CN116426510B - 含修饰Xa因子的利伐沙班检测试剂盒及检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物医学检验测定技术领域，提供了含修饰Xa因子的利伐沙班检测试剂盒及检测方法与应用。所述试剂盒包括Xa因子试剂和发色底物试剂；所述Xa因子试剂包含修饰Xa因子；所述修饰Xa因子表现出对肝素和/或ATIII浓度变化的不敏感性；所述发色底物试剂包含Xa因子底物；所述Xa因子底物可以与利伐沙班竞争结合修饰后Xa因子。本发明的Xa因子试剂与发色底物试剂联合使用，可以有效的抑制样本中肝素和或ATIII对利伐沙班检测的干扰。本发明的试剂盒检测准确率高，重复性好，而且检测步骤简单，有效提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检验测定技术领域，尤其涉及一种含修饰Xa因子的利伐沙班检测试剂盒及检测方法与应用。
背景技术
利伐沙班是一种口服，具有生物利用度的Xa因子抑制剂，其选择性地阻断Xa因子的活性位点，且不需要辅因子（例如抗凝血酶Ⅲ) 以发挥抑制凝血的活性，达到抗血凝的作用。
目前利伐沙班的检测主要利用凝血酶原时间（PT）或利用活化部分凝血活酶时间凝血酶原时间（APTT）以及液相色谱质谱联用的方法等进行。其中凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）的敏感性和特异性较差。而用液相色谱质谱联用的方法虽然可以准确的测量利伐沙班的含量，然而这种方法价格昂贵，操作繁琐。
专利CN 107576799 A公开了一种基于发色底物法来检测利伐沙班的试剂盒，通过Xa因子和其发色底物的相互作用，得到吸光度信号，血浆中的利伐沙班抑制这种酶 ,而利伐沙班含量越高 ,对这种酶的抑制越强，得到的吸光度信号越弱。所以在一定的范围之内,利伐沙班的含量和吸光度的信号是负相关关系。虽然这种方法可以测量血浆中利伐沙班的含量，但当样本中存在肝素时，肝素与样本中的ATIII的复合物也可以结合Xa因子，影响其活力，从而导致最终测试结果的准确性降低。
药物浓度的准确检测在血栓与止血病人进行治疗用药指导方向具有重要临床意义，不准确或错误的结果会影响抗凝或纤溶药物使用的判断，危及患者的生命。因此，当前在血栓与止血相关临床用药监测领域迫切需求一种可以准确监测利伐沙班的含量且易于获得的检测试剂盒。
发明内容
其本发明的目的之一在于提供一种修饰的Xa因子，旨在将其应用于利伐沙班试剂盒中，以解决现有利伐沙班检测方法存在的检测准确性不理想，成本高和使用过程复杂等技术问题。
本发明实施例是这样实现的，一种修饰的Xa因子，其特征在于，所述修饰的Xa因子包括Xa因子及修饰于其上的富含负电荷的基团，所述富含负电荷的基团来源于聚氨基酸类试剂。
更进一步地，所述修饰的Xa因子与富含负电荷的基团以化学键结合，优选共价结合。
更进一步地，所述修饰的Xa因子包括Xa因子在活化剂的存在下与富含负电荷的基团反应，所述富含负电荷的基团与Xa因子的摩尔比大于1。
更进一步地，所述修饰的Xa因子的等电点小于4.5，优选0.5-4.5，1-4，1.5-3.6。
更进一步地，所述Xa因子来源于哺乳动物，优选牛Xa因子。
进一步地，所述修饰Xa因子表现出对肝素和/或ATIII浓度或活性变化的不敏感性。
作为优选，所述富含负电荷的基团主要来自聚氨基酸类试剂。
进一步优选，所述聚氨基酸类试剂包括聚氨基酸或聚氨基酸衍生物；例如，聚谷氨酸、聚天冬氨酸及其衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种Xa因子试剂，其特征在于，包括所述修饰的Xa因子。
进一步地，所述修饰Xa因子的浓度为0.1~1.0U/mL。
进一步地，所述Xa因子试剂还至少包括含缓冲液；作为优选，所述缓冲包括但不限于HEPES缓冲液、Tris缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的至少一种。
更进一步地，所述缓冲液的浓度为1~30g/L。
进一步地，所述试剂还包括保护剂。所述保护剂包括但不限于盐类保护剂、蛋白类保护剂、糖类保护剂、氨基酸类保护剂、醇类保护剂的至少一种。
更进一步地，所述盐类保护剂1~20g/L、蛋白类保护剂1~50g/L、糖类保护剂1~50g/L、氨基酸类保护剂5～50g/L、醇类保护剂0.5~10.0g/L；
更进一步地，所述盐类保护剂为一价金属盐，包括但不限于钠盐、钾盐中的至少一种；和/或所述蛋白类保护剂包括但不限于白蛋白、牛血清白蛋白中的至少一种；和/或所述糖类保护剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种；和/或所述氨基酸类保护剂包括但不限于甘氨酸、精氨酸、赖氨酸中的至少一种；和/或所述醇类保护剂包括但不限于乙二醇、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种。
进一步地，所述Xa因子试剂还包括表面活性剂；所述表面活性剂为非阴离子表面活性剂，包括但不限于吐温-20或Triton X-100中的至少一种。
更进一步地，所述表面活性剂的浓度为0.5~10.0g/L。
进一步地，所述Xa因子试剂还包括防腐剂；所述防腐剂组分包括但不限于Proclin300、叠氮钠中至少的一种。
更进一步地，所述防腐剂的浓度为0.5~5.0mL/L。
本发明的目的还在于提供一种利伐沙班检测试剂盒，其特征在于，包括Xa因子试剂。
进一步地，所述试剂盒还包括独立包装的发色底物试剂。
进一步地，所述发色底物试剂包括极性非水溶剂和混合于所述极性非水溶剂中的发色底物；所述发色底物可以与利伐沙班竞争结合修饰Xa因子。
更进一步地，所述底物试剂中的极性非水溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、二甲基亚砜、异丙醇和丙二醇中的一种或至少两种的混合物，优选为乙二醇。
更进一步地，所述发色底物为S-2765、S-2732和S-2222中的一种，优选为S2732；所述发色底物的浓度为2～8mg/mL。
本发明还提供使用上述利伐沙班检测试剂盒的检测方法，包括以下
步骤：
通过样本和稀释液混合配制待测样品溶液，随后在所述待测样品溶液中加入发色底物试剂和Xa因子试剂继续进行混合得到最终反应溶液并进行反应；
通过检测反应后生成物质的情况，判断利伐沙班的含量。
更进一步地，所述样本与最终反应溶液的体积比例需小于0.1。
在检测时，需控制样本与最终反应溶液的体积比例小于0.1。当样本与最终反应溶液的体积比例大于0.1时，样本量加入过多，而不同样本中可能会含有不同的浓度的ATIII或肝素等物质，可能会因为样本中这些干扰物质的浓度差异而导致测试结果的偏差较大，因此，需要控制样本与最终反应溶液的体积比例。
本发明还提供修饰的Xa因子在制备检测利伐他班的试剂盒中的应用。
术语释义
术语“聚氨基酸”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸的任何一条或多条链，并不指产物的特定长度。因此，在“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以代替或与这些术语中的任一个互换使用。
术语“聚氨基酸类试剂”旨在涵盖聚氨基酸及聚氨基酸衍生物，其中术语“聚氨基酸衍生物”还旨在指聚氨基酸的表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解或通过非天然存在氨基酸修饰。
术语“基团”简称“基”，是有机物失去一个原子或一个原子团后剩余的部分。本发明的“富含负电荷的基团来源于聚氨基酸类试剂”意指聚氨基酸类试剂失去一个原子或原子团后形成的基团，该基团通过化学键，优选共价键结合到Xa因子上，形成Xa因子-聚氨基酸或其衍生物的复合结构，即为本发明所述“修饰的Xa因子”。
技术效果:
本发明的试剂盒中含有修饰Xa因子，修饰后Xa因子对肝素和/或ATIII的浓度或活性变化不敏感，降低了样本中肝素和/或ATIII对Xa因子活力的影响。修饰Xa因子通过富含负电荷的修饰剂在Xa因子蛋白表面形成一个负电荷层，随后通过电荷作用抑制肝素、ATIII以及其相关复合物与Xa因子的作用。此外，修饰Xa因子由于其表面负电荷层，一方面提高其亲水性，另外一方面有效防止Xa因子自身聚集而引起自水解作用，从而使得修饰Xa因子可以在水溶液中处于稳定的状态。
本发明的利伐沙班检测方法由于是直接利用本发明利伐沙班检测试剂盒进行检测，检测准确率高，重复性好，而且检测步骤简单，有效提高了检测效率。
附图说明
图1为含有聚谷氨酸修饰的Xa因子的利伐沙班测定试剂盒的校准曲线；
图2为含有聚天冬氨酸修饰的Xa因子的利伐沙班测定试剂盒的校准曲线；
图3为不同摩尔比的Xa因子与聚谷氨酸制备修饰Xa因子的抗ATIII干扰验证结果；
图4为不同摩尔比的Xa因子与聚天冬氨酸制备修饰Xa因子的抗ATIII干扰验证结果；
图5为含有聚谷氨酸修饰的Xa因子的利伐沙班测定试剂盒的线性范围结果；
图6为含有聚天冬氨酸修饰的Xa因子的利伐沙班测定试剂盒的线性范围结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 聚谷氨基酸修饰的Xa因子
取聚谷氨基酸10ml（聚谷氨基酸与Xa因子的摩尔比为2:1），加入浓度为3.95mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）100µL，在室温下搅拌反应1小时，随后加入0.1mg的Xa因子，继续在室温下搅拌反应1小时，反应完成后，进行透析过夜处理，得到修饰后的Xa因子浓缩液1ml。
实施例2 聚天冬氨酸修饰的Xa因子
取聚天冬氨酸10ml（聚天冬氨酸与Xa因子的摩尔比为2:1），加入浓度为3.95mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）100µL，在室温下搅拌反应1小时，随后加入0.1mg的Xa因子，继续在室温下搅拌反应1小时，反应完成后，进行透析过夜处理，得到修饰后的Xa因子浓缩液1ml。
将实施例1和2处理后的Xa因子，进行等电点测定。测定流程为：配制不同pH的醋酸与醋酸钠的缓冲液（pH分别为6.01、5.52、5.15、4.51、3.97、3.51、2.97、2.52、2.04）。随后，分别加入修饰后的Xa因子，对照组为未修饰的Xa因子，观察在醋酸与醋酸钠的缓冲液中出现最多沉淀所对应缓冲液的pH值。结果如表1所示，修饰后的Xa因子的等电点明显降低，说明成功将两种修饰剂修饰在Xa因子上。
表1 等电点测定
实施例3 修饰的Xa因子的稳定性研究
对实施例1-2配制的修饰的Xa因子进行进行稳定性研究，以未修饰的Xa因子为对照组，分别取三种Xa因子试剂使用Hepes缓冲液稀释成浓度为0.5U/mL的试剂各5组，随后与S-2732底物试剂进行混合孵育1min，在紫外分光光度计上进行测试，然后将剩下4组Xa因子试剂放置在37°C环境中，放置时间为3天、5天、7天和10天，按照同样测试方式测试吸光度值，结果如表2所示，修饰Xa因子试剂在37°C加速10天，其结果与第0天的结果的相对偏差未超过10%，说明修饰后的Xa在溶液状态下存放较长时间依然可以保持较好的性能，明显优于未修饰Xa的稳定性。
表2 修饰的Xa因子的稳定性评价
实施例4 利伐沙班检测试剂盒
一种利伐沙班检测试剂盒，包括独立存储的Xa因子试剂和发色底物试剂。
其中，Xa因子试剂包含修饰Xa因子（实施例1或实施例2），其中修饰后的Xa因子含量为0.3U/mL，Xa因子试剂的pH为7.2。Xa因子试剂中还包括含有活性组分的缓冲溶液。活性组分包括保护剂，例如盐类保护剂10g/L、蛋白类保护剂25g/L、糖类保护剂30g/L、氨基酸类保护剂15g/L、醇类保护剂5g/L中至少一种。活性组分还包括吐温208g/L、Proclin 3003mL/L；缓冲液为HEPES缓冲液用量为20g/L。
发色底物试剂包含发色底物S-2732，终浓度4mg/mL。
实施例5 利伐沙班的检测方法
本实施例利伐沙班检测试剂盒用于测定样本中利伐沙班的含量。具体检测方法包括如下步骤：
1、 校准曲线制作：
（1）取浓度为600ng/ml的利伐沙班校准品，在仪器上设置不同稀释比例，配制成600、400、200、100、50、25、0ng/ml的校准品样本。
（2）取稀释后的校准品60μL并分别加入30μL所述底物试剂后进行混合均匀，分别37℃孵育20s；
（3）孵育后分别加入75μL的实施例4中两种修饰的Xa因子试剂进行检测，检测时间为180s；
（4）对孵育处理后的校准品样本分别采用YX-3000 凝血仪进行检测，将OD405吸光度变化率与利伐沙班浓度进行建立线性方程做出校准曲线；根据利伐沙班标准液梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制校准曲线，校准曲线如图1和图2所示。
2、血液样本中利伐沙班的浓度检测：
（1）取稀释后的血液样本60μL并加入30μL所述发色底物试剂并混合均匀，37℃孵育20s；
（2）孵育后加入75μL的所述Xa因子试剂进行检测，检测时间为180s；
（3）对孵育处理后的血液样本采用YX-3000凝血仪进行检测，获得吸光值，根据步骤1中绘制的所述校准曲线获得所述血液样本利伐沙班的浓度。
3、实验测试
（1）利伐沙班检测试剂盒不同加入比例修饰Xa因子抗ATIII干扰研究
按照实施例1和2的方法制备修饰的Xa因子，其中Xa因子和修饰剂的加入摩尔比分别为4，2，1，0.5和0.25，然后按照实施例4中的其他组分制备利伐沙班检测试剂盒。在YX-3000凝血仪绘制校准曲线后，选择100ng/ml左右浓度利伐沙班血浆样本且含有105%ATIII活性的干扰样本进行利伐沙班的测定，重复测试2次，计算含有105%ATIII活性干扰样本的测试结果与标准加入浓度之间的相对偏差，并根据修饰Xa因子的分子量与相对偏差进行结果分析。两种修饰剂结果如图3和4所示，发现随着修饰Xa因子的修饰剂加入量越大，相对偏差越小，摩尔比不超过1时，对应的相对偏差不超过15%。
（2）利伐沙班检测试剂盒的线性范围检测
按照实施例1-2的方法制备修饰的Xa因子，随后再按照实施例4中的Xa因子试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，对照组中Xa因子试剂选用未修饰Xa因子。在YX-3000凝血仪绘制校准曲线后，取浓度为600ng/ml左右的利伐沙班样本，在仪器上设置不同稀释比例，配制成600、400、200、100、50、25ng/ml的样本，用YX-3000凝血仪检测三次，取平均值做线性回归曲线，要求在25-600ng/ml线性范围内有较好的线性关系。经检测，利用上文实施例5提供的检测试剂盒所做线性回归曲线的线性关系好，如图5和6所示，其线性相关系数r分别为0.9982和0.9966，满足检测利伐沙班含量的要求。
（3）利伐沙班检测试剂盒重复性结果考察
按照实施例1-2的方法制备修饰的Xa因子，随后再按照实施例4中的Xa因子试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，对照组中Xa因子试剂选用未修饰Xa因子。在YX-3000凝血仪绘制校准曲线后，选择100ng/ml和200ng/ml两种浓度利伐沙班血浆样本进行利伐沙班的测定，重复测试10次，计算变异系数，变异系数在±10%以内视为重复性较好。结果如表3所示，基于实施例1-2制备的试剂盒，其在100ng/ml和200ng/ml两种浓度利伐沙班血浆样本变异系数分别为2.09%和1.98%以及1.26%和1.35%，均在5%以内，说明重复性较好。
表3 利伐沙班试剂盒重复性结果
（4）利伐沙班检测试剂盒抗肝素干扰结果考察
按照实施例1-2的方法制备修饰的Xa因子，随后再按照实施例4中的Xa因子试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，对照组中Xa因子试剂选用未修饰Xa因子。在YX-3000凝血仪绘制校准曲线后，选择100ng/ml和200ng/ml两种浓度利伐沙班血浆样本，分别添加不同浓度的普通肝素（0，0.5，1IU/mL）和不同浓度的低分子肝素（0，1，2IU/mL）配制干扰样本，随后进行利伐沙班的测定，重复测试2次，计算不同浓度肝素的干扰样本的测试结果与不添加肝素样本测试结果之间的相对偏差，相对偏差需在±10%以内。结果如表4、表5所示，基于实施例1-2中修饰Xa因子的试剂盒在检测普通肝素或低分子肝素干扰样本时，相对偏差均在10%以内，而使用未修饰Xa因子的试剂盒，在普通肝素含量超过0.5IU/mL或低分子肝素含量超过1IU/mL时，相对偏差已经超过10%，说明本发明使用修饰Xa因子开发的试剂盒在普通肝素浓度1 IU/mL或低分子肝素含量2 IU/mL内具有抗干扰能力。
表4 利伐沙班试剂盒抗普通肝素干扰验证结果
表5 利伐沙班试剂盒抗低分子肝素干扰验证结果
（5）利伐沙班检测试剂盒抗ATIII干扰结果考察
按照实施例1-2的方法制备修饰的Xa因子，随后再按照实施例4中的Xa因子试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，对照组中Xa因子试剂选用未修饰Xa因子。在YX-3000凝血仪绘制校准曲线后，选择2000ng/ml浓度利伐沙班母液，分别与含有不同活性的ATIII样本（26.2%，52.5%，105%，157.5%）按照固定比例（1:19）配制干扰样本，随后进行利伐沙班的测定，重复测试2次，计算不同活性ATIII的干扰样本的测试结果与空白样本（不含ATIII的稀释液与利伐沙班母液混合制备的样本）测试结果之间的相对偏差，相对偏差需在±15%以内。结果如下表6所示，基于修饰Xa因子的试剂盒在检测肝素干扰样本时，相对偏差均在15%以内，而使用未修饰Xa因子的试剂盒，ATIII活性超过52.5%时，相对偏差已经超过15%，说明本发明使用修饰Xa因子开发的试剂盒在ATIII活性150%内具有抗干扰能力。
表6 不同活性ATIII的干扰样本的测试结果
（6）利伐沙班检测试剂盒37℃加速稳定性考察
按照实施例4中的Xa因子试剂和底物试剂制备方法进行试剂制备，随后，将上述试剂在37℃环境下分别放置不同时间（0,7,14,21,28天）。在第0天时，进行校准曲线绘制，随后选择100ng/ml和200ng/ml两种浓度利伐沙班血浆样本，分别在不同时间节点进行利伐沙班的测定，重复测试2次，计算不同时间节点的测试结果与第0天测试结果之间的相对偏差，相对偏差需在±10%以内。结果如表7所示，试剂在37℃加速28天后，相对偏差均在10%以内，说明本发明的试剂盒加速稳定性较好。
表7利伐沙班试剂盒加速稳定性验证结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种修饰的Xa因子，其特征在于，所述修饰的Xa因子包括Xa因子及修饰于其上的富含负电荷的基团，所述修饰的Xa因子与富含负电荷的基团共价结合；所述富含负电荷的基团来源于聚氨基酸类试剂；所述聚氨基酸类试剂选自聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
2.如权利要求1所述修饰的Xa因子，其特征在于，所述修饰的Xa因子的等电点小于4.5。
3.如权利要求1或2所述修饰的Xa因子，其特征在于，所述修饰的Xa因子的制备方法包括X因子在活化剂的存在下与富含负电荷的基团反应，所述富含负电荷的基团与Xa因子的摩尔比大于1。
4.一种Xa因子试剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述修饰的Xa因子。
5.如权利要求4所述Xa因子试剂，其特征在于，所述修饰的Xa因子的浓度为0.1~1.0U/mL。
6.一种利伐沙班检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4或5所述Xa因子试剂。
7.如权利要求6所述利伐沙班检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括独立包装的发色底物试剂。
8.如权利要求7所述利伐沙班检测试剂盒，其特征在于，所述发色底物为S-2765、S-2732和S-2222中的一种；所述发色底物的浓度为2～8mg/mL。
9.如权利要求1所述修饰的Xa因子在制备利伐沙班检测试剂盒中的用途。
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