JPH11160321A - 血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法 - Google Patents
血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法Info
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- JPH11160321A JPH11160321A JP33220997A JP33220997A JPH11160321A JP H11160321 A JPH11160321 A JP H11160321A JP 33220997 A JP33220997 A JP 33220997A JP 33220997 A JP33220997 A JP 33220997A JP H11160321 A JPH11160321 A JP H11160321A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 発色基質法において検体中に存在する夾雑プ
ロテアーゼによる非特異的発色の防止または／および活
性化トロンビンの活性制御を行うことにより，Ｃｌｏｔ
法との相関性を高めた血液凝固検査試薬を提供するこ
と。 【解決手段】 検体希釈液にプロテアーゼインヒビター
（ＰＩ）を添加する（Ｓ１０１）。検体希釈液（ＰＩ含
有）で希釈した検体，第一試薬（凝固試薬），第二試薬
（発色基質）を，自動分析機に載置し（Ｓ１０３），希
釈検体と第一試薬とを混合して反応セルに分注し（Ｓ１
０４），さらに第二試薬を添加して反応セル内に生じて
いる活性化トロンビンを発色させる（Ｓ１０５）。続い
て，発色を光学的に測定し（Ｓ１０６），吸光度に基づ
いて，検体の血液凝固能が正常範囲であるか，血液凝固
能が高いことによる異常範囲であるか，血液凝固能が低
いことによる異常範囲であるか，を判定する（Ｓ１０
７）。
ロテアーゼによる非特異的発色の防止または／および活
性化トロンビンの活性制御を行うことにより，Ｃｌｏｔ
法との相関性を高めた血液凝固検査試薬を提供するこ
と。 【解決手段】 検体希釈液にプロテアーゼインヒビター
（ＰＩ）を添加する（Ｓ１０１）。検体希釈液（ＰＩ含
有）で希釈した検体，第一試薬（凝固試薬），第二試薬
（発色基質）を，自動分析機に載置し（Ｓ１０３），希
釈検体と第一試薬とを混合して反応セルに分注し（Ｓ１
０４），さらに第二試薬を添加して反応セル内に生じて
いる活性化トロンビンを発色させる（Ｓ１０５）。続い
て，発色を光学的に測定し（Ｓ１０６），吸光度に基づ
いて，検体の血液凝固能が正常範囲であるか，血液凝固
能が高いことによる異常範囲であるか，血液凝固能が低
いことによる異常範囲であるか，を判定する（Ｓ１０
７）。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は，発色基質を用い
た発色により，活性化トロンビンの酵素活性を測定して
血液凝固能を調べる，いわゆる発色基質法に用いられる
血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法に関し，
より詳細には，検体中に存在する夾雑プロテアーゼによ
る非特異的発色の防止または／および活性化トロンビン
の活性制御を行って，一般的な血液凝固能の測定方法と
の相関性を向上させた血液凝固検査試薬および血液凝固
能の測定方法に関する。
た発色により，活性化トロンビンの酵素活性を測定して
血液凝固能を調べる，いわゆる発色基質法に用いられる
血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法に関し，
より詳細には，検体中に存在する夾雑プロテアーゼによ
る非特異的発色の防止または／および活性化トロンビン
の活性制御を行って，一般的な血液凝固能の測定方法と
の相関性を向上させた血液凝固検査試薬および血液凝固
能の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液検査項目の一つとして，血液凝固能
を測定して，検体（ここでは，検査対象者の血液成分）
の凝血障害の鑑別を行う項目が知られている。具体的に
は，この凝結障害の鑑別を行う項目の代表的なものとし
て，ＰＴ測定用試薬を用いて検体のプロトロンビン時間
（ＰＴ）を測定するＰＴ項目や，ＡＰＴＴ測定用試薬を
用いて検体の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰ
ＴＴ）を測定するＡＰＴＴ項目等がある。
を測定して，検体（ここでは，検査対象者の血液成分）
の凝血障害の鑑別を行う項目が知られている。具体的に
は，この凝結障害の鑑別を行う項目の代表的なものとし
て，ＰＴ測定用試薬を用いて検体のプロトロンビン時間
（ＰＴ）を測定するＰＴ項目や，ＡＰＴＴ測定用試薬を
用いて検体の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰ
ＴＴ）を測定するＡＰＴＴ項目等がある。
【０００３】ここで，血液凝固とは，多段階のカスケー
ド反応の結果としておこる現象であり，その最終ステッ
プで活性化されたトロンビンが，可溶性のフィブリノー
ゲンを不溶性のフィブリンに変換することで血液凝固が
生じる。
ド反応の結果としておこる現象であり，その最終ステッ
プで活性化されたトロンビンが，可溶性のフィブリノー
ゲンを不溶性のフィブリンに変換することで血液凝固が
生じる。
【０００４】かかる原理から，従来，血液凝固能の測定
方法として，検体に凝固試薬を加えて血液を凝固させ，
その凝固する時間を測定して血液凝固能を調べる方法
（以下，Ｃｌｏｔ法と記載する）があった。
方法として，検体に凝固試薬を加えて血液を凝固させ，
その凝固する時間を測定して血液凝固能を調べる方法
（以下，Ｃｌｏｔ法と記載する）があった。
【０００５】ところが，このＣｌｏｔ法によれば，反応
セル中で凝固した血液がセル壁面に固着するため，反応
セルを使い捨てにせざるを得ず，コストがかかるととも
に，使い捨てセルが使用可能な自動分析装置でしか測定
できないという不具合があった。
セル中で凝固した血液がセル壁面に固着するため，反応
セルを使い捨てにせざるを得ず，コストがかかるととも
に，使い捨てセルが使用可能な自動分析装置でしか測定
できないという不具合があった。
【０００６】そこで，新たに，血液が実際に凝固するま
でに要する時間を測定するのではなく，血液凝固前のス
テップである活性化トロンビンの酵素活性を測定する方
法が考案されている。すなわち，検体に凝固試薬を加え
たのち，さらに発色基質を加えて活性化トロンビンを発
色させ，その吸光度の測定から血液凝固能を調べる，発
色基質法である。
でに要する時間を測定するのではなく，血液凝固前のス
テップである活性化トロンビンの酵素活性を測定する方
法が考案されている。すなわち，検体に凝固試薬を加え
たのち，さらに発色基質を加えて活性化トロンビンを発
色させ，その吸光度の測定から血液凝固能を調べる，発
色基質法である。
【０００７】その測定原理を簡単に述べると，次のよう
になる。トロンビンはペプチド結合を切断する一種のプ
ロテアーゼであるため，このトロンビンをペプチド鎖の
末端に発色部位（ｐ−ニトロフェノール）を有する発色
基質に作用させると，活性化トロンビンにより前記発色
部位が遊離されて発色する。したがって，この発色を光
学的に定量することで，トロンビン活性との相関，すな
わち血液凝固能が測定できるのである。
になる。トロンビンはペプチド結合を切断する一種のプ
ロテアーゼであるため，このトロンビンをペプチド鎖の
末端に発色部位（ｐ−ニトロフェノール）を有する発色
基質に作用させると，活性化トロンビンにより前記発色
部位が遊離されて発色する。したがって，この発色を光
学的に定量することで，トロンビン活性との相関，すな
わち血液凝固能が測定できるのである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら，上記従
来の発色基質法によれば，検体中に含まれる夾雑プロテ
アーゼに起因する非特異的な発色等が生じるため，上記
Ｃｌｏｔ法との相関性が悪くなるという問題点があっ
た。
来の発色基質法によれば，検体中に含まれる夾雑プロテ
アーゼに起因する非特異的な発色等が生じるため，上記
Ｃｌｏｔ法との相関性が悪くなるという問題点があっ
た。
【０００９】また，発色基質法によれば，Ｃｌｏｔ法と
の相関性が悪く，凝固検査として実用レベルに至ってい
なかった。もし，発色基質法とＣｌｏｔ法との相関性が
向上すれば，従来のＣｌｏｔ法では測定できなかったと
ころの，血液が凝固しやすい傾向にある被検者の血液
（過凝固検体）の検査への応用が可能となる。この過凝
固検体の検査ができるようになれば，脳血栓や脳梗塞等
の予防診断あるいは経過コントロールにつながり，臨床
検査上非常に有用な手段となることが期待される。
の相関性が悪く，凝固検査として実用レベルに至ってい
なかった。もし，発色基質法とＣｌｏｔ法との相関性が
向上すれば，従来のＣｌｏｔ法では測定できなかったと
ころの，血液が凝固しやすい傾向にある被検者の血液
（過凝固検体）の検査への応用が可能となる。この過凝
固検体の検査ができるようになれば，脳血栓や脳梗塞等
の予防診断あるいは経過コントロールにつながり，臨床
検査上非常に有用な手段となることが期待される。
【００１０】本発明は上記に鑑みてなされたものであっ
て，発色基質法において検体中に存在する夾雑プロテア
ーゼによる非特異的発色の防止または／および活性化ト
ロンビンの活性制御を行うことにより，Ｃｌｏｔ法との
相関性を高めた血液凝固検査試薬を提供することを目的
とする。
て，発色基質法において検体中に存在する夾雑プロテア
ーゼによる非特異的発色の防止または／および活性化ト
ロンビンの活性制御を行うことにより，Ｃｌｏｔ法との
相関性を高めた血液凝固検査試薬を提供することを目的
とする。
【００１１】また，本発明は上記に鑑みてなされたもの
であって，発色基質法において反応系でのフィブリン塊
の生成速度を抑制して凝固時間を延長させることによ
り，過凝固検体の測定を行えるようにした血液凝固能の
測定方法を提供することを目的とする。
であって，発色基質法において反応系でのフィブリン塊
の生成速度を抑制して凝固時間を延長させることによ
り，過凝固検体の測定を行えるようにした血液凝固能の
測定方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに，請求項１に係る血液凝固検査試薬は，活性化トロ
ンビンの酵素活性を測定して血液凝固能を測定する発色
基質法に用いられ，少なくとも検体を凝固させるための
凝固試薬を含む第一試薬と，少なくとも活性化トロンビ
ンの酵素活性を測定するための発色基質を含む第二試薬
と，からなる血液凝固検査試薬において，検体中に存在
する夾雑プロテアーゼによる非特異的発色の防止または
／および活性化トロンビンの活性制御を行うプロテアー
ゼインヒビターを含むものである。
めに，請求項１に係る血液凝固検査試薬は，活性化トロ
ンビンの酵素活性を測定して血液凝固能を測定する発色
基質法に用いられ，少なくとも検体を凝固させるための
凝固試薬を含む第一試薬と，少なくとも活性化トロンビ
ンの酵素活性を測定するための発色基質を含む第二試薬
と，からなる血液凝固検査試薬において，検体中に存在
する夾雑プロテアーゼによる非特異的発色の防止または
／および活性化トロンビンの活性制御を行うプロテアー
ゼインヒビターを含むものである。
【００１３】また，請求項２に係る血液凝固検査試薬
は，請求項１に記載の血液凝固検査試薬において，前記
プロテアーゼインヒビターの濃度が，１×１０-7〜１×
１０-3モル／リットルであるものである。
は，請求項１に記載の血液凝固検査試薬において，前記
プロテアーゼインヒビターの濃度が，１×１０-7〜１×
１０-3モル／リットルであるものである。
【００１４】また，請求項３に係る血液凝固検査試薬
は，請求項１または２に記載の血液凝固検査試薬におい
て，前記第一試薬および第二試薬が，それぞれｐＨ７〜
ｐＨ１１の範囲であるものである。
は，請求項１または２に記載の血液凝固検査試薬におい
て，前記第一試薬および第二試薬が，それぞれｐＨ７〜
ｐＨ１１の範囲であるものである。
【００１５】また，請求項４に係る血液凝固検査試薬
は，請求項１〜３のいずれか一に記載の血液凝固検査試
薬において，前記第一試薬または／および第二試薬が，
易溶性のアルカリ金属塩または／およびアルカリ土類金
属塩を含み，かつ，その塩濃度の合計が，ＮａＣｌ換算
で，５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲であるも
のである。
は，請求項１〜３のいずれか一に記載の血液凝固検査試
薬において，前記第一試薬または／および第二試薬が，
易溶性のアルカリ金属塩または／およびアルカリ土類金
属塩を含み，かつ，その塩濃度の合計が，ＮａＣｌ換算
で，５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲であるも
のである。
【００１６】また，請求項５に係る血液凝固能の測定方
法は，検体と凝固試薬とを混合させて反応系を作成し，
更に発色基質を加えて前記反応系で生じた活性化トロン
ビンを発色させ，前記発色を光学的に測定して前記検体
の血液凝固能を測定する血液凝固能の測定方法におい
て，前記検体中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特
異的発色の防止または／および活性化トロンビンの活性
制御を行うプロテアーゼインヒビターを，前記凝固試
薬，発色気質または希釈液のいずれかに添加する添加工
程と，前記検体または／および凝固試薬を希釈液で希釈
する希釈工程と，前記希釈工程で希釈した前記検体また
は／および凝固試薬を用いて，所定量の前記検体および
凝固試薬を反応セルに分注し，混合させることにより，
希釈した反応系を作成する反応系作成工程と，前記希釈
した反応系に発色基質を加えて前記活性化トロンビンを
発色させる発色工程と，前記活性化トロンビンの発色を
光学的に測定する測定工程と，前記測定工程で測定した
吸光度に基づいて，前記検体の血液凝固能が正常範囲で
あるか，血液凝固能が高いことによる異常範囲である
か，血液凝固能が低いことによる異常範囲であるか，を
判定する判定工程と，を含むものである。
法は，検体と凝固試薬とを混合させて反応系を作成し，
更に発色基質を加えて前記反応系で生じた活性化トロン
ビンを発色させ，前記発色を光学的に測定して前記検体
の血液凝固能を測定する血液凝固能の測定方法におい
て，前記検体中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特
異的発色の防止または／および活性化トロンビンの活性
制御を行うプロテアーゼインヒビターを，前記凝固試
薬，発色気質または希釈液のいずれかに添加する添加工
程と，前記検体または／および凝固試薬を希釈液で希釈
する希釈工程と，前記希釈工程で希釈した前記検体また
は／および凝固試薬を用いて，所定量の前記検体および
凝固試薬を反応セルに分注し，混合させることにより，
希釈した反応系を作成する反応系作成工程と，前記希釈
した反応系に発色基質を加えて前記活性化トロンビンを
発色させる発色工程と，前記活性化トロンビンの発色を
光学的に測定する測定工程と，前記測定工程で測定した
吸光度に基づいて，前記検体の血液凝固能が正常範囲で
あるか，血液凝固能が高いことによる異常範囲である
か，血液凝固能が低いことによる異常範囲であるか，を
判定する判定工程と，を含むものである。
【００１７】また，請求項６に係る血液凝固能の測定方
法は，請求項５に記載の血液凝固能の測定方法におい
て，前記添加工程で添加するプロテアーゼインヒビター
が，セリンプロテアーゼインヒビターであるものであ
る。
法は，請求項５に記載の血液凝固能の測定方法におい
て，前記添加工程で添加するプロテアーゼインヒビター
が，セリンプロテアーゼインヒビターであるものであ
る。
【００１８】また，請求項７に係る血液凝固能の測定方
法は，請求項５または６に記載の血液凝固能の測定方法
において，前記添加工程で添加するプロテアーゼインヒ
ビターが，１×１０-7〜１×１０-3モル／リットルの範
囲であるものである。
法は，請求項５または６に記載の血液凝固能の測定方法
において，前記添加工程で添加するプロテアーゼインヒ
ビターが，１×１０-7〜１×１０-3モル／リットルの範
囲であるものである。
【００１９】また，請求項８に係る血液凝固能の測定方
法は，請求項５〜７のいずれか一に記載の血液凝固能の
測定方法において，前記希釈した反応系が，ｐＨ７〜ｐ
Ｈ１１の範囲に調整されているものである。
法は，請求項５〜７のいずれか一に記載の血液凝固能の
測定方法において，前記希釈した反応系が，ｐＨ７〜ｐ
Ｈ１１の範囲に調整されているものである。
【００２０】また，請求項９に係る血液凝固能の測定方
法は，請求項５〜８のいずれか一に記載の血液凝固能の
測定方法において，前記希釈した反応系の塩濃度がＮａ
Ｃｌ換算で５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲に
調整されているものである。
法は，請求項５〜８のいずれか一に記載の血液凝固能の
測定方法において，前記希釈した反応系の塩濃度がＮａ
Ｃｌ換算で５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲に
調整されているものである。
【００２１】また，請求項１０に係る血液凝固能の測定
方法は，請求項５〜９のいずれか一に記載の血液凝固能
の測定方法において，前記希釈した反応系は，前記検体
が１０〜２００倍の範囲で希釈され，または／および，
前記凝固試薬が５〜１００倍の範囲で希釈されているも
のである。
方法は，請求項５〜９のいずれか一に記載の血液凝固能
の測定方法において，前記希釈した反応系は，前記検体
が１０〜２００倍の範囲で希釈され，または／および，
前記凝固試薬が５〜１００倍の範囲で希釈されているも
のである。
【００２２】
【発明の実施の形態】以下，この発明につき図面を参照
しつつ詳細に説明する。なお，この実施の形態によりこ
の発明が限定されるものではない。
しつつ詳細に説明する。なお，この実施の形態によりこ
の発明が限定されるものではない。
【００２３】〔実施の形態１〕実施の形態１に示す発色
基質法用の血液凝固検査試薬は，プロテアーゼインヒビ
ター（以下，「ＰＩ」と記す）を含んでいるために，検
体中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特異的発色の
防止または／および活性化トロンビンの活性制御を行っ
て測定精度を高めることができ，Ｃｌｏｔ法との相関性
の向上を図ることができるものである。
基質法用の血液凝固検査試薬は，プロテアーゼインヒビ
ター（以下，「ＰＩ」と記す）を含んでいるために，検
体中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特異的発色の
防止または／および活性化トロンビンの活性制御を行っ
て測定精度を高めることができ，Ｃｌｏｔ法との相関性
の向上を図ることができるものである。
【００２４】そこで，この発明の効果を調べるために， ＰＩ添加によるＣｌｏｔ法との相関性の向上 ＰＩの種類の影響 ＰＩ添加濃度の影響 試薬のｐＨの影響 試薬中の塩濃度の影響 の各項目について，上記の順に検討する。
【００２５】ＰＩ添加によるＣｌｏｔ法との相関性の
向上 図１は，ＰＩを添加した場合（ａ）と添加しない場合
（ｂ）の，Ｃｌｏｔ法との相関性を示す相関図である。
縦軸の△ＯＤは，一定時間の吸光度差であり，発色の程
度を示している。ここでは，約３分間に変化した吸光度
変化を示しており，１△ＯＤ（自動分析機）＝１０-4Ａ
ＢＳに相当する。また，横軸は，活性化トロンビンの酵
素活性（ＫＣ−１０：ＫＣ１０Ａ ｍｉｃｏｒｏ（自動
血液凝固測定装置，アメルング社製）を用いて測定した
酵素活性％）を示す。
向上 図１は，ＰＩを添加した場合（ａ）と添加しない場合
（ｂ）の，Ｃｌｏｔ法との相関性を示す相関図である。
縦軸の△ＯＤは，一定時間の吸光度差であり，発色の程
度を示している。ここでは，約３分間に変化した吸光度
変化を示しており，１△ＯＤ（自動分析機）＝１０-4Ａ
ＢＳに相当する。また，横軸は，活性化トロンビンの酵
素活性（ＫＣ−１０：ＫＣ１０Ａ ｍｉｃｏｒｏ（自動
血液凝固測定装置，アメルング社製）を用いて測定した
酵素活性％）を示す。
【００２６】尚，本実験に用いた検体，試薬等は以下の
とおりである。 検体 ： 血漿 検体希釈液 ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ
（１００ｍＭ）を添加し塩濃度を調整する。次に，この
緩衝液に後述するトリプシンインヒビターが２×１０-5
Ｍとなるように添加する。さらにこの緩衝液をｐＨ７．
３５に調整する。 凝固試薬 ： 市販のＰＴ測定用試薬（商品名：トロン
ボプラスチン・Ｃ，販売元：株式会社ミドリ十字） 緩衝液１ ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ（１
００ｍＭ）を添加して塩濃度を調整する。次に，この緩
衝液をｐＨ７．３５に調整する。 緩衝液２ ： 緩衝液１にＣａＣｌ2 （１０ｍＭ）を添
加したものを緩衝液２とする。 発色基質 ： 市販の合成発色基質（商品名：テストチ
ーム発色気質Ｓ−２２３８，販売元：第一化学薬品
（株）） ＰＩ ： トリプシンインヒビター（商品名：大豆ト
リプシンインヒビター，販売元：シグマ社） 測定装置： 生化学用の自動分析装置（７０５０日立自
動分析装置，日立製作所製）
とおりである。 検体 ： 血漿 検体希釈液 ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ
（１００ｍＭ）を添加し塩濃度を調整する。次に，この
緩衝液に後述するトリプシンインヒビターが２×１０-5
Ｍとなるように添加する。さらにこの緩衝液をｐＨ７．
３５に調整する。 凝固試薬 ： 市販のＰＴ測定用試薬（商品名：トロン
ボプラスチン・Ｃ，販売元：株式会社ミドリ十字） 緩衝液１ ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ（１
００ｍＭ）を添加して塩濃度を調整する。次に，この緩
衝液をｐＨ７．３５に調整する。 緩衝液２ ： 緩衝液１にＣａＣｌ2 （１０ｍＭ）を添
加したものを緩衝液２とする。 発色基質 ： 市販の合成発色基質（商品名：テストチ
ーム発色気質Ｓ−２２３８，販売元：第一化学薬品
（株）） ＰＩ ： トリプシンインヒビター（商品名：大豆ト
リプシンインヒビター，販売元：シグマ社） 測定装置： 生化学用の自動分析装置（７０５０日立自
動分析装置，日立製作所製）
【００２７】また，測定方法は，以下のとおりである。 （イ）検体を検体希釈液で２５倍希釈し，希釈検体とす
る。 （ロ）凝固試薬に１０倍量の緩衝液２を加えて，第一試
薬を作成する。 （ハ）２ｍＭの発色基質に４倍量の緩衝液２を加えて，
第二試薬を作成する。 （ニ）最終的な添加比率が，希釈検体／第一試薬／第二
試薬＝２０／５０／２４０となるように，希釈検体に第
一試薬を添加し，続いて第二試薬を添加する。 （ホ）波長４００ｎｍ付近における吸光度を測定し，△
ＯＤを求める。
る。 （ロ）凝固試薬に１０倍量の緩衝液２を加えて，第一試
薬を作成する。 （ハ）２ｍＭの発色基質に４倍量の緩衝液２を加えて，
第二試薬を作成する。 （ニ）最終的な添加比率が，希釈検体／第一試薬／第二
試薬＝２０／５０／２４０となるように，希釈検体に第
一試薬を添加し，続いて第二試薬を添加する。 （ホ）波長４００ｎｍ付近における吸光度を測定し，△
ＯＤを求める。
【００２８】同図に示すように，ＰＩを添加した測定系
（ａ）では正常域（１００％）の発色が抑えられている
ため，その相関度（Ｒ＝０．８１）は，ＰＩを添加しな
い測定系（ｂ）の相関度（Ｒ＝０．６９）に比べて際だ
って良好であり，ＰＩの添加によりＣｌｏｔ法との相関
性が向上することが明らかである。
（ａ）では正常域（１００％）の発色が抑えられている
ため，その相関度（Ｒ＝０．８１）は，ＰＩを添加しな
い測定系（ｂ）の相関度（Ｒ＝０．６９）に比べて際だ
って良好であり，ＰＩの添加によりＣｌｏｔ法との相関
性が向上することが明らかである。
【００２９】なお，本発明において，使用する試薬等は
上記記載に限定されることはなく，たとえば，凝固試薬
としてはＡＰＴＴ測定用試薬を用いることができる。ま
た，測定方法も上記記載に限定されることはなく，たと
えば，第一試薬および第二試薬に対する緩衝液の添加量
に特に制限はない。
上記記載に限定されることはなく，たとえば，凝固試薬
としてはＡＰＴＴ測定用試薬を用いることができる。ま
た，測定方法も上記記載に限定されることはなく，たと
えば，第一試薬および第二試薬に対する緩衝液の添加量
に特に制限はない。
【００３０】ＰＩの種類の影響 図２（ａ），（ｂ）および図３（ａ），（ｂ）は，ＰＩ
として様々な種類のプロテアーゼインヒビターを用いた
場合の，酵素活性と△ＯＤとの関係を示す説明図であ
る。なお，ＰＩとしては以下のものを用いた。なお，Ｐ
Ｉの種類以外の条件は，図１の場合と同様である。
として様々な種類のプロテアーゼインヒビターを用いた
場合の，酵素活性と△ＯＤとの関係を示す説明図であ
る。なお，ＰＩとしては以下のものを用いた。なお，Ｐ
Ｉの種類以外の条件は，図１の場合と同様である。
【００３１】（イ）トリプシンインヒビター（セリンプ
ロテアーゼ）：商品名：トリプシンキモトリプシンイン
ヒビター，販売元：シグマ社 （ロ）アンチパイン（セリンプロテアーゼ）：商品名：
アンチパイン，販売元：和光純薬社 （ハ）ペプスタチン（カルボキシルプロテアーゼインヒ
ビター）：商品名：ペプスタチンＡ，販売元：和光純薬
社 （ニ）ロイペプチン（セリンプロテアーゼ，チロールプ
ロテアーゼ）商品名：ロイプチン，販売元：和光純薬社
ロテアーゼ）：商品名：トリプシンキモトリプシンイン
ヒビター，販売元：シグマ社 （ロ）アンチパイン（セリンプロテアーゼ）：商品名：
アンチパイン，販売元：和光純薬社 （ハ）ペプスタチン（カルボキシルプロテアーゼインヒ
ビター）：商品名：ペプスタチンＡ，販売元：和光純薬
社 （ニ）ロイペプチン（セリンプロテアーゼ，チロールプ
ロテアーゼ）商品名：ロイプチン，販売元：和光純薬社
【００３２】図２および図３に示すように，トリプシン
インヒビター以外に，アンチパイン，ペプスタチンＡ，
ロイペプチンでも同様の効果が得られることが明らかで
ある。
インヒビター以外に，アンチパイン，ペプスタチンＡ，
ロイペプチンでも同様の効果が得られることが明らかで
ある。
【００３３】なお，この発明におけるＰＩが，図２およ
び図３に示したようなセリンプロテアーゼインヒビター
に限定されることはなく，夾雑プロテアーゼの活性を抑
制して非特異的発色を防止しうるものであれば，いかな
る種類のＰＩであっても使用できる。
び図３に示したようなセリンプロテアーゼインヒビター
に限定されることはなく，夾雑プロテアーゼの活性を抑
制して非特異的発色を防止しうるものであれば，いかな
る種類のＰＩであっても使用できる。
【００３４】ＰＩ添加濃度の影響 図４は，ＰＩの添加濃度の影響を調べた説明図である。
すなわち，ＰＩの濃度を０〜１×１０-5モル／リットル
まで変化させて，酵素活性と△ＯＤとの相関性を調べた
ものである。なお，ＰＩ添加濃度以外の条件は，図１の
場合と同様である。
すなわち，ＰＩの濃度を０〜１×１０-5モル／リットル
まで変化させて，酵素活性と△ＯＤとの相関性を調べた
ものである。なお，ＰＩ添加濃度以外の条件は，図１の
場合と同様である。
【００３５】同図より，正常域（活性％１００％）付近
の領域において，第二試薬中のＰＩの添加濃度が１×１
０−８モル／リットルまたは１×１０−９モル／リット
ルの場合は，酵素活性（％）と△ＯＤとの間に直線的な
相関性がみられないが，１×１０-7以上では良好な相関
性が得られている。さらに，１×１０-6モル／リットル
の場合に，酵素活性（％）と△ＯＤとの直線性は最も向
上することが明らかである。一方，１×１０-3モル／リ
ットルを超えると発色が阻害される虞がある。したがっ
て，第二試薬中のＰＩの添加濃度としては，１×１０-7
〜１×１０-3モル／リットルが適当であり，１×１０-6
モル／リットル程度であることが最も好ましいと考えら
れる。
の領域において，第二試薬中のＰＩの添加濃度が１×１
０−８モル／リットルまたは１×１０−９モル／リット
ルの場合は，酵素活性（％）と△ＯＤとの間に直線的な
相関性がみられないが，１×１０-7以上では良好な相関
性が得られている。さらに，１×１０-6モル／リットル
の場合に，酵素活性（％）と△ＯＤとの直線性は最も向
上することが明らかである。一方，１×１０-3モル／リ
ットルを超えると発色が阻害される虞がある。したがっ
て，第二試薬中のＰＩの添加濃度としては，１×１０-7
〜１×１０-3モル／リットルが適当であり，１×１０-6
モル／リットル程度であることが最も好ましいと考えら
れる。
【００３６】試薬のｐＨの影響 図５は，緩衝液の種類とｐＨの影響を示す説明図であ
る。緩衝液としては，濃度５０ミリモル／リットルに調
整された以下の各種を用い，第一試薬および第二試薬の
ｐＨを，それぞれ以下に調整した。なお，前記緩衝液の
種類およびｐＨ以外の条件は，図１の場合と同様であ
る。 イミダゾール： 商品名：イミダゾール，販売元：和光
純薬社 ｐＨ６．２，７．０，７．３５，７．８ トリス ： 商品名：トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン，販売元：和光純薬社 ｐＨ７．０，７．３５，７．８ ＨＥＰＥＳ ： 商品名：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸，販売元：和光
純薬社 ｐＨ６．６，７．０，７．３５，７．８
る。緩衝液としては，濃度５０ミリモル／リットルに調
整された以下の各種を用い，第一試薬および第二試薬の
ｐＨを，それぞれ以下に調整した。なお，前記緩衝液の
種類およびｐＨ以外の条件は，図１の場合と同様であ
る。 イミダゾール： 商品名：イミダゾール，販売元：和光
純薬社 ｐＨ６．２，７．０，７．３５，７．８ トリス ： 商品名：トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン，販売元：和光純薬社 ｐＨ７．０，７．３５，７．８ ＨＥＰＥＳ ： 商品名：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸，販売元：和光
純薬社 ｐＨ６．６，７．０，７．３５，７．８
【００３７】同図より，緩衝液の種類は特に問われるこ
とはなく，いずれの種類の緩衝液でも使用できることが
明らかである。一方，ｐＨは７．０未満であると発色反
応が阻害される虞が生じることから，検査試薬のｐＨ
は，中性から弱アルカリ性付近，たとえば７以上１１以
下程度に調整することが望ましいと考えられる。
とはなく，いずれの種類の緩衝液でも使用できることが
明らかである。一方，ｐＨは７．０未満であると発色反
応が阻害される虞が生じることから，検査試薬のｐＨ
は，中性から弱アルカリ性付近，たとえば７以上１１以
下程度に調整することが望ましいと考えられる。
【００３８】試薬中の塩濃度の影響 図６は，反応系の塩濃度の影響を示す説明図である。な
お，塩濃度以外の条件は，図１の場合と同様である。
お，塩濃度以外の条件は，図１の場合と同様である。
【００３９】同図より，１００ミリモルで最も発色が増
幅されていることが明らかである。一方，塩濃度が高く
なると発色が阻害される可能性がある。したがって，検
査試薬には，５０〜１０００ミリモル程度の塩が含まれ
ていることが好ましいと考えられる。
幅されていることが明らかである。一方，塩濃度が高く
なると発色が阻害される可能性がある。したがって，検
査試薬には，５０〜１０００ミリモル程度の塩が含まれ
ていることが好ましいと考えられる。
【００４０】以上みてきたように，実施の形態１の血液
凝固検査試薬によれば，検体中に存在する夾雑プロテア
ーゼによる非特異的発色の防止または／および活性化ト
ロンビンの活性制御を行うことにより，一般的な血液凝
固能の測定方法であるＣｌｏｔ法との相関性の良い測定
が可能となる。
凝固検査試薬によれば，検体中に存在する夾雑プロテア
ーゼによる非特異的発色の防止または／および活性化ト
ロンビンの活性制御を行うことにより，一般的な血液凝
固能の測定方法であるＣｌｏｔ法との相関性の良い測定
が可能となる。
【００４１】〔実施の形態２〕実施の形態２に示す発色
基質法による血液凝固能の測定方法は，検体または／お
よび凝固試薬を希釈液で希釈して，希釈した反応系にお
いて発色を行わせることにより，フィブリン塊の生成速
度を抑制して凝固時間を延長させ，過凝固検体の測定を
可能にしたものである。
基質法による血液凝固能の測定方法は，検体または／お
よび凝固試薬を希釈液で希釈して，希釈した反応系にお
いて発色を行わせることにより，フィブリン塊の生成速
度を抑制して凝固時間を延長させ，過凝固検体の測定を
可能にしたものである。
【００４２】そこで，この発明の効果を調べるために， 本測定方法の概略フローチャート 過凝固検体の測定における検量線 検体の希釈率の影響 凝固試薬の希釈率の影響 の各項目について，上記の順に検討する。
【００４３】本測定方法の概略フローチャート 図７は，実施の形態２の血液凝固能の測定方法の概略フ
ローチャートである。ここでは，検体を希釈して希釈し
た反応系を作成する場合を例として説明する。
ローチャートである。ここでは，検体を希釈して希釈し
た反応系を作成する場合を例として説明する。
【００４４】図において，まず，検体希釈液にＰＩを添
加する（Ｓ１０１：請求項５の添加工程）。
加する（Ｓ１０１：請求項５の添加工程）。
【００４５】次に，検体を検体希釈液（ＰＩ含有）で予
め希釈する（Ｓ１０２：請求項５の希釈工程）。
め希釈する（Ｓ１０２：請求項５の希釈工程）。
【００４６】続いて，検体希釈液（ＰＩ含有）で試薬し
た検体，第一試薬（凝固試薬），第二試薬（発色基質）
を，自動分析機（図示せず）の検体ラック，第一試薬ラ
ック，第二試薬ラックにそれぞれ載置する。（Ｓ１０
３）。ここで，希釈検体／第一試薬／第二試薬が，それ
ぞれ２０マクロリットル，５０マイクロリットル，２４
０マイクロリットル添加されるように，自動分析機のパ
ラメータを設定する。また，測光時間ポイントは１９−
２６（測光時間１３８．４６秒）に設定し，測定波長は
４１５ｎｍに設定する。
た検体，第一試薬（凝固試薬），第二試薬（発色基質）
を，自動分析機（図示せず）の検体ラック，第一試薬ラ
ック，第二試薬ラックにそれぞれ載置する。（Ｓ１０
３）。ここで，希釈検体／第一試薬／第二試薬が，それ
ぞれ２０マクロリットル，５０マイクロリットル，２４
０マイクロリットル添加されるように，自動分析機のパ
ラメータを設定する。また，測光時間ポイントは１９−
２６（測光時間１３８．４６秒）に設定し，測定波長は
４１５ｎｍに設定する。
【００４７】次に，分析を開始すると，希釈検体と第一
試薬（凝固試薬）が混合されて，所定の反応セルに分注
される（Ｓ１０４：請求項５の反応系作成工程）。
試薬（凝固試薬）が混合されて，所定の反応セルに分注
される（Ｓ１０４：請求項５の反応系作成工程）。
【００４８】続いて，上記反応セルにさらに，第二試薬
（発色基質）が添加され，反応セル内に生じている活性
化トロンビンを発色させる（Ｓ１０５：請求項５の発色
工程）。
（発色基質）が添加され，反応セル内に生じている活性
化トロンビンを発色させる（Ｓ１０５：請求項５の発色
工程）。
【００４９】ステップＳ１０５で現れた発色を，光学的
に測定する（Ｓ１０６：請求項５の測定工程）。具体的
には，所定時間内の吸光度変化を測定することになる。
に測定する（Ｓ１０６：請求項５の測定工程）。具体的
には，所定時間内の吸光度変化を測定することになる。
【００５０】最後に，ステップＳ１０６で得られた吸光
度に基づいて，検体の血液凝固能が正常範囲であるか，
血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血液凝
固能が低いことによる異常範囲であるか，を判定する
（Ｓ１０７：請求項５の判定工程）。具体的には，自動
分析装置のプリンタまたは表示部に，測定した吸光度を
表示し，オペレータ（分析者）が目視で吸光度を確認す
る。そして，あらかじめ検証された正常値の吸光度の範
囲に入っているか，または上下のいずれに外れているか
に基づいて，正常値の吸光度の範囲内であれば検体の血
液凝固能は正常であると判定し，当該範囲を超えている
場合は検体の血液凝固能が高いことによる異常であると
判定し，当該範囲より低い場合には検体の血液凝固能が
低いことによる異常であると判定する。なお，この判定
工程は，あらかじめ判定プログラムを作成して自動分析
装置に組み込むことにより，自動化することができるの
は勿論である。
度に基づいて，検体の血液凝固能が正常範囲であるか，
血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血液凝
固能が低いことによる異常範囲であるか，を判定する
（Ｓ１０７：請求項５の判定工程）。具体的には，自動
分析装置のプリンタまたは表示部に，測定した吸光度を
表示し，オペレータ（分析者）が目視で吸光度を確認す
る。そして，あらかじめ検証された正常値の吸光度の範
囲に入っているか，または上下のいずれに外れているか
に基づいて，正常値の吸光度の範囲内であれば検体の血
液凝固能は正常であると判定し，当該範囲を超えている
場合は検体の血液凝固能が高いことによる異常であると
判定し，当該範囲より低い場合には検体の血液凝固能が
低いことによる異常であると判定する。なお，この判定
工程は，あらかじめ判定プログラムを作成して自動分析
装置に組み込むことにより，自動化することができるの
は勿論である。
【００５１】過凝固検体の測定における検量線 図８は，過凝固検体（凝固時間２００％）を測定したと
きの検量線を示す。横軸は，活性化トロンビンの酵素活
性（％）を示し，縦軸は△ＯＤを示す。
きの検量線を示す。横軸は，活性化トロンビンの酵素活
性（％）を示し，縦軸は△ＯＤを示す。
【００５２】本実験に用いた検体，試薬等は以下のとお
りである。 検体 ： 血漿 検体希釈液 ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ
（１００ｍＭ）を添加し塩濃度を調整する。次に，この
緩衝液に後述するトリプシンインヒビターが２×１０-5
Ｍとなるように添加する。さらにこの緩衝液をｐＨ７．
３５に調整する。 凝固試薬 ： 市販のＰＴ測定用試薬（商品名：トロン
ボプラスチン・Ｃ，販売元：株式会社ミドリ十字） 緩衝液１ ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ（１
００ｍＭ）を添加して塩濃度を調整する。次に，この緩
衝液をｐＨ７．３５に調整する。 緩衝液２ ： 緩衝液１にＣａＣｌ2 （１０ｍＭ）を添
加したものを緩衝液２とする。 発色基質 ： 市販の合成発色基質（商品名：テストチ
ーム発色気質Ｓ−２２３８，販売元：第一化学薬品
（株）） ＰＩ ： トリプシンインヒビター（商品名：大豆ト
リプシンインヒビター，販売元：シグマ社） 測定装置： 生化学用の自動分析装置（７０５０日立自
動分析装置，日立製作所製）
りである。 検体 ： 血漿 検体希釈液 ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ
（１００ｍＭ）を添加し塩濃度を調整する。次に，この
緩衝液に後述するトリプシンインヒビターが２×１０-5
Ｍとなるように添加する。さらにこの緩衝液をｐＨ７．
３５に調整する。 凝固試薬 ： 市販のＰＴ測定用試薬（商品名：トロン
ボプラスチン・Ｃ，販売元：株式会社ミドリ十字） 緩衝液１ ： トリス緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ（１
００ｍＭ）を添加して塩濃度を調整する。次に，この緩
衝液をｐＨ７．３５に調整する。 緩衝液２ ： 緩衝液１にＣａＣｌ2 （１０ｍＭ）を添
加したものを緩衝液２とする。 発色基質 ： 市販の合成発色基質（商品名：テストチ
ーム発色気質Ｓ−２２３８，販売元：第一化学薬品
（株）） ＰＩ ： トリプシンインヒビター（商品名：大豆ト
リプシンインヒビター，販売元：シグマ社） 測定装置： 生化学用の自動分析装置（７０５０日立自
動分析装置，日立製作所製）
【００５３】また，測定方法は，以下のとおりである。 （イ）検体希釈液に２×１０-5モル／リットルのＰＩを
添加する。 （ロ）検体を検体希釈液で２５倍に希釈し，希釈検体と
する。 （ハ）凝固試薬に１０倍量の緩衝液２を加えて，第一試
薬を作成する。 （ニ）２ｍＭの発色基質に４倍量の緩衝液２を加えて，
第二試薬を作成する。 （ホ）最終的な添加比率が，希釈検体／第一試薬／第二
試薬＝２０／５０／２４０となるように，希釈検体に第
一試薬を添加し，続いて第二試薬を添加する。 （ヘ）波長４００ｎｍ付近における吸光度を測定し，△
ＯＤを求める。
添加する。 （ロ）検体を検体希釈液で２５倍に希釈し，希釈検体と
する。 （ハ）凝固試薬に１０倍量の緩衝液２を加えて，第一試
薬を作成する。 （ニ）２ｍＭの発色基質に４倍量の緩衝液２を加えて，
第二試薬を作成する。 （ホ）最終的な添加比率が，希釈検体／第一試薬／第二
試薬＝２０／５０／２４０となるように，希釈検体に第
一試薬を添加し，続いて第二試薬を添加する。 （ヘ）波長４００ｎｍ付近における吸光度を測定し，△
ＯＤを求める。
【００５４】同図において，発色（△ＯＤ）が，活性％
にして２００％までほぼ直線的に伸びている。これよ
り，従来の一般的な検査法では測定できなかった過凝固
領域の血液凝固能を測定できることが明らかである。
にして２００％までほぼ直線的に伸びている。これよ
り，従来の一般的な検査法では測定できなかった過凝固
領域の血液凝固能を測定できることが明らかである。
【００５５】なお，本発明において，使用する試薬等は
上記記載に限定されることはなく，たとえば，凝固試薬
としてはＡＰＴＴ測定用試薬を用いることができる。ま
た，測定方法も上記記載に限定されることはなく，たと
えば，検体／凝固試薬／発色基質の添加比率は自由に設
定することができる。
上記記載に限定されることはなく，たとえば，凝固試薬
としてはＡＰＴＴ測定用試薬を用いることができる。ま
た，測定方法も上記記載に限定されることはなく，たと
えば，検体／凝固試薬／発色基質の添加比率は自由に設
定することができる。
【００５６】さらに，本発明におけるＰＩの種類と添加
濃度，反応系のｐＨ，反応系の塩濃度については，上記
の実施の形態１においてなされたと同様の検討結果が得
られている。
濃度，反応系のｐＨ，反応系の塩濃度については，上記
の実施の形態１においてなされたと同様の検討結果が得
られている。
【００５７】検体の希釈率の影響 図９は，検体の希釈率の影響を示す説明図である。すな
わち，検体を１１〜８８倍に希釈した場合の，酵素活性
と△ＯＤとの関係を示している。ここで，検体の希釈率
を変化させたこと以外の条件は，図８の場合と同様であ
る。
わち，検体を１１〜８８倍に希釈した場合の，酵素活性
と△ＯＤとの関係を示している。ここで，検体の希釈率
を変化させたこと以外の条件は，図８の場合と同様であ
る。
【００５８】同図より，検体の希釈が１０倍より低い場
合は，検体が凝固する虞があり，一方，検体の希釈が２
００倍を超えるとΔＯＤが小さく良好な測定再現性が得
られなくなる虞がある。したがって，検体は１０〜２０
０倍程度に希釈されることが好ましいと考えられる。
合は，検体が凝固する虞があり，一方，検体の希釈が２
００倍を超えるとΔＯＤが小さく良好な測定再現性が得
られなくなる虞がある。したがって，検体は１０〜２０
０倍程度に希釈されることが好ましいと考えられる。
【００５９】凝固試薬の希釈率の影響 図１０は，凝固試薬の希釈率の影響を示す説明図であ
る。すなわち，凝固試薬を２〜１５０倍に希釈した場合
の，酵素活性と△ＯＤとの関係を示している。ここで，
凝固試薬の希釈率を変化させたこと以外の条件は，図８
の場合と同様である。
る。すなわち，凝固試薬を２〜１５０倍に希釈した場合
の，酵素活性と△ＯＤとの関係を示している。ここで，
凝固試薬の希釈率を変化させたこと以外の条件は，図８
の場合と同様である。
【００６０】同図より，凝固試薬の希釈が５倍未満であ
ると，反応系が凝固する虞れがある。また１００倍を超
えると十分なΔＯＤが得られず良好な測定再現性が得ら
れない虞がある。したがって，凝固試薬は５〜１００倍
程度に希釈されることが好ましいと考えられる。
ると，反応系が凝固する虞れがある。また１００倍を超
えると十分なΔＯＤが得られず良好な測定再現性が得ら
れない虞がある。したがって，凝固試薬は５〜１００倍
程度に希釈されることが好ましいと考えられる。
【００６１】以上みてきたように，実施の形態２の血液
凝固能の測定方法によれば，まず，ＰＩを使用すること
で検体中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特異的発
色の防止または／および活性化トロンビンの活性制御を
行って，一般的な血液凝固能の測定方法であるＣｌｏｔ
法との相関性の良い測定が可能となる。
凝固能の測定方法によれば，まず，ＰＩを使用すること
で検体中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特異的発
色の防止または／および活性化トロンビンの活性制御を
行って，一般的な血液凝固能の測定方法であるＣｌｏｔ
法との相関性の良い測定が可能となる。
【００６２】また，希釈液により反応系を希釈すること
で，反応系におけるフィブリン塊の生成速度を抑制して
凝固時間を延長することができ，その結果，発色基質法
を採用して過凝固検体をも測定することができる。
で，反応系におけるフィブリン塊の生成速度を抑制して
凝固時間を延長することができ，その結果，発色基質法
を採用して過凝固検体をも測定することができる。
【００６３】
【発明の効果】以上説明したように，本発明の血液凝固
検査試薬（請求項１）は，活性化トロンビンの酵素活性
を測定して血液凝固能を測定する発色基質法に用いら
れ，少なくとも検体を凝固させるための凝固試薬を含む
第一試薬と，少なくとも活性化トロンビンの酵素活性を
測定するための発色基質を含む第二試薬と，からなる血
液凝固検査試薬において，検体中に存在する夾雑プロテ
アーゼによる非特異的発色の防止または／および活性化
トロンビンの活性制御を行うプロテアーゼインヒビター
を含むため，発色基質法において検体中に存在する夾雑
プロテアーゼによる非特異的発色の防止または／および
活性化トロンビンの活性制御を行って，Ｃｌｏｔ法との
相関性を高めた血液凝固検査試薬を提供することができ
る。
検査試薬（請求項１）は，活性化トロンビンの酵素活性
を測定して血液凝固能を測定する発色基質法に用いら
れ，少なくとも検体を凝固させるための凝固試薬を含む
第一試薬と，少なくとも活性化トロンビンの酵素活性を
測定するための発色基質を含む第二試薬と，からなる血
液凝固検査試薬において，検体中に存在する夾雑プロテ
アーゼによる非特異的発色の防止または／および活性化
トロンビンの活性制御を行うプロテアーゼインヒビター
を含むため，発色基質法において検体中に存在する夾雑
プロテアーゼによる非特異的発色の防止または／および
活性化トロンビンの活性制御を行って，Ｃｌｏｔ法との
相関性を高めた血液凝固検査試薬を提供することができ
る。
【００６４】また，本発明の血液凝固検査試薬（請求項
２）は，請求項１に記載の血液凝固検査試薬において，
プロテアーゼインヒビターの濃度が，１×１０-7〜１×
１０ -3モル／リットルであるため，夾雑プロテアーゼに
よる非特異的発色を良好に防止することができる。
２）は，請求項１に記載の血液凝固検査試薬において，
プロテアーゼインヒビターの濃度が，１×１０-7〜１×
１０ -3モル／リットルであるため，夾雑プロテアーゼに
よる非特異的発色を良好に防止することができる。
【００６５】また，本発明の血液凝固検査試薬（請求項
３）は，請求項１または２に記載の血液凝固検査試薬に
おいて，第一試薬および第二試薬が，それぞれｐＨ７〜
ｐＨ１１の範囲であるため，発色反応が阻害される虞が
なく，光学的測定を良好に行うことができる。
３）は，請求項１または２に記載の血液凝固検査試薬に
おいて，第一試薬および第二試薬が，それぞれｐＨ７〜
ｐＨ１１の範囲であるため，発色反応が阻害される虞が
なく，光学的測定を良好に行うことができる。
【００６６】さらに，本発明の血液凝固検査試薬（請求
項５）は，請求項１〜３のいずれか一に記載の血液凝固
検査試薬において，第一試薬または／および第二試薬
が，易溶性のアルカリ金属塩または／およびアルカリ土
類金属塩を含み，かつ，その塩濃度の合計が，ＮａＣｌ
換算で，５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲であ
るため，発色を十分に増幅することができ，測定の精度
をさらに高めることができる。
項５）は，請求項１〜３のいずれか一に記載の血液凝固
検査試薬において，第一試薬または／および第二試薬
が，易溶性のアルカリ金属塩または／およびアルカリ土
類金属塩を含み，かつ，その塩濃度の合計が，ＮａＣｌ
換算で，５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲であ
るため，発色を十分に増幅することができ，測定の精度
をさらに高めることができる。
【００６７】一方，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項５）は，検体と凝固試薬とを混合させて反応系を作
成し，更に発色基質を加えて反応系で生じた活性化トロ
ンビンを発色させ，発色を光学的に測定して検体の血液
凝固能を測定する血液凝固能の測定方法において，検体
中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特異的発色の防
止または／および活性化トロンビンの活性制御を行うプ
ロテアーゼインヒビターを，凝固試薬，発色気質または
希釈液のいずれかに添加する添加工程と，検体または／
および凝固試薬を希釈液で希釈する希釈工程と，希釈工
程で希釈した検体または／および凝固試薬を用いて，所
定量の検体および凝固試薬を反応セルに分注し，混合さ
せることにより，希釈した反応系を作成する反応系作成
工程と，希釈した反応系に発色基質を加えて活性化トロ
ンビンを発色させる発色工程と，活性化トロンビンの発
色を光学的に測定する測定工程と，測定工程で測定した
吸光度に基づいて，検体の血液凝固能が正常範囲である
か，血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血
液凝固能が低いことによる異常範囲であるか，を判定す
る判定工程と，を含むため，反応系でのフィブリン塊の
生成速度を抑制して凝固時間を延長させることにより，
過凝固検体の測定を行えるようにした血液凝固能の測定
方法を提供することができる。また，プロテアーゼイン
ヒビターの働きで夾雑プロテアーゼによる非特異的発色
が防止されるため，精度の高い測定が可能となる。
求項５）は，検体と凝固試薬とを混合させて反応系を作
成し，更に発色基質を加えて反応系で生じた活性化トロ
ンビンを発色させ，発色を光学的に測定して検体の血液
凝固能を測定する血液凝固能の測定方法において，検体
中に存在する夾雑プロテアーゼによる非特異的発色の防
止または／および活性化トロンビンの活性制御を行うプ
ロテアーゼインヒビターを，凝固試薬，発色気質または
希釈液のいずれかに添加する添加工程と，検体または／
および凝固試薬を希釈液で希釈する希釈工程と，希釈工
程で希釈した検体または／および凝固試薬を用いて，所
定量の検体および凝固試薬を反応セルに分注し，混合さ
せることにより，希釈した反応系を作成する反応系作成
工程と，希釈した反応系に発色基質を加えて活性化トロ
ンビンを発色させる発色工程と，活性化トロンビンの発
色を光学的に測定する測定工程と，測定工程で測定した
吸光度に基づいて，検体の血液凝固能が正常範囲である
か，血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血
液凝固能が低いことによる異常範囲であるか，を判定す
る判定工程と，を含むため，反応系でのフィブリン塊の
生成速度を抑制して凝固時間を延長させることにより，
過凝固検体の測定を行えるようにした血液凝固能の測定
方法を提供することができる。また，プロテアーゼイン
ヒビターの働きで夾雑プロテアーゼによる非特異的発色
が防止されるため，精度の高い測定が可能となる。
【００６８】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項６）は，請求項５に記載の血液凝固能の測定方法に
おいて，添加工程で添加するプロテアーゼインヒビター
が，セリンプロテアーゼインヒビターであるため，夾雑
プロテアーゼによる非特異的発色を良好に防止すること
ができる。
求項６）は，請求項５に記載の血液凝固能の測定方法に
おいて，添加工程で添加するプロテアーゼインヒビター
が，セリンプロテアーゼインヒビターであるため，夾雑
プロテアーゼによる非特異的発色を良好に防止すること
ができる。
【００６９】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項７）は，請求項５または６に記載の血液凝固能の測
定方法において，添加工程で添加するプロテアーゼイン
ヒビターが，１×１０-7〜１×１０-3モル／リットルの
範囲であるため，夾雑プロテアーゼによる非特異的発色
を良好に防止することができる。
求項７）は，請求項５または６に記載の血液凝固能の測
定方法において，添加工程で添加するプロテアーゼイン
ヒビターが，１×１０-7〜１×１０-3モル／リットルの
範囲であるため，夾雑プロテアーゼによる非特異的発色
を良好に防止することができる。
【００７０】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項８）は，請求項５〜７のいずれか一に記載の血液凝
固能の測定方法において，希釈した反応系は，ｐＨ７〜
ｐＨ１１の範囲に調整されているため，発色反応が阻害
される虞がなく，光学的測定を良好に行うことができ
る。
求項８）は，請求項５〜７のいずれか一に記載の血液凝
固能の測定方法において，希釈した反応系は，ｐＨ７〜
ｐＨ１１の範囲に調整されているため，発色反応が阻害
される虞がなく，光学的測定を良好に行うことができ
る。
【００７１】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項９）は，請求項５〜８のいずれか一に記載の血液凝
固能の測定方法において，希釈した反応系が，その塩濃
度がＮａＣｌ換算で５０〜１０００ミリモル／リットル
の範囲に調整されているため，測定の精度をさらに高め
ることができる。
求項９）は，請求項５〜８のいずれか一に記載の血液凝
固能の測定方法において，希釈した反応系が，その塩濃
度がＮａＣｌ換算で５０〜１０００ミリモル／リットル
の範囲に調整されているため，測定の精度をさらに高め
ることができる。
【００７２】さらに，本発明の血液凝固能の測定方法
（請求項１０）は，請求項５〜９のいずれか一に記載の
血液凝固能の測定方法において，希釈した反応系は，検
体が１０〜２００倍の範囲で希釈され，または／およ
び，凝固試薬が５〜１００倍の範囲で希釈されているた
め，反応系におけるフィブリン塊の生成速度を良好に抑
制することができる。
（請求項１０）は，請求項５〜９のいずれか一に記載の
血液凝固能の測定方法において，希釈した反応系は，検
体が１０〜２００倍の範囲で希釈され，または／およ
び，凝固試薬が５〜１００倍の範囲で希釈されているた
め，反応系におけるフィブリン塊の生成速度を良好に抑
制することができる。
【図１】実施の形態１の血液凝固検査試薬における，プ
ロテアーゼインヒビター添加によるＣｌｏｔ法との相関
性の向上を示す相関図である。
ロテアーゼインヒビター添加によるＣｌｏｔ法との相関
性の向上を示す相関図である。
【図２】実施の形態１の血液凝固検査試薬における，プ
ロテアーゼインヒビター種の影響を示す説明図である。
ロテアーゼインヒビター種の影響を示す説明図である。
【図３】実施の形態１の血液凝固検査試薬における，プ
ロテアーゼインヒビター種の影響を示す説明図である。
ロテアーゼインヒビター種の影響を示す説明図である。
【図４】実施の形態１の血液凝固検査試薬における，プ
ロテアーゼインヒビター濃度の影響を示す説明図であ
る。
ロテアーゼインヒビター濃度の影響を示す説明図であ
る。
【図５】実施の形態１の血液凝固検査試薬における，緩
衝液の種類とｐＨの影響を示す説明図である。
衝液の種類とｐＨの影響を示す説明図である。
【図６】実施の形態１の血液凝固検査試薬における，塩
濃度の影響を示す説明図である。
濃度の影響を示す説明図である。
【図７】実施の形態２の血液凝固能の測定方法の概略フ
ローチャートである。
ローチャートである。
【図８】実施の形態２の血液凝固能の測定方法による，
過凝固検体の測定を示す検量線である。
過凝固検体の測定を示す検量線である。
【図９】実施の形態２の血液凝固能の測定方法におけ
る，検体の希釈率の影響を示す説明図である。
る，検体の希釈率の影響を示す説明図である。
【図１０】実施の形態２の血液凝固能の測定方法におけ
る，過凝固検体の希釈率の影響を示す説明図である。
る，過凝固検体の希釈率の影響を示す説明図である。
△ＯＤ 一定時間の吸光度差
Claims (10)
- 【請求項１】 活性化トロンビンの酵素活性を測定して
血液凝固能を測定する発色基質法に用いられ，少なくと
も検体を凝固させるための凝固試薬を含む第一試薬と，
少なくとも活性化トロンビンの酵素活性を測定するため
の発色基質を含む第二試薬と，からなる血液凝固検査試
薬において，検体中に存在する夾雑プロテアーゼによる
非特異的発色の防止または／および活性化トロンビンの
活性制御を行うプロテアーゼインヒビターを含むことを
特徴とする血液凝固検査試薬。 - 【請求項２】 前記プロテアーゼインヒビターは，その
濃度が，１×１０-7〜１×１０-3モル／リットルである
ことを特徴とする請求項１に記載の血液凝固検査試薬。 - 【請求項３】 前記第一試薬および第二試薬は，それぞ
れｐＨ７〜ｐＨ１１の範囲であることを特徴とする請求
項１または２に記載の血液凝固検査試薬。 - 【請求項４】 前記第一試薬または／および第二試薬
は，易溶性のアルカリ金属塩または／およびアルカリ土
類金属塩を含み，かつ，その塩濃度の合計が，ＮａＣｌ
換算で，５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲であ
ることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載の
血液凝固検査試薬。 - 【請求項５】 検体と凝固試薬とを混合させて反応系を
作成し，更に発色基質を加えて前記反応系で生じた活性
化トロンビンを発色させ，前記発色を光学的に測定して
前記検体の血液凝固能を測定する血液凝固能の測定方法
において，前記検体中に存在する夾雑プロテアーゼによ
る非特異的発色の防止または／および活性化トロンビン
の活性制御を行うプロテアーゼインヒビターを，前記凝
固試薬，発色気質または希釈液のいずれかに添加する添
加工程と，前記検体または／および凝固試薬を希釈液で
希釈する希釈工程と，前記希釈工程で希釈した前記検体
または／および凝固試薬を用いて，所定量の前記検体お
よび凝固試薬を反応セルに分注し，混合させることによ
り，希釈した反応系を作成する反応系作成工程と，前記
希釈した反応系に発色基質を加えて前記活性化トロンビ
ンを発色させる発色工程と，前記活性化トロンビンの発
色を光学的に測定する測定工程と，前記測定工程で測定
した吸光度に基づいて，前記検体の血液凝固能が正常範
囲であるか，血液凝固能が高いことによる異常範囲であ
るか，血液凝固能が低いことによる異常範囲であるか，
を判定する判定工程と，を含むことを特徴とする血液凝
固能の測定方法。 - 【請求項６】 前記添加工程で添加するプロテアーゼイ
ンヒビターは，セリンプロテアーゼインヒビターである
ことを特徴とする請求項５に記載の血液凝固能の測定方
法。 - 【請求項７】 前記添加工程で添加するプロテアーゼイ
ンヒビターは，１×１０-7〜１×１０-3モル／リットル
の範囲であることを特徴とする請求項５または６に記載
の血液凝固能の測定方法。 - 【請求項８】 前記希釈した反応系は，ｐＨ７〜ｐＨ１
１の範囲に調整されていることを特徴とする請求項５〜
７のいずれか一に記載の血液凝固能の測定方法。 - 【請求項９】 前記希釈した反応系は，その塩濃度がＮ
ａＣｌ換算で５０〜１０００ミリモル／リットルの範囲
に調整されていることを特徴とする請求項５〜８のいず
れか一に記載の血液凝固能の測定方法。 - 【請求項１０】 前記希釈した反応系は，前記検体が１
０〜２００倍の範囲で希釈され，または／および，前記
凝固試薬が５〜１００倍の範囲で希釈されていることを
特徴とする請求項５〜９のいずれか一に記載の血液凝固
能の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33220997A JPH11160321A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | 血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33220997A JPH11160321A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | 血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11160321A true JPH11160321A (ja) | 1999-06-18 |
Family
ID=18252405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33220997A Pending JPH11160321A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | 血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11160321A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007107889A (ja) * | 2005-10-11 | 2007-04-26 | Sysmex Corp | 検体分析装置、検体分析方法及びコンピュータプログラム |
| JP2011523461A (ja) * | 2008-05-22 | 2011-08-11 | エシコン・インコーポレイテッド | タンパク質アッセイ |
| JP2013145238A (ja) * | 2013-03-04 | 2013-07-25 | Sekisui Medical Co Ltd | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
-
1997
- 1997-12-02 JP JP33220997A patent/JPH11160321A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007107889A (ja) * | 2005-10-11 | 2007-04-26 | Sysmex Corp | 検体分析装置、検体分析方法及びコンピュータプログラム |
| JP2011523461A (ja) * | 2008-05-22 | 2011-08-11 | エシコン・インコーポレイテッド | タンパク質アッセイ |
| US9213035B2 (en) | 2008-05-22 | 2015-12-15 | Ethicon, Inc. | Protein assay |
| US9896716B2 (en) | 2008-05-22 | 2018-02-20 | Ethicon, Inc. | Protein assay |
| JP2013145238A (ja) * | 2013-03-04 | 2013-07-25 | Sekisui Medical Co Ltd | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
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