JP2000501295A - 精製フィブリン単量体を基質に用いる血液凝固▲ｘｉｉｉ▼因子の酵素活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は精製されたフィブリン単量体（fibrin monomer）を酵素基質として用いることによる、血液凝固XIII因子の酵素活性測定方法に関する。血液凝固XIII因子によって形成したフィブリン単量体の架橋程度を測定することによって、酵素活性を決定する。また、血液凝固XIII因子を含まないフィブリン単量体は、そのプレパラートをクエン酸溶液で洗浄することによって得られる。本発明の方法は、血液凝固XIII因子に対する他の酵素分析方法を調べたり、血液凝固XIII因子の性質を研究するのに効果的に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 精製フィブリン単量体を基質に用いる血液凝固XIII因子の酵素活性測定方法 〔発明が属する技術分野〕 本発明は、精製フィブリン単量体を基質に用いる血液凝固XIII因子の酵素活 性測定方法に関する。より詳しくは、血液凝固XIII因子が含まれていないフィブ リン単量体を基質に使用して、血液凝固XIII因子により形成されたフィブリン架 橋の程度を測定することによる、血液凝固XIII因子の酵素活性測定方法に関する 。 〔発明の背景〕 血液凝固XIII因子は、血液中で酵素源（zymogen）として循環しているが、 カルシウムイオンの存在下でトロンビンにより活性化され、アシル転位反応を触 媒する転移グルタミナーゼ（trans-glutaminase）の一つである。血液凝固XIII 因子は、フィブリン分子のライシン残渣とグルタミン残渣との間にイソペプチド 架橋を生成することによって、フィブリン分子の共有結合架橋の触媒として働く 。血液凝固XIII因子に対して特異性を有する基質は、普通、血小板内物質、単球 、上皮細胞表面の巨大分子、又は、血液中を循環している巨大分子であり、具体 的には、フィブリン−フィブリン；フィブリン−フィブリン（フィブリノゲン） ；フィブリン−α２−プラスミノゲン抑制因子；フィブリン−フィブロネクチン （Fibronectin）；フィブリノゲン−コラーゲン；フィブリン−フォンビレブラ ント因子（von Willebrand factor）；トロンボスポンディン；（Thrombospondi n）−トロンボスポンディン；血液凝固Ｖ因子−アクチン；フォンビレブラント 因子−コラーゲン；フィブロネクチン−ミオシン（Myosin）；アクチン−ミオシ ン；ゲルソリン（Gelsollin）−フィブリンまたはゲルソリン；ビンキュリン（V incullin）−フィブリンである（Karges，H．E.，Clemens，R.，Behring Inst． Mitt．８２：４３−５８，１９８８）。 血液凝固XIII因子は、機械的に強度が強いフィブリン凝固物を作り止血及び 傷部位の治療の役割を果たし、細胞増殖、腫瘍細胞成長と転移そして動脈硬化に も効果を及ぼす。そして病理的な状態（先天的、後天的出血症、慢性腎不全、悪 性腫瘍、肝疾患）にしたがい血液凝固XIII因子の濃度が多様に変わるものと知ら れている。 血液凝固XIII因子は、生理学的分野において重要な役割を果たし、また、血 液凝固XIII因子の濃度は、病理的状態により変化するため、臨床分野で血液凝固 XIII因子の酵素活性を測定することによる病理診断が求められている。この他に も血液凝固XIII因子を有効成分として包含する医薬品の検定に、血液凝固XIII因 子の酵素活性を測定する分析方法が求められている。また、血液凝固XIII因子の 特性研究などにも前記分析方法が求められている。 いままで血液凝固XIII因子の定量法が大いに開発されてきて、その種類とし てはクロット溶解（Clot lysis）法、架橋フィブリンのSDS−PAGE法、トロンボ エラストグラフィー（Thromboelastography）法、標識または非標識アミンの結 合法、トランスアミデーション（transamidation）におけるアンモニア生成法、 合成機材測定法、免疫測定法などがある（Karges，H．E.，Clemens，R.，Behrin g Inst．Mitt．８２：４３−５８、１９８８）。しかし、日常的な分析に適合す る迅速で簡単な定量法はいままで開発されていない。 従来のクロット溶解方法は、試料中の血液凝固XIII因子の酵素活性を測定す る。この方法の基本は、溶剤（１％モノクロロ酢酸）をフィブリン凝固物に加え たとき、フィブリン凝固物が溶剤に溶解しない最低濃度（endpoint）で希釈され た標準血漿中の血液凝固XIII因子の酵素活性は、不溶のフィブリン凝固物を作る 最大希釈因子によって希釈された試料中の血液凝固XIII因子の酵素活性と同じで あるということにある。（フィブリン凝固物は、適当な希釈倍率で希釈された標 準血漿（血液凝固XIII因子含有）と試料に、トロンビン／カルシウム溶液を加え ることにより生成する。）したがって、試料の血液凝固XIII因子の濃度（mU／ml ）は標準血漿中血液凝固XIII因子の濃度にフィブリン凝固物を不溶にする試料の 希釈倍数を乗じて得られる。 この分析方法は簡単で、高価な装備が必要でもないし、臨床病理実験室にお いて血液凝固の酵素活性の測定に容易に用いられる。しかし、血液凝固XIII因子 がフィブリノゲンに強く結合しているので、フィブリノゲンから血液凝固XIII因 子を除去し難く、また、クロット溶解方法の基質である血液凝固XIII因子を含ま ないフィブリノゲンは相当高価であるという問題点があった。 したがって、本発明者は、迅速かつ経済的に血液凝固XIII因子の酵素活性を 測定でき、再現性の良い新しくて簡単な方法を開発するために鋭意検討した。そ の結果、血液凝固XIII因子を含まないフィブリン単量体を基質として用い、血液 凝固XIII因子により形成したフィブリン架橋の程度を測定すれば経済的で迅速に 血液凝固XIII因子の酵素活性を測定することができることを確認して本発明を完 成した。 〔発明の要旨〕 本発明においては血液凝固XIII因子を含まないフィブリン単量体を基質に使 用して、血液凝固XIII因子により生成したフィブリン架橋の程度を測定すること による血液凝固XIII因子の酵素活性測定方法を提供する。 また、本発明においては、トロンビン処理したフィブリノゲンから得られた 非共有（non-covalent）フィブリン重合体を適切な溶媒で洗浄して、血液凝固XI II因子のないフィブリン単量体を製造する方法を提供する。 〔図面の簡単な説明〕 図１は、血液凝固XIII因子の外部からの添加を触媒としてフィブリン単量体 からγ−γ二量体が生成することを示す、フィブリン単量体の電気泳動図（１０ ％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル）である。レーン１はフィブリン単量体を示 し、レーン２−５は、血液凝固XIII因子の濃度が０（レーン２）から４０mU／ml （レーン１５）まで増加したときのそれぞれの濃度での血液凝固XIII因子により 触媒されたフィブリン単量体を示している。全てのフィブリン単量体プレパラー トは、血液凝固XIII因子の活性化のために、トロンビンを加えて、３７℃で１時 間保持された。 図２は、フィブリン単量体に対する血液凝固XIII因子の酵素反応活性化を示 すγ鎖濃度の減少とγ−γ二量体濃度の増加を示す。 図３は、フィブリン凝固物の１％モノクロロ酢酸溶液に対する溶解度を示し 、光学濃度２８０nmで示されている。フィブリン凝固物は、フィブリン単量体と 血液凝固XIII因子との反応により生成したものである。 図４は、既存の血液凝固XIII因子分析方法であるＣ¹⁴プトレッシン（putres cine）結合法と本発明のクロット溶解方法とが一次相関（ｒ＝０．９５、ｎ＝１ ５）にあることを示す。 図５は、フィブリン単量体のマイクロプレート法により得られた血液凝固XI II因子濃度による標準曲線を示す。 〔発明の詳細な説明〕 本発明においては、先ず、血液凝固XIII因子の基質として高純度のフィブリ ン単量体を準備する。本発明においては、トロンビン処理によりフィブリノゲン から得られた非共有（non-covalent）フィブリン重合体を適当な溶媒で洗浄して 、血液凝固XIII因子を含まない高純度フィブリン単量体を準備する。このとき溶 媒としてはクエン酸塩（citrate）溶液を使用するのが望ましい。 血液凝固XIII因子が完全除去されたフィブリン単量体の製造原理は、以下の 通りである。 トロンビンによるタンパク質分解の結果、フィブリノゲンはフィブリン単量 体とフィブリノペプチドA、Bに分離され、このとき溶解性タンパク質であるフィ ブリン単量体は水素結合によって規則的に配列して非共有フィブリン重合体にな る。この非共有重合体を適切な溶液で洗浄することで、フィブリン重合体に強く 結合している血液凝固XIII因子を完全に除去することができる。 本発明においては、先に精製したフィブリノゲンを適当量のトロンビン（望 ましくはフィブリノゲン１ｇ当り２５Ｕ）で処理して非共有フィブリン重合体を 得る。これを５Ｍ尿素溶液に溶解させ、その後２ｍＭ氷酢酸溶液で透析した。透 析完了後、溶解されない凝固物を濾過により除去した。 前記工程で製造されたフィブリン単量体が、完全に血液凝固XIII因子が除去 された純粋なものであることは、前記フィブリン単量体にトロンビンと塩化カル シウムを添加した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にγ−γ二量体バンド が検知されないことにより確認した。その結果、反応前のフィブリン単量体溶液 中と反応後のフィブリン凝固物中にγ−γ二量体が見られないので、本発明のフ ィブリン単量体からは血液凝固XIII因子が完全に除去されたものであることがわ かった。 前記の高純度フィブリン単量体を基質として血液凝固XIII因子により形成さ れたフィブリン架橋の程度を測定して、血液凝固XIII因子の酵素活性を測定する 。また、このような方法で転移グルタミナーゼの活性も測定することができる。 本発明の血液凝固XIII因子の酵素活性の測定方法の基本原理は次の通りであ る。 血液凝固XIII因子がカルシウムの存在下で、トロンビンにより活性化され、 この活性化された血液凝固XIII因子を触媒としてγ鎖が架橋してγ−γ二量体が 生成される。これは部分的溶解性二量体であり、その後、次第にα鎖からα重合 体が生成するにつれて非溶解性重合体が形成される。全反応速度は、血液凝固XI II因子の酵素活性に比例するが、しかしながら、α重合体の生成速度はγ−γ二 量体の生成速度に比べて非常に遅い。前記事実を利用して血液凝固XIII因子の酵 素活性を測定することができる。 詳細には、血液凝固XIII因子の濃度を測定する方法としては、フィブリン凝 固物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による方法、形成されたγ−γ 二量体とγ単量体の量的変化比率を測定する方法、溶解したフィブリン凝固物の 吸光度を測定する方法、血液凝固XIII因子のマイクロプレート定量法、クロット 溶解方法などを利用することができる。 本発明においては、フィブリン単量体溶液に血漿試料を希釈因子の次数を増 加させて添加したあと、カルシウムとトロンビン存在下で架橋反応させた。前記 反応結果生成したフィブリン凝固物を尿素溶液で溶解させ、ＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により、生成したγ−γ二量体のバンドを測定した。その 後、試料中の血液凝固XIII因子の酵素活性を既知の血液凝固XIII因子活性を持つ 標準血漿と比較して決定した。 また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の対応するバンドの密度測 定を利用して、形成されたγ−γ二量体とγ単量体の量的比率から、上記活性を 測定した。また、血液凝固XIII因子の酵素活性に逆比例するフィブリン凝固物の 溶解度を求めるために、フィブリン凝固物の溶解後の溶液の吸光度を測定した。 マイクロプレート定量法は、フィブリン単量体を付したマイクロプレートを 、カルシウム、トロンビン存在下で、血液凝固XIII因子の基質としてビオチニル ペンチルアミンを添加して反応させた後、フィブリン単量体を付したマイクロプ レートへのビオチニルペンチルアミンの導入量をストレプトアビジン共役パーオ キシダーゼを用いて血液凝固XIII因子を定量した。 また、純粋なフィブリン単量体を基質にした既存の凝固物溶解方法により、 血液凝固XIII因子の定量が可能である。 本発明においては、凝固物溶解方法の再現性を評価し、血液凝固XIII因子の 酵素活性を測定する方法の一つである、Ｃ¹⁴−プトレッシン結合法との相関関係 を調査した結果、実験内（intra assay）と実験間（inter assay）の変異係数（ coefficient of variance: CV）がそれぞれ３．７％及び５％の高い再現性を見 せていることを確認し、０．９５の高い相関関係をみせた（p＞0．01）。したが って本発明の測定方法は再現性が高い有用な方法であることを確認した。 本発明で使用した試薬は次の通りである。 試薬としては、１Ｍトリス−アセテート（１２５mM塩化カルシウム含有、pH ８．０）、１w/v％モノクロロ酢酸水溶液、標準血漿（血液凝固XIII因子）、希 釈液（0．４％アルブミン、0．１５M 塩化ナトリウム）、カオリン（kaolin）、 血液凝固XIII因子を含まないフィブリン単量体、トロンビン溶液（２００U／ml ）、２mM氷酢酸などを使用した。１Ｍトリス−アセテート、１％モノクロロ酢酸 水溶液、希釈液、カオリン、凍結乾燥したフィブリン単量体、２mM氷酢酸は冷蔵 庫内で数ヶ月間安定し、標準血漿は−７０℃で安定し、室温では４時間以内に使 用しなければならない。 標準血漿（血液凝固XIII因子）はベーリング（Behring）社の標準ヒト血漿 を使用し、トロンビン、２０％アルブミン、フィブリノゲンは（株）韓国緑十字 製を使用し、カオリン、モノクロロ酢酸、トリズマベース（trisma base）、塩 化カルシウム、塩化ナトリウム、透析管（１２，０００Da以下除去）、ε−アミ ノカプロン酸（ε−amino caproic acid、以下“EACA”という）はシグマ社、尿 素はICNバイオケミカル社、そして氷酢酸、クエン酸ナトリウムはリデルディヘ ン社（Riedel deHaen）のものを使用した。一方、試料は健康な人から得た血漿 であり、−２０℃で保管して使用した。 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。下記実施例は本発明を例示す るものであり、本発明の内容がこれに限定されるのではない。 ＜実施例１＞血液凝固XIII因子を含まないフィブリン単量体の製造 グリシン沈殿法で沈殿させたフィブリノゲンを０．０５Ｍシトレート緩衝液 （pH５．５−８．０、望ましくは６．８，０．１５M 塩化ナトリウム）に４℃で １時間冷浸させて溶かした。この溶解液のタンパク質濃度を５mg/mlに調整した あと、EACAを最終濃度が５０mMになるようにフィブリノゲン溶液に入れ込んで３ ０分間室温で保温させたあと、ここに固体グリシンを１５０g/L入れフィブリノ ゲンを再び沈殿させた。沈殿物を遠心分離（１５，０００xg、３０分）して上澄 液を除去し沈殿物を再びタンパク質濃度を１０mg/mlに調整した前記緩衝液に溶 解させた。フィブリン凝固物を得るために、トロンビンをフィブリノゲン１ｇ当 り２５Ｕになるように入れて３７℃で反応させた。フィブリン凝固物が生成する とすぐに、凝固されるフィブリン凝固物をガラス棒で巻き上げ、巻き上げた凝固 物をハサミでみじん切りした。前記緩衝液で洗浄（好ましくは５回）して凝固物 に溶けているタンパク質を完全に除去したあと、すぐに５Ｍ尿素に溶解させた（ このときフィブリノゲンの濃度を１３mg／ml以上に調整して同時に溶解時間が３ ０分を超えないようにする）。前記溶解液を２mM氷酢酸溶液に対して透析を実施 した。透析初期には透析管内に存在する尿素が減少するにつれて凝固物が形成さ れるが次第に凝固物は２mM氷酢酸により溶解された。溶解されない残渣を濾過に より除去し、濾液を凍結乾燥させた。凍結乾燥したフィブリン単量体を４℃で保 管した。 ＜実施例２＞製造したフィブリン単量体中の血液凝固XIII因子の存在有無の確認 実施例１から製造したフィブリン単量体に血液凝固XIII因子が不純物として 存在するのかを調べるために、ランリー（Laemmli）法（Nature誌、１９７０年 、２２７号、６８０−６８５頁）により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動を実施した。もし、フィブリン単量体溶液中で、血液凝固XIII因子の酵素活 性があれば、トロンビンと塩化カルシウムの存在下でγ−γ二量体が形成し、Ｓ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で検知できる。 凍結乾燥されたフィブリン単量体を１ｗ／ｖ％濃度になるように２mM氷酢酸 溶液に溶解して、標準血漿を希釈液に血液凝固XIII因子の濃度がそれぞれ０，０ ．０２８、０．０５５、０．１１、０．２２、０．４４、０．８８、１．７５、 ２．５０、５．００、１０．００、２０．００、３０．００、４０．００mU/ml になるように希釈したあと、それぞれ希釈した標準血液凝固XIII因子２００μｌ を１０mｌガラス試験管に入れた。カオリンを０．６ｗ／ｖ％になるように希釈 液で溶解させたあと、２００Ｕ／mlのトロンビン溶液２００μｌと０．６％カオ リン溶液２．２mlと１Ｍトリス−アセテート（１２５ｍＭ塩化カルシウム含有、 ｐＨ＝８．０）０．８mlをよく混合し、最終濃度として０．４M トリス−アセテ ート、５０mM塩化カルシウム、１０Uトロンビン、pH８．０を得た。上記トロン ビン／カルシウム／カオリン溶液１００μｌを上述のガラス管に入れ弱くとり混 ぜて、すぐフィブリン単量体溶液を１００μl入れたあと、１−２回振り混ぜ、 ３７℃で１時間反応させた。反応のあと、８M尿素１mlでフィブリン凝固物を溶 解させて溶解液３０μｌを１０％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析 し、γ−γ二量体バンドを測定した（図１）。 レーン１はフィブリン単量体を、レーン２〜１５は活性化された血液凝固XI II因子の濃度が０（レーン２）から４０mU/ml（レーン１５）に増加するに従っ ての、その因子を触媒として得られたフィブリン単量体を表している。 反応前のフィブリン単量体と反応後のフィブリン凝固物にすべてγ−γ二量体 バンドが見られなかった。したがって、実施例１のフィブリン単量体で血液凝固 XIII因子が完全に除去されたことを確認した。 ＜実施例３＞製造したフィブリン単量体の血液凝固XIII因子の基質としての検討 実施例１によるフィブリン単量体が血液凝固XIII因子の基質として用いられる かどうかを次の通り確認した。血液凝固XIII因子を各種濃度で実施例２のように 実験したあと、形成されたγ−γ二量体とγ単量体の比率をＳＤＳポリアミドゲ ル電気泳動での対応バンドの密度測定により定量した。 図２は、γ鎖の濃度の減少とγ−γ二量体の濃度の増加を示しており、フィブ リン単量体が血液凝固XIII因子の酵素反応によって触媒作用を受けていることを 示している。血液凝固XIII因子の酵素活性はこのような事実に基づいて測定でき る。 血液凝固XIII因子の濃度を各種調整して実施例２のように実験したあと、生成 したフィブリン凝固物に１％モノクロロ酢酸３mlを入れ溶解し、５分後に上澄液 をとり２８０nmで吸光度を測定した。その結果、フィブリン凝固物の溶解度が血 液凝固XIII因子の酵素活性に逆比例することがわかった。したがって、血液凝固 XIII因子の酵素活性はこのような事実に基づいて測定できる。 ＜実施例４＞クロット溶解分析方法の再現性、および、この方法と他の血液凝固 XIII因子分析方法との相関関係 血液凝固XIII因子の酵素活性値がこの分析方法で信頼性よく得ることができる かを調べるために、本発明のクロット溶解方法の再現性を調査した。 本分析方法の感度（端点：１５〜３０mU／ml）によると、血漿を約１０〜７０ 倍希釈した溶液中で、正常人の血液凝固XIII因子を検知することができ、その分 析方法は次の通りである。 凍結乾燥したフィブリン単量体を２mM氷酢酸溶液で溶解して１％（w／v）フィ ブリン単量体溶液を製造した。試料を１０−、２０−、３０−、４０−、５０− 、６０−、及び７０倍まで正確に希釈液で希釈し、標準血漿を希釈して血液凝固 XIII因子の濃度がそれぞれ１２、１４，１６、１８，２０及び２２mU／mlになる ようにした。カオリンを０．６％（w／v）になるように希釈液で希釈した。次に 、前記各希釈した標準液と試料２００μｌをそれぞれ１０mlガラス試験管に入れ た。２００U／mlのトロンビン溶液２００μｌ、０．６％カオリン溶液２．２ml 及び１Mトリス−アセテート（１２５mM塩化カルシウム含有pH０．８）０．８ml をよく混合した、最終濃度として、０．４M トリス−アセテート、５０mM塩化カ ルシウム、１０Uトロンビン、pH８．０を得た。次に前記トロンビン／カルシウ ム／カオリン溶液１００μｌを前述した１０mlガラス試験管に入れた。この混合 物を弱く混ぜたあと、直ちにフィブリン単量体溶液１００μｌを添加した。その あと、この反応混合物を１−２回振り混ぜて３７℃で１時間反応させたあと、１ ％モノクロロ酢酸３mlを、形成したフィブリン凝固物に入れた。その混合物を１ ０分ごとに３０分間手で振ってフィブリン凝固物を溶かした。フィブリン凝固物 が溶解されない試験管中で希釈倍数がもっとも大きい試験管を標準血漿及び試料 からそれぞれ選んだ。この試料から選ばれた血液凝固XIII因子の濃度は、標準血 漿から選ばれた血液凝固XIII因子の濃度と同一であった。このときの血液凝固XI II因子の濃度を端点（endpoint）とした。 結果として、端点（endpoint：１％モノクロロ酢酸により溶解されない凝固物 を形成するのに必要な最低血液凝固XIII因子濃度）は１８mU／mlであって、本実 験の再現性を調べた結果、実験内（intra assay）、実験間（inter assay）の変 異係数（coefficient of variance：CV）がそれぞれ３．７％及び５％の高い再 現性を示した（表１及び表２）。 また、血液凝固XIII因子を分析する他の方法との相関関係に関し、C¹⁴−プ トレッシン（putrescine）結合法（Chung S．l．and J．E．Folk、J．Biol．Ch em．２４７：２７９８−２８０７、１９７２）との相関関係は０．９５（ｐ＞０ ．０１）の高い相関関係を示した（図４）。 ＜実施例５＞フィブリン単量体を基質に使用したマイクロプレート測定方法 フィブリン単量体をコーティング緩衝液（５０mMカーボネート緩衝液、pH９． ６）で１００μg／ml以下の濃度に希釈した。そのフィブリン単量体溶液１５０ μｌをマイクロプレートに付したあと、室温で約１６時間結合反応させて、フィ ブリン単量体にマイクロプレートを結合させた。結合されないフィブリン単量体 は４０mMトリス緩衝液（０．１５M 塩化ナトリウム、pH８．３）で２回洗浄して 除去した。 フィブリン単量体が被覆されていないマイクロプレート面は１％ウシ血清アル ブミン（bovine serum albumin）で遮断され、他タンパク質が非特異的に表面に 結合するのを防いだ。用意したプレートは冷蔵庫に保管または凍結乾燥させ冷蔵 庫に保管した。 フィブリン単量体であらかじめ被覆したマイクロプレートに、０．２５、０． ５、１、２、４、８、１６mU／ml濃度の標準血液凝固XIII因子を、各ウェルに５ ０μｌずつ入れたあと、トロンビン（１０U／ml）１０μｌ、５mMビオチニルペ ンチルアミン（biotinylpentylamine）１５μl、５０mM塩化カルシウム２０μｌ 、１７．５mMジチオトレートル（Dithiothreitol）を混ぜた溶液４５μｌをいれ てよく混ぜた後、１時間室温で反応させた。０．２M EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid）２０μｌを加えて反応を停止させた。 フィブリン単量体に結合されないビオチニルペンチルアミンを４０mMトリス 緩衝液で３回洗浄して除去した後、ストレプトアビジン（streptavidine）が結 合したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（horse−radish peroxidase）を４００ ０倍希釈した溶液１００μｌを入れて３０分間室温で反応させた。続いて、ビオ チニルペンチルアミンと結合していないストレラトアビシンが結合したセイヨウ ワサビペルオキシダーゼを４０mMトリス緩衝液で５回洗浄して除去した。 セイヨウワサビペルオキシダーゼ基質１００μｌを各ウェルに加え、室温で１ ５分間反応させた。その後、４０５nmで吸光度を読んだ（Lee、K、N．，et al． ，Clin．Chem．３４：９０６−９１０）１９８８；Yeqing C．Song．et al．，A nal．Biochem．２２３：８８−９２、１９９４）。 結果として、吸光度と血液凝固XIII因子の濃度とが一次相関関係にあることが 、１〜１０mU／mlの範囲でみられた。したがって、上記範囲内で血液凝固XIII因 子濃度が定量できるのが伴った（図５）。 本発明においては、血液凝固XIII因子を含まないフィブリン単量体が血液凝固 XIII因子の酵素活性を決定する上での基質として用いられる。フィブリン単量体 は容易に多量に得ることができるので、本発明の方法は経済性がきわめて高い。 その上、フィブリン単量体またはフィブリノゲンは血液凝固XIII因子の天然基質 であるので、本発明の方法は、優れた再現性を有する。 したがって、フィブリン単量体を血液凝固XIII因子の基質として使用している 本発明の方法は、迅速、簡単に、再現性高く、血液凝固XIII因子の酵素活性を測 定することができる。さらに本発明は血液凝固XIII因子に対する他の酵素分析方 法を調べたり、血液凝固XIII因子の性質を研究するのに利用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フー，ジェ−ウーク 大韓民国，キョンキ―ドゥ 449―900，ヨ ンギン―シ，キフン―ウプ，グガル−リ 396，ハンヤン エーピーティー．＃101― 201 (72)発明者 チャン，シン―ジェ 大韓民国，キョンキ―ドゥ 449―900，ヨ ンギン―シ，キフン―ウプ，グガル−リ, シンスン エーピーティー．＃Ｂ―605 (72)発明者 リー，ジュン―シク 大韓民国，キョンキ―ドゥ 442―192，ス ウォン―シ，パルダル―ク，ウォーマン ２―ドン，ウォーマン―ゾーコン エーピ ーティー．＃207―1304 (72)発明者 チュン，スーン―クヮン 大韓民国，キョンキ―ドゥ 449―900，ヨ ンギン―シ，キフン―ウプ，グガル―リ 227 (72)発明者 ソン，ハーク−モ 大韓民国，チョーンチョンバク―ドゥ 361―270，チョンジュ―シ，フンダク― ク，ボクデ―ドン 217

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血液凝固XIII因子を含有しない精製フィブリン単量体を基質に使用して血液 凝固XIII因子により形成されたフィブリン架橋の程度を検知することによる血液 凝固XIII因子の酵素活性測定方法。 ２．フィブリン単量体を、トロンビンと塩化カルシウムの存在下で、血液凝固XI II因子により反応させ、生成したフィブリン凝固物をＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により調べることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固XIII 因子の酵素活性測定方法。 ３．フィブリン単量体を、トロンビンと塩化カルシウムの存在下で、血液凝固XI II因子と反応させた後、形成されたγ−γ二量体とγ単量体の量的比率によって 血液凝固XIII因子の酵素活性を決定することを特徴とする、請求項１に記載の血 液凝固XIII因子の酵素活性測定方法。 ４．フィブリン単量体を、トロンビンと塩化カルシウムの存在下で、血液凝固XI II因子と反応させた後、吸光度を測定することによって、血液凝固XIII因子の酵 素活性を決定することを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固XIII因子の酵素 活性測定方法。 ５．フィブリン単量体でコーティングされたマイクロプレートを用いることによ って血液凝固XIII因子の酵素活性を決定することを特徴とする、請求項１に記載 の血液凝固XIII因子の酵素活性測定方法。 ６．トロンビンで処理したフィブリノゲンから得られた非共有（non-Covalent ）フィブリン重合体を適当な溶媒で洗浄することにより血液凝固XIII因子活性を 含まない精製フィブリン単量体を製造する方法。 ７．血液凝固XIII因子を含まないフィブリン単量体を基質に使用することを特徴 とする転移グルタミナーゼの活性測定方法。