の変異ＡＴII
I を含む検体についても本来のヘパリン依存ＡＴIII 活
性測定値を与えることが期待でき、正確な測定が可能と
なるものである。同様の操作を、エチレングリコールの
代わりにグリセロールを用いて実施したところ、同様に
ヘパリン非依存的ＡＴIII による正の干渉を抑制するこ
とができた。なお、グリセロールの場合には、エチレン
グリコールに比べて高い濃度を必要とした。
【００４５】
【発明の効果】被検試料中のヘパリンコファクターIIの
妨害及びアンチトロンビンIII のヘパリン非依存的なト
ロンビン阻害活性の影響を受けずに、アンチトロンビン
III 活性を正確に測定することができる。
妨害及びアンチトロンビンIII のヘパリン非依存的なト
ロンビン阻害活性の影響を受けずに、アンチトロンビン
III 活性を正確に測定することができる。
【図１】エチレングリコール濃度が０％（Ｖ／Ｖ）の場
合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビ
ン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示す
グラフである。
合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロンビ
ン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示す
グラフである。
【図２】エチレングリコール濃度が１２％（Ｖ／Ｖ）の
場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロン
ビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示
すグラフである。
場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロン
ビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示
すグラフである。
【図３】エチレングリコール濃度が２４％（Ｖ／Ｖ）の
場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロン
ビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示
すグラフである。
場合の、血漿及びヘパリンコファクターIIによるトロン
ビン阻害活性と、反応液中のＮａＣｌ濃度との関係を示
すグラフである。
【図４】ｐＨ６．５の場合の、血漿及びヘパリンコファ
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図５】ｐＨ７．０の場合の、血漿及びヘパリンコファ
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図６】ｐＨ７．５の場合の、血漿及びヘパリンコファ
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図７】ｐＨ８．０の場合の、血漿及びヘパリンコファ
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図８】ｐＨ８．５の場合の、血漿及びヘパリンコファ
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
クターIIによるトロンビン阻害活性と、反応液中のＮａ
Ｃｌ濃度との関係を示すグラフである。
【図９】エチレングリコール濃度が０％の場合の検量線
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図１０】エチレングリコール濃度が８％の場合の検量
線を示すグラフである。
線を示すグラフである。
【図１１】エチレングリコール濃度が１６％の場合の検
量線を示すグラフである。
量線を示すグラフである。
【図１２】エチレングリコール濃度が２４％の場合の検
量線を示すグラフである。
量線を示すグラフである。
【図１３】エチレングリコール濃度が３２％の場合の検
量線を示すグラフである。
量線を示すグラフである。
【図１４】エチレングリコール濃度が４０％の場合の検
量線を示すグラフである。
量線を示すグラフである。
【図１５】ヘパリン非存在下におけるトロンピン阻害活
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
【図１６】ヘパリン存在下におけるトロンピン阻害活性
を示すグラフである。
を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】 アンチトロンビンIII を含む被検試料
に、ヘパリン及び既知濃度のセリンプロテアーゼを添加
して複合体を形成させた後、残存するセリンプロテアー
ゼ活性を検出することにより被検試料中のアンチトロン
ビンIII 活性を測定する方法において、前記複合体を形
成させる反応前又は反応時に多価アルコールを共存させ
ることを特徴とする、アンチトロンビンIII 活性測定方
法。 - 【請求項２】 セリンプロテアーゼがトロンビンである
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 多価アルコールがエチレングリコールで
ある、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 セリンプロテアーゼ及びヘパリンを含む
アンチトロンビンIII 測定用試薬に、更に多価アルコー
ルを含有させることを特徴とする、アンチトロンビンII
I 活性測定用試薬。 - 【請求項５】 セリンプロテアーゼがトロンビンである
請求項４に記載の試薬。 - 【請求項６】 多価アルコールがエチレングリコールで
ある、請求項４又は５に記載のアンチトロンビンIII 活
性測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19698896A JP3773595B2 (ja) | 1996-07-08 | 1996-07-08 | アンチトロンビンｉｉｉ 活性測定方法及び測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19698896A JP3773595B2 (ja) | 1996-07-08 | 1996-07-08 | アンチトロンビンｉｉｉ 活性測定方法及び測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014599A true JPH1014599A (ja) | 1998-01-20 |
| JP3773595B2 JP3773595B2 (ja) | 2006-05-10 |
Family
ID=16366972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19698896A Expired - Lifetime JP3773595B2 (ja) | 1996-07-08 | 1996-07-08 | アンチトロンビンｉｉｉ 活性測定方法及び測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3773595B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114958963A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-08-30 | 深圳传世生物医疗有限公司 | 一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒及其应用 |
| CN115032164A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-09-09 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种肝素钠中是否含有凝血因子Xa直接抑制剂的检测方法 |
-
1996
- 1996-07-08 JP JP19698896A patent/JP3773595B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114958963A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-08-30 | 深圳传世生物医疗有限公司 | 一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒及其应用 |
| CN114958963B (zh) * | 2022-07-29 | 2023-09-05 | 深圳传世生物医疗有限公司 | 一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒及其应用 |
| CN115032164A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-09-09 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种肝素钠中是否含有凝血因子Xa直接抑制剂的检测方法 |
| CN115032164B (zh) * | 2022-08-10 | 2022-12-06 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种肝素钠中是否含有凝血因子Xa直接抑制剂的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3773595B2 (ja) | 2006-05-10 |
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