DE4038899C2 - Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Transglutaminasen (EC 2.3.2.13) - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue Methode zur Bestimmung der Aktivität der Enzyme der Enzymkommisions-Nummer EC 2.3.2.13, insbesondere der Aktivität des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase), sowie ein Reagenzkit zur Durchführung der Bestimmung.

Die Blutgerinnung ist ein komplexer, in mehreren Phasen ablaufender Vorgang, der durch verschiedene physiologische und pathologische Prozesse ausgelöst werden kann und in vivo vor allem der Blutstillung dient. An der Blutgerinnung sind verschiedene, sogenannte Gerinnungs­ faktoren beteiligt. Meist handelt es sich hierbei um Proteasen, die durch hochspezifische proteolytische Wirkung auf andere Gerinnungsfaktoren diese aktivieren, oder um Cofaktoren dieser Reaktionen. Ziel dieser Reak­ tionen ist die Überführung des Fibrinogens in polymeres Fibrin. Sowohl Fibrinogen wie auch Faktor XIII erfahren durch das Enzym Thrombin, welches im Verlauf der Blutgerinnung aus Prothrombin entsteht, eine proteolytische Abspaltung von Polypeptiden. Nach Abspaltung dieser Polypeptide entsteht aus Fibrinogen Fibrinmonomer, welches spontan polymerisiert. Abspaltung des Polypeptids von der katalytischen Einheit des Faktors XIII bewirkt die Aktivierung des Enzyms. Das katalytisch inaktive Proenzym Faktor XIII findet sich im Blutplasma, sowie in Thrombocyten. Aktiver Faktor XIII katalysiert die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den polymerisierten Fibrinmolekülen und damit eine Erhöhung der mechanischen Resistenz des Fibrins. Zusätzlich wer­ den pathophysiologisch wichtige Moleküle wie Fibronectin und Alpha-2- Antiplasmin kovalent an das Fibringerinnsel gekoppelt. Die Kopplung von Fibronectin ermöglicht das Einwachsen von Zellen in Fibrin­ gerinnsel, die Kopplung von Alpha-2-Antiplasmin führt zu einer Er­ höhung der Resistenz des Fibrins gegenüber Proteasen wie Plasmin.

Transglutaminasen finden sich auch in zahlreichen Geweben und Zellen, wie Erythrocyten, Leucocyten, Endothelzellen, Leberzellen, verschiedenen Tumorzellen, etc. Diese intrazellulären Transglutaminasen zeigen ähnliche Spezifität wie Faktor XIII, sind in ihrer Aktivität jedoch nicht thrombinabhängig. Die bekannten Nachweisverfahren zur Messung der Transglutaminaseaktivität sind anhand der Proteintransglutaminaseaktivität des Faktors XIII entwickelt worden.

Lorand et al. (J. Clin. Invest. 48, Seite 1054-1064 (1964) beschreiben einen Test, in dem Faktor XIII mit Thrombin, Glutathion und Calciumchlorid aktiviert und Monodansylcadaverin und gelöstes Casein zugefügt wird. Die Reaktion wird nach 30 Minuten mit Ethanol oder Chloressigsäure abgestoppt, das ausgefallene Protein abzentrifugiert und mehrfach gewaschen, anschließend in einer 8 M Harnstofflösung wieder aufgelöst und die Fluoreszenz des incorporierten Dansylcadaverins gemessen. Die durch die Fällungs- und Waschschritte außerordentlich umständliche Methode wurde später durch Nishida et al. (Thromb. Res. 36, Seite 123-131 (1984)) verbessert, indem die Trennung zwischen dem proteingebundenen Dansylcadaverin und dem freien Dansylcadaverin durch Gelfiltration durchgeführt wird. Die Reaktion benötigt aber immer noch einige Stunden und einen relativ hohen Aufwand.

Die EP 097 853 A1 beschreibt eine Reaktion zwischen gelöstem Casein und gelöstem fluoreszierendem Cadaverin in Gegenwart von Faktor XIII und einer anschließenden Trennung des nicht reagierten Cadaverins von dem reagierten Cadaverin über Molekularsiebe. Entscheidend ist die Reaktion in homogener flüssiger Phase, durch die eine relativ umständliche Trennoperation erforderlich ist.

Nach einer etwas abgewandelten Methode läßt sich die Aktivität von Faktor XIII und anderen Transglutaminasen durch Gelelektrophorese auf Agarosegelplatten und anschließender Reaktion mit stark farbigen oder fluoreszierenden Cadaverinderivaten, Casein und Thrombin bestimmen. Auch hier muß durch relativ umständliches Fixieren und Auswaschen das überschüssige Cadaverin aus der Gelplatte entfernt werden. Die Messung erfolgt durch densitometrische Auswertung der Gelplatten (Lorand et al. (Anal. Biochem. 131, Seite 419-425 (1983)).

Die DE 38 11 647 A1 beschreibt die Reaktion von glutaminhaltigen Peptiden mit Aminen in Gegenwart von Faktor XIII in einem kinetischen System, wobei gebildetes Ammoniak gemessen wird. Die Bestimmung der geringen Ammoniakverbindungen in dieser Reaktion in Lösung erweist sich als problematisch und ungenau.

Ein anderes Verfahren mit radioaktiv markierten Aminen wird von Lorand et al. in Anal. Biochem. 50, Seite 623-631 (1972) beschrieben, wobei die Reaktionsmischung aus Faktor XIII, Thrombin, Calciumchlorid und einem radioaktiv markierten Amin (Putrescin oder Histamin) nach einer Reaktionszeit von etwa 30 Minuten mit Trichloressigsäure gestoppt und das gefällte Protein mit Filterpapier aufgefangen wird. Gründliches Waschen mit Trichloressigsäure, Ethanol und Aceton beseitigt weitgehend die nicht reagierten radioaktiven Amine und erlaubt an der Restradioaktivität den Gehalt an Faktor XIII zu bestimmen.

Ein anders verlaufendes Verfahren wird von Mousli et al. in Clin. Chem. 23/9, Seite 39-43 (1977) beschrieben. Das Verfahren nutzt die Tatsache aus, daß bei der durch Transglutaminase, in diesem Falle thrombinaktiviertem Faktor XIII, katalysierten Reaktion zwischen der freien Aminogruppe des proteingebundenen Glutamins und der freien Aminogruppe des Lysins Ammoniak frei wird, welches mit einem Kationenaustauscher gebunden und so von der übrigen Lösung getrennt wird, um es anschließend nach Berthelot zu bestimmen. Auch diese Reaktion ist relativ umständlich und durch den ungenauen Ammoniaknachweis als Mikromethode nicht sehr geeignet.

Eine wesentliche Verbesserung bringt der von Velasco beschriebene Test (Biochem. Biophys. Res. Commun. 152, Seite 505-511 (1988)). Gemäß dieser Methode wird Dansylcadaverin unter Katalyse von Faktor XIII an N,N′-Dimethylcasein gebunden und die calciumabhängige Reaktion gestoppt, indem eine aliquote Menge des Reaktionsgemisches in eine EDTA-haltige Microtiterplatte überführt wird. Ein Teil des Proteins wird an die Oberfläche der Microtiterplatte adsorbiert und vom Überstand durch Abgießen und Waschen getrennt. Freie Bindungsflächen der Microtiterplatte, welche nicht durch Protein belegt sind, werden anschließend durch Milchproteine blockiert und dann ein monoclonaler Antikörper gegen die Dansylgruppe zugegeben. Nach Auswaschen überschüssigen Antikörpers wird ein weiterer Antikörper gegen Epitope des ersten Antikörpers hinzugegen, welcher mit Peroxidase markiert ist. Nach weiteren Waschschritten wird durch Zugabe von Peroxidase-Reagenz (Farbstoff und Wasserstoffperoxid) die Peroxidaseaktivität gemessen, die letztlich einen Rückschluß auf die Transglutaminaseaktivität der ursprünglichen Probe erlaubt. Nachteilig an diesem Verfahren ist die große Anzahl der Wach- und Umsetzungsschritte.

Aus der DE 38 34 233 A1 ist bekannt, an feste Phasen gebundene physiologische Substrate des Blutgerinnungsfaktors XIII mit einer Lösung des gleichen Substrats, welches jedoch eine nachweisbare Markierung trägt, in Gegenwart der transaminasenhaltigen Probe zur Reaktion zu bringen und danach das Ausmaß der Markierung in der festen oder flüssigen Phase zu bestimmen. Die physiologischen Substrate haben als Eiweißverbindungen die Neigung, zusätzlich zu der transglutaminasevermittelten Kopplung an die bereits gebundenen Eiweißkörper, sich direkt an die festen Trägeroberflächen anzulagern, andererseits durch Reaktion der gelösten Substrate miteinander zu Präzipitaten zu führen, wodurch einerseits während der Reaktion eine Überreaktion vorgetäuscht wird, die das Ergebnis verfälscht und andererseits bereits während der Lagerung durch Präzipitation zu einer Instabilität der Lösung führen.

Ein ähnliches Verfahren wird von Lee et al. (Clin. Chem. 34/5, Seite 906-910 (1988)) beschrieben, wobei Citratplasma mit Bentonit inkubiert wird, um Fibrinogen zu entfernen und der Überstand auf eine Microtiterplatte übertragen wird und mit Thrombin inkubiert wird. Danach wird eine Lö­ sung von Calciumchlorid, N, N′-Dimethylcasein und Biotinamidopentyl­ amin zugefügt. Die Reaktion wird mit EDTA gestoppt und zur Insolubili­ sierung eine aliquote Menge auf eine andere Microtiterplatte übertragen. Nach dem Waschen wird eine Streptavidin-β-Galactosidaselösung zuge­ fügt. Die adsorbierte Galactosidaseaktivität wird durch die Freisetzung von p-Nitrophenol aus p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid bestimmt und bildet ein Maß für die Konzentration des Faktors XIII. Auch diese Metho­ de ist noch sehr aufwendig und durch die verschiedenen Übertragungs­ schritte ungenau.

Es bestand daher die Aufgabe, eine einfaches, mit möglichst wenigen Reagenzien und Reaktions- und Waschschritten auskommendes ana­ lytisches Verfahren zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase) und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13 zu finden, das möglichst automatisierbar und von ungeschulten Fachkräften durch­ führbar ist.

Die Lösung dieser Aufgabe ist in dem Hauptanspruch wiedergegeben. Die Unteransprüche dienen zur Förderung dieses Verfahrens.

Dadurch, daß die Microtiterplatten zunächst mit dem Protein oder Polypeptid, vorzugsweise mit Casein belegt werden, kann dieses in opti­ maler Konzentration eingesetzt werden, so daß alle aktiven Stellen der Microtiterplatte, an die sich solche Proteine oder Polypeptide anlagern können, blockiert werden. Dadurch wird die im Verfahren von "Velasco" und "Lee" notwendige Stufe, zwischen der Anlagerung des Caseins und der Reaktion mit den Antikörpern zunächst freie aktive Zentren der Mi­ crotiterplatte mit Milchproteinen zu blockieren, eingespart. Auch die in den Verfahren von "Velasco" und "Lee" notwendige Blockierung der im reaktiven Protein enthaltenen freien Aminogruppen von Lysinresten des Proteins durch Methylierung oder Acetylierung wird überflüssig, da durch die Fixierung des Proteins auf der Oberfläche der Microtiterplatte aus Gründen der fehlenden Mobilität der Proteine zueinander diese freien Aminogruppen nicht mehr in Wechselwirkung mit freien Aminogrup­ pen der Glutaminreste des Proteins treten können. So stehen alle freien Aminogruppen der Glutaminreste des Proteins für die Reaktion mit dem löslichen primären Amin der Reaktionsmischung zur Verfügung. Gleichzeitig vergrößert sich zudem die Auswahl der für das Verfahren einsetzbaren Proteine und Peptide.

Bei verschiedenen handelsüblichen Microtiterplatten aus Kunststoff, beispielsweise solchen aus Polystyrol, ist die Oberfläche so beschaffen, daß Proteine und Peptide in ausreichendem Maße nichtkovalent zu binden. Als Reaktionsgefäße können natürlich auch solche aus anderen Kunst­ stoffen wie Polyethylen, Polycarbonat oder Polypropylen verwendet wer­ den. Soweit diese die erforderlichen Proteine und Peptide nicht in aus­ reichendem Maße adsorbieren, kann die Oberfläche zusätzlich durch Glutaraldehyd, Cyanbromid oder andere Aktivatoren aktiviert werden.

Die Form der Reaktions- und Meßgefäße ist natürlich völlig variabel, so können bespielsweise Kunststoffreagenzröhrchen oder Zentrifugen­ röhrchen oder Photometerküvetten verschiedenster Form verwendet wer­ den. Am einfachsten und preiswertesten ist die Durchführung der Teste mit handelsüblichen Microtiterplatten, beispielsweise mit 96 Vertiefun­ gen von jeweils 300-400 µl Volumen, oder Microtiterstrips mit 8, 12 oder 16 Vertiefungen von ebenfalls 300-400 µl Volumen, da diese sich für die Durchführung von Reihenversuchen besonders gut eignen.

Als Protein wird insbesondere Casein verwendet, da sowohl Faktor XIII wie auch Gewebe- und Zell-Transglutaminasen mit diesem Substrat reagieren. Jedoch können auch andere glutaminhaltige Substrate in gleicher Weise eingesetzt werden. Neben Caseinfraktionen oder proteo­ lytischen Caseinderivaten kommen dafür natürliche Faktor XIII- oder Transglutaminasesubstrate wie Fibrinogen, Collagen, Fibronectin, Thrombospondin, etc. sowie Derivate und Fragmente dieser Proteine ebenso in Frage wie natürliche und synthetische Peptide, die das zur Reaktion notwendige Glutamin enthalten.

Voraussetzung ist, daß die Substanzen absolut frei von Transglutaminase sind, was bei nativem Fibrinogen und Fibronectin nicht immer gewährleistet ist. Da sich die glutaminhaltigen Substrate in ihrer Reak­ tionsfähigkeit mit den Transglutaminasen wie auch in ihrer Bindungs­ fähigkeit an die Kunststoffoberflächen der Reaktionsgefäße unterschei­ den, ist es erforderlich, bei der Messung der Transglutaminaseaktivität Kontrollproben mit bekannter Aktivität mitzuführen.

Die Bindung des glutaminhaltigen Substrates an das Reaktionsgefäß (die Microtiterplatte) kann entweder kurz vor der eigentlichen Durchführung der Bestimmungen erfolgen, es können aber auch die beschichteten Plat­ ten unter sterilen Bedingungen gefertigt und gelagert werden.

Für das reaktive primäre Amin der Formel I sind solche besonders geeignet, welche eine lineare Methylenkette mit 4-8 C-Atomen besitzen, wobei solche mit 5-6 C-Atomen besonders bevorzugt sind. Bei kürzeren Ketten ist aus sterischen Gründen offensichtlich eine Reaktion nicht mehr möglich, bei längeren Ketten nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit stark ab. Als Substituenten -X- der Formel (I) kommen praktisch alle Gruppen in Frage, welche die Transglutaminasereaktion nicht stören, jedoch eine Antikörperreaktion eingehen. Größere, gegebenenfalls substi­ tuierte carbozyklische Gruppen sind besonders geeignet, wobei eine gewisse Hydrophobizität die Reaktionsfähigkeit der nucleophiolen primären Aminogruppe zu erhöhen scheint.

Die aus der Literatur bekannten Substrate Dinitrophenylcadaverin, Biotinamido-pentylamin und Dansylcadaverin sind daher beispielsweise geeignet.

Neben monoclonalen Antikörpern können auch polyclonale Antikörper verwendet werden, sofern diese für die vorstehenden Substrate genügend spezifisch sind und in ausreichend reiner Form verfügbar sind, so daß eine Kopplung mit einem Indikatorenzym möglich ist. Eine Reinigung derartiger polyclonaler Antiseren kann durch Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie erfolgen. In jedem Fall muß durch eine Kontrollreaktion mit Faktor XIII-freiem Plasma bzw. trans­ glutaminasefreier Probe geprüft werden, daß bei solchen polyclonalen Antikörpern keine Reaktivität mit den normalen Plasma- oder Probenkomponenten oder Komponenten der Beschichtungslösungen der Reaktionsgefäße besteht.

Als Markierung für die verwendeten Antikörper kommt vorzugsweise ein Enzym in Frage, um dadurch die Analysenempfindlichkeit entsprechend zu steigern. Die in der Technik gebräuchlichen Markierungen mit alka­ lischer Phosphatase, Peroxidase oder Urease können auch für diese Teste mit Vorteil eingesetzt werden. Entsprechende Nachweisreagenzien sind bekannt, beispielsweise seien für die alkalische Phosphatase p-Nitro­ phenylphosphat, für Peroxidase 2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sul­ fonsäure) oder o-Phenylendiamin und für Urease Bromcresolpurpur ge­ nannt.

Soweit es für die Nachweisempfindlichkeit ausreicht, können auch Markierungen mit chromophoren, insbesondere fluoreszierenden Grup­ pen verwendet werden, wodurch die zusätzlichen Nachweisreaktionen verbleiben und die Reaktion direkt photometrisch verfolgt werden kann. Radioaktive Markierungen sind wegen der damit verbundenen Sicher­ heitsvorkehrungen und des apparativen Aufwandes in vielen Laborato­ rien nicht erwünscht, jedoch läßt sich selbstverständlich das erfindungs­ gemäße Verfahren auch durch eine radioaktive Markierung entweder des eingesetzten primären Amins, oder des verwendeten Antikörpers durchführen. Im ersteren Falle kann bereits die Stufe der Antikörper­ markierung des Reaktionsproduktes entfallen, in dem zweiten Fall kann erst anschließend an diese Markierung und die Auswaschung über­ schüssiger Antikörper eine Radioaktivitätsmessung der gebundenen Sub­ strate erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere auf den Nachweis des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasmatransglutaminase) ausgearbeitet worden, jedoch können auch die anderen Enzyme der Nummer EC 2.3.2.13 auf diese Weise bestimmt werden.

In den folgenden Beispielen ist die Erfindung näher beschrieben, ohne daß dadurch eine Beschränkung beabsichtigt ist.

Beispiel 1 Belegen einer Microtiterplatte mit Casein a) Nichtkovalente Bindung durch hydrophobe Interaktion

Gereinigte Microtiterplatten mit 96 Vertiefungen à 400 µl aus Polystyrol werden mit einer Lösung aus Casein in 0.1 M Phosphat­ puffer pH 8.0, oder 0.05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und 0.1 M NaCl, pH 8.5 bei 37°C inkubiert. Die optimale Konzentration des Caseins liegt zwischen 3 und 6 µg/ml Lösung, die Inkubations­ zeit bei 37°C sollte mindestens 2 Stunden und höchstens 24 Stunden betragen. Die Microtiterplatten werden anschließend entleert und mit einer Pufferlösung, beispielsweise mit gepufferter NaCl-Lösung gespült.

b) Kovalente Bindung nach Aktivierung mit Glutaraldehyd

Gereinigte Microtiterplatten mit 96 Vertiefungen à 400 µl aus Polystyrol werden mit einer Lösung aus 0.25% Glutaraldehyd in 0.1 M Phosphatpuffer pH 5.0 für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lö­ sung wird ausgekippt, die Platten mit 0.1 M Phosphatpuffer pH 5.0 gewaschen, mit der Caseinlösung aus 3-6 µg/ml Casein in 0.1 M Phosphatpuffer pH 8.0 gefüllt und zwischen 2 und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wird anschließend ausgekippt und die Platten 1 Stunde mit einer Lösung aus 0.1 M Glycin oder Ethanolamin in 0.1 M Phosphatpuffer pH 8.0 bei 37°C inkubiert, um freie aktive Gruppen zu blockieren. Die Microtiterplatten werden an­ schließend entleert und mit einer Pufferlösung, beispielsweise mit gepufferter NaCl-Lösung gespült.

Die Auswirkung der Caseinkonzentration in der Caseinlösung auf die Empfindlichkeit des Tests für zwei Typen von Polystyrol-Microtiterplatten mit und ohne Glutaraldehydaktivierung ist in Abb. 1 und 2 gezeigt. Eine optimale Empfindlichkeit wird in einem Konzentrations­ bereich von 1-10, vorzugsweise von 3-6 µg Casein pro ml Pufferlösung erzielt.

Abb. 3 zeigt vergleichende Versuche mit Casein und dem proteo­ lytischen Fibrinogenfragment D als Beschichtungsmaterial. Sowohl Ca­ sein wie Fibrinogenfragment D zeigen eine der Transglutaminase­ aktivität des Faktors XIII proportionale empfindliche Reaktion. Die Mes­ sungen für die Abb. 1, 2 und 3 wurden gemäß Beispiel 2 und 3 mit standartisierten Proben bekannter Faktor XIII-Aktivität durchgeführt.

Beispiel 2 Durchführung der Transglutaminasereaktion zur Messung der Faktor XIII-Aktivität a) Pufferlösung zur Probenverdünnung

Eine Pufferlösung wird hergestellt aus:
0.05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und
0.05 M Natriumchlorid,
und der pH mit 1 M HCl auf einen Wert von 7.4 eingestellt.

Die eingesetzten Proben werden mit dem Probenverdünnungspuffer verdünnt, wobei zur Messung der Faktor XIII-Aktivität im menschlichen Blutplasma eine Verdünnung zwischen 1 : 15 und 1 : 40, insbesondere 1 : 20 verwendet wird. Für andere Proben ergeben sich andere Verdünnungsfaktoren.

b) Pufferlösung zum Waschen der Microtiterplatten

Eine Puffer-Stammlösung wird hergestellt aus:
0.2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7.4,
1.4 M Natriumchlorid,
0.003 M Kaliumchlorid,
0.5% Tween 20 (Polyethoxysorbitanlaureat)
und vor Gebrauch 1 : 10 mit destilliertem Wasser verdünnt.

c) Substratlösung

Die Substratlösung des aktiven Amins wird hergestellt aus:
0.1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer, pH 7.4,
0.1 M Natriumchlorid,
0.06 M Calciumchlorid,
0.005 M Dithioerythritol (DTE),
0.001 M Dinitrophenylcadaverin (DNPC).

d) Thrombinlösung

1000-1500 NIH U lyophilisiertes Thrombin werden in 10 ml destil­ liertem Wasser gelöst.

Durchführung der Reaktion

Eine Microtiterplatte (96 Vertiefungen) gemäß Beispiel 1 wird mit Lösung b) gespült. Je Vertiefung werden 100 µl verdünnte Probe, 100 µl Sub­ stratlösung c) und 100 µl Thrombinlösung eingefüllt (2 bis 3 Parallelver­ suche pro Probe und Kontrolle mit Standardplasma mit bekannter Trans­ glutaminasekonzentration und Faktor XIII-Mangelplasma). Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird der Reagenzüberstand mit Lösung b) ausgespült.

Beispiel 3 Verstärkung der Meßempfindlichkeit durch das Antikörper-Enzymkonjugat

Microtiterplatten gemäß vorstehendem Beispiel werden anschließend an die Substratreaktion mit 250 µl Vertiefung einer Anti-Dinitrophenyl- Antikörperkonjugat-Lösung aus 25 µl Antikörperkonjugat (Phosphatase­ markiert) und 25 ml Lösung b) versetzt und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Das Antikörper-Enzymkonjugat wird durch Glutaraldehyd-Kopplung aus kommerziell erhältlichem Antikörper (Fa. Sigma, Deisenhofen) und kommerziell erhältlichem Enzym alkalische Phosphatase (Fa. Boehringer, Mannheim) nach einer von Harlow und Lane beschriebenen Methode hergestellt (Harlow E, Lane D, Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA. (1988)). Andere Methoden zur Kopplung von Antikörpern und Enzymen können im beschriebenen Verfahren ebenso eingesetzt werden.

Nach der Inkubation wird die Microtiterplatte mit Lösung b) gewaschen und mit 250 µl Phosphatase-Substratlösung pro Vertiefung versetzt.

Zur Herstellung der Phophatase-Substratlösung werden gemischt:
5 ml 1 M Diethanolamin, 0.01 M Magnesiumchlorid, pH 9.5,
15 mg p-Nitrophenylphosphat (Substrattablette, z. B. Fa. Sigma, Deisen­ hofen),
20 ml destilliertes Wasser.

Anschließend wird die Absorption bei 405 nm photometrisch gemessen. Die Messung kann kinetisch durch Messungen nach festgelegten Inkuba­ tionszeiten, vorzugsweise nach 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten, oder durch Endpunktmessung nach Hinzufügen eines Stopreagenzes, vorzugsweise 50 µl pro Vertiefung einer 3 M NaOH-Lösung, durchgeführt werden.

Durch Vergleich mit der Absorption der Kontrollen wird die Faktor XIII- Aktivität errechnet. Eine entsprechende Eichkurve ist in Abb. 4 gezeigt.

Claims (10)

1. Verfahren zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase) und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13, wobei

• a) Microtiterplatten aus Kunststoffen oberflächlich mit Proteinen oder Peptiden beschichtet werden, welche Glutamin enthalten,
• b) Calciumchlorid, eine als Reduktionsmittel wirkende Thioverbindung, eine Verbindung mit einer primären Aminogruppe der allgemeinen Formel I NH₂-(CH₂)_n-X (I)in welcher n eine ganze Zahl von 4-8 und X eine inerte, mit spezifischen Antikörpern koppelnde Gruppe bedeutet,
  sowie eine Transglutaminase-haltige Probe auf der beschichteten Microtiterplatte zur Reaktion gebracht werden, wobei zur Bestimmung von Blutgerinnungsfaktor XIII noch Thrombin zur proteolytischen Aktivierung der Transglutaminase zugefügt wird,
• c) die durch Transglutaminase an die Platte gebundenen Amine mit einem markierten Antikörper gegen die Gruppe X umgesetzt,
• d) die Menge des gebundenen Amins bzw. des Antikörpers mittels eines geeigneten Nachweisreagenzes bestimmt,
• e) und jeweils zwischen den einzelnen Schritten gelöste Reagenzreste ausgewaschen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Amin der Formel I Dinitrophenylcadaverin ist und mit einem enzymmarkierten Antikörper gegen Dinitrophenylgruppen umgesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit alkalischer Phosphatase, Peroxidase oder Urease markiert ist und mit einem Phosphatase-, Peroxidase- bzw. Urease-Reagenz bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper radioaktiv markiert ist und die Radioaktivität gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Amin oder der Antikörper mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert ist und die Fluoreszenz gemessen wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in gepufferten Lösungen bei pH-Werten von 7.0 bis 8.5, vorzugsweise bei pH 7.4, und Temperaturen von 20-40°C, vorzugsweise 20-37°C, durchgeführt werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Microtiterplatten mit Caseinlösung beschichtet werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Thioverbindung Dithioerythritol (DTE, erythro-1,4-Dimercapto-2,3-butandiol) oder Dithiothreitol (DTT, threo-1,4-Dimercapto-2,3-butandiol) ist.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Thrombin Rinderthrombin oder Humanthrombin ist.

10. Reagenzkit zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase) und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13, bestehend aus:

• a) Microtiterplatte aus Kunststoff,
• b) Beschichtungslösung mit Proteinen oder Peptiden, welche Glutamin enthalten, in gepufferter Lösung, oder
  Microtiterplatten, welche mit Proteinen oder Peptiden, die Glutamin enthalten, vorzugsweise Casein, beschichtet sind
• c) einer Reagenzlösung aus Calciumchlorid, einer Thioverbindung und einem primären Amin der Formel I, NH₂-(CH₂)_n-X (I)
• d) gegebenenfalls einer Thrombinlösung zum Nachweis thrombinabhängiger Transglutaminasen,
• e) einer markierten Antikörperlösung gegen die Gruppe X des Amins der Formel I,
• f) einem Nachweisreagenz für die Markierung des Antikörpers e),
• g) Pufferlösungen zum Waschen,
• h) gegebenenfalls Eichlösungen mit normierter Trans­ glutaminase-Aktivität.