KR100222292B1 - 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법 - Google Patents

피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100222292B1
KR100222292B1 KR1019970025516A KR19970025516A KR100222292B1 KR 100222292 B1 KR100222292 B1 KR 100222292B1 KR 1019970025516 A KR1019970025516 A KR 1019970025516A KR 19970025516 A KR19970025516 A KR 19970025516A KR 100222292 B1 KR100222292 B1 KR 100222292B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
coagulation factor
blood coagulation
fibrin
factor
fibrin monomer
Prior art date
Application number
KR1019970025516A
Other languages
English (en)
Other versions
KR19990002006A (ko
Inventor
김희철
허재욱
장신재
이정식
정순관
성학모
Original Assignee
허일섭
주식회사녹십자
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 허일섭, 주식회사녹십자 filed Critical 허일섭
Priority to KR1019970025516A priority Critical patent/KR100222292B1/ko
Priority to EP98929875A priority patent/EP0956363B1/en
Priority to AT98929875T priority patent/ATE251221T1/de
Priority to PCT/KR1998/000160 priority patent/WO1998058078A1/en
Priority to JP50419199A priority patent/JP3193728B2/ja
Priority to US09/242,436 priority patent/US6406874B1/en
Priority to DE69818639T priority patent/DE69818639T2/de
Publication of KR19990002006A publication Critical patent/KR19990002006A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100222292B1 publication Critical patent/KR100222292B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
    • G01N2333/91074—Aminoacyltransferases (general) (2.3.2)
    • G01N2333/9108—Aminoacyltransferases (general) (2.3.2) with definite EC number (2.3.2.-)
    • G01N2333/91085—Transglutaminases; Factor XIIIq (2.3.2.13)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법에 관한 것으로, 특히 혈액 응고 제13인자가 존재하지 않는 피브린 단량체를 기질로 사용하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법에 관한 것이다. 본 발명은 신속, 간단하고, 저가로 재현성 높게 혈액 응고 제13인자를 정량할 수 있으며, 새로 개발된 검사방법의 신뢰도를 검증하거나 혈액 응고 제13인자의 성질을 조사하는데 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법
본 발명은 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈액 응고 제13인자가 존재하지 않는 피브린 단량체를 기질로 사용하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법에 관한 것이다.
혈액 응고 제13인자는 혈액에서 효소원(zymogen)으로 순환하다가, 칼슘의 존재하에서 트롬빈에 의해 활성화되며, 기질 단백질들의 라이신과 글루타민 잔기 사이의 이소펩티드 결합을 촉매하는 글루타민전이효소(transglutaminase)중의 하나이다. 혈액 응고 제13인자에 대해 특이성을 갖는 기질은 표 1에 나타나 있으며(참조 ; Karges, H. E., Clemens, R., Behring Inst. Mitt. 82: 43-58, 1988), 이들은 주로 혈소판내 물질이거나, 단핵구, 상피세포 표면의 거대분자, 그리고 혈액에 존재하는 거대분자들이다.
Figure kpo00004
혈액 응고 제13인자는 혈관내에서 기계적 강도가 강한 피브린 응고물을 만들어 지혈 및 상처 부위의 치료에 관여하며, 세포증식, 암세포 성장과 전이 그리고 동맥경화에도 영향을 미친다. 그리고 병리적인 상태(선천적, 후천적 출혈증, 만성 신부전, 악성 종양, 간질환)에서 혈액 응고 제13인자의 농도가 다양하게 변하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 혈액 응고 제13인자의 생리적 기능의 중요성과 병리적 상태에서의 변화 때문에 임상분야에서 혈액 응고 제13인자의 역가측정을 이용한 병리진단의 필요성이 부각되고 있다. 이 외에도 혈액 응고 제13인자의 역가 측정이 요구되는 분야를 살펴보면, 혈액 응고 제13인자를 유효성분으로 포함하는 의약품의 검정과 실험실 수준에서의 혈액 응고 제13인자의 특성연구 등을 들 수 있다.
지금까지 혈액 응고 제13인자의 정량법이 매우 많이 개발되어 왔다. 그러나 일상적인 분석에 적합한 이상적인 정량법은 아직까지 개발되지 않았으며, 개발된 정량법의 기본원리는 표 2에 나타나 있다(참조: Karges, H. E., Clemens, R., Behring Inst. Mitt. 82: 43-58, 1988).
기존에 개발된 혈전 용해 방법은 혈액 응고 제13인자의 기질로 혈액 응고 제13인자가 전혀 존재하지 않는 피브리노겐을 사용하였으며, 이 방법은 적절한 희석배수로 각각 희석한 표준 혈장(혈액 응고 제13인자를 포함)과 시트에 트롬빈/칼슘용액을 가하여 형성된 피브린 응고물에 용해제를 가하였을 때, 각각 용해제에 용해되지 않는 피브린 응고물을 형성시키는데 필요한 표준 혈장의 최저 농도(단점(斷點):endpoint) 혈액 응고 제13인자의 역가와 희석 배수(endpoint)가 가장 높은 시료에 존재하는 혈액 응고 제13인자의 역가는 동일하다는 논리에 근거하여 시료의 혈액 응고 제13인자를 정량하였다.
Figure kpo00005
위 방법은 매우 간단하고, 고가 장비가 필요하지 않으며, 임상병리 실험실 등에서 혈액 응고 제13인자의 결핍증을 쉽게 진단할 수 있었다. 그러나, 혈액 응고 제13인자가 피브리노겐에 매우 강하게 결합하고 있기 때문에 피브리노겐으로부터 혈액 응고 제13인자를 제거하기가 매우 어려웠다. 또한, 혈전 용해 방법의 기질인 혈액 응고 제13인자가 전혀 존재하지 않는 피브리노겐은 상당히 고가이므로 쉽게 이용할 수 없는 문제점이 있었다.
상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 고안된 본 발명의 목적은 신속, 간단하고, 저가로 재현성 높게 혈액 응고 제13인자를 정량할 수 있으며, 새로 개발된 검사방법의 신뢰도를 검증하거나 혈액 응고 제13인자의 성질을 조사하는데 이용할 수 있는 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법은 혈액 응고 제13인자가 존재하지 않는 피브린 단량체를 기질로 사용하는 것을 특징으로 한다.
제1도는 피브린 단량체와 피브린 응고물의 10
Figure kpo00002
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 사진.
제2도는 혈액 응고 제13인자에 의한 피브린 단량체의 감마 사슬의 감마이량체로의 전환율을 나타내는 그래프.
제3도는 혈액 응고 제13인자에 의해 형성된 피브린 응고물의 1
Figure kpo00003
모노클로로 아세테이트 용액에 대한 용해도를 나타내는 그래프.
제4도는 혈액 응고 제13인자의 정량 방법인 C14푸트레신(putrescine)결합법과 본 발명에서 개발한 혈전 용해 방법과의 상관 관계를 나타내는 그래프.
제5도는 피브린 단량체의 마이크로플레이트 분석법을 이용한 혈액 응고 제13인자 농도에 따른 표준곡선을 나타내는 그래프.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 혈액 응고 제13인자가 완전 제거된 피브린 단량체(fibrin monomer)의 제조원리를 살펴보면 다음과 같다.
Figure kpo00006
용해성 단백질인 피브린 단량체는 수소 결합을 통하여 규칙적으로 배열하여 비공유 피브린 중합체가 된다. 이 비공유 피브린 중합체를 적절한 용액으로 세척함으로써 비공유 피브린 중합체에 강하게 결합하고 있는 혈액 응고 제13인자를 완전히 제거할 수 있다.
본 발명의 혈전 용해 방법의 원리를 간단하게 살펴보면 다음과 같다.
Figure kpo00007
활성화된 혈액 응고 제13인자에 의해 피브린 단량체 사이의 감마 사슬이 먼저 교차 공유결합하여 감마 이량체가 생성된다. 이것은 부분적 용해성 이량체이며, 그후, 점차 알파 사슬끼리의 알파 다량체가 생성되면 비용해성 다량체가 형성된다. 이 반응은 혈액 응고 제13인자의 활성에 비례하며, 이량체와 다량체의 형성속도는 각각 다르다. 위 사실을 이용하여 혈액 응고 제13인자를 측정할 수 있다.
본 발명은 표 2의 혈전용해(clot lysis)를 이용한 단계적 희석방법으로서 기본원리는 다음과 같다. 혈액 응고 제13인자가 칼슘의 존재하에서, 트롬빈에 의해 활성화되고, 이것이 트롬빈에 의해 전환된 피브린의 감마-사슬사이와 알파-사슬사이의 교차공유결합으로 감마-이량체와 알파-중합체를 만들어 용해제(요소, 아세테이트, 모노클로로아세테이트)에 용해되지 않는 피브린 응고물을 만드는 능력을 측정함으로써 혈액 응고 제13인자를 정량할 수 있다. 그리고 혈액 응고 제13인자가 없는 상태에서 형성된 피브린 응고물은 수소결합만으로 결합되어 있으므로 용해제에 쉽게 용해된다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다. 이러한 실시예에서 사용한 시약 및 분석방법은 다음과 같다.
시약으로는 분석용 용액(1M 트리스-아세테이트 125mM 염화칼슘, pH 8.0), 1중량
Figure kpo00008
모노클로로아세테이트 수용액, 표준 혈장(혈액 응고 제13인자), 희석액(0.4
Figure kpo00009
알부민, 0.15M 염화나트륨), 카올린(caolin), 혈액 응고 제13인자로 오염되지 않은 피브린 단량체, 트롬빈 용액(200U/
Figure kpo00010
), 2mM 빙초산 등을 사용하였으며, 분석용 용액, 1
Figure kpo00011
모노클로로아세테이트 수용액, 희석액, 카올린, 2mM 빙초산은 수개월 동안 안정하고, 동결건조된 피브린 단량체는 4
Figure kpo00012
에서 수개월 동안 안정하며, 표준 혈장은 -70
Figure kpo00013
에서 안정하고 용해후 4시간 이내에 사용하여야 한다.
표준 혈장(혈액 응고 제13인자)은 베링(Behring)사의 표준-인 혈장을 사용하였고, 트롬빈(1U/
Figure kpo00014
), 20
Figure kpo00015
알부민, 피브리노겐은 주식회사녹십자제품을 사용하였으며, 카올린, 모노클로로아세테이트, 트리즈마 베이스(trisma base), 염화칼슘, 염화나트륨, 투석막(분자량 12,000Da 이하 제거), ε-아미노 카프론산(ε-amino caproic acid, 이하 EACA라 한다)은 시그마사, 요소는 ICN 바이오케미칼사, 그리고 빙초산, 구염산 나트륨은 리델 디헨사(Riedel deHaen)의 것을 사용하였다.
한편, 시료는 건강한 사람으로부터 얻은 혈장이며, -20
Figure kpo00016
에 보관하여 사용하였다.
본 발명의 감도에 따르면, 정상인의 혈장을 희석액으로 약 10
Figure kpo00017
70배 희석하여 혈액 응고 제13인자를 정량할 수 있고, 그 분석방법은 다음과 같다.
1. 동결 건조된 피브린 단량체를 2mM 빙초산 2
Figure kpo00018
로 용해한다(1
Figure kpo00019
피브린 단량체).
2. 시료를 10에서 70배까지 적절하게 희석액으로 희석하고, 표준 혈장을 혈액 응고 제13인자의 농도가 각각 12, 14, 16, 18, 20, 그리고 22mU/
Figure kpo00020
되도록 희석한다.
3. 상기 각 희석한 시료와 표준 혈장 200
Figure kpo00021
를 100
Figure kpo00022
유리 시험관에 넣는다.
4. 카올린을 0.6중량
Figure kpo00023
가 되도록 희석액으로 용해한다.
5. 200U/
Figure kpo00024
의 트롬빈 100
Figure kpo00025
를 카올린 용액 1.1
Figure kpo00026
과 분석용 용액 0.8
Figure kpo00027
로 희석한다(최종 조성: 0.4M 트리스-아세테이트, 50mM 염화칼슘, 10U 트롬빈, pH 8.0).
6. 상기 트롬빈/칼슘/카올린 용액 100
Figure kpo00028
를 넣고 약하게 섞어주고, 바로 피브린 단량체 용액 100
Figure kpo00029
를 넣어 준 다음 1
Figure kpo00030
2회 흔들어서 섞어 준다. 최종 분석 혼합물의 조성(0.4
Figure kpo00031
)은 트롬빈 1U, 피브린 단량체 1㎎, 염화칼슘 12.5mM, 카올린 0.08
Figure kpo00032
, 트리스-아세테이트 0.1M, pH 8.0이다.
7. 37
Figure kpo00033
에서 1시간 동안 반응시킨 후 1
Figure kpo00034
모노클로로아세테이트 3
Figure kpo00035
를 피브린 응고물에 넣는다.
8. 매 10분마다 손으로 흔들어 주고, 30분 후에 피브린 응고물이 용해되지 않은 시험관중에서 희석 배수가 가장 큰 시험관을 표준 혈장 및 시료에서 각각 관찰한다. 이 희석 배수의 시료시험관에 포함되어 있는 혈액 응고 제13인자의 농도는 표준 혈장 시험관의 혈액 응고 제13인자의 농도와 동일하며, 이 때의 혈액 응고 제13인자의 농도는 단점(端點 : endpoint)으로 한다.
따라서, 시료의 혈액 응고 제13인자 농도(mU/
Figure kpo00036
)는 표준 혈장 혈액 응고 제13인자 농도(endpoint, mU/
Figure kpo00037
)에 시료의 희석 배수를 곱하여 얻어진다.
[실시예 1]
혈액 응고 제13인자가 오염되지 않은 피브린 단량체의 제조
글리신 침전법으로 침전시킨 정제 피브리노겐을 0.05M 시트레이트완충액(pH 6.8, 0.15M 염화나트륨)에 1시간 동안 냉침시킨 다음 녹였다. 이 용해액의 단백질 농도를 5mg/
Figure kpo00038
로 조정한 다음 EACA를 최종농도가 50mM되게 넣어주어 30분동안 평형시킨 후 여기에 글리신을 150g/L로 넣어주어 피브리노겐을 침전시켰다. 침전액을 원심분리(15,000×g, 30분)하여 상청액을 제거하고 침전물을 다시 상기 완충액으로 용해시켰다. 상기 용해액의 단백일 농도를 100mg/
Figure kpo00039
로 조정하고 트롬빈을 피브리노겐 1g당 25U되게 넣어주어 37
Figure kpo00040
에서 반응시켰다. 반응시키는 동안 응고되는 피브린 응고물을 막대로 감아올려 감아올린 응고물을 가위로 잘게 자르고 위 완충액으로 세척하여 응고물에 녹아 있는 단백질을 완전히 제거한다음 5M 요소로 용해시켰다(이때 피브리노겐의 농도를 13mg/
Figure kpo00041
이상으로 조정하고 동시에 용해시간이 30분을 넘기지 않게 한다). 상기 용해액을 2mM 빙초산에 대하여 투석을 실시하였다. 투석초기에는 용해액에 존재하는 요소가 투석막에서 제거되면서 응고물이 형성되나 점차적으로 응고물은 2mM 빙초산에 의해 용해되었다. 투석완료후 응고, 용해되지 않는 응고물을 여과에 의해 제거하여 피브린 단량체 용액을 제조하였고, 피브린 단량체 용해액을 동결건조시킨 후, 4
Figure kpo00042
에 보관하였다.
[실시예 2]
제조한 피브린 단량체의 혈액 응고 제13인자 존재여부
실시예 1에서 제조된 피브린 단량체에 혈액 응고 제13인자가 존재하는지 알아보기 위해 전기영동을 실시하여 트롬빈과 염화칼슘의 존재하에서 감마 이량체의 형성여부를 관찰하여 보았다.
즉, 동결 건조된 피브린 단량체를 1
Figure kpo00043
농도가 되도록 2mM 빙초산 2
Figure kpo00044
로 용해시키고, 표준 혈장을 희석액으로 혈액 응고 제13인자의 농도가 각각 0, 0.028, 0.055, 0.11, 0.22, 0.44, 0.88, 1.75, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00, 30.00, 40.00mU/
Figure kpo00045
되도록 희석한 후, 각각 희석한 표준 혈장 200
Figure kpo00046
를 10
Figure kpo00047
유리 시험관에 넣었다. 카올린을 0.6중량
Figure kpo00048
되도록 희석액으로 용해시키고, 200U/
Figure kpo00049
의 트롬빈 100
Figure kpo00050
를 카올린 용액 1.1
Figure kpo00051
과 분석용 용액 0.81
Figure kpo00052
로 희석한 후(최종 조성 : 0.4M 트리스-아세테이트, 50mM 염화칼슘, 10U 트롬빈, pH 8.0), 상기한 트롬빈/칼슘/카올린 용액 100
Figure kpo00053
를 넣고 약하게 섞어 주고, 바로 피브린 단량체 용액을 100
Figure kpo00054
넣어 준 다음 1
Figure kpo00055
2회 흔들어 섞어 준 다음 37
Figure kpo00056
에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 8M 요소 1
Figure kpo00057
로 피브린 응고물을 용해시키고 용해액 30
Figure kpo00058
를 Laem
Figure kpo00059
i(Nature, 227 : 680-685, 1970)의 방법을 기초로 하여 10
Figure kpo00060
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다(제1도).
제1도의 레인1은 피브린 단량체를, 레인2
Figure kpo00061
15는 피브린 단량체와 혈액 응고 제13인자(레인 2:0, 레인 3:0.028, 레인 4:0.055, 레인 5:0.11, 레인 6:0.22, 레인 7:0.44, 레인 8:0.88, 레인 9:1.75, 레인 10:2.50, 레인 11:5.00, 레인 12:10.00, 레인 13:20.00, 레인 14:30.00, 레인 15:40.00mU/
Figure kpo00062
의 제13인자 농도)를 염화칼슘 및 트롬빈 존재하에서 반응시킨 후 피브린 응고물을 용해시킨 것을 10
Figure kpo00063
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨 것이다.
실험 결과, 반응 전의 피브린 단량체와 반응후의 피브린 응고물에 모두 감마 이량체가 형성되지 않았으며, 첨가된 혈액 응고 제13인자의 양이 증가할수록 감마 이량체의 형성이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 따라서, 실시예 1의 피브린 단량체에서 혈액 응고 제13인자가 완전히 제거된 것을 알 수 있었다.
[실시예 3]
제조한 피브린 단량체의 혈액 응고 제13인자의 기질로서의 작용
상기 피브린 단량체가 혈액 응고 제13인자의 기질로 작용하는지를 다음과 같이 확인하였다. 혈액 응고 제13인자를 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 25, 30mU/
Figure kpo00064
의 농도로 실시예 2와 같이 실험한 후, 형성된 감마 이량체와 감소된 감마 단량체를 밀도 측정기(densitometer)로 정량하여 감마 이량체와 감마 단량체의 양적 변화 비율(감마 이량체÷감마 단량체×100)을 그래프로 나타낸 결과(제2도), 혈액 응고 제13인자가 증가함에 따라 감마 이량체의 형성이 증가함과 동시에 감마 단량체가 감소하는 것으로 보아 피브린 단량체가 혈액 응고 제13인자의 기질로 작용하는 것과 혈액 응고 제13인자의 양을 측정할 수 있음을 확인하였다.
혈액 응고 제13인자의 농도를 0, 5, 10, 15, 20, 25mU/
Figure kpo00065
로 조정하여 실시예 2와 같이 실험한 후 1
Figure kpo00066
모노클로로아세테이트 3
Figure kpo00067
를 넣어 가볍게 흔들어 주고, 5분 후에 상청액을 취하여 OD280
Figure kpo00068
에서 흡광도를 측정하였다(제3도). 그 결과, 혈액 응고 제13인자 농도 10
Figure kpo00069
25mU/
Figure kpo00070
에서 응고물의 용해도가 농도의 증가에 따라, 감소되는 것으로 보아 피브린 단량체가 혈액 응고 제13인자의 기질로 작용하는 것과 혈액 응고 제13인자의 양을 측정할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 4]
제조한 피브린 단량체를 기질로 사용한 혈액 응고 제13인자 정량의 신뢰도 및 다른 정량 분석방법과의 상관관계
위와 같이 제조한 피브린 단량체로 혈액 응고 제13인자를 신뢰성있게 정량할 수 있는지를 알아보기 위해 혈전 용해 방법을 상술한 분석 방법에 따라 실시하여 재현성을 조사하여 보았다.
실험결과 단점(endpoint : 1
Figure kpo00071
모노클로로아세테이트에 의해 용해되지 않는 응고물을 형성하는데 필요한 최저 혈액 응고 제13인자 농도)은 18mU/
Figure kpo00072
이었고, 위 실험의 재현성을 알아본 결과 실험내(intra assay), 실험간(inter assay)의 변이계수(coefficient of variance : CV)가 각각 3.7, 5
Figure kpo00073
의 높은 재현성을 보여주었다(표 3 및 표 4 참조).
Figure kpo00074
Figure kpo00075
또한, 혈액 응고 제13인자를 정량하는 다른 정량법과의 상관 관계를 조사한 결과, C14-푸트레신(putrescine) 결합법(참조 : Chung S.I. and J.E. Folk, J. Biol. Chem. 247 : 2798-2807, 1972)과의 상관 관계(r)는 0.95의 높은 상관관계를 보여 주었다(제4도).
[실시예 5]
피브린 단량체를 기질로 사용한 마이크로플레이트 정량법
피브린 단량체를 결합 완충액(50mM 카보네이트 완충액, pH 9.6)으로 100
Figure kpo00076
/
Figure kpo00077
이하로 희석시킨 피브린 단량체 150
Figure kpo00078
를 마이크로플레이트에 분주한 후, 실온에서 약 16시간 동안 결합(coating)시키고, 결합되지 않은 피브린 단량체는 40mM 트리스 완충액(0.15M 염화나트륨, pH 8.3)으로 2번 세척하여 제거하였다. 피브린 단량체가 결합되지 않은 마이크로플레이트면은 1
Figure kpo00079
소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 결합시켜 타 단백질이 비특이적으로 마이크로플레이트에 결합되는 것을 차단(blocking)시켰다. 상기 플레이트는 냉장고에 보관하거나 동결건조시켜 냉장고에 보관하였다.
상기 피브린 단량체가 결합된 마이크로플레이트에 혈액 응고 제13인자를 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16mU/
Figure kpo00080
으로 희석한 표준액을 각 웰에 50
Figure kpo00081
씩 넣어준 다음, 트롬빈(10U/
Figure kpo00082
) 10
Figure kpo00083
, 5mM 비오티닐펜탈아민(biotinlpentylamine) 15
Figure kpo00084
, 50mM 염화칼슘 20
Figure kpo00085
, 17.5mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 섞은 용액 45
Figure kpo00086
를 넣어 주어 잘 섞어 준 다음 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 0.2M EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 20
Figure kpo00087
로 반응을 정지시켰다.
피브린 단량체에 결합되지 않은 비오티닐펜탈아민을 40mM 트리스 완충액으로 3번 세척하여 제거한 후, 스트렙트아비딘(streptavidine)이 결합된 양고추냉이 페록시다제(horse-radish peroxidase)(pierce사 제품)를 4000배 희석한 100
Figure kpo00088
를 넣어주어 30분동안 실온에서 반응시켰다. 피브린 단량체에 결합된 비오티닐펜탈아민과 결합되지 않은 양고추냉이 페록시다제를 40mM 트리스 완충액으로 5번 세척하여 제거한 후, 양고추냉이 페록시다제 기질(OPP)로 발색시켜 405
Figure kpo00089
에서 흡광도를 읽었다(참조 : Lee, K. N. et al., Clin Chem. 34 : 906-910, 1988 ; Yeqing C. Song, et al., Anal. Biochem. 223 : 88-92, 1994).
실험 결과, 혈액 응고 제13인자의 농도가 1
Figure kpo00090
10mU/
Figure kpo00091
에서 직선상의 표준곡선이 나타남을 볼 수 있으며, 위 범위내에서 혈액 응고 제13인자를 정량할 수 있음을 알 수 있었다(제5도).
본 발명에서는 혈액 응고 제13인자가 완전히 제거된 피브린 단량체를 기질로 사용하고 있으며, 피브린 단량체는 대량으로 제조하기가 매우 용이하므로 경제성이 매우 높다. 더우기 피브린 단량체 또는 피브리노겐은 혈액 응고 제13인자의 천연 기질이므로 기질 특이성과 효소 반응의 재현성이 높다는 장점이 있다.
따라서, 피브린 단량체를 기질로 사용하는 혈전 용해 방법은 신속, 간단하고, 저가의 장비로 재현성 높게 혈액 응고 제13인자를 정량할 수 있으며, 새로 개발된 검사방법의 신뢰도를 검증하거나 혈액 응고 제13인자의 성질을 조사하는 데 이용할 수 있다.

Claims (7)

  1. 혈전 용해(clot lysis)방법에 의한 혈액 응고 제13인자의 활성측정방법에 있어서, 혈액 응고 제13인자가 존재하지 않는 피브린 단량체를 상기 혈액 응고 제13인자의 기질로 사용하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법.
  2. 제1항에 있어서, 혈전 용해물 중의 감마 이량체의 생성량과 감마 단량체의 감소량과의 양적 변화 비율을 측정하는 방법을 사용하고, 이때 혈전용해물을 전기영동시켜 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법.
  3. 마이크로플레이트 분석법(microplate assay)를 이용하여 혈액 응고 제13인자의 활성을 측정하는 방법에 있어서, 마이크로플레이트에 결합되는 상기 제13인자의 기질로서 상기 제13인자가 제거된 피브린 단량체를 사용하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법.
  4. 제1항에 있어서, 특히 희석 측정법(dilution-based assay)을 이용하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 혈전 용해물의 흡광도를 측정하여 혈액 응고 제13인자를 정량하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법.
  6. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브린 단량체는 피브리노겐에 트롬빈을 처리하여 얻어진 피브린 중합체를 세척하여 제조한 것임을 특징으로 하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 피브린 단량체는 피브리노겐에 트롬빈을 처리하여 얻어진 피브린 중합체를 세척하여 제조한 것임을 특징으로 하는 혈액 응고 제13인자의 활성 측정방법.
KR1019970025516A 1997-06-18 1997-06-18 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법 KR100222292B1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019970025516A KR100222292B1 (ko) 1997-06-18 1997-06-18 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법
EP98929875A EP0956363B1 (en) 1997-06-18 1998-06-16 Method of determining the enzymatic activity of the blood coagulation factor xiii using purified fibrin monomer as a substrate
AT98929875T ATE251221T1 (de) 1997-06-18 1998-06-16 Verfahren zur bestimmung der enzymatischen aktivität des blutkoagulationsfaktors xiii, das gereinigtes fibrinmonomer als substrat verwendet
PCT/KR1998/000160 WO1998058078A1 (en) 1997-06-18 1998-06-16 Method of determining the enzymatic activity of the blood coagulation factor xiii using purified fibrin monomer as a substrate
JP50419199A JP3193728B2 (ja) 1997-06-18 1998-06-16 精製フィブリン単量体を基質に用いる血液凝固▲ｘｉｉｉ▼因子の酵素活性測定方法
US09/242,436 US6406874B1 (en) 1997-06-18 1998-06-16 Method of determining the enzymatic activity of the blood coagulation factor XIII using purified fibrin monomer as a substrate
DE69818639T DE69818639T2 (de) 1997-06-18 1998-06-16 Verfahren zur bestimmung der enzymatischen aktivität des blutkoagulationsfaktors xiii, das gereinigtes fibrinmonomer als substrat verwendet

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019970025516A KR100222292B1 (ko) 1997-06-18 1997-06-18 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19990002006A KR19990002006A (ko) 1999-01-15
KR100222292B1 true KR100222292B1 (ko) 1999-10-01

Family

ID=19510077

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970025516A KR100222292B1 (ko) 1997-06-18 1997-06-18 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6406874B1 (ko)
EP (1) EP0956363B1 (ko)
JP (1) JP3193728B2 (ko)
KR (1) KR100222292B1 (ko)
AT (1) ATE251221T1 (ko)
DE (1) DE69818639T2 (ko)
WO (1) WO1998058078A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10046187A1 (de) * 2000-09-13 2002-03-21 Univ Schiller Jena Verfahren zur Messung der Aktivität von Gerinnungsfaktor XIIIa
US20070125392A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Sdgi Holdings, Inc. Systems and methods of accounting for surgical instruments and disposables
CN113025685A (zh) * 2021-03-25 2021-06-25 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 一种测定凝血因子xiii活性的方法及其在猪血制品检测中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464471A (en) * 1994-11-10 1995-11-07 Whalen Biomedical Inc. Fibrin monomer based tissue adhesive

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5453359A (en) * 1988-06-13 1995-09-26 American Biogenetic Sciences, Inc. Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers
DE3834233A1 (de) 1988-10-07 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur aktivitaetsbestimmung von transglutaminasen
DE4038899C2 (de) 1990-12-06 1995-01-19 Dempfle Carl Erik Dr Med Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Transglutaminasen (EC 2.3.2.13)
WO1992015609A1 (en) * 1991-03-11 1992-09-17 The General Hospital Corporation Compositions and methods to inhibit the activation of active factor xiii
JP3224607B2 (ja) 1992-09-11 2001-11-05 株式会社アズウェル 血液凝固第ｘｉｉｉ因子活性測定方法および該測定用試薬キット
DE4402631A1 (de) * 1994-01-29 1995-08-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Bestimmung von Gerinnungsparametern

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464471A (en) * 1994-11-10 1995-11-07 Whalen Biomedical Inc. Fibrin monomer based tissue adhesive

Also Published As

Publication number Publication date
US6406874B1 (en) 2002-06-18
WO1998058078A1 (en) 1998-12-23
EP0956363B1 (en) 2003-10-01
KR19990002006A (ko) 1999-01-15
EP0956363A1 (en) 1999-11-17
DE69818639D1 (de) 2003-11-06
JP3193728B2 (ja) 2001-07-30
JP2000501295A (ja) 2000-02-08
DE69818639T2 (de) 2004-08-05
ATE251221T1 (de) 2003-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4486999B2 (ja) 凝固パラメーターを決定するためのキット
Schwartz et al. The effect of fibrin-stabilizing factor on the subunit structure of human fibrin
Carrell et al. Hereditary dysfibrinogenemia in a patient with thrombotic disease
Soria et al. A new type of congenital dysfibrinogenaemia with defective fibrin lysis—Dusard syndrome: possible relation to thrombosis
JP3224607B2 (ja) 血液凝固第ｘｉｉｉ因子活性測定方法および該測定用試薬キット
JP3242733B2 (ja) エンドトキシン特異的測定剤
US5766869A (en) Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism
Verhovsek et al. Laboratory testing for fibrinogen abnormalities
US6156530A (en) Method for analysis of haemostatic activity
CA2311479C (en) Procedure for the determination of the activity of the protease which activates factor vii from protein solutions
Lee et al. Colorimetric assay of blood coagulation factor XIII in plasma.
KR100222292B1 (ko) 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법
US20090176310A1 (en) Detection procedures for fibrinogen and/or fibrinogen derivatives
JPS6033480B2 (ja) アンチトロンビン３の定量測定方法
US4295855A (en) Method for separating fibrinogen and its constituent components
NO309902B1 (no) FremgangsmÕte ved bestemmelse av fibrinogen
JP2714562B2 (ja) 可溶性フイブリンの測定方法
RU2732388C1 (ru) Способ определения фибриногена и оценка его функциональности
CN114958963B (zh) 一种作用于凝血酶的抗凝药物检测试剂盒及其应用
JPH05130899A (ja) 血液凝固測定方法
Exner et al. Fibrinogen Adelaide: a familial hypodysfibrinogenaemia associated with abnormal alpha chains
Van Wersch Analytical and clinical utility of a photometric assay for blood coagulation factor XIII
CN113025685A (zh) 一种测定凝血因子xiii活性的方法及其在猪血制品检测中的应用
RU2189590C2 (ru) Способ определения плазминогена
Rosenberg et al. Rapid estimation of fibrinogen in fibrinolytic and nonfibrinolytic states

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130612

Year of fee payment: 15

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140618

Year of fee payment: 16

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150703

Year of fee payment: 17

LAPS Lapse due to unpaid annual fee