CN114958963A - 一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物医学检验测定技术领域，提供了一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，包括第一功能试剂和第二功能试剂；所述第一功能试剂包含改性凝血酶；所述改性凝血酶的肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原的结合位点完全或部分封闭；所述改性凝血酶表现出对肝素和/或ATIII浓度变化的不敏感性；所述第二功能试剂包含至少一种凝血酶底物；所述凝血酶底物可以与作用于凝血酶的抗凝药物竞争结合改性后凝血酶。本发明的第一功能试剂与第二功能试剂联合使用，可以有效的抑制样本中肝素和或ATIII和或纤维蛋白原对作用于凝血酶的抗凝药物检测的干扰。本发明的试剂盒检测准确率高，重复性好，而且检测步骤简单，有效提高了检测效率。

Description

一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物医学检验测定技术领域，尤其涉及一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒。

背景技术

目前抗凝剂可以根据作用靶点，将其分为两类：作用于Xa因子的抗凝药物和作用于凝血酶的抗凝药物。其中，作用于凝血酶的抗凝药物，如达比加群，已有相关专利报道。

专利CN 114277089 A公开了一种基于凝固法来检测达比加群的试剂盒，达比加群可结合于凝血酶的纤维蛋白特异结合位点，阻止纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，从而使凝固时间延长。凝固时间与达比加群的浓度呈正相关，此外还通过添加肝素中和剂来提高试剂抗肝素干扰的性能。但在实际临床应用中，血浆中组分十分复杂，且在不同人群存在一定的差异，如纤维蛋白原作为凝固法检测的基础，其含量的差异会影响样本的凝固时间，从而导致测试结果出现偏差。

专利CN 107167439 A公开了一种基于发色底物法来检测达比加群的试剂盒，通过在血浆中加入蛇静脉酶用于作用在凝血酶原上，产生一种具有裂解活性的酶，这种酶裂解其发色底物，得到吸光度信号。血浆中的达比加群抑制这种酶,而达比加群含量越高,对这种酶的抑制越强，得到的吸光度信号越弱。所以在一定的范围之内, 达比加群的含量和吸光度的信号是负相关关系。虽然这种方法可以有效避免纤维蛋白原的含量差异对结果的影响，但其产生的酶的活力还会受到样本中的肝素或ATIII的影响，从而导致最终测试结果的准确性降低。

药物浓度的准确检测在血栓与止血病人进行治疗用药指导方向具有重要临床意义，不准确或错误的结果会影响抗凝或纤溶药物使用的判断，危及患者的生命。因此，当前在血栓与止血相关临床用药监测领域迫切需求一种可以准确监测作用于凝血酶抗凝药物的含量且易于获得的检测试剂盒。

发明内容

本发明实施例提供一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，旨在解决现有作用于凝血酶的抗凝药物检测方法存在的检测准确性不理想，成本高和使用过程复杂等技术问题。

一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，包括第一功能试剂和第二功能试剂；

所述第一功能试剂包含长链化合物改性凝血酶；所述长链化合物改性凝血酶的肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原的结合位点完全或部分封闭；所述长链化合物改性凝血酶表现出对肝素和/或ATIII浓度或活性变化的不敏感性。

所述第二功能试剂包含至少一种凝血酶底物；所述凝血酶底物可以与作用于凝血酶的抗凝药物竞争结合长链化合物改性凝血酶。

进一步地，所述长链化合物改性凝血酶通过长链化合物共价结合于凝血酶制备得到。

更进一步地，待改性的凝血酶与长链化合物的结合位点为氨基，所述长链化合物包括但不限于分子量大于500的聚醇类试剂、酰卤类试剂、醛类试剂、卤甲基类试剂、酸酐类试剂、环氧基类试剂、有机酸类试剂中的一种或者多种；

更进一步地，待改性的凝血酶与长链化合物的结合位点为羧基，所述长链化合物为与羧基具备共价结合能力的基团和亲水基团或负电荷基团的长链化合物，包括但不限于分子量大于500，且富含亲水基团或负电荷基团的氨基酸类试剂、聚醇类试剂中的一种或者多种。

进一步地，所述长链化合物改性凝血酶的蛋白条带灰度分布峰值对应的分子量需大于40KDa。

更进一步地，所述改性后凝血酶表现为ATIII和或肝素的浓度的不敏感性，当ATIII活性范围为150%以内时，对基于改性后凝血酶开发的试剂盒检测结果的影响不超过15%。

更进一步地，所述第一功能试剂还至少包括含有活性组分的缓冲溶液；和/或所述活性组分包括但不限于盐类保护剂、蛋白类保护剂、糖类保护剂、氨基酸类保护剂、醇类保护剂、表面活性剂以及防腐剂中的至少一种；

更进一步地，所述缓冲溶液包括但不限于HEPES缓冲液、Tris缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的至少一种。

更进一步地，所述盐类保护剂为一价金属盐，包括但不限于钠盐、钾盐中的至少一种；和/或所述蛋白类保护剂包括但不限于白蛋白、牛血清白蛋白中的至少一种；和/或所述糖类保护剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种；和/或所述氨基酸类保护剂包括但不限于甘氨酸、精氨酸、赖氨酸中的至少一种；和/或所述醇类保护剂包括但不限于乙二醇、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种；和/或所述表面活性剂为非阴离子表面活性剂，包括但不限于吐温-20或Triton X-100中的至少一种；和/或所述防腐剂组分包括但不限于Proclin300、叠氮钠中至少的一种。

进一步地，所述凝血酶底物包括发色底物或纤维蛋白原中的至少一种。凝血酶底物为纤维蛋白原时，可以通过检测纤维蛋白的生成情况来反映作用于凝血酶的抗凝药物含量。凝血酶底物为发色底物时，可以通过检测发色化合物生成量来反映作用于凝血酶的抗凝药物含量。

更进一步地，所述凝血酶底物为发色底物时，需要特异性选择特殊氨基酸序列的发色底物，当所述抗凝药物为达比加群及其衍生物时，所述发色底物特异性选择氨基酸序列为pyroGlu-Pro-Arg-的短肽与发色基团的组合，所述发色基团包括但不限于硝基苯酚基团、硝基苯胺基团、硝基苯基团中的至少一种，优选发色底物S-2366。

进一步地，所述作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒还包括稀释液、校准品。

更进一步地，所述改性凝血酶的用量可以与校准品中的达比加群最大浓度以及第一功能试剂和校准品加入体积建立一个公式：k*V1*C1=V2*C2，其中V1为绘制校准曲线时校准品加入体积，C1为校准品中达比加群的最大浓度，V2为第一功能试剂加入体积，C2为第一功能试剂中改性凝血酶的浓度，k为固定系数，需大于0.04 U·mL^-1/ng·mL^-1。

本发明实施例还提供上述作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的制备方法，包括分别配置第一功能试剂和第二功能试剂，分别密封包装。

本发明实施例还提供上述作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

通过样本和稀释液混合配制待测样品溶液，随后在所述待测样品溶液中加入第一功能试剂和第二功能试剂继续进行混合得到最终反应溶液并进行反应；

通过检测反应后生成物质的情况，判断作用于凝血酶的抗凝药物的含量。

更进一步地，所述样本与最终反应溶液的体积比例需小于1:6。

本发明实施例还提供上述作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的应用，用于检测作用于凝血酶的抗凝药物。

更进一步地，上述作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒可用于达比加群及其衍生物的检测。

在检测时，需控制样本与最终反应溶液的体积比例小于1:6。当样本与最终反应溶液的体积比例大于1:6时，样本量加入过多，而不同样本中可能会含有不同的浓度的纤维蛋白原或肝素等物质，可能会因为样本中这些干扰物质的浓度差异而导致测试结果的偏差较大，因此，需要控制样本与最终反应溶液的体积比例。

本发明的作用于凝血酶的抗凝药物检测方法由于是直接利用本发明作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒进行检测，检测准确率高，重复性好，而且检测步骤简单，有效提高了检测效率。

附图说明

图1为实施例1改性凝血酶与未改性凝血酶凝胶电泳对比图，图中A为未改性的凝血酶，B为氨基结合位点改性凝血酶，C为羧基结合位点改性凝血酶；

图2为采用不同大小的灰度分布峰值对应的分子量的改性凝血酶在ATIII干扰下对达比加群检测影响趋势的结果；

图3为采用不同的发色底物制备底物试剂的达比加群测定试剂盒与达比加群浓度之间反应曲线对比结果；

图4为实施例5基于底物为发色底物的达比加群测定试剂盒的校准曲线；

图5为实施例6基于底物为纤维蛋白原的达比加群测定试剂盒的校准曲线；

图6为实施例5基于底物为发色底物的达比加群测定试剂盒的线性范围结果；

图7为实施例6基于底物为纤维蛋白原的达比加群测定试剂盒的线性范围结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的试剂盒中含有长链化合物改性凝血酶，改性后凝血酶的肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原的结合位点完全或部分封闭，降低了样本中肝素和或ATIII对凝血酶活力的影响，用于检测作用于凝血酶的抗凝药物，如可用于达比加群及其衍生物的检测。长链化合物改性凝血酶一方面部分或完全封闭了肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原电荷性的特异性结合位点，另一方面长链化合物的分子结构可以产生较大的空间位阻，从而可以抑制肝素、ATIII、纤维蛋白原以及其相关复合物与凝血酶的作用。进一步长链化合物改性凝血酶由于空间位阻效应也抑制蛋白酶、以及凝血酶对自身表面位点的水解能力，从而使得凝血酶可以在水溶液中处于稳定的状态。

实施例1

凝血酶进行表面改性

1、结合位点为氨基

将氨基结合位点的长链化合物与凝血酶按照5:1摩尔比例进行混合，随后在37℃下进行孵育，时间为2小时，即可得到氨基改性的凝血酶。

2、结合位点为羧基

将羧基结合位点的长链化合物与凝血酶按照5:1摩尔比例进行混合，随后在37℃下进行孵育，时间为2小时，即可得到羧基改性的凝血酶。

改性后凝血酶与未改性的凝血酶进行凝胶电泳检测，详细结果如图1，未改性凝血酶的蛋白条带分布峰值对应分子量大约为36KDa，改性后的凝血酶由于每个凝血酶固定的长链化合物数量存在一定差异，因此其蛋白条带较宽，但改性凝血酶蛋白条带分子量明显大于未改性的凝血酶，说明长链化合物成功固定凝血酶上。

同时，对改性后凝血酶蛋白电泳结果进行电泳条带灰度分布峰值分析，根据灰度曲线的最大峰对应的分子量需大于40KDa。如果分子量小于40KDa，在凝血酶上固定的长链化合物数量较少，可能会导致封闭的位点不足以及形成的空间位阻不够，无法有效抑制肝素、ATIII、纤维蛋白原以及其相关复合物与凝血酶的作用，详细结果如图2所示。

与现有技术相比，本实施例长链化合物改性后的凝血酶的肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原的结合位点完全或部分封闭，降低了样本中肝素和/或ATIII对凝血酶活力的影响，可以有效的抑制样本中肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原对作用于凝血酶的抗凝药物检测的干扰，如可用于达比加群及其衍生物的检测。长链化合物改性凝血酶一方面部分或完全封闭了肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原电荷性的特异性结合位点，另一方面长链化合物的分子结构可以产生较大的空间位阻，从而可以抑制肝素、ATIII、纤维蛋白原以及其相关复合物与凝血酶的作用。进一步长链化合物改性凝血酶由于空间位阻效应也抑制蛋白酶、以及凝血酶对自身表面位点的水解能力，从而使得凝血酶可以在水溶液中处于稳定的状态，制备得到的改性凝血酶试剂在溶液状态下存放较长时间依然可以保持较好的性能。

实施例2

一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，包括第一功能试剂和第二功能试剂，稀释液、校准品。

第一功能试剂包含改性后凝血酶。本实施例中改性后凝血酶采用实施例1的方法制备得到，改性后的凝血酶的肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原的结合位点完全或部分封闭。改性后的凝血酶降低了样本中肝素和或ATIII对凝血酶活力的影响。

第二功能试剂包含至少一种凝血酶底物，包括发色底物或纤维蛋白原中的至少一种，其可以与作用于凝血酶的抗凝药物竞争与改性凝血酶结合，并发生酶解反应，生成可被检测的物质。当凝血酶底物为发色底物时，需要特异性选择特殊氨基酸序列的发色底物，当所述抗凝药物为达比加群及其衍生物时，所述发色底物特异性选择氨基酸序列为pyroGlu-Pro-Arg-的短肽与发色基团的组合，所述发色基团包括但不限于硝基苯酚基团、硝基苯胺基团、硝基苯基团中的至少一种，优选发色底物S-2366，用量为2~10mg/mL。当凝血酶底物为纤维蛋白原时用量为4-10g/L，本实施例发现纤维蛋白原用量为6-8g/L时最佳。

本实施例中改性后凝血酶用量可以与校准品中的达比加群最大浓度、第一功能试剂和校准品加入体积建立一个公式：k*V1*C1=V2*C2，其中V1为绘制校准曲线时校准品加入体积，C1为校准品中达比加群的最大浓度，V2为第一功能试剂加入体积，C2为第一功能试剂中改性凝血酶的浓度，k需大于0.04 U·mL^-1/ng·mL^-1。

本实施例中改性后凝血酶用量可以根据上述公式中其他三个参数的实际情况在固定系数k的基础上进行调节。

本实施例中第一功能试剂的pH值的范围为7.0~7.4。

本实施例中凝血酶主要为哺乳动物凝血酶。

与现有抗凝药物检测试剂盒相比，本实施例的第一功能试剂与第二功能试剂的联合使用，可以有效的抑制样本中肝素和或ATIII和或纤维蛋白原含量对作用于凝血酶抗凝药物检测的干扰。检测准确高，重复性好，而且检测步骤简单，有效提高了其检测效率。

实施例3

一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，包括第一功能试剂、第二功能试剂、稀释液和校准品。

其中，第一功能试剂中包括改性凝血酶和含有活性组分的缓冲溶液。活性组分包括盐类保护剂1~20g/L、蛋白类保护剂1~50g/L、糖类保护剂1~50g/L、氨基酸类保护剂5～50g/L、醇类保护剂0.5~10.0g/L、表面活性剂0.5~10.0g/L、防腐剂0.5~5.0mL/L；缓冲液用量为1~30g/L。第一功能试剂的pH为7.0~7.4。

第二功能试剂的凝血酶底物为发色底物为S-2366，用量为2~10mg/mL。

本实施例的凝血酶主要为哺乳动物凝血酶。

本实施例中改性后凝血酶的结合位点为氨基，长链化合物选自分子量大于500的化合物。本实施例的长链化合物优选聚醇类试剂、酰卤类试剂、醛类试剂、卤甲基类试剂、酸酐类试剂、环氧基类试剂，有机酸类试剂中的一种或者多种。长链化合物优选分子量大于1000以上的化合物，包括但不限于聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺中的一种或者多种。所选用氨基结合位点长链化合物的分子量大于500时，可以通过分子间的空间位阻效应有效抑制肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原等物质与凝血酶上相应结合位点进行结合，达到封闭位点的效果。

本实施例中改性后凝血酶的分子量分布峰值需大于40KDa，当分子量较小时，说明凝血酶上结合的长链化合物数量过少，凝血酶上封闭的结合位点也较少，无法达到有效抑制肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原对检测结果的干扰的效果。

本实施例中盐类保护剂为一价金属盐，包括但不限于钠盐、钾盐中的至少一种；蛋白类保护剂包括但不限于白蛋白、牛血清白蛋白中的至少一种；糖类保护剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种；氨基酸类保护剂包括但不限于甘氨酸、精氨酸、赖氨酸中的至少一种；醇类保护剂包括但不限于乙二醇、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种；表面活性剂为非阴离子表面活性剂，包括但不限于吐温-20或TritonX-100中的至少一种；防腐剂组分包括但不限于Proclin300、叠氮钠中至少的一种。

凝血酶底物为发色底物时，需要特异性选择特殊氨基酸序列的发色底物，当所述抗凝药物为达比加群及其衍生物时，所述发色底物特异性选择氨基酸序列为pyroGlu-Pro-Arg-的短肽与发色基团的组合，所述发色基团包括但不限于硝基苯酚基团、硝基苯胺基团、硝基苯基团中的至少一种，优选发色底物S-2366，即pyroGlu-Pro-Arg-PNA以及其不同的成盐形式。本发明中的凝血酶经过长链化合物的改性，此时为了检测抗凝血的抑制活性，需要配合在改性凝血酶的基础上，选择能够与待测物有共同竞争酶的结合位点的底物，并呈现出抑制作用。而凝血酶的底物有多种，如S-2238、S-2846、S-2337、S-2366等，其中S-2366非凝血酶常用底物，比如在专利CN104714036B和专利CN 106568765 B中均选择S-2238作为凝血酶底物。因此，此时使用这种特殊分子结构和序列的底物（S-2366），具备选择结合改性后凝血酶与达比加群共同的结合位点，从而产生竞争抑制作用，最后可以针对不同浓度达比加群的样本产生明显的线性反应趋势，详细结果如图3所示。

本实施例的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂液体形态的，一方面，其相较于冻干粉剂，制备过程简便，成本相对较低，可以有效克服了冻干粉试剂在复溶或冻干过程所带来的缺陷，另一方面，液态试剂可保证所有成份分散的均匀性，保证其在灌装、运输或保存时成分和浓度的稳定，不会导致成份或浓度发生变化，不存在冻干粉制剂存在的如瓶间差等问题。从而有效提高作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂对作用于凝血酶的抗凝药物含量检测的准确性和重复性。

实施例4

一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，包括第一功能试剂、第二功能试剂、稀释液和校准品。

其中，第一功能试剂中包括改性凝血酶和含有活性组分的缓冲溶液。活性组分包括盐类保护剂1~20g/L、蛋白类保护剂1~50g/L、糖类保护剂1~50g/L、氨基酸类保护剂5～50g/L、醇类保护剂0.5~10.0g/L、表面活性剂0.5~10.0g/L、防腐剂0.5~5.0mL/L；缓冲液用量为1~30g/L。

第二功能试剂的凝血酶底物为纤维蛋白原，纤维蛋白原用量为4-10g/L，优选6-8g/L。

本实施例的凝血酶主要为哺乳动物凝血酶。

本实施例中改性后凝血酶的结合位点为羧基，长链化合物选自分子量大于500且富含亲水基团或负电荷基团的化合物。长链化合物优选氨基酸类试剂、聚醇类试剂中的一种或者多种。

本实施例中盐类保护剂为一价金属盐，包括但不限于钠盐、钾盐中的至少一种；蛋白类保护剂包括但不限于白蛋白、牛血清白蛋白中的至少一种；糖类保护剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种；氨基酸类保护剂包括但不限于甘氨酸、精氨酸、赖氨酸中的至少一种；醇类保护剂包括但不限于乙二醇、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种；表面活性剂为非阴离子表面活性剂，包括但不限于吐温-20或TritonX-100中的至少一种；防腐剂组分包括但不限于Proclin300、叠氮钠中至少的一种。

本实施例中当纤维蛋白原浓度较高，比如超过10g/L时，纤维蛋白原在保存溶液中的溶解状态无法受控，同时试剂成本也会相应过高。当纤维蛋白原浓度较低，比如低于4g/L时，即使调整样本和纤维蛋白原试剂在反应体系中的加入量比例，最终反应液中的添加的纤维蛋白原含量较低，极大地延长检测时间，因此，需要控制纤维蛋白原加入量。

常规基于凝固法检测达比加群的试剂盒，通过样本中含有的纤维蛋白原作为凝固实验的基础，其含量差异对最终的凝固时间存在一定的影响。而本发明开发的试剂盒可以通过改性凝血酶和增加纤维蛋白原试剂的两种方式避免样本中纤维蛋白原的差异对结果的影响，一方面通过凝血酶改性的方式降低纤维蛋白原对凝血酶的敏感性，从而纤维蛋白原在一定浓度范围内变化对凝血酶的影响无明显影响；另一方面，在反应体系中固定加入一定含量的纤维蛋白原，再通过调整样本的加入量，可以将最终反应体系中纤维蛋白原的含量固定在一定可控的范围内，从而降低其含量差异对结果的影响。因此，本发明开发的试剂盒可以有效避免样本中纤维蛋白原含量差异对最终的检测结果的影响，详细结果如表6所示。

实施例5

本发明实施例提供了一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒。本实施例的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒包括第一功能试剂、第二功能试剂、稀释液和校准品。

其中，第一功能试剂包含氨基结合位点改性凝血酶，其中改性后的凝血酶含量为20U/mL，第一功能试剂的pH为7.2。第一功能试剂中还包括含有活性组分的缓冲溶液。活性组分包括盐类保护剂1~20g/L、蛋白类保护剂1~50g/L、糖类保护剂1~50g/L、氨基酸类保护剂5～50g/L、醇类保护剂0.5~10.0g/L、表面活性剂0.5~10.0g/L、防腐剂0.5~5.0mL/L；缓冲液用量为1~30g/L。

第二功能试剂包含发色底物S-2366，终浓度4mg/mL。

本实施例作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒用于测定样本中达比加群的含量。具体检测方法包括如下步骤：

1、校准曲线制作：

（1）取浓度为600ng/ml的达比加群校准品，在仪器上设置不同稀释比例，配制成600、400、200、100、50、25、0ng/ml的校准品样本。

（2）取稀释后的校准品99μL并分别加入20μL所述底物试剂后进行混合均匀，分别37℃孵育20s；

（3）孵育后分别加入20μL的所述凝血酶试剂进行检测，检测时间为80s；

（4）对孵育处理后的校准品样本分别采用YX-3000 凝血仪进行检测，将OD405吸光度变化率与达比加群浓度进行建立线性方程做出校准曲线；根据达比加群标准液梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制校准曲线，校准曲线请见图4。

2、血液样本中达比加群的浓度检测：

（1）取稀释后的血液样本99μL并加入20μL所述发色底物试剂并混合均匀，37℃孵育20s；

（2）孵育后加入20μL的所述凝血酶试剂进行检测，检测时间为80s；

（3）对孵育处理后的血液样本采用YX-3000凝血仪进行检测，获得吸光值，根据步骤S1中绘制的所述校准曲线获得所述血液样本达比加群的浓度。

实施例6

本实施例的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒包括第一功能试剂、第二功能试剂、稀释液和校准品。

第一功能试剂包含氨基结合位点改性凝血酶，其中改性后的凝血酶含量为30U/mL，第一功能试剂的pH为7.2。第一功能试剂中还包括含有活性组分的缓冲溶液。活性组分包括盐类保护剂1~20g/L、蛋白类保护剂1~50g/L、糖类保护剂1~50g/L、氨基酸类保护剂5～50g/L、醇类保护剂0.5~10.0g/L、表面活性剂0.5~10.0g/L、防腐剂0.5~5.0mL/L；缓冲液用量为1~30g/L。

第二功能试剂包含纤维蛋白原，其中纤维蛋白原终浓度为6g/L。

本实施例宽范围的抑制凝血酶通路的药物检测试剂盒的试剂盒用于测定样本中达比加群的含量。具体检测方法包括如下步骤：

1、校准曲线制作：

（1）取浓度为600ng/ml的达比加群校准品，在仪器上设置不同稀释比例，配制成600、400、200、100、50、25、0ng/ml的校准品样本。

（2）取稀释后的校准品99μL并分别加入20μL所述纤维蛋白原试剂后进行混合均匀，分别37℃孵育40s；

（3）孵育后分别加入20μL的所述凝血酶试剂进行检测，检测时间为600s；

（4）对孵育处理后的校准品样本分别采用YX-3000 凝血仪进行检测，将凝固时间进行求对数处理，其对数值与达比加群浓度进行建立线性方程做出校准曲线；根据达比加群标准液梯度浓度与所凝固时间的对数值，采用线性方程绘制校准曲线，校准曲线请见图5。

2、血液样本中达比加群的浓度检测：

（1）取稀释后的血液样本99μL并加入20μL所述纤维蛋白原试剂并混合均匀，37℃孵育40s；

（2）孵育后加入20μL的所述凝血酶试剂进行检测，检测时间为600s；

（3）对孵育处理后的血液样本采用YX-3000凝血仪进行检测，获得凝固时间，根据步骤S1中绘制的所述校准曲线获得所述血液样本达比加群的浓度。

实验测试

1、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒不同分子量改性凝血酶抗ATIII干扰研究

按照实施例5中的凝血酶试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，其中，改性凝血酶分别通过加入不同的长链化合物的量制备蛋白条带的灰度分布峰值对应的不同分子量的改性凝血酶（蛋白条带灰度分布峰值对应分子量分别约为36KDa，38KDa，40KDa，42KDa和44KDa）。在YX-3000凝血仪绘制校准曲线后，选择100ng/ml左右浓度达比加群血浆样本且含有106%ATIII活性的干扰样本进行达比加群的测定，重复测试2次，计算含有106%ATIII活性干扰样本的测试结果与标准加入浓度之间的相对偏差，并根据改性凝血酶的分子量与相对偏差进行结果分析。结果如图2所示，发现随着改性凝血酶的蛋白条带的灰度分布峰值对应分子量的增大，相对偏差越小，在分子量约为40KDa时，根据相关曲线上对应的相对偏差在10%左右，因此，为了更好抗ATIII的干扰，改性凝血酶蛋白条带的灰度分布峰值对应分子量需大于40KDa。

2、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒发色底物特异性研究

按照实施例5中的凝血酶试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，其中，底物试剂分别使用S-2366、S-2238、S-2846、S-2337进行配制。随后取浓度为500ng/ml左右的达比加群样本，用稀释液按照按照不同比例配制成500、400、200、100、50、25ng/ml的样本，用YX-3000凝血仪检测2次，取平均值做反应曲线。结果发现，发色底物为S-2366时，其仪器上检测的反应度与达比加群浓度有明显的线性关系，呈负相关性。而发色底物为S-2238、S-2846、S-2337时，仪器上检测的反应度基本一致，不会随着达比加群浓度变化而变化。对比结果如图3所示。

3、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的线性范围检测

分别实施例5-6提供的检测试剂盒，按照上述描述的检测步骤，取浓度为500ng/ml左右的达比加群样本，在仪器上设置不同稀释比例，配制成500、400、200、100、50、25ng/ml的样本，用YX-3000凝血仪检测三次，取平均值做线性回归曲线，要求在25-500ng/ml线性范围内有较好的线性关系。经检测，利用上文实施例5-6提供的检测试剂盒所做线性回归曲线的线性关系关系好，其中，实施例5提供的检测试剂盒的线性结果如图6所示，其线性相关系数r=0.9972，满足检测达比加群含量的要求，实施例6提供的检测试剂盒的线性结果如图7所示，其线性相关系数r=0.9957，满足检测达比加群含量的要求。

4、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒重复性结果考察

分别采用上文实施例5-6提供的检测试剂盒，按照上述描述的检测步骤，选择50ng/ml和100ng/ml两种浓度达比加群血浆样本进行达比加群的测定，重复测试10次，计算变异系数，变异系数在±10%以内视为重复性较好。结果如下表所示，基于两个实施例制备的试剂盒，其在50ng/ml和100ng/ml两种浓度达比加群血浆样本变异系数分别为2.09%和1.98%以及3.91%和2.74%，均在5%以内，说明重复性较好。

表1达比加群试剂盒重复性结果

5、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒抗肝素干扰结果考察

按照实施例5中的凝血酶试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，其中，凝血酶试剂分别使用未改性凝血酶和改性凝血酶进行配制。选择50ng/ml和100ng/ml两种浓度达比加群血浆样本，分别添加不同浓度的普通肝素（0，0.5，1IU/mL）和不同浓度的低分子肝素（0，1，2IU/mL）配制干扰样本，随后进行达比加群的测定，重复测试2次，计算不同浓度肝素的干扰样本的测试结果与不添加肝素样本测试结果之间的相对偏差，相对偏差需在±10%以内。结果如下表所示，基于改性凝血酶的试剂盒在检测普通肝素或低分子肝素干扰样本时，相对偏差均在10%以内，而使用未改性凝血酶的试剂盒，在普通肝素含量超过0.5IU/mL或低分子肝素含量超过1IU/mL时，相对偏差已经超过10%，说明本发明使用改性凝血酶开发的试剂盒在普通肝素浓度1IU/mL或低分子肝素含量2IU/mL内具有抗干扰能力。

表2 达比加群试剂盒抗普通肝素干扰验证结果

表 3达比加群试剂盒抗低分子肝素干扰验证结果

6、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒抗ATIII干扰结果考察

按照实施例5中的凝血酶试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，其中，凝血酶试剂分别使用未改性凝血酶和改性凝血酶进行配制。选择1000ng/ml浓度达比加群母液，分别与含有不同活性的ATIII样本（25.2%，50.5%，101%，151.5%）按照固定比例（1:19）配制干扰样本，随后进行达比加群的测定，重复测试2次，计算不同活性ATIII的干扰样本的测试结果与空白样本（不含ATIII的稀释液与达比加群母液混合制备的样本）测试结果之间的相对偏差，相对偏差需在±15%以内。结果如下表4所示，基于改性凝血酶的试剂盒在检测肝素干扰样本时，相对偏差均在15%以内，而使用未改性凝血酶的试剂盒，在普通肝素含量超过ATIII活性超过50.5%时，相对偏差已经超过15%，说明本发明使用改性凝血酶开发的试剂盒在ATIII活性150%内具有抗干扰能力。

表4不同活性ATIII的干扰样本的测试结果

7、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒37℃加速稳定性考察

按照实施例5中的凝血酶试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，随后，将上述试剂在37℃环境下分别放置不同时间（0,7,14,21,28天）。在第0天时，进行校准曲线绘制，随后选择50ng/ml和100ng/ml两种浓度达比加群血浆样本，分别在不同时间节点进行达比加群的测定，重复测试2次，计算不同时间节点的测试结果与第0天测试结果之间的相对偏差，相对偏差需在±10%以内。结果如下表所示，试剂在37℃加速28天后，相对偏差均在10%以内，说明本发明的试剂盒加速稳定性较好。

表 5达比加群试剂盒加速稳定性验证结果

8、作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒抗纤维蛋白原干扰结果考察

按照实施例6中的凝血酶试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备。选择50ng/ml和100ng/ml两种浓度达比加群血浆样本，分别添加不同浓度的纤维蛋白原（0，2，4，6，8g/L）配制干扰样本，随后进行达比加群的测定，重复测试2次，计算不同浓度纤维蛋白原的干扰样本的测试结果与不添加纤维蛋白原样本测试结果之间的相对偏差，相对偏差需在±10%以内。结果如下表所示，基于本发明开发的试剂盒在检测纤维蛋白原干扰样本时，相对偏差均在10%以内，说明本发明开发的试剂盒在纤维蛋白原浓度8g/L内具有抗干扰能力。

表6达比加群试剂盒抗纤维蛋白原干扰验证结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，包括第一功能试剂和第二功能试剂；

所述第一功能试剂包含长链化合物改性凝血酶；所述长链化合物改性凝血酶的肝素和/或ATIII和/或纤维蛋白原的结合位点完全或部分封闭；所述长链化合物改性凝血酶表现出对肝素和/或ATIII浓度或活性变化的不敏感性；

所述第二功能试剂包含至少一种凝血酶底物；所述凝血酶底物可以与作用于凝血酶的抗凝药物竞争结合所述长链化合物改性凝血酶。

2.如权利要求1所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，所述长链化合物改性凝血酶通过长链化合物共价结合于凝血酶制备得到。

3.如权利要求2所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，当待改性的凝血酶与长链化合物的结合位点为氨基时，所述长链化合物包括分子量大于500的聚醇类试剂、酰卤类试剂、醛类试剂、卤甲基类试剂、酸酐类试剂、环氧基类试剂、有机酸类试剂中的一种或者多种；或当待改性的凝血酶与长链化合物的结合位点为羧基时，所述长链化合物包括分子量大于500且富含亲水基团或负电荷基团的氨基酸类试剂、聚醇类试剂中的一种或者多种。

4.权利要求1所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，所述长链化合物改性凝血酶的蛋白条带灰度分布峰值对应的分子量需大于40KDa。

5.如权利要求1所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，所述第一功能试剂还至少包括含有活性组分的缓冲溶液；和/或所述活性组分包括盐类保护剂、蛋白类保护剂、糖类保护剂、氨基酸类保护剂、醇类保护剂、表面活性剂以及防腐剂中的至少一种。

6.如权利要求1所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，所述凝血酶底物包括发色底物或纤维蛋白原中的至少一种。

7.如权利要求6所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，所述凝血酶底物为发色底物时，需要特异性选择特殊氨基酸序列的发色底物；和/或当所述抗凝药物为达比加群及其衍生物时，所述发色底物特异性选择氨基酸序列为pyroGlu-Pro-Arg-的短肽与发色基团的组合。

8.如权利要求1所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，其特征在于，所述作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒还包括稀释液、校准品。

9.权利要求8所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒，所述长链化合物改性凝血酶的用量可以与校准品中的达比加群最大浓度、第一功能试剂及校准品加入体积建立如下公式：

k*V1*C1=V2*C2，

其中V1为绘制校准曲线时校准品加入体积，C1为校准品中达比加群的最大浓度，V2为所述第一功能试剂加入体积，C2为所述第一功能试剂中所述长链化合物改性凝血酶的浓度，k为固定系数，需大于0.04 U·mL^-1/ng·mL^-1。

10.如权利要求1-9任一项所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：分别配置第一功能试剂和第二功能试剂，分别密封包装。

11.如权利要求1-9任一项所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过样本和稀释液混合配制待测样品溶液，随后在所述待测样品溶液中加入第一功能试剂和第二功能试剂继续进行混合得到最终反应溶液并进行反应；

通过检测反应后生成物质的情况，判断作用于凝血酶的抗凝药物的含量。

12.如权利要求11所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述样本与最终反应溶液的体积比例需小于1:6。

13.如权利要求1-9任一项所述的作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒的应用，其特征在于，用于检测作用于凝血酶的抗凝药物。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，用于达比加群及其衍生物的检测。

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