CN113025685A

CN113025685A - 一种测定凝血因子xiii活性的方法及其在猪血制品检测中的应用

Info

Publication number: CN113025685A
Application number: CN202110321560.7A
Authority: CN
Inventors: 余美伦; 朱佳伟; 秦香芹; 赵丽; 李常禄; 宫佳欣; 范宝祥; 孟庆雪; 王宁; 耿东涛; 王磊; 何佳; 陈威威; 赵君
Original assignee: Harbin Hanbang Medical Science And Technology Co ltd
Current assignee: Harbin Hanbang Medical Science And Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2021-06-25

Abstract

本发明提供了一种测定凝血因子XIII活性的方法及其在猪血制品检测中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供的检测凝血因子XIII活性的方法，稳定性和专属性好、特异性强、准确度高、精密度高、重复性好、准确度误差RSD均小于8％，参考品线性范围内R²大于0.98。该方法避免凝块法人为因素干扰，同时该方法能够适用于猪源血液FXIII活性检测。

Description

一种测定凝血因子XIII活性的方法及其在猪血制品检测中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种测定凝血因子XIII活性的方法及其在猪血制品检测中的应用。

背景技术

纤维蛋白粘合剂是一种外科用止血剂，主要成分为纤维蛋白原和凝血酶，对渗血和细小静脉性出血有独到的止血功效，除此之外，还具有组织封闭、促进创伤愈合等作用，自1972年欧盟批准上市以来，一直在全球外科领域广泛使用。使用时，凝血酶激活纤维蛋白原，纤维蛋白单体生成；单体以非共价键结合；凝血酶继续对FXIII激活，相邻的纤维蛋白快速共价交联，形成纤维蛋白网络，发挥作用。纤维蛋白粘合剂还可以用作药物缓释载体等。

凝血因子XIII(FXIII)在纤维蛋白粘合剂中起到重要作用，是在凝血级联反应中末端酶，催化纤维蛋白α和β链的交联，以稳定纤维蛋白，使得纤维蛋白凝胶更加具有弹性和抗纤维蛋白溶解。FXIII是存在于血浆中的一种糖蛋白，是2个A亚单位和2个B亚单位通过强非共价相互作用保持在一起的聚合物，分子量320kDa，在血浆中大概含量为21.6μg/ml，与纤维蛋白原非共价键结合；FXIIIa是731个氨基酸组成的多肽，分子量83136； FXIIIb是641个氨基酸组成的多肽，分子量73107。A亚单位包含催化区， B亚单位充当载体和调节蛋白的作用。

FXIII是一种重要的酶原，即转谷氨酰胺酶原，在Ca²⁺存在时被凝血酶激活。其主要功能是在止血过程中保持凝块的稳定性。活化的FXIIIa在凝血过程中促进纤维蛋白的交联，并且是从生理学上保护凝块免于溶解。它是一种转谷氨酰胺酶，交联催化纤维蛋白α和β链的谷氨酰胺和赖氨酸残基，以稳定纤维蛋白，使得纤维蛋白凝块更加具有强度和稳定性，不再溶于单氯乙酸。FXIIIa可将α2-纤溶酶抑制物交联到纤维蛋白的α链上，以保护纤溶酶对凝块蛋白的降解。交联的纤维蛋白是凝血瀑布的最终结果，为原发的止血血小板栓提供抗张强度。

FXIII对于血液凝固和维持凝块稳定性有着重要的作用，因此药品监督管理部门对各类型纤维蛋白粘合剂中FXIII含量十分关注。目前FXIII的活性检测方法为凝块法，其原理为FXIII在Ca²⁺的作用下得到活化的FXIIIa，活化的FXIIIa在凝血过程中促进纤维蛋白的交联，并且是从生理学上保护凝块免于溶解。通过对比不同稀释度的标准血浆和样品在相同条件下凝块的大小，即可间接判断FXIII的活性。这种方法广泛应用于血液制品和临床样品FXIII活性检测，但并没有针对猪源FXIII检测进行优化，因此存在很多应用问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定凝血因子XIII活性的方法及其在猪血制品检测中的应用，本发明的方法旨在解决现有技术中FXIII活性检测方法存在的问题与不足，提供一种简便、准确、高效地测定FXIII活性(尤其是猪源FXIII)的检测方法，所述方法专属性强、准确度好、精密度高。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一种测定凝血因子XIII活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)添加包含凝血酶、Ca²⁺和抑制肽在内的激活试剂；

(b)添加包含带有酰胺基侧链的氨基酸衍生物、多肽底物、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和α-酮戊二酸的检测试剂；

(c)测定所述还原型辅酶转变为氧化型辅酶而引起的吸光度的降低速率；以及

(d)使用标准血浆按上述步骤(a)-(c)进行测定并制定标准曲线，根据步骤(a)-(c)测定待测样品的吸光度的降低速率并根据标准曲线计算待测样品FXIII相对于标准血浆FXIII的相对活性。

在血液或者血液制品中，FXIII以酶原形式存在，人为添加凝血酶和 Ca²⁺可以激活FXIII形成FXIIIa，同时添加多肽抑制底物(抑制肽)可以用于抑制纤维蛋白胶体形成，避免干扰FXIII活性检测。

在FXIIIa的作用下，带有酰胺基侧链的氨基酸衍生物和多肽底物结合并释放氨气。氨气在谷氨酸脱氢酶和还原型辅酶共同作用下被α-酮戊二酸吸收，还原型辅酶则变为氧化型；还原型辅酶变为氧化型辅酶后可引起吸光度的降低，在一定时间范围内吸光度降低与酶活性呈反比，与FXIII活性成正比。

通过将待测样品中吸光度的降低速率与标准曲线进行比较，可以得出待测样品相对于标准血浆FXIII的相对活性。

在一个实施方案中，所述抑制肽为纤维蛋白原凝集抑制剂，包括肝素、水蛭素或其他天然或合成的血液抗凝剂；优选的采用 Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-NH₂；所述多肽底物为Leu-Gly-Pro-Gly-Glu-Ser-Lys-Val-Ile-Gly-NH₂；

所述带有酰胺基侧链的氨基酸衍生物为甘氨酸有机物；优选地，所述甘氨酸有机物为甘氨酸乙酯；

所述还原型辅酶选自还原型辅酶I、还原型辅酶II或硫代辅酶I；优选地，所述还原型辅酶为还原型辅酶I。

在一个实施方案中，所述激活试剂中还包含缓冲液；优选地，所述缓冲液为N,N-二羟乙基甘氨酸。

为了保证结果的准确和可重复性好，本发明对于上述方法中试剂的选择类型以及试剂的使用浓度进行了充分的摸索和优化。在本发明中，所述凝血酶的浓度为10-20IU/ml，所述Ca²⁺(氯化钙)的浓度为1.2mg/ml-2.0 mg/ml；所述抑制肽的浓度为2mg/ml-4mg/ml；所述多肽底物的浓度为2.4 mg/ml-4.0mg/ml；所述带有酰胺基侧链的氨基酸衍生物的浓度为1.4 mg/ml-4.0mg/ml；所述α-酮戊二酸的浓度为2.7mg/ml-3.0mg/ml；所述谷氨酸脱氢酶的浓度为250IU/ml-300IU/ml。

在一个实施方案中，所述检测试剂还包含稳定剂，所述稳定剂为ADP；优选地，所述检测试剂包含0.5μg/ml-1μg/ml ADP。

在一个优选的实施方案中，加入0.5μg/mlADP。当加入0.5μg/mlADP 检测剂后可明显改善样品检测的稳定性。

在一个实施方案中，所述标准血浆或待测样品、激活试剂和检测试剂的添加体积比为(0.2-0.5)：(0.6-0.8)：(1-1.2)，优选0.2：0.8：1。

当以凝血酶、氯化钙、抑制肽作为激活试剂，NADH(NADPH)、谷氨酸脱氢酶、多肽底物、甘氨酸乙酯和α-酮戊二酸作为检测试剂，按标准血浆或待测样品、激活试剂和检测试剂的添加体积比为0.2：0.8：1配制，结果的准确性更好并且结果具有可重复性。

在一个实施方案中，所述激活试剂与所述检测试剂在使用前在37℃±2 ℃条件下预热10min以上。当不在不在37℃进行试剂预热和反应，对同一样品检测结果不稳定，重复性差。因此，优选地，本方法中的所有检测试剂，甚至包括耗材均需在37℃预热10min以上。

在一个实施方案中，所述激活试剂加入后激活120s以上，然后加入所述检测试剂。发明人在研究中发现，低于100s的激活时间，会使得回收率答复降低，因此，样品中加入激活剂后保持至少120s即可完全激活FXIII 活性。在加入激活剂后至少120s才能够进行后续检测实验。

在一个实施方案中，所述方法的检测窗口期为加入检测试剂后 200s-500s的范围内。当加入检测试剂后160s-600s左右时吸光度下降呈线性趋势关系，因此检测方法中将加入检测剂后200s-500s作为检测窗口进行检测。本发明的检测方法特别适用于猪源血液FXIII活性检测。

在另一方面，本发明提供了所述方法在猪血制品检测中的应用。

有益效果：

(1)本发明提供了一种能够简便、准确、高效地评价血液或血液提取物中FXIII活性的检测方法，该方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确度、精密度(包括重复性、人员操作误差)等方面的要求，该方法对于猪源纤维蛋白粘合剂的质量检测和控制有着重要意义。

(2)本发明采用酶标仪检测FXIII活性，方法稳定专属性好、特异性强、准确度高、精密度高、重复性、准确度误差RSD均小于8％，参考品线性范围内R²大于0.98。

(3)本发明的方法能够避免凝块法人为因素干扰，同时该方法能够适用于猪源血液FXIII活性检测，这对于猪血液药物开发中FXIII活性研究，产品质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的吸光率降低速率测定曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

一、材料和试剂

下列实施例涉及到的材料和试剂：

材料：标准血浆(自制猪标准血浆)，纤维蛋白冻干粉(自制)，凝血酶冻干粉(自制)。

试剂：氯化钙、还原型辅酶I、纤维蛋白聚集抑制肽、N,N-二羟乙基甘氨酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成底物、甘氨酸乙酯、α-酮戊二酸和ADP 均为市售常规产品，可以通过常规商业途径购买获得。

二、检测方法的建立

1)检测试剂的选择

FXIII活性检测方法主要反应式如下：

FXIII(在凝血酶、Ca²⁺作用下)→FXIIIa

多肽底物+含甘氨酸有机物(在FXIIIa作用下)→多肽底物-甘氨酸 +NH₄ ⁺

NH₄ ⁺+α-酮戊二酸+NADPH(NADH)(经谷氨酸脱氢酶作用)→NADP (NAD)+谷氨酸+H₂O。

本发明检测方法采用的试剂如下：

①FXIII激活剂：凝血酶、氯化钙

②纤维蛋白原凝集抑制剂：Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-NH₂

③多肽底物：Leu-Gly-Pro-Gly-Glu-Ser-Lys-Val-Ile-Gly-NH₂

④甘氨酸有机物：甘氨酸乙酯

⑤其他关键试剂：α-酮戊二酸、NADH(NADPH)、谷氨酸脱氢酶

⑥缓冲体系：50mM N,N-二羟乙基甘氨酸(pH8.3)

2)检测方法的建立

A)基础反应液浓度

方法建立过程中均按下表标注浓度进行检测：

试剂	浓度
		凝血酶	10IU/ml
氯化钙	2mg/ml
		抑制肽	2mg/ml
多肽底物	2mg/ml
		甘氨酸乙酯	1mg/ml
α-酮戊二酸	1.5mg/ml
		NADH(NADPH)	150mM
谷氨酸脱氢酶	150IU/ml

因反应分为2步酶催化过程，涉及到氨基的释放和吸收，为保证结果准确和可重复，本检测方法将上述试剂分为2部分，分别进行氨释放和氨吸收反应过程。其中凝血酶、氯化钙、抑制肽作为激活试剂，NADH(NADPH)、谷氨酸脱氢酶、多肽底物、甘氨酸乙酯和α-酮戊二酸作为检测试剂，分别以2倍浓度进行配置，最终按待检品：激活剂：检测剂体积比＝0.2:0.8:1进行配制检测。

辅酶I和辅酶II的选择：分别采用相同浓度的NADH和NADPH按上述列表进行样品检测，对比检测结果选择合适的反应物。检测结果显示，二者无显著差异，因NADH的价格比NADPH价格低很多，因此本实验中采用NADH作为反应试剂。

B)试剂浓度的调整与优化

为使检测实验能够真实准确，需对主要使用的试剂进行优化。以不同的浓度水平进行摸索和调整，分别进行标曲实验和加样回收实验，以标曲 R²和回收率作为评判标准对各组分浓度进行优化，结果见下表：

实验发现：

①凝血酶：由于5IU/ml激活效果不好造成回收率和线性关系均未达到要求，而10-20IU/ml均符合要求，因此暂定凝血酶浓度为10IU/ml；

②氯化钙：1.2mg/ml-2.0mg/ml均符合标准，因此暂定氯化钙浓度为 1.2mg/ml；

③抑制肽：1mg/ml时在激活剂和检测剂混合后发生凝集现象，2 mg/ml-4mg/ml均符合要求，暂定抑制肽浓度为2mg/ml；

④多肽底物：2.4mg/ml-4.0mg/ml均符合要求，暂定多肽底物浓度为 2.4mg/ml；

⑤甘氨酸乙酯：1.4mg/ml-4.0mg/ml均符合要求，暂定多肽底物浓度为 1.4mg/ml；

⑥α-酮戊二酸：2.4mg/ml时线性关系不符合要求，2.7mg/ml-3.0mg/ml 均符合要求，暂定α-酮戊二酸浓度为2.7mg/ml；

⑦NADH：当NADH浓度为250mM与200mM时线性关系均不合格， 300mM时线性关系和回收率均符合要求，因此暂定NADH浓度为300mM；

⑧谷氨酸脱氢酶：200IU/ml时线性关系与回收率均不符合要求，250 IU/ml-300IU/ml可以符合实验要求，因此暂定谷氨酸脱氢酶浓度为250 IU/ml。

终上所述，确定本检测方法试剂配制如下：

(1)激活试剂配制：取适量氯化钙、还原型辅酶I、纤维蛋白聚集抑制肽、100IU/ml凝血酶标准品、N,N-二羟乙基甘氨酸，以样品稀释液配制成含有300mM NADH、10IU/ml凝血酶、2mg/ml纤维蛋白聚集抑制肽、 1.2mg/ml钙离子、100mM N,N-二羟乙基甘氨酸(pH8.3)的溶液。

(2)检测试剂：取适量谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成底物、甘氨酸乙酯、α-酮戊二酸、ADP，用水溶解后配制成含有250IU/ml谷氨酸脱氢酶、 2.4mg/ml谷氨酰胺合成底物、1.4mg/ml甘氨酸乙酯、2.7mg/mlα-酮戊二酸、 0.5μg/mlADP的水溶液。

C)检测条件建立

①孵育温度

实验中发现，没有在37℃进行试剂预热和反应的情况下，对同一样品检测结果不稳定，重复性差，但当所使用试剂盒耗材均进行足够长时间的 37℃预热后重复性和检测结果均达到预期，因此本实验中所有检测试剂和耗材均需在37℃预热10min以上。

②激活时间

实验发现，样品中加入激活剂后120s即可完全激活FXIII活性，低于 100s回收率仅为74.3％，因此本检测方法中样品加入激活剂后需激活至少 120s才能够进行后续检测实验。

③检测窗口

由于FXIII检测方法为酶催化氨释放和吸收方法，通过吸光率的降低速率制定标准曲线和检测样品，因此存在检测窗口期，经实验发现吸光率的降低速率如附图1所示。

实验表明，当加入检测试剂后160s-600s左右时吸光度下降呈线性趋势关系，因此本检测方法中将加入检测剂后200s-500s作为检测窗口进行检测。

④稳定剂

实验中发现当检测剂加入0.5μg/mlADP后可明显改善样品检测的稳定性，因此本方法中将检测剂中加入0.5μg/mlADP作为稳定剂。

三、方法实施过程

1.供试品溶液配置

①取2.0ml规格纤维蛋白原冻干粉针2支，分别用3.0ml水完全复溶后，各取250μl置于10ml容量瓶中，以样品稀释液定容至刻度，混匀后即为2mg/ml样品，样品配制时应保持液体温度一直处于37℃左右。

②取1支2.0ml规格凝血酶标准品，以2.0ml水复溶后，用样品稀释液将凝血酶标准品稀释至约100IU/ml备用。

③取自制标准猪血浆1ml，按下表制备标准品溶液：

比例	100％	50％	25％	12.5％	0％
						标准猪血浆	500μl	250μl	125μl	62μl	0μl
样品稀释液	0μl	250μl	375μl	438μl	500μl

2.检测试剂溶液配置

①样品稀释液配制：取5ml 20％人血白蛋白，0.9g氯化钠置于100ml 容量瓶中，以水定容至刻度即为样品稀释液。

②激活试剂配制：取适量氯化钙、纤维蛋白聚集抑制肽、100IU/ml凝血酶标准品、N,N-二羟乙基甘氨酸，以样品稀释液配制成含有10IU/ml凝血酶、2mg/ml纤维蛋白聚集抑制肽、1.2mg/ml钙离子、100mM N,N-二羟乙基甘氨酸(pH8.3)的溶液。

③检测试剂：取适量谷氨酸脱氢酶、NADH、谷氨酰胺合成底物、甘氨酸乙酯、α-酮戊二酸、ADP，用水溶解后配制成含有300mM NADH、 250IU/ml谷氨酸脱氢酶、2.4mg/ml谷氨酰胺合成底物、1.4mg/ml甘氨酸乙酯、2.7mg/mlα-酮戊二酸、0.5μg/mlADP的水溶液。

3.样品检验

取上述供试品溶液或标准品溶液20μl置于酶标仪检测板孔中，加入 20μl生理盐水，加入80μl已在37℃事先预热好的激活试剂，在37℃孵育 120s，加入37℃预热的检测试剂100μl，吹打震荡混匀后继续孵育在37℃环境中。在以加入检测试剂开始计算，在340nm下测量200s至500s间各孔OD值下降速率，以OD/min表示。

4.含量计算

以标准猪血浆各稀释度为x轴，以OD值下降平均速率为y轴制定标准曲线，根据标准曲线以样品OD值下降速率计算待测样品FXIII活性与标准猪血浆的相对比率，乘以稀释倍数即为样品FXIII活性相对值，表示样品 FXIII活性是标准猪血浆的x倍，简写为x。

实施例1.氨释放法检测纤维蛋白原冻干产物中FXIII活性

以冻干纤维蛋白原参考品和供试品为材料，采用上述检测方法检测考察供试品相对参考品的生物学活性。

实验结果如表1所示，以标准品配置的不同浓度标准样品检验结果曲线拟合情况良好，曲线拟合常数R²均满足＞0.99，样品含量检验重复性RSD 为2.32％。

表1：标准品线性关系及样品检验重复性

实施例2、氨释放法FXIII活性检测方法的方法验证

(1)样品稀释液的选择：

1)实验方法：

取120mg/支纤维蛋白原冻干粉针作为对照品，分别以水、生理盐水、含1％人血白蛋白的生理盐水和含5％人血白蛋白的生理盐水分别溶解，用标准猪血浆作为标准品，用氨释放法进行检测，计算FXIII活性的RSD。

2)结果判定：RSD应小于5％。

3)实验结果：经计算，含有1％人血白蛋白和5％人血白蛋白的生理盐水符合标准，因此应采用大于1％白蛋白含量的生理盐水作为样品稀释液。

表2、系统适用性结果

(2)专属性：

1)实验方法：

空白基质：取纤维蛋白原原液相关辅料，按原液配制方法配制空白基质；

抗凝剂：取上述空白基质加入枸橼酸钠抗凝剂；

样品稀释液：按上述样品稀释方法制备样品稀释液；

分别以空白基质和抗凝剂代替生理盐水对标准猪血浆进行稀释，按检测方法进行检测并绘制标准曲线，同时用空白基质和抗凝剂替代生理盐水制备1％人血白蛋白样品稀释液并以此对样品进行稀释，对此样品进行检测。

2)结果判定：空白基质和抗凝剂制备的标准曲线符合要求，并且空白基质和抗凝剂稀释的样品检测值与样品检测值间P≤0.05，各样品RSD＜5％。

3)实验结果：

表3.干扰物标准曲线

稀释倍数	空白基质(OD/min)	抗凝剂(OD/min)	生理盐水(OD/min)
				0	0.001	0.001	0.001
12.5％	0.005	0.006	0.006
				25％	0.01	0.013	0.011
50％	0.022	0.02	0.021
				100％	0.037	0.037	0.037
R<sup>2</sup>	0.9911	0.9924	0.9966

表4.干扰物对样品检测影响

经计算，标曲R²符合要求，各组数据RSD均小于5％，与样品相比P 均小于0.05，符合要求。

(3)标准曲线：

1)实验方法：按上述标曲检测和绘制方法进行3次重复试验。

2)结果判定：每次实验以峰面积及含量进行线性拟合，R2应大于0.98。

3)实验结果：

表5.低浓度条件下线性关系

由上表可知，该方法能成良好的线性关系。

(4)定量限：

1)实验方法：取标准猪血浆，以样品稀释液进行稀释，按检测方法进行检测，直至吸光度变化趋近于0.001。

2)结果判定：吸光度变化值趋近于0.001

3)实验结果：当标准猪血浆稀释至10％时，吸光度变化为0.014，当稀释至5％时吸光度变化趋近于0.001，因此定量限为0.1

(5)定量限重复性：

1)实验方法：取标准猪血浆，以样品稀释液稀释10倍，平行制备6 个样品，以上述检测方法进行检测。

2)结果判定：6个样品FXIII活性的RSD应小于10％。

3)实验结果：6个样品峰面积的RSD为8.25％，小于10％，所以判定定量限的重复性合格。

(6)重复性：

1)实验方法：按上述样品制备方法，使用同一批次样品制备6个平行样品进行检测。

2)结果判定：供试品FXIII活性RSD应＜5.0％。

3)实验结果：

表6.重复性结果

由表5可知，样品含量检测重复性RSD小于5％，符合方法要求。

(7)中间精密度：

1)实验方法：由2名实验人员(A，B)在不同时间，重复平行制备6 份样品溶液，共计12份样品溶液，由2名实验人员(A，B)分别进样6 次，按重复性实验中含量计算公式计算供试品的含量。

2)结果判定：12次检测含量结果的RSD应＜8.0％。

3)实验结果：

表7.中间精密度结果

由表5可知，样品含量检测中间精密度RSD小于8％，符合方法要求。

(8)准确度：

1)实验方法：

取已定量为20.31的纤原作为加标空白基质储液。

精密量取适量加标空白基质储液置于10ml容量瓶中，用样品稀释液稀释至刻度，即为(1：0.8)加标空白基质溶液E1；

精密量取适量加标空白基质储液置于10ml容量瓶中，用样品稀释液稀释至刻度，即为(1：1)加标空白基质溶液E2；

精密量取适量加标空白基质储液置于10ml容量瓶中，用样品稀释液稀释至刻度，即为(1：1.2)加标空白基质溶液E3；

取加标空白基质溶液E1、E2、E3，按照供试品水解方法处理对照品溶液，按照上述确定的色谱条件进行检测，此实验重复三次，9次实验的结果用计算回收率。

2)结果判定

9次检测回收率均应在85％-110％之间。

3)实验结果

表8.回收率结果

由表7可知，样品检测回收率均在85％-110％之间，符合方法要求。

综上所述，氨释放法定量限为10％标准猪血浆，线性范围为12.5％-100％标准猪血浆，专属性良好，重复性、准确度和精密度均符合检测方法需求，能够很好的替代现有猪血浆FXIII活性检测方法，填补猪血浆FXIII活性定量检测空白，为猪血液制品的质量研究和应用安全奠定基础。

实施例3、与紫外法吐温80含量检测对比研究

1、样品检测对比研究

取不同批次冻干纤维蛋白原样品作为供试品，分别采用氨释放法和凝块法进行对比研究。

氨释放法操作同实施例2中样品检测方法，凝块法参照中国食品药品检定研究院的FXIII活性测定法，测定结果如下：

表9.不同检测方法检测结果对比

批号	氨释放法检测结果	凝块法检测结果
			BC201909003	21.58	20
BC201910005	22.75	20
			BC201910006	20.92	20
BC201912007	21.08	20
			BC201912008	22.42	20
BC201912009	20.25	20

2、样品稳定性对比研究

取统一批次冻干纤维蛋白原样品，稀释后暂存于冰箱中。在1、4、8、 12、24小时取适量样品分别用液相法和紫外法进行检测，结果如下：

表10.不同检测方法检测结果对比

时间	氨释放法检测结果	凝块法检测结果
			1小时	21.58	20
4小时	22.75	20
			8小时	20.92	20
12小时	19.58	20
			24小时	19.08	20

结果说明，氨释放法能够真实准确反映溶液中FXIII的活性，样品配制保存24小时后仍能够准确检测含量。结果稳定重复性好，从准确度、重复性、稳定性等方面优于中检院方法。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)添加包含凝血酶、Ca²⁺和抑制肽在内的激活试剂；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制肽为纤维蛋白原凝集抑制剂，包括肝素、水蛭素或其他天然或合成的血液抗凝剂；优选的采用Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-NH₂；

所述多肽底物为Leu-Gly-Pro-Gly-Glu-Ser-Lys-Val-Ile-Gly-NH₂；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活试剂中还包含缓冲液；优选地，所述缓冲液为N,N-二羟乙基甘氨酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝血酶的浓度为10-20IU/ml，所述Ca²⁺的浓度为1.2mg/ml-2.0mg/ml；所述抑制肽的浓度为2mg/ml-4mg/ml；所述多肽底物的浓度为2.4mg/ml-4.0mg/ml；所述带有酰胺基侧链的氨基酸衍生物的浓度为1.4mg/ml-4.0mg/ml；所述α-酮戊二酸的浓度为2.7mg/ml-3.0mg/ml；所述谷氨酸脱氢酶的浓度为250IU/ml-300IU/ml。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述检测试剂还包含稳定剂，所述稳定剂为ADP；优选地，所述检测试剂包含0.5μg/ml-1μg/ml ADP。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准血浆或待测样品、激活试剂和检测试剂的添加体积比为(0.2-0.5)：(0.6-0.8)：(1-1.2)，优选为0.2：0.8：1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活试剂与所述检测试剂在使用前在37℃±2℃条件下预热10min以上。

8.根据权利要求1或权利要求7所述的方法，其特征在于，所述激活试剂加入后激活120s以上，然后加入所述检测试剂。

9.根据权利要求1或权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法的检测窗口期为加入检测试剂后200s-500s的范围内。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法在猪血制品检测中的应用。