CN103238072A - 用于凝血酶检测的免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在包含抗凝血酶III(AT-III)和凝血酶的样品中对凝血酶进行定量的体外免疫测定法。所述方法包括以下步骤：使所述样品与识别所述凝血酶的底物结合位点的小分子接触；使所述凝血酶与凝血酶特异性抗体接触，所述凝血酶特异性抗体针对在所述活性位点封闭的凝血酶而产生；以及测量结合抗体的水平。

Description

用于凝血酶检测的免疫测定法
技术领域
本发明涉及一种用于在包含抗凝血酶III(AT-III)的样品中对凝血酶进行定量的免疫测定法。
背景技术
凝血酶(α-凝血酶)为内切型丝氨酸蛋白酶，其在凝血级联或血栓形成中起重要作用。凝血酶由酶原凝血酶原酶切产生。酶切由活化因子X(因子Xa)执行。人凝血酶由轻链(具有约6kDa的分子量)和重链(具有约31kDa的分子量)组成。凝血酶包括位于重链内的活性位点。凝血酶对含有精氨酸键的蛋白底物具有高度特异性，并且其主要底物为纤维蛋白原。凝血酶结合纤维蛋白原并且将其转化为血纤维蛋白。凝血酶还活化蛋白C、血小板、因子XIII和血浆羧肽酶原B(TAFI)。
正常情况下，凝血酶活性在血浆中受到抑制。血浆中存在的凝血酶的主要抑制剂为抗凝血酶III(AT-III)，并且在更小范围内讲为肝素辅因子II。在最佳浓度的肝素存在下，这两种抑制剂的抑制率大幅增加。凝血酶的其他生理抑制剂为α2-巨球蛋白和α1-抗胰蛋白酶1-4。
AT-III通过结合凝血酶和因子Xa来抑制凝血级联。AT-III的抑制活性由于肝素的存在而显著增加。人血浆中的正常抗凝血酶III浓度较高并且为大约0.12mg/ml。由于凝血酶被诱捕到具有AT-III的等摩尔复合物中，因此发生凝血酶失活。复合物的形成阻止凝血酶的活性位点接近其底物。抗凝血酶III-凝血酶复合物的形成涉及凝血酶与AT-III内的特异性活性肽键之间的相互作用。在人AT-III中，该键介于精氨酸(arg)393和丝氨酸(ser)394之间。
循环中凝血酶的异常高水平可触发凝血级联，因此导致广义的凝血功能障碍。生物医学方面相当关注能够快速定量确定受试生物样品(例如，血样)中凝血酶水平的方法。人和动物模型血浆中凝血酶的快速定量分析对于包含凝血酶的止血剂的实验和常规用量的安全性评估也可能非常重要。
在酶前体凝血酶原的量相对较大的背景中，例如在血浆样品中，使用凝血酶特异性抗体的免疫测定法进行凝血酶检测可能具有挑战性。
US4753875公开了一种测定凝血酶的方法，其中将过量的带标签凝血酶抑制剂(例如，带标签水蛭素或带标签AT-III)与含凝血酶的受试样品一起混合在溶液中，以形成带标签抑制剂-凝血酶复合物与游离的带标签抑制剂的混合物。接下来，添加抗凝血酶抗体以形成带标签抑制剂-凝血酶和凝血酶特异性抗体的复合物。随后将复合物与游离的带标签抑制剂分离并且测量标签。本发明举例说明了一种通过以下方式测试血浆的样品中凝血酶的测定法：添加3H-水蛭素并且将复合物凝血酶-水蛭素与耦合到纤维素的凝血酶特异性抗体分离。因此，该测试需要复合物分离步骤，例如，使用额外的亲和色谱柱分离步骤。
US5296352公开了单克隆抗体，其靶向并识别凝血酶/水蛭素复合物及其衍生物。US5296352公开了使用单克隆抗体对凝血酶/水蛭素复合物进行检测。其还公开了可利用单克隆抗体对受检者中自发产生的少量凝血酶进行检测。该方法包括向受检者注射水蛭素作为示踪剂，然后借助识别复合物的单克隆抗体对形成的复合物凝血酶/水蛭素进行测量。本发明举例说明了一种用于确定血浆中存在的凝血酶-水蛭素复合物的ELISA测定法。该测试需要向受检者注射水蛭素以进行凝血酶测试。
需要一种体外、简单、快速并且有效的测试来确定血样中的凝血酶水平。
发明内容
本发明涉及一种在抗凝血酶III(AT-III)存在下对样品中的凝血酶进行定量的体外免疫测定法。
在一个方面，免疫测定法包括以下步骤：使样品与识别凝血酶的底物结合位点的小分子接触；使凝血酶与凝血酶特异性抗体接触，所述凝血酶特异性抗体针对在活性位点封闭的凝血酶而产生；以及测量结合抗体的水平。
在另一方面，免疫测定法包括以下步骤：使样品与识别凝血酶的底物结合位点的小分子接触；向样品中添加凝血酶特异性抗体，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生凝血酶特异性抗体；测量抗体与凝血酶的结合；以及确定所存在的凝血酶的量。
在本发明的一个实施例中，样品为选自血液或血液组分的生物样本。
在本发明的另一个实施例中，小分子选自天然存在的水蛭素、合成的水蛭素变体、水蛭素衍生物、重组的水蛭素变体、模拟物、以及它们的组合。
在另一个实施例中，凝血酶特异性抗体为多克隆抗体或其片段。
然而在本发明的另一个实施例中，针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生所述抗体，所述活性位点用选自如下的肽封闭：Phe-Pro-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4-氨基苯丙酮酸(APPA)、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物(AEBSF)、以及它们的组合。
在本发明的又一个实施例中，免疫测定法为固相免疫测定法，例如夹心免疫测定法。
在本发明的又一个实施例中，使用凝血酶标准曲线确定凝血酶量。
本发明还提供了一种用于在包含抗凝血酶III(AT-III)的样品中对凝血酶进行定量的试剂盒，所述试剂盒包含凝血酶特异性多克隆抗体或其片段以及识别凝血酶的底物结合位点的小分子，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生凝血酶特异性抗体。
附图说明
图1示出了为确定缓冲液样品中的凝血酶水平而建立的免疫测定法的效能(OD值)。
图2示出了通过凝血酶特异性免疫测定法在缓冲液中包含增加浓度凝血酶的样品中获得的OD值(◆)与加标有增加浓度凝血酶的血浆样品中获得的OD值(▲)的比较。
图3示出了通过凝血酶特异性免疫测定法在缓冲液中包含增加浓度凝血酶并且包含AT-III的样品中获得的OD值(▲)，和在不存在AT-III的情况下在缓冲液中包含增加浓度凝血酶的样品中获得的OD值(◆)。
图4至6示出了向凝血酶样品中添加水蛭素和血浆的混合物(图4)、水蛭素和AT-III的混合物(图5)或水蛭素、AT-III和肝素的混合物(图6)对通过免疫测定法的凝血酶检测的影响。
图7示出了通过向样品中添加水蛭素，使用凝血酶特异性免疫测定法检测到血浆样品中凝血酶水平增加。
具体实施方式
已发现，根据本发明，通过凝血酶特异性免疫测定法进行的凝血酶检测因血浆中所存在的干涉作用物质而受到影响。另外已发现，血浆中检测到的干涉作用可至少部分地归因于AT-III的存在。
另外，令人意外地发现，根据本发明，与不含水蛭素的对照样品相比，向包含水蛭素的样品中添加凝血酶和AT-III，导致凝血酶特异性免疫测定法检测样品中的凝血酶的能力提高。这些结果表明，在存在抗凝血酶III的情况下，水蛭素增强了凝血酶检测。
鉴于凝血酶分子中的水蛭素和AT-III的结合位点不同并且与AT-III相反，水蛭素为小分子，这些发现令人意外。凝血酶中水蛭素的结合位点与凝血酶的纤维蛋白原结合位点重叠(Chang JY.，The hirudin-binding site ofhuman alpha-thrombin，Identification of lysyl residues which participate in thecombining site of hirudin-thrombin complex，《生物化学杂志》，1989年5月5日；第264卷，第13期，第7141-7146页；Huntington JA.，Molecularrecognition mechanisms of thrombin，《血栓形成与止血杂志》，2005年8月，第3卷，第8期，第1861-1872页)，而AT-III的结合位点与凝血酶的催化位点重叠(Griffith MJ.，Kinetics of the heparin-enhanced antithrombinIII/thrombin reaction，Evidence for a template model for the mechanism of actionof heparin，《生物化学杂志》，1982年7月10日，第257卷，第13期，第7360-7365页；和Markwardt等人，The influence of synthetic thrombininhibitors on the thrombin-antithrombin reaction，《血栓研究》，1973年，第2卷，第343至348页)。
另外已发现，与不含水蛭素的对照相比，在将凝血酶与AT-III混合之后添加水蛭素导致凝血酶检测增强。测试包含AT-III的血浆样品或其他样品时，水蛭素减少了在凝血酶特异性免疫测定法中遇到的干涉作用。
不受该机制的束缚，似乎凝血酶与AT-III缔合隐藏和/或改变了凝血酶中的抗原基团，并且添加水蛭素减少了AT-III对免疫测定法造成的干涉作用，从而增强了免疫测定法的凝血酶检测。
这些发现为免疫测定法方法的建立铺平了道路，从而能够在AT-III高水平条件(即血浆样品中存在的普遍条件)下确定凝血酶水平。
本发明提供了一种在AT-III存在下对样品中的凝血酶进行定量的体外免疫测定法，所述方法包括以下步骤：使样品与识别凝血酶的底物结合位点(例如纤维蛋白原结合位点)的小分子接触；向样品中添加凝血酶特异性抗体；测量抗体与凝血酶的结合；以及确定所存在的凝血酶的量。
术语“接触”是指使小分子与样品产生接触的结合行为，更具体地讲，是指以使小分子与样品中存在的凝血酶之间发生结合相互作用的方式，使小分子与凝血酶产生接触的结合行为。
术语“小分子”是指例如分子量在400至100,000道尔顿范围内的分子，所述分子量诸如在400至50,000道尔顿、或400至40,000道尔顿、或400至8,000道尔顿、或400至1000道尔顿、或5,000至40,000道尔顿、或1,000至8,000道尔顿的范围内。小分子可为具有类似三维结构但显示非重复序列的水蛭素的合成模拟物。可通过筛选例如随机肽的例如噬菌体展示库来鉴定水蛭素的模拟物。筛选可依赖用于将水蛭素结合至凝血酶中的底物结合位点的肽的竞争。在本发明的一个实施例中，使用ELISA夹心测定法。可使用凝血酶催化位点的特异性单克隆抗体包被ELISA微量滴定板。所述板上样有封闭溶液中的凝血酶并且通过若干次洗涤去除过量凝血酶。接下来，上样封闭溶液中的水蛭素，并且冲洗掉过量的水蛭素。然后，使用标记的多克隆抗水蛭素抗体检测结合至所述板的水蛭素(水蛭素100％结合)。也可通过使用标记的水蛭素(例如，3H-水蛭素)检测水蛭素的结合。在各测试孔中将单独的肽包括在ELISA中，并且存在给定肽时所述板的水蛭素结合减少表明肽为可能的模拟肽。
在一个实施例中，识别凝血酶中的底物结合位点的小分子抑制凝血酶与纤维蛋白原的结合的至少50％。本发明方法中所用的小分子可以为肽、合成化合物、天然存在的水蛭素、合成的水蛭素变体、水蛭素衍生物和/或重组的水蛭素变体，其保持对凝血酶的底物结合位点的结合能力。
变体包括那些水蛭素多肽，其相对于天然存在的水蛭素含有氨基酸置换、缺失和/或添加。通常，氨基酸置换、缺失和/或添加不改变变体结合至凝血酶的底物结合位点的能力。变体还可包括非天然存在的氨基酸残基。
衍生物包括糖基化改变、酰化改变和/或其他化学改变；非氨基酸置换，例如共价或非共价结合至多肽的氨基酸序列的报告分子和/或其他配体。
模拟物包含很大数目的小分子，所述小分子能够再现水蛭素的三维构象而不必复制其结构。该模拟物无需为完整的复制，也可为与水蛭素的模拟物充分类似的近似物，使得该模拟物能够结合凝血酶。
在本发明的一个实施例中，按照使样品中存在的凝血酶中和的量将小分子添加到受试样品中。在本发明的另一个实施例中，样品中水蛭素与凝血酶的摩尔比高于或等于0.64，例如摩尔比为0.67、1.27、2.55、5.10、10.20、12.76、20.41、25.52、40.82、51.05、81.63、102.56、205.13、410.26、816.36以及1632.65或更高。
在一个实施例中，推测凝血酶以约1个单位存在于样品中，并且以约0.64个抗凝血酶单位或更高添加水蛭素。
通常，术语“中和”和“抑制”是可互换的。
术语“识别凝血酶的底物结合位点的分子”是指对凝血酶的底物结合位点具有亲和力的分子。在本发明的一个实施例中，凝血酶的底物结合位点处于外部位I中。在本发明的另一个实施例中，结合的一个要素为Tyr76，位于与凝血酶的活性位点相距约
Figure BDA00003317374900061
处，如同纤维蛋白原的情况(ThierryRose和Enrico Di Cera.，Three-dimensional Modeling of Thrombin-FibrinogenInteraction，《生物化学杂志》，2001年，第277卷，第21期，第18875-1880页)。
本发明的免疫测定法可在任何样品中执行，例如生物样本(诸如血液)；血液组分(诸如血浆和其他血液衍生成分)；包含凝血酶和抗凝血酶III的其他体液；等等。
针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生根据本发明使用的凝血酶特异性抗体。术语“具有封闭活性位点的凝血酶”是指肽结合至其活性位点的凝血酶。在本发明的一个实施例中，凝血酶的活性位点处于P4至P2’的裂缝中(示于以下文献的图2中：Huntington JA.，Molecular recognitionmechanisms of thrombin，《血栓形成与止血杂志》，2005年8月，第3卷，第8期，第1861-1872页)。肽(本文称为“封闭肽”)可以为例如约400至1000道尔顿范围内的三氨基酸肽衍生物Phe-Pro-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4-氨基苯丙酮酸(APPA)或4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物(AEBSF)。术语“活性位点”可以与术语“催化位点”互换。
凝血酶特异性抗体可以为单克隆抗体、单链、Fab片段(包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物)、多克隆抗体或其片段，只要它们对凝血酶显示结合特异性和/或能够结合凝血酶。
术语“多克隆抗体”是指异质抗体群。这可包括对凝血酶内的不同表位具有特异性抗原结合功能的抗体。可通过使用人凝血酶对例如哺乳动物物种的动物例如兔、山羊、驴和绵羊进行免疫来生成多克隆抗体。可由经纯化的人凝血酶原制备用于免疫的凝血酶。免疫途径包括但不限于真皮内、腹膜内、皮下、肌内、颅内和/或静脉内。
术语“单克隆抗体”是指由产生抗体的细胞的单个克隆体(例如杂交瘤细胞的单个克隆体)制备的抗体制品。通常，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体。术语“杂交瘤”是指经过工程化改造产生大量所需抗体的细胞，例如用以制备单克隆抗体。为了制备单克隆抗体，可从用凝血酶免疫的动物(例如，任何哺乳动物物种)的脾中取出B细胞。可由经纯化的人凝血酶原制备用于免疫的凝血酶。免疫途径包括但不限于真皮内、腹膜内、皮下、肌内、颅内和/或静脉内。随后可将B细胞与可在培养基中无限生长的骨髓瘤细胞融合。可通过使细胞膜更具通透性来进行该融合。融合的细胞，由于为癌细胞，可快速和无限地繁殖并且可产生大量所需抗体。可测试所产生的抗体对凝血酶的特异性和亲和力。制备单克隆抗体的方法是本领域已知的，确定其特异性的方法也是一样(参见例如Shivanand Pandey，“HYBRIDOMATECHNOLOGY FOR PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES”，《国际药物科学检阅与研究杂志》，2010年，第1卷，第2期，第88-94页)。
多克隆和单克隆抗体的制备和纯化是本领域中熟知的(Immunoassay，Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos编辑，学术出版社，1996年，第5章)。凝血酶特异性抗体可以为重组的(Immunoassay，Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos编辑，学术出版社，1996年，第6章)。
供检测的标记抗体是本领域所熟知的(Immunoassay，Eleftherios PDiamandis和Theodore K.Christopoulos编辑，学术出版社，1996年，第8章)。
“检测抗体”和“标记的抗体/标记抗体”是指能够被发现的抗体。检测抗体可直接或间接地(例如，通过另一个抗体)偶联到可检测的信号或信号生成部分。信号可以为放射性信号(例如，放射性的碘、氚、碳、硫等等)、比色信号、荧光信号等等。作用于信号生成底物的信号生成部分包括但不限于辣根过氧化物酶(HR)[合适的底物包括3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)；OPD；2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸二铵盐]；碱性磷酸酶[合适的底物包括对硝基苯基磷酸二钠盐]；和β-半乳醣苷酶[合适的底物包括O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷]。可通过使用抗生物素蛋白-生物素偶联体系放大信号。
依赖抗原的抗原决定簇与特异性抗体的抗原结合部分之间的结合相互作用的不同类型的免疫测定法是本领域熟知的(Immunoassay，Eleftherios PDiamandis和Theodore K.Christopoulos编辑，学术出版社，1996年，第8至19章)，例如固相免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，例如双位(夹心类型，其中抗原被夹在固定抗体和标记的抗体之间)免疫测定法，抗生物素蛋白-生物素免疫测定体系，蛋白质印迹，免疫沉淀，放射性免疫测定(RIA)，酶免疫测定法，荧光免疫测定法(其中荧光标记物与抗体偶联，例如，荧光素、罗丹明等等)，免疫沉淀，化学发光免疫测定法(其中使用在化学结构修饰时发出光的有机分子，例如异鲁米诺、连苯三酚、虫荧光素、鲁米诺等等)，生物发光免疫测定法，免疫印迹技术等等。“抗原决定簇”是指抗体所识别的抗原中的区域。
为了将抗体结合(包被)至聚苯乙烯微量滴定孔，可如下面的实例中所指定，按照pH9-9.6在碳酸盐缓冲液中稀释抗原特异性抗体。共价结合已有报道(Immunoassay，Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos编辑，学术出版社，1996年，第24章)。通常通过在存在封闭溶液(例如，BSA)的情况下，在孔中孵育抗原特异性抗体来执行包被步骤。可使用第二抗体检测结合到包被抗体的抗原。可标记第二抗体。接下来，可制备适当的抗原(例如，凝血酶)标准品，以建立校准曲线(Immunoassay，Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos编辑，学术出版社，1996年，第24章)。术语“包被抗体”、“捕获抗体”和“固定抗体”通常是指存在于固体载体表面上的抗体。可对包被抗体进行定向，使得其抗原结合部分可用于接触样品中存在的抗原。若检测为间接的(例如，通过第二抗体执行)，则可在用于生成捕获抗体的物种之外的其他物种中生成第二检测抗体。
术语“确定凝血酶的量”是指定性或定量测定。
ELISA可为定性的或定量的。定性结果提供受试样品中凝血酶存在的简单阳性或阴性结果。通常使用两倍或三倍标准偏差(测试中固有的误差)区分阳性样品与阴性样品。在定量的ELISA中，将样品的光密度(OD)与标准曲线相比，所述标准曲线通常为已知量的经纯化的凝血酶的系列稀释度。在本发明的一个实施例中，不同已知浓度的凝血酶按如下方式制备：将43.9μg/ml浓度的凝血酶标准溶液在封闭缓冲液(含0.05％吐温-20的PBS中的1％I-Block)中稀释成6.27μg/ml(6270ng/ml)的浓度。接下来，通过将此前稀释液中的100μl转移到含有100μl封闭缓冲液的管内，对经稀释的凝血酶标准溶液进行两倍连续稀释(7次)。制备从6270下降至49ng/ml的八种稀释液。接下来，在封闭缓冲液中对上述凝血酶稀释液中的每一种进行进一步稀释(1∶10)，获得4.9、9.8、19.5、39、78、156.7、313.5和627ng/ml的最终凝血酶浓度。在下一步骤中，将最终凝血酶溶液中的每一种的100μl转移到预包被的微ELISA板内，并且如下所详述在不添加小分子的情况下执行免疫测定法。免疫测定法可为自动化的(Immunoassay，Eleftherios PDiamandis和Theodore K.Christopoulos编辑，学术出版社，1996年，第21章)。
在本发明的一个实施例中，执行固相免疫测定法。可使用不同的固相，例如管、微珠、磁性颗粒物质、塑料微珠、塑料载体、色谱柱、小片材和测定板(例如微量滴定孔)。
在本发明的一个实施例中，使用下面建立的双位(夹心类型)免疫测定法检测受试样品中的凝血酶：在第一步骤中，将识别凝血酶的底物结合位点的小分子添加到受试样品内。小分子可以为水蛭素，其被添加至中和凝血酶的至少1个NIH单位的最终浓度，例如添加中和凝血酶的20个NIH单位的量。包含凝血酶的样品可与小分子一起孵育约15分钟。然后，将包含小分子的样品移取到固相上并在固相上孵育，固相用过量的凝血酶特异性多克隆抗体(“捕获抗体”)预包被。在该孵育过程中，样品中的凝血酶结合至捕获抗体并且随后洗去所有其他样品成分。接下来，添加过量的标记多克隆凝血酶特异性抗体。在孵育之后，冲洗掉过量的标记的抗体并且测量结合标记的抗体的信号(例如，通过测量光密度[OD])。可由使用如上指定的已知量的经纯化的凝血酶建立的凝血酶标准曲线进行比较和外推来执行凝血酶水平的定量/确定。在本免疫测定法实施例中，相同的凝血酶特异性多克隆抗体充当捕获抗体和标记的抗体。
在可供选择的实施例中，使用单克隆抗体作为捕获抗体并作为标记的抗体。在此类实施例中，捕获抗体和标记的抗体不同并且必须识别凝血酶上的单独表位，以便它们不会妨碍彼此的结合。在一个实施例中，凝血酶特异性单克隆抗体不靶向底物结合位点。
在示例性ELISA中，过量的捕获凝血酶特异性抗体(例如，多克隆抗体)被预包被到微量滴定孔上。更具体地讲，在包被缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液；pH＝9.6)中，以1∶200至1∶100的范围(例如1∶500)稀释抗体溶液(例如，蛋白浓度为2mg/ml)并且将100μl经稀释的抗体添加到每个孔内。在2-8℃下过夜孵育微量滴定板。然后，弃去包被溶液并且用200μl/孔的洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20的PBS中)对微量滴定板进行三次洗涤。随后，将200μl封闭缓冲液(洗涤缓冲液中的1％I-Block)添加到每个孔并且在37℃下孵育微量滴定板1小时。在孵育结束时，去除封闭缓冲液。使每个受试样品，例如生物流体，与识别凝血酶的底物结合位点的小分子接触。样品可与小分子一起孵育约15分钟。可在封闭缓冲液中以1∶5稀释受试样品，并且随后将100μl每种稀释的样品添加到预包被孔内。随后在37℃下将板孵育1小时。孵育期之后，弃去样品溶液，用洗涤缓冲液对孔进行洗涤。接下来，随之将100μl包含偶联HRP的凝血酶检测多克隆抗体的溶液添加到每个孔内，所述抗体已在封闭缓冲液(例如，从具有2mg/ml蛋白浓度的储备溶液)中以1∶200至1∶100的范围(诸如1∶500)内稀释。在37℃下将板孵育1小时，如上所述在洗涤缓冲液中进行洗涤，并且将用于ELISA的100μl 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底物体系(HRP底物)添加至每个孔。在室温下将板孵育约60分钟(直至在包含高凝血酶浓度的孔中观察到深蓝颜色)。通过向每个孔添加100μl终止液(1M盐酸)终止反应。在OD450nm处读取板，并且可通过与由上述已知凝血酶浓度建立的凝血酶标准曲线进行比较来推断样品中的精确凝血酶浓度。通常，使用凝血酶标准曲线的线性范围计算受试样品中的精确凝血酶浓度。
在本发明的一个实施例中，捕获抗体为多克隆抗人凝血酶绵羊抗体(例如，由Affinity Biologicals制造的抗体；目录号SAHT-AP)。在本发明的另一个实施例中，用于产生多克隆抗体的免疫原为由经纯化的人凝血酶原制备的凝血酶，其中活性位点用PPACK封闭。在本发明的另一个实施例中，检测抗体为偶联HRP的绵羊抗人凝血酶抗体(例如，由AffinityBiologicals制造的抗体；目录号SAHT-HRP)。
在本发明的另一个实施例中，使用间接ELISA测定法。在示例性的间接ELISA中，使受试样品与识别凝血酶的底物结合位点(例如纤维蛋白原结合位点)的小分子接触，并且随后将该样品添加到固相，例如，微量滴定板的孔，此时给出一定时间以例如通过电荷相互作用而粘附到塑料。接下来，添加未反应蛋白的溶液，例如牛血清白蛋白或酪蛋白，以封闭孔中仍然未被受试样品中存在的抗原包被的任何塑料表面。在下一步骤中，将具体地结合至凝血酶的第一抗体添加到每个孔内。此后，将结合第一抗体的第二抗体添加到每个孔内。第二抗体具有附接到其上的酶，该酶对抗体结合特性的影响是微乎其微的。然后，添加这种酶的底物。该底物在与酶反应时改变颜色。颜色改变显示第二抗体已结合至第一抗体。通常，在添加第一抗体和第二抗体之后，对所述板进行洗涤，从而去除未结合的抗体。在可供选择的实施例中，使用连接到酶的一个抗体检测样品内凝血酶的存在。使用分光计给出色彩强度的定量值。可检测的信号可以为放射性信号(例如，放射性的碘、氚、碳、硫等等)、比色信号、荧光信号等等。
本发明提供了一种用于在包含抗凝血酶III(AT-III)的样品中对凝血酶进行定量的试剂盒，所述试剂盒包含以下组分：凝血酶特异性多克隆抗体以及识别凝血酶的底物结合位点的小分子，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生凝血酶特异性抗体。试剂盒可包括使用说明和/或用于制备标准曲线的经纯化的凝血酶。试剂盒的组分可以粉末、溶液和/或其组合的形式提供。溶液可采用冷冻形式提供。以上或以下引用的专利申请、专利和出版物的公开内容在此均以引用方式并入。
以下实例为示例性的，而非限制性的。
实例
材料和方法。
免疫测定法工序：
1.用捕获抗体包被微ELISA板。
用多克隆抗人凝血酶绵羊抗体(Affinity Biologicals；目录号SAHT-AP；用于制备多克隆抗体的免疫原为由经纯化的人凝血酶原制备的凝血酶，其中活性位点用PPACK封闭)包被微ELISA板(96个孔；Costar；目录号9018)。包被工序按如下方式执行：在包被缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液；pH＝9.6；Sigma；目录号C-3041)中以1∶500稀释抗体并且将100μl稀释的抗体添加到每个孔内。随后在2-8℃下过夜(约16小时)孵育微ELISA板。然后，弃去包被溶液并且用200μl/孔的洗涤缓冲液[含0.05％吐温-20(Sigma；目录号P-1379)的PBS(Biological Industries；目录号02-023-SA)中]对孔进行三次洗涤。随后，将200μl封闭缓冲液[洗涤缓冲液中的1％I-Block(Tropix；目录号AI300)添加到每个孔内并且在37℃下将ELISA板孵育1小时。在添加受试样品之前去除封闭缓冲液。
2.将受试样品和标记的结合抗体添加到预包被孔内并且测量标记的结 合抗体的信号。
在封闭缓冲液中以1∶5稀释受试样品，并且将100μl每种稀释的样品添加到预包被的微ELISA板内。随后在37℃下将板孵育1小时。孵育期之后，弃去样品溶液，用如上所指定的200μl/孔的洗涤缓冲液对孔进行三次洗涤，并且将100μl偶联HRP的抗凝血酶抗体(Affinity Biologicals；目录号SAHT-HR；在封闭缓冲液中以1∶500稀释；“标记的抗体”)添加到每个孔内。未经处理的猪血浆充当阴性对照。将封闭缓冲液中的已知浓度的凝血酶(4.9至627ng/ml)用作阳性对照。下面示出的结果中未展现阴性和阳性对照组的OD结果。在37℃下将板孵育1小时，用如上所指定的200μl/孔的洗涤缓冲液洗涤三次，并且将100μl的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB，一种HR底物；Sigma，目录号T-0440)添加到每个孔内。在室温(约22±3℃)下将板孵育约60分钟(直至在包含最高凝血酶浓度的孔中观察到深蓝颜色)。通过将100μl终止液(1M盐酸；Riedel de Haen；目录号30721)添加到每个孔中使反应终止。在OD450nm处读取板。所获得的OD值的增加表明样品中的凝血酶浓度较高。通过与使用已知量的经纯化的凝血酶建立的凝血酶标准曲线进行比较来推断样品中的精确凝血酶浓度。使用凝血酶标准曲线的线性范围计算样品中的精确凝血酶浓度。
下面实例中所用的不同浓度凝血酶的制备：
为了制备不同凝血酶浓度，使用内部标准的Omrix(43.9μg/ml)。为了获得不同浓度，在封闭缓冲液(参见上述组分)中将凝血酶标准品稀释成6.27μg/ml(6270ng/ml)的浓度。接下来，通过将此前稀释液中的100μl转移到含有100μl封闭缓冲液的管内，对经稀释的凝血酶标准溶液进行两倍连续稀释(7次)。制备从6270下降至49ng/ml的八种稀释液。接下来，将上述凝血酶稀释液中的每一种进一步稀释(1∶10)到受试样品内。
实例1-用于检测样品中凝血酶的夹心ELISA
建立双位(夹心类型)免疫测定法以检测受试样品中的凝血酶。简而言之，将包含凝血酶的样品移取到固相上，所述固相用过量的多克隆抗凝血酶抗体(“捕获抗体”)预包被，并且进行孵育，如“材料和方法”部分中所详述。在该孵育过程中，样品中的凝血酶结合至捕获抗体并且随后洗去所有其他样品成分。接下来，添加过量的标记抗凝血酶抗体。孵育之后，冲洗掉过量的标记的抗体。在该免疫测定法中，相同的多克隆抗体充当捕获和检测/标记的抗体。多克隆抗体为亲和经纯化的IgG绵羊抗人凝血酶。通过使用作为免疫原的经纯化的人凝血酶(由经纯化的凝血酶原制备)产生抗体，其中活性位点/催化位点用PPACK封闭。PPACK为结合至凝血酶的催化位点的肽。
在本实验中，对上述建立的免疫测定法检测样品中凝血酶水平的能力进行检验。出于这一目的，制备包含封闭缓冲液中的增加凝血酶浓度的样品(样品中的最终的凝血酶浓度为约：4.9、9.8、19.5、39、78、156.7、313.5和627ng/ml，如上所详述制备)，并且如上述“材料和方法”部分中所特别详述的那样执行免疫测定法。在每个样品中检测标记的结合抗体的信号并且结果展示于图1中。
已发现，结合抗体的信号与包含缓冲液中精确浓度的凝血酶的样品中的凝血酶的浓度直接相关。最低的五种稀释液在线性范围内。
因此得出结论，该免疫测定法为一种工具，其可用于确定包含凝血酶的受试缓冲液样品中凝血酶的水平(通过与使用已知量的经纯化的凝血酶建立的凝血酶标准曲线进行比较)。
实例2-血浆中存在的物质对通过凝血酶特异性免疫测定法进行的凝血 酶检测的干涉作用
前述实验示出了以上免疫测定法对包含凝血酶的缓冲液样品中凝血酶进行检测的能力。在该实验中，对上述建立的免疫测定法检测猪血浆样品(得自动物研究所(Kibutz Lahav Israel))中凝血酶的能力进行检验，所述样品加标有增加浓度的凝血酶(与实例1中相同)。使用封闭缓冲液中的类似凝血酶浓度作为参考。如上所述执行免疫测定法，并且两组[即，组1-加标有凝血酶的血浆样品(▲)；和组2-包含凝血酶的缓冲液样品(◆)]所获得的OD值示于图2中。
可以看出，在相同凝血酶浓度下，血浆中的凝血酶所获得的OD结果远远低于封闭缓冲液中的凝血酶所获得的OD结果。因此已发现，免疫测定法因血浆中存在的干涉作用物质而受到影响。
实例3-AT-III对通过凝血酶特异性免疫测定法进行的凝血酶检测的干 涉作用
实例2示出血浆中存在干涉凝血酶特异性免疫测定法的物质。人血浆中的正常AT-III浓度较高并且为大约0.12mg/ml。执行以下实验以便检验血浆中存在的AT-III是否为干涉免疫测定法的因子。
出于这一目的，制备具有AT-III的样品(American diagnostica；目录号433；在封闭缓冲液中稀释成1IU/ml的最终浓度)或不具有AT-III的样品(如上面所指出的封闭缓冲液)。接下来，将不同浓度的凝血酶添加到这些样品中(最终浓度为4.9、9.8和19.5ng/ml，如上所详述制备)。如上所详述执行免疫测定法以检测样品中的凝血酶。
可以看出，在存在AT-III的情况下所获得的OD结果远远低于在不存在AT-III的情况下所获得的OD结果(图3)。
已发现，AT-III对凝血酶免疫测定法产生干涉作用，并且因此表明，在血浆中检测到的干涉作用(实例2)可至少部分地归因于AT-III的存在。
实例4-免疫测定法中水蛭素添加对血浆中凝血酶检测的有益效果
水蛭素为65个氨基酸的小肽，其天然存在于水蛭中并且具有血液抗凝剂特性。水蛭素结合至凝血酶中的纤维蛋白原结合位点(底物结合位点)，而AT-III结合至凝血酶中的催化位点/活性位点。在下面一组实验中，检验水蛭素添加对凝血酶特异性免疫测定法中的AT-III干涉作用的影响。
出于这一目的，制备包含AT-III的不同溶液[参见下面的溶液1、4和7]并且将不同浓度的水蛭素混合到不同溶液内(参见下面的组2、3、5、6、8和9)。接下来，将不同浓度的凝血酶添加到混合物内并且执行免疫测定法。
溶液1-9的制备：
1.AT-III(American diagnostica；目录号433)在封闭缓冲液中稀释成1IU/ml的最终浓度。
2.一种含有1+最终浓度为1U/ml(1U水蛭素对应于1ATU(抗凝血酶单位[ATU]；1ATU定义为中和1NIH单位凝血酶的抑制剂的量)的水蛭素(Sigma；目录号94581)的溶液。
3.一种含有1+添加至最终浓度为5U/ml的仅水蛭素的溶液。
4.一种含有1+最终浓度为10IU/ml的肝素(药物补助计划)的溶液。肝素增强AT-III对凝血酶的失活。
5.一种含有4+最终浓度为1U/ml的水蛭素的溶液。
6.一种含有4+最终浓度为5U/ml的水蛭素的溶液。
7.猪血浆。
8.含有7+最终浓度为1U/ml的水蛭素。
9.含有7+最终浓度为5U/ml的水蛭素。
接下来，采用上面所详述的方式(参见“材料和方法”部分)以4.9、9.8、19.5、39、78、156.7、313.5和627ng/ml的最终浓度将凝血酶添加至每种溶液(1-9)。在本实验中，将凝血酶连同AT-III添加至包含水蛭素的溶液2、3、5、6、8和9中。
将所制备的样品(与不同凝血酶浓度混合的溶液1-9)稀释，将其移取到预包被的ELISA板内，并且如“材料和方法”部分中所指定的来确定OD水平。
包含凝血酶的不同样品的OD值示于图4、5和6中。在图4中，样品为猪血浆(利用溶液7-9制备的样品)。在图5中，样品为包含AT-III的溶液(利用溶液1-3制备的样品)。在图6中，样品为包含AT-III和肝素的溶液(利用溶液4-6制备的样品)。
据观察，添加的水蛭素以剂量依赖性方式降低AT-III对凝血酶特异性免疫测定的干涉作用。
这些结果表明，为了在包含AT-III的样品中提高通过凝血酶特异性免疫测定法进行的凝血酶检测，有利的是向受试样品中添加水蛭素，能够结合至凝血酶的底物结合位点的小分子。
实例5-凝血酶特异性免疫测定中水蛭素添加对血浆中凝血酶检测的有 益效果
上述实验的结果表明，向包含AT-III的样品中添加水蛭素可在特异性免疫测定中提高凝血酶检测。在上述实验中，将凝血酶连同AT-III添加到包含水蛭素的样品中。然而，受试血浆样品已包含凝血酶，并且凝血酶中的大部分附接到抗凝血酶III。在这种情况下，水蛭素将需要作用于凝血酶-AT-III复合物。以下实验对水蛭素在用于检测血浆样品中凝血酶的免疫测定法中的有益效果进行检验，所述血浆样品已经包含凝血酶和AT-III。
在下面一组实验中，将各种浓度的凝血酶加标到猪血浆的样品内(最终浓度为4.9至627ng/ml；参见“材料和方法”部分中的样品制备)。制备三组样品。在下一步骤中，以最终浓度1U/ml(■)或20U/ml(●)将水蛭素添加到其中两组中。未向第三组添加任何水蛭素，该组用作对照(▲)。通过上述的ELISA测定法检测不同组中的凝血酶。在本实验中，补充有5U/ml水蛭素的未加标猪血浆用作阴性对照(未示出阴性对照的结果)。结果示于图7中。
添加至样品中的水蛭素与样品中存在的凝血酶之间的摩尔比示于下面的表1中。
表1：受试样品中的水蛭素与凝血酶之间的摩尔比
Figure BDA00003317374900171
*1凝血酶单位等同于约400ng/ml凝血酶。
已发现，向加标有凝血酶的血浆样品中添加水蛭素导致在免疫测定法中检测凝血酶的能力根据水蛭素浓度增强。结果还表明，当水蛭素与凝血酶之间的摩尔比高于或等于0.637755时，观察到免疫测定法检测凝血酶的能力增强。

Claims (21)

1. 一种用于在抗凝血酶III (AT-III)存在下对样品中的凝血酶进行定量的体外免疫测定法，所述免疫测定法包括以下步骤：使所述样品与识别凝血酶的底物结合位点的小分子接触；向所述样品中添加凝血酶特异性抗体，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生所述凝血酶特异性抗体；测量所述抗体与所述凝血酶的结合；以及确定所存在的凝血酶的量。
2. 根据权利要求1所述的免疫测定法，其中所述样品为选自血液或血液组分的生物样本。
3. 根据权利要求1或2所述的免疫测定法，其中所述小分子选自天然存在的水蛭素、合成水蛭素变体、水蛭素衍生物、重组的水蛭素变体、模拟物、以及它们的组合。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定法，其中所述凝血酶特异性抗体为多克隆抗体或其片段。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的免疫测定法，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生所述抗体，所述活性位点用选自如下的肽封闭：Phe-Pro-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4-氨基苯丙酮酸(APPA)、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物(AEBSF)、以及它们的组合。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的免疫测定法，其中所述免疫测定法为固相免疫测定法。
7. 根据权利要求6所述的免疫测定法，其中所述固相免疫测定法为夹心免疫测定法。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的免疫测定法，其中利用凝血酶标准曲线对所述凝血酶量进行确定。
9. 一种用于在包含抗凝血酶III (AT-III)的样品中对凝血酶进行定量的试剂盒，所述试剂盒包含凝血酶特异性多克隆抗体或其片段，以及识别凝血酶的所述底物结合位点的小分子，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生所述凝血酶特异性抗体。
10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述小分子选自天然存在的水蛭素、合成的水蛭素变体、水蛭素衍生物、重组的水蛭素变体、模拟物、以及它们的组合。
11. 根据权利要求9或10所述的试剂盒，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生所述抗体，所述活性位点用选自如下的肽封闭：Phe-Pro-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4-氨基苯丙酮酸(APPA)、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物(AEBSF)、以及它们的组合。
12. 根据权利要求9至11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒为免疫测定试剂盒。
13. 根据权利要求9至12中任一项所述的试剂盒，还包括经纯化的凝血酶。
14. 一种用于在包含抗凝血酶III (AT-III)和凝血酶的样品中对凝血酶进行定量的体外免疫测定法，所述免疫测定法包括以下步骤：使所述样品与识别凝血酶的所述底物结合位点的小分子接触；使所述凝血酶与凝血酶特异性抗体接触，所述凝血酶特异性抗体针对在活性位点封闭的凝血酶而产生；以及测量结合抗体的水平。
15. 根据权利要求14所述的免疫测定法，其中所述样品为选自血液或血液组分的生物样本。
16. 根据权利要求14或15所述的免疫测定法，其中所述小分子选自天然存在的水蛭素、合成的水蛭素变体、水蛭素衍生物、重组的水蛭素变体、模拟物、以及它们的组合。
17. 根据权利要求14至16中任一项所述的免疫测定法，其中所述凝血酶特异性抗体为多克隆抗体或其片段。
18. 根据权利要求14至17中任一项所述的免疫测定法，其中针对具有封闭活性位点的凝血酶而产生所述抗体，所述活性位点用选自如下的肽封闭：Phe-Pro-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4-氨基苯丙酮酸(APPA)、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物(AEBSF)、以及它们的组合。
19. 根据权利要求14至18中任一项所述的免疫测定法，其中所述免疫测定法为固相免疫测定法。
20. 根据权利要求19所述的免疫测定法，其中所述固相免疫测定法为夹心免疫测定法。
21. 根据权利要求14至20中任一项所述的免疫测定法，其中利用凝血酶标准曲线对所述凝血酶量进行确定。
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