JPH1042895A - 酵素検出方法、そのための組成物及びそのための試験片 - Google Patents
酵素検出方法、そのための組成物及びそのための試験片Info
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- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/70—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases the product, e.g. phenol, naphthol being diazotised in situ, e.g. with Fast Red
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/966—Elastase
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 短時間で酵素接触反応のエンドポイントを提
供する。 【解決手段】 試薬系中に酵素を分解するプロテアーゼ
を含有させる。
供する。 【解決手段】 試薬系中に酵素を分解するプロテアーゼ
を含有させる。
Description
【0001】大部分の酵素検出法は、Kaplanらにより、
Clinical Chemistry(C. V. Mosby社出版、1984年)の
938頁に論じられている理由のため、エンドポイント
(終点)法ではなく速度測定法である。一般に、酵素検
出法における速度測定法の利用は、エンドポイント測定
法を利用したならば長い分析時間を生じさせるであろ
う、より少量の酵素の使用及び遅いターンオーバ速度を
可能にする。速度測定法は計器を用いて行うことが好ま
しいが、そのような速度測定は、多数の読み取りを目視
的に行うことが困難であるため、目視的比色測定では困
難である。したがって、目視的速度測定では通常、発さ
れる色の量が時間に依存するため、比較的大きくばらつ
く検定につながる1点読み取りである。たとえば、尿の
ような体液中の白血球(WBC)を測定するための現在
の方法は、エステラーゼ活性の速度測定に依存する。
5.0×10-16 mole/μL のエステラーゼ試料は、9
0秒では10細胞/μL として検出されるが、60秒で
は2細胞/μL として、120秒では16細胞/μL と
して検出される。この時間依存性が7.9細胞/μL の
高い標準偏差につながる。エンドポイント酵素検出方法
に対してはいくつかの方法が採用されてきた。そのよう
な一つの方法は、Shiyuku により特開昭51−76,7
97号公報に開示されている。この方法は、酵素を沈殿
させ、コレステロールハイドロゲナーゼによるコレステ
ロールの測定をエンドポイントするためのヒドラジンの
使用を含む。Mallinckrodtにより欧州特許公開第12
3,902号公報に開示されているもう一つの方法は、
設定期間後に試料を希釈して酵素反応の速度を下げ、そ
れにより、ペルオキシダーゼ測定にエンドポイントを生
じさせる方法である。もう一つのそのような方法は、特
開平2−131,597号公報に開示されているよう
な、アミラーゼ活性の測定において、多重層を使用して
基質からの酵素を封じ込める方法である。もっとも一般
的な方法は、Carbohyra. Res. 246, 229-141 1993 にお
ける、アルギン酸リアーゼの測定に関するK. Oestgaard
の研究で例示されるような、酵素速度の阻害を利用する
方法である。酵素検出阻害方法は、ターンオーバ速度を
変えるが、真のエンドポイントにはつながらない。この
挙動は、Cookらが、ヒト白血球エラスターゼのCu2+及
びZn2+阻害の効果に基づき、Biol. Chem. Hoppe-Seyl
er, Vol. 370. Pp. 11−19, January1989に報告してい
る。
Clinical Chemistry(C. V. Mosby社出版、1984年)の
938頁に論じられている理由のため、エンドポイント
(終点)法ではなく速度測定法である。一般に、酵素検
出法における速度測定法の利用は、エンドポイント測定
法を利用したならば長い分析時間を生じさせるであろ
う、より少量の酵素の使用及び遅いターンオーバ速度を
可能にする。速度測定法は計器を用いて行うことが好ま
しいが、そのような速度測定は、多数の読み取りを目視
的に行うことが困難であるため、目視的比色測定では困
難である。したがって、目視的速度測定では通常、発さ
れる色の量が時間に依存するため、比較的大きくばらつ
く検定につながる1点読み取りである。たとえば、尿の
ような体液中の白血球(WBC)を測定するための現在
の方法は、エステラーゼ活性の速度測定に依存する。
5.0×10-16 mole/μL のエステラーゼ試料は、9
0秒では10細胞/μL として検出されるが、60秒で
は2細胞/μL として、120秒では16細胞/μL と
して検出される。この時間依存性が7.9細胞/μL の
高い標準偏差につながる。エンドポイント酵素検出方法
に対してはいくつかの方法が採用されてきた。そのよう
な一つの方法は、Shiyuku により特開昭51−76,7
97号公報に開示されている。この方法は、酵素を沈殿
させ、コレステロールハイドロゲナーゼによるコレステ
ロールの測定をエンドポイントするためのヒドラジンの
使用を含む。Mallinckrodtにより欧州特許公開第12
3,902号公報に開示されているもう一つの方法は、
設定期間後に試料を希釈して酵素反応の速度を下げ、そ
れにより、ペルオキシダーゼ測定にエンドポイントを生
じさせる方法である。もう一つのそのような方法は、特
開平2−131,597号公報に開示されているよう
な、アミラーゼ活性の測定において、多重層を使用して
基質からの酵素を封じ込める方法である。もっとも一般
的な方法は、Carbohyra. Res. 246, 229-141 1993 にお
ける、アルギン酸リアーゼの測定に関するK. Oestgaard
の研究で例示されるような、酵素速度の阻害を利用する
方法である。酵素検出阻害方法は、ターンオーバ速度を
変えるが、真のエンドポイントにはつながらない。この
挙動は、Cookらが、ヒト白血球エラスターゼのCu2+及
びZn2+阻害の効果に基づき、Biol. Chem. Hoppe-Seyl
er, Vol. 370. Pp. 11−19, January1989に報告してい
る。
【0002】本発明は、計量した流体試験試料中の酵素
又は酵素基質の測定をエンドポイントする方法であっ
て、酵素が、流体試験試料中の酵素又は酵素基質の濃度
を示す検出可能な応答を提供する反応に触媒として作用
するところの方法に関する。この方法は、酵素を不活性
化し、それにより、検出可能な応答を終了させ、酵素接
触反応のエンドポイントを提供することができる計量し
たプロテアーゼを試薬系に含めることを含む。
又は酵素基質の測定をエンドポイントする方法であっ
て、酵素が、流体試験試料中の酵素又は酵素基質の濃度
を示す検出可能な応答を提供する反応に触媒として作用
するところの方法に関する。この方法は、酵素を不活性
化し、それにより、検出可能な応答を終了させ、酵素接
触反応のエンドポイントを提供することができる計量し
たプロテアーゼを試薬系に含めることを含む。
【0003】好ましい実施態様では、本発明の方法は、
尿のような体液中の白血球(WBC)の定量に用いられ
る。患者の尿中の異常に高いレベルの白血球の存在は、
腎臓又は泌尿生殖器系の感染のような疾病状態を示唆し
ているおそれがある。したがって、正確な尿中白血球情
報は、医師にとって、そのような疾病の診断及び治療に
おける貴重な手段であることができる。従来から、臨床
医は、尿沈降物又は遠心分離していない尿の中の白血球
の数を数えるために、目視的測定技術に依存してきた。
これは、細胞計数を実行するのに、高価な機器、たとえ
ば遠心分離機及び顕微鏡ならびに多大な時間を要する方
法である。従来の技術にはまた、無傷の細胞しか検出す
ることができないという欠点がある。泌尿器系中の白血
球は、広範囲の細胞溶解現象に好都合である条件にさら
される。たとえば、異常に高いpHの尿中では、白血球の
半減期はわずか60分でしかない。これらの溶解細胞は
目視的検出技術をのがれ、それにより、誤った低い測定
値及び擬陰性の結果が問題になる。
尿のような体液中の白血球(WBC)の定量に用いられ
る。患者の尿中の異常に高いレベルの白血球の存在は、
腎臓又は泌尿生殖器系の感染のような疾病状態を示唆し
ているおそれがある。したがって、正確な尿中白血球情
報は、医師にとって、そのような疾病の診断及び治療に
おける貴重な手段であることができる。従来から、臨床
医は、尿沈降物又は遠心分離していない尿の中の白血球
の数を数えるために、目視的測定技術に依存してきた。
これは、細胞計数を実行するのに、高価な機器、たとえ
ば遠心分離機及び顕微鏡ならびに多大な時間を要する方
法である。従来の技術にはまた、無傷の細胞しか検出す
ることができないという欠点がある。泌尿器系中の白血
球は、広範囲の細胞溶解現象に好都合である条件にさら
される。たとえば、異常に高いpHの尿中では、白血球の
半減期はわずか60分でしかない。これらの溶解細胞は
目視的検出技術をのがれ、それにより、誤った低い測定
値及び擬陰性の結果が問題になる。
【0004】白血球を測定するためのより最近の技術
は、白血球中に含まれる加水分解酵素、たとえばエステ
ラーゼ及びプロテアーゼの検出を含む。これらの手法
は、エステラーゼ又はプロテアーゼによって加水分解さ
れると、有色のアルコール生成物を生成する色素形成性
エステル類、たとえばL−アラニン、ラクテート、バリ
ンもしくはペプチドのエステルを含む試薬系を利用す
る。種々の動物種からの膵エラスターゼ、Streptomyces
sp.のα−溶解プロテアーゼ、ヒト好中球カテプシンG
ならびにStreptomyces grieseus プロテアーゼB及び3
のようなプロテアーゼは、エステラーゼの非存在下で色
素形成性エステルを加水分解し、それにより、擬陽性の
結果を作り出す傾向を示すため、本発明に使用するには
適さないであろう。いくつかの試薬系は、反応促進剤化
合物及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む。
は、白血球中に含まれる加水分解酵素、たとえばエステ
ラーゼ及びプロテアーゼの検出を含む。これらの手法
は、エステラーゼ又はプロテアーゼによって加水分解さ
れると、有色のアルコール生成物を生成する色素形成性
エステル類、たとえばL−アラニン、ラクテート、バリ
ンもしくはペプチドのエステルを含む試薬系を利用す
る。種々の動物種からの膵エラスターゼ、Streptomyces
sp.のα−溶解プロテアーゼ、ヒト好中球カテプシンG
ならびにStreptomyces grieseus プロテアーゼB及び3
のようなプロテアーゼは、エステラーゼの非存在下で色
素形成性エステルを加水分解し、それにより、擬陽性の
結果を作り出す傾向を示すため、本発明に使用するには
適さないであろう。いくつかの試薬系は、反応促進剤化
合物及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む。
【0005】たとえば、酵素活性によって分解される
と、有色種又は他の検出可能な種を形成する特定のエス
テル類の使用を開示する多数の参考文献が存在する。
と、有色種又は他の検出可能な種を形成する特定のエス
テル類の使用を開示する多数の参考文献が存在する。
【0006】米国特許第4,637,979号明細書
は、色素形成性エステル及びジアゾニウム塩の使用を開
示している。このエステルは、白血球中に通常に存在す
るエステラーゼによって加水分解を受けて、フェノール
類又は疑似フェノール類を生成することができる。この
フェノール類又は疑似フェノール類が、ジアゾニウムカ
ップリング反応によってジアゾニウム塩とカップリング
して、有色のアゾ染料を形成することができる。WBC
が溶解すると、ヒト白血球エラスターゼとして知られる
エステラーゼが放出され、それにより、加水分解反応が
始まり、その結果、有色のアゾ染料の形成が起こること
ができる。アゾ染料形成の結果として出る色の明暗度
が、試験される流体中の白血球の濃度を示す。この試験
は、尿のような体液中のWBCを測定するための迅速か
つ効果的な方法である。しかし、反応は時間依存性であ
るため、時限反応に固有の前記欠点を避けなければなら
ないならば、一貫して正確な結果を提供するためにはあ
る種のエンドポイント手法が必要である。本発明は、試
験流体と接触すると、エステラーゼを不活性化し、それ
により、色形成反応を終了させる計量したプロテアーゼ
を試薬配合物に含めることにより、反応をエンドポイン
トする方法を提供する。プロテアーゼが過多であると、
色が形成される前にエステラーゼを急激に分解してしま
い、プロテアーゼが過少であると、所望のエンドポイン
トで色の形成を止めるのに十分なだけエステラーゼを分
解することができないため、本発明の手法には、注意深
く計量したプロテアーゼを使用する必要がある。
は、色素形成性エステル及びジアゾニウム塩の使用を開
示している。このエステルは、白血球中に通常に存在す
るエステラーゼによって加水分解を受けて、フェノール
類又は疑似フェノール類を生成することができる。この
フェノール類又は疑似フェノール類が、ジアゾニウムカ
ップリング反応によってジアゾニウム塩とカップリング
して、有色のアゾ染料を形成することができる。WBC
が溶解すると、ヒト白血球エラスターゼとして知られる
エステラーゼが放出され、それにより、加水分解反応が
始まり、その結果、有色のアゾ染料の形成が起こること
ができる。アゾ染料形成の結果として出る色の明暗度
が、試験される流体中の白血球の濃度を示す。この試験
は、尿のような体液中のWBCを測定するための迅速か
つ効果的な方法である。しかし、反応は時間依存性であ
るため、時限反応に固有の前記欠点を避けなければなら
ないならば、一貫して正確な結果を提供するためにはあ
る種のエンドポイント手法が必要である。本発明は、試
験流体と接触すると、エステラーゼを不活性化し、それ
により、色形成反応を終了させる計量したプロテアーゼ
を試薬配合物に含めることにより、反応をエンドポイン
トする方法を提供する。プロテアーゼが過多であると、
色が形成される前にエステラーゼを急激に分解してしま
い、プロテアーゼが過少であると、所望のエンドポイン
トで色の形成を止めるのに十分なだけエステラーゼを分
解することができないため、本発明の手法には、注意深
く計量したプロテアーゼを使用する必要がある。
【0007】本発明をうまく実施するための要点は、エ
ステルを分解させることはできないが、エステラーゼを
分解して失活させうるプロテアーゼの選択である。疎水
性アミノ酸、たとえばアラニンを分解するプロテアーゼ
は、この系に使用するには適さないであろう。これに関
して、トリプシンXIII、セリンプロテアーゼが、エステ
ラーゼの非存在下でさえ陽性の結果を出すということが
見いだされた。当然、このタイプの擬陽性は避けなけれ
ばならないため、適切なプロテアーゼの選択が不可欠で
ある。他方、エンドプロテアーゼXVII−Bは、エステラ
ーゼの非存在下では何の応答をも示さず、したがって、
本発明に使用するのに適している。一般に、トリプシン
XIIIとは違い、このプロテアーゼは、アスパラギン酸及
びグルタミン酸残基のカルボキシル側のペプチド結合を
特異的に切断することを特徴とする。塩基性アミノ酸を
開裂させるプロテアーゼを用いてもよい。
ステルを分解させることはできないが、エステラーゼを
分解して失活させうるプロテアーゼの選択である。疎水
性アミノ酸、たとえばアラニンを分解するプロテアーゼ
は、この系に使用するには適さないであろう。これに関
して、トリプシンXIII、セリンプロテアーゼが、エステ
ラーゼの非存在下でさえ陽性の結果を出すということが
見いだされた。当然、このタイプの擬陽性は避けなけれ
ばならないため、適切なプロテアーゼの選択が不可欠で
ある。他方、エンドプロテアーゼXVII−Bは、エステラ
ーゼの非存在下では何の応答をも示さず、したがって、
本発明に使用するのに適している。一般に、トリプシン
XIIIとは違い、このプロテアーゼは、アスパラギン酸及
びグルタミン酸残基のカルボキシル側のペプチド結合を
特異的に切断することを特徴とする。塩基性アミノ酸を
開裂させるプロテアーゼを用いてもよい。
【0008】本発明は、WBCの測定のための上記エス
テラーゼ法には限定されず、検出可能な応答を提供する
のに酵素が役立つ他の検定をエンドポイントするのに使
用することもできる。プロテアーゼの選択は基質に依存
する。上記の推理はアラニン基質の場合である。酵素基
質がアミノ酸又はペプチドでないならば、たとえばアス
コルベートの場合、プロテアーゼが酵素の活性部位を破
壊する能力を有する限り、手法は限定されない。酵素の
活性部位を破壊するこの能力は、プロテアーゼが、活性
部位の一部であるアミノ酸に対して作用するかどうか、
また、プロテアーゼが酵素の第三級構造の内部でアミノ
酸を開裂させるかどうかに依存する。本発明を適用する
のに適した分析対象物/酵素の組み合わせは、以下のも
のを含む。
テラーゼ法には限定されず、検出可能な応答を提供する
のに酵素が役立つ他の検定をエンドポイントするのに使
用することもできる。プロテアーゼの選択は基質に依存
する。上記の推理はアラニン基質の場合である。酵素基
質がアミノ酸又はペプチドでないならば、たとえばアス
コルベートの場合、プロテアーゼが酵素の活性部位を破
壊する能力を有する限り、手法は限定されない。酵素の
活性部位を破壊するこの能力は、プロテアーゼが、活性
部位の一部であるアミノ酸に対して作用するかどうか、
また、プロテアーゼが酵素の第三級構造の内部でアミノ
酸を開裂させるかどうかに依存する。本発明を適用する
のに適した分析対象物/酵素の組み合わせは、以下のも
のを含む。
【0009】基質 酵素 コレステロール コレステロールオキシダーゼ グルコース グルコースオキシダーゼ アスコルベート アスコルビン酸オキシダーゼ D−アミノ酸 アミノ酸オキシダーゼ L−アラニン アラニンデヒドロゲナーゼ β−D−グルコース グルコースデヒドロゲナーゼ 亜硝酸塩 亜硝酸塩レダクターゼ 水素供与体 ペルオキシダーゼ プトレシン プトレシンアセチルトランスフェラーゼ アスパルテート アスパラギン酸キナーゼ 尿 ウレアーゼ ピルビン酸フェニル ピルビン酸フェニルデカルボキシラーゼ ポルフォビリノーゲン ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ L−アラニンエステル ヒト白血球エラスターゼ
【0010】これらの検定は、指示薬、たとえば別の酵
素系の存在下で有色生成物を生成し、それにより、検出
可能な応答を提供する生成物を酵素的に生成する原理に
基づいて作用する。プロテアーゼエンドポインティング
の使用を成功させるためには、所望の読み取り時間まで
に酵素を不活性化するのに十分なプロテアーゼ活性が存
在しなければならないが、基質のターンオーバが起こる
前に酵素が不活性化されるほどのプロテアーゼ活性が存
在してはならない。たとえば、グルコースオキシダーゼ
の場合には、試験試料がグルコース100mg/dLを含有
するとき、試薬パッドあたり1.3IUのGOが30秒
以内に十分な色を発させるのに十分である。エンドプロ
テアーゼXVII−B4.3mg/dLが試薬パッドに含まれる
ならば、それは、色が形成される前に1.3IUのGO
を破壊してしまうであろう。しかし、エンドプロテアー
ゼが0.5mg/mLならば、30秒が経過するまでは、
1.3IUのグルコースオキシダーゼを破壊することは
なく、有色応答が達成されるであろう。
素系の存在下で有色生成物を生成し、それにより、検出
可能な応答を提供する生成物を酵素的に生成する原理に
基づいて作用する。プロテアーゼエンドポインティング
の使用を成功させるためには、所望の読み取り時間まで
に酵素を不活性化するのに十分なプロテアーゼ活性が存
在しなければならないが、基質のターンオーバが起こる
前に酵素が不活性化されるほどのプロテアーゼ活性が存
在してはならない。たとえば、グルコースオキシダーゼ
の場合には、試験試料がグルコース100mg/dLを含有
するとき、試薬パッドあたり1.3IUのGOが30秒
以内に十分な色を発させるのに十分である。エンドプロ
テアーゼXVII−B4.3mg/dLが試薬パッドに含まれる
ならば、それは、色が形成される前に1.3IUのGO
を破壊してしまうであろう。しかし、エンドプロテアー
ゼが0.5mg/mLならば、30秒が経過するまでは、
1.3IUのグルコースオキシダーゼを破壊することは
なく、有色応答が達成されるであろう。
【0011】本発明はまた、酵素基質の測定に使用する
こともできる。たとえば、グルコースがグルコースオキ
シダーゼを介して過酸化水素に変換されるグルコースの
検定では、直接的検出又は酸化還元指示薬の有色生成物
への酸化のいずれかによって過酸化水素が検出可能な応
答に変換される。この変換はしばしばペルオキシダーゼ
を触媒として促進される。グルコースの過酸化水素への
変換は、通常、動力学的であり、所望の読み取り時間中
にエンドポイントするのに十分な速度ではない。
こともできる。たとえば、グルコースがグルコースオキ
シダーゼを介して過酸化水素に変換されるグルコースの
検定では、直接的検出又は酸化還元指示薬の有色生成物
への酸化のいずれかによって過酸化水素が検出可能な応
答に変換される。この変換はしばしばペルオキシダーゼ
を触媒として促進される。グルコースの過酸化水素への
変換は、通常、動力学的であり、所望の読み取り時間中
にエンドポイントするのに十分な速度ではない。
【0012】したがって、一般に、酵素の検出は、基質
が試薬中にあることを要し、基質の検出は、試薬中の酵
素の存在を要する。試薬中の計量したプロテアーゼの存
在は、酵素を検出するのか、酵素基質を検出するのかに
依存して、試料中の酵素又は試薬中の酵素を不活性化す
ることができる。前者の場合、プロテアーゼ及び酵素基
質は試薬組成物の一部であり、後者の場合、プロテアー
ゼ及び酵素が試薬組成物の一部である。酵素の早期分解
を避けるために、試験試料が提示されるまで、プロテア
ーゼを酵素と混合してはならない。混合は、乾燥試薬を
試験試料で濡らすか、液体試薬の形態でそれを添加する
ことによって達成される。
が試薬中にあることを要し、基質の検出は、試薬中の酵
素の存在を要する。試薬中の計量したプロテアーゼの存
在は、酵素を検出するのか、酵素基質を検出するのかに
依存して、試料中の酵素又は試薬中の酵素を不活性化す
ることができる。前者の場合、プロテアーゼ及び酵素基
質は試薬組成物の一部であり、後者の場合、プロテアー
ゼ及び酵素が試薬組成物の一部である。酵素の早期分解
を避けるために、試験試料が提示されるまで、プロテア
ーゼを酵素と混合してはならない。混合は、乾燥試薬を
試験試料で濡らすか、液体試薬の形態でそれを添加する
ことによって達成される。
【0013】本発明の一つの態様は、流体試験試料中の
酵素の検出に用いるための分析試験片であって、試薬系
をプロテアーゼとともに含浸させた吸収性担体を含む分
析試験片に関する。好適なプロテアーゼは、酵素が相互
作用する予定の基質とは反応することなく、試薬系中の
酵素を分解し、それにより、その不活性化を生じさせる
ものである。以下の実施例では、ヒト白血球エラスター
ゼを使用して本発明を実証する。いくつかのプロテアー
ゼは、プロテアーゼの注意深い選択を要するヒト白血球
エラスターゼ活性を計測するのに使用されるL−アラニ
ンエステル基質をも分解させうるため、これは、最悪の
場合の酵素である。
酵素の検出に用いるための分析試験片であって、試薬系
をプロテアーゼとともに含浸させた吸収性担体を含む分
析試験片に関する。好適なプロテアーゼは、酵素が相互
作用する予定の基質とは反応することなく、試薬系中の
酵素を分解し、それにより、その不活性化を生じさせる
ものである。以下の実施例では、ヒト白血球エラスター
ゼを使用して本発明を実証する。いくつかのプロテアー
ゼは、プロテアーゼの注意深い選択を要するヒト白血球
エラスターゼ活性を計測するのに使用されるL−アラニ
ンエステル基質をも分解させうるため、これは、最悪の
場合の酵素である。
【0014】試験片に使用するための吸収性担体は、好
ましくはろ紙である。吸収性担体として有用である他の
材料には、フェルト、多孔質セラミック片及び紡織もし
くは艶消しガラス繊維、たとえば米国特許第3,84
6,247号明細書に記載のものがある。同じく好適な
ものは、木、布、スポンジ材料及び粘土質、例えば米国
特許第3,552,928号明細書に記載されたものの
ようなものがある。あるいはまた、吸収性担体は、非孔
質材料、たとえばポリマー膜又はガラスからなることも
できる。試験片の調製においては、通常、吸収性担体
を、プロテアーゼと、緩衝系と、界面活性剤との水溶液
で含浸させ、乾燥させる。次に、試験片を、濃度が決定
されている酵素の基質と、検出可能な応答の形成に必要
な他の試薬との溶剤溶液で含浸させる。先に論じたWB
C試験の場合、ジアゾニウム塩指示薬及びL−アラニン
エステルが含まれて、そのエステルが、白血球によって
放出されるヒト白血球エラスターゼによって分解する
と、アゾ染料が形成される。通常、試薬配合物には、酵
素加水分解の速度を高めるための酵素活性化剤、たとえ
ばデカノールが含まれる。
ましくはろ紙である。吸収性担体として有用である他の
材料には、フェルト、多孔質セラミック片及び紡織もし
くは艶消しガラス繊維、たとえば米国特許第3,84
6,247号明細書に記載のものがある。同じく好適な
ものは、木、布、スポンジ材料及び粘土質、例えば米国
特許第3,552,928号明細書に記載されたものの
ようなものがある。あるいはまた、吸収性担体は、非孔
質材料、たとえばポリマー膜又はガラスからなることも
できる。試験片の調製においては、通常、吸収性担体
を、プロテアーゼと、緩衝系と、界面活性剤との水溶液
で含浸させ、乾燥させる。次に、試験片を、濃度が決定
されている酵素の基質と、検出可能な応答の形成に必要
な他の試薬との溶剤溶液で含浸させる。先に論じたWB
C試験の場合、ジアゾニウム塩指示薬及びL−アラニン
エステルが含まれて、そのエステルが、白血球によって
放出されるヒト白血球エラスターゼによって分解する
と、アゾ染料が形成される。通常、試薬配合物には、酵
素加水分解の速度を高めるための酵素活性化剤、たとえ
ばデカノールが含まれる。
【0015】WBCからのヒト白血球エラスターゼの放
出を保証するために、試薬配合物には、白血球溶解剤、
たとえばBio-terge 又は別の洗剤もしくは界面活性剤が
含まれる。この物質は、試験片を調製するのに使用され
る第一又は第二の浸漬溶液に界面活性剤を加えることに
より、試験片に適用される。
出を保証するために、試薬配合物には、白血球溶解剤、
たとえばBio-terge 又は別の洗剤もしくは界面活性剤が
含まれる。この物質は、試験片を調製するのに使用され
る第一又は第二の浸漬溶液に界面活性剤を加えることに
より、試験片に適用される。
【0016】試薬系を、吸収性担体に適用し、試験片フ
ォーマットで使用することが好ましいが、試験流体を試
薬溶液と直接接触させる湿式系を使用することもでき
る。
ォーマットで使用することが好ましいが、試験流体を試
薬溶液と直接接触させる湿式系を使用することもでき
る。
【0017】本発明のもう一つの重要な側面は、試験試
料中の基質に対する試薬系中のプロテアーゼの比率を適
切な範囲に維持するため、計量した流体試験試料を使用
しなければならないことである。乾燥試薬系の場合、試
験片は、それが吸収する試験流体の量を計る。液検定で
は、一定量の流体が使用されよう。
料中の基質に対する試薬系中のプロテアーゼの比率を適
切な範囲に維持するため、計量した流体試験試料を使用
しなければならないことである。乾燥試薬系の場合、試
験片は、それが吸収する試験流体の量を計る。液検定で
は、一定量の流体が使用されよう。
【0018】
【実施例】以下の実施例によって本発明をさらに説明す
る。
る。
【0019】実施例I 酵素の検出 WBC試薬は、ろ紙の2回の連続含浸から製造した。1
回目の含浸は、緩衝剤としてのホウ酸と、均一な色分布
のための界面活性剤としてのBio-Terge A540と、基質及
びジアゾニウムイオンをベースから分離するためのポリ
(ビニルピロリドン)ポリマーと、吸湿剤としての硫酸
マグネシウムとを含む水性混合物を用いて行った。その
配合物は、イオン強度を制御するためのNaClを含む
ものであった。混合物のpHは、NaOH又はHClを使
用して8.8〜9.3の値に調節して、酵素が働くのに
最適なpHを得た。
回目の含浸は、緩衝剤としてのホウ酸と、均一な色分布
のための界面活性剤としてのBio-Terge A540と、基質及
びジアゾニウムイオンをベースから分離するためのポリ
(ビニルピロリドン)ポリマーと、吸湿剤としての硫酸
マグネシウムとを含む水性混合物を用いて行った。その
配合物は、イオン強度を制御するためのNaClを含む
ものであった。混合物のpHは、NaOH又はHClを使
用して8.8〜9.3の値に調節して、酵素が働くのに
最適なpHを得た。
【0020】2回目の含浸は、1−ジアゾ−2−ナフト
ール−4−スルホン酸(DNSA)、2−ヒドロキシ−
5−フェニル−ピロール−N−トシル−L−アラニンエ
ステル(PPTA)及びデカノールを含む1−メトキシ
−2−プロパノール/1,3−ジメチル−3,4,5,
6−テトラヒドロ−2(1H)−ピリミジオン(MOP
/DMPU)溶剤混合物からなるものであった。本発明
に使用するための機能、好適濃度及び許容可能範囲を表
1にまとめる。
ール−4−スルホン酸(DNSA)、2−ヒドロキシ−
5−フェニル−ピロール−N−トシル−L−アラニンエ
ステル(PPTA)及びデカノールを含む1−メトキシ
−2−プロパノール/1,3−ジメチル−3,4,5,
6−テトラヒドロ−2(1H)−ピリミジオン(MOP
/DMPU)溶剤混合物からなるものであった。本発明
に使用するための機能、好適濃度及び許容可能範囲を表
1にまとめる。
【0021】
【表1】
【0022】混合溶液を使用して、205C等級のAhls
tromろ紙を含浸させ、そのろ紙を、1回目の含浸ののち
121℃で9分間乾燥させ、2回目の含浸ののち90℃
で7分間乾燥させた。得られた乾燥試薬を試薬試験片に
加工して、これを、色分け図を使用して目視的に試験し
た。
tromろ紙を含浸させ、そのろ紙を、1回目の含浸ののち
121℃で9分間乾燥させ、2回目の含浸ののち90℃
で7分間乾燥させた。得られた乾燥試薬を試薬試験片に
加工して、これを、色分け図を使用して目視的に試験し
た。
【0023】トリプシンIII 又はエンドプロテアーゼXV
II−Bのいずれかであるプロテアーゼを上述の試験溶液
に加えた。エステラーゼは加えなかった。0、25、4
2及び75細胞/μL に相当する尿中のWBCの陰性、
極微量、少量及び中程度の各レベルに相当する10、2
0、30及び40の数値的指定(ND)に相当する色ブ
ロックを有するWBC色分け図に照らして溶液を比較す
ることにより、目視的応答を得た。
II−Bのいずれかであるプロテアーゼを上述の試験溶液
に加えた。エステラーゼは加えなかった。0、25、4
2及び75細胞/μL に相当する尿中のWBCの陰性、
極微量、少量及び中程度の各レベルに相当する10、2
0、30及び40の数値的指定(ND)に相当する色ブ
ロックを有するWBC色分け図に照らして溶液を比較す
ることにより、目視的応答を得た。
【0024】
【表2】
【0025】上述した試験溶液は、2−ヒドロキシ−5
−フェニル−ピロール−N−トシル−L−アラニン(P
PTA)を、白血球中に存在するエステラーゼ酵素によ
って分解するエステラーゼ加水分解性エステルとして使
用した。分解したのち、PPTAは、DNSAジアゾニ
ウム指示薬とのジアゾニウムカップリングを介して色を
発することができる。エステラーゼが溶液中に存在しな
かったため、応答は予想されなかった。これは、20秒
及び90秒での10(陰性)の応答によって示されたよ
うに、プロテアーゼ又はエンドプロテアーゼXVII−Bの
いずれかをも使用しなかった実験におけるケースであっ
た。しかし、プロテアーゼとしてのトリプシンXIIIの場
合には、エステラーゼの非存在下でさえ陽性の応答(2
0秒で15及び90秒で25)があり、それにより、特
定のプロテアーゼ、たとえばトリプシンXIIIがPPTA
L−アラニンエステル結合を切断できることを示し
た。このようなプロテアーゼは、擬陽性を生じさせるそ
れらの傾向により、当然、本発明の組成物では避けなけ
ればならない。
−フェニル−ピロール−N−トシル−L−アラニン(P
PTA)を、白血球中に存在するエステラーゼ酵素によ
って分解するエステラーゼ加水分解性エステルとして使
用した。分解したのち、PPTAは、DNSAジアゾニ
ウム指示薬とのジアゾニウムカップリングを介して色を
発することができる。エステラーゼが溶液中に存在しな
かったため、応答は予想されなかった。これは、20秒
及び90秒での10(陰性)の応答によって示されたよ
うに、プロテアーゼ又はエンドプロテアーゼXVII−Bの
いずれかをも使用しなかった実験におけるケースであっ
た。しかし、プロテアーゼとしてのトリプシンXIIIの場
合には、エステラーゼの非存在下でさえ陽性の応答(2
0秒で15及び90秒で25)があり、それにより、特
定のプロテアーゼ、たとえばトリプシンXIIIがPPTA
L−アラニンエステル結合を切断できることを示し
た。このようなプロテアーゼは、擬陽性を生じさせるそ
れらの傾向により、当然、本発明の組成物では避けなけ
ればならない。
【0026】より高いプロテアーゼ濃度は、より迅速に
エンドポイントに達し、酵素が有色応答を形成する機を
有する前に酵素が不活性化されることにより応答を減ら
すという結果をもたらす。たとえば、4.80mg/mLの
エンドプロテアーゼは、60秒でエンドポイントを生じ
させるが、視覚的応答を、49細胞/μL に相当するも
のから16細胞/μL に相当するものに減らす。WBC
の測定において、PPTAエステルの十分なターンオー
バを達成して、エステラーゼが破壊される前に色分け図
に照合しなければならない。エステラーゼは240μM
のPPTA/分の活性を有するため、42細胞/μM 試
験試料を用いて現在の低いレベルの尿中WBC色ブロッ
クを照合するためには、約100μM PPTAのターン
オーバが必要である。したがって、この実施例の系は、
許容される最大プロテアーゼ活性が5.2nMエステラー
ゼ/分であり、最小プロテアーゼ活性は少なくとも0.
2nMエステラーゼ/分であろう。
エンドポイントに達し、酵素が有色応答を形成する機を
有する前に酵素が不活性化されることにより応答を減ら
すという結果をもたらす。たとえば、4.80mg/mLの
エンドプロテアーゼは、60秒でエンドポイントを生じ
させるが、視覚的応答を、49細胞/μL に相当するも
のから16細胞/μL に相当するものに減らす。WBC
の測定において、PPTAエステルの十分なターンオー
バを達成して、エステラーゼが破壊される前に色分け図
に照合しなければならない。エステラーゼは240μM
のPPTA/分の活性を有するため、42細胞/μM 試
験試料を用いて現在の低いレベルの尿中WBC色ブロッ
クを照合するためには、約100μM PPTAのターン
オーバが必要である。したがって、この実施例の系は、
許容される最大プロテアーゼ活性が5.2nMエステラー
ゼ/分であり、最小プロテアーゼ活性は少なくとも0.
2nMエステラーゼ/分であろう。
【0027】表3は、エステラーゼを含有する試験溶液
に加えられたときのプロテアーゼ濃度の効果をまとめ
る。
に加えられたときのプロテアーゼ濃度の効果をまとめ
る。
【0028】
【表3】
【0029】WBCの視覚的応答を、0、25、42、
75及び200細胞/μL に対する標準色を有する標準
色分け図に照らして測定した。試験した溶液は、42細
胞/μLiに相当する2.6nMエステラーゼを含有してい
た。pHを5.2に維持した。表3から、4.8mg/mLの
プロテアーゼ濃度が42細胞/μL WBC応答を16細
胞/μL に減らして、濃度の上限を実証したと判断する
ことができる。0.16mg/mLのプロテアーゼ濃度は、
エンドポイントにはつながらず、それにより、この例に
おけるプロテアーゼの有効濃度の下限を実証した。
75及び200細胞/μL に対する標準色を有する標準
色分け図に照らして測定した。試験した溶液は、42細
胞/μLiに相当する2.6nMエステラーゼを含有してい
た。pHを5.2に維持した。表3から、4.8mg/mLの
プロテアーゼ濃度が42細胞/μL WBC応答を16細
胞/μL に減らして、濃度の上限を実証したと判断する
ことができる。0.16mg/mLのプロテアーゼ濃度は、
エンドポイントにはつながらず、それにより、この例に
おけるプロテアーゼの有効濃度の下限を実証した。
【0030】実施例II 基質の検出 ろ紙の1回の含浸からグルコース試薬系を製造した。含
浸溶液は、緩衝剤としてのクエン酸と、指示薬としてヨ
ウ化カリウムと、試薬の色を安定させるためのポリ(ビ
ニルピロリドン)ポリマーと、過酸化水素を検出するた
めの触媒としてペルオキシダーゼと、グルコースが試験
試料中に存在するとき過酸化水素を生成するためのグル
コースオキシダーゼとを含むものであった。NaOH又
はHClを使用して混合物のpHを6.0〜6.5の値に
調節して、酵素が働くのに最適なpHを得た。本系に使用
した試薬それぞれの機能、好適濃度及び許容可能範囲を
表4にまとめる。
浸溶液は、緩衝剤としてのクエン酸と、指示薬としてヨ
ウ化カリウムと、試薬の色を安定させるためのポリ(ビ
ニルピロリドン)ポリマーと、過酸化水素を検出するた
めの触媒としてペルオキシダーゼと、グルコースが試験
試料中に存在するとき過酸化水素を生成するためのグル
コースオキシダーゼとを含むものであった。NaOH又
はHClを使用して混合物のpHを6.0〜6.5の値に
調節して、酵素が働くのに最適なpHを得た。本系に使用
した試薬それぞれの機能、好適濃度及び許容可能範囲を
表4にまとめる。
【0031】
【表4】
【0032】この混合溶液を使用して、Whatman 3MM
等級ろ紙を含浸させ、その後、ろ紙を100℃で15分
間乾燥させた。得られた乾燥試薬を試験片に加工して、
色分け図を使用してこれらの試験片を目視的に試験し
た。
等級ろ紙を含浸させ、その後、ろ紙を100℃で15分
間乾燥させた。得られた乾燥試薬を試験片に加工して、
色分け図を使用してこれらの試験片を目視的に試験し
た。
【0033】表5に示すように、エンドプロテアーゼXV
II−Bのグルコースオキシダーゼ試薬への添加がエンド
ポイントの達成を許す。エンドポイントは、プロテアー
ゼが存在するときの、180秒での結果に等しい20秒
での結果によって実証される。0、100、250、5
00及び1,000mg/dLグルコースで得られた色標準
を使用して、最も近い色レベルに対して試薬を目視的に
読み取った。
II−Bのグルコースオキシダーゼ試薬への添加がエンド
ポイントの達成を許す。エンドポイントは、プロテアー
ゼが存在するときの、180秒での結果に等しい20秒
での結果によって実証される。0、100、250、5
00及び1,000mg/dLグルコースで得られた色標準
を使用して、最も近い色レベルに対して試薬を目視的に
読み取った。
【0034】
【表5】
Claims (15)
- 【請求項1】 酵素が、流体試験試料中の該酵素又は酵
素基質の濃度を示す検出可能な応答を提供する試薬系中
の反応を触媒する、流体試験試料中で酵素活性を測定す
る方法において、 呈色応答を提供する反応が、試薬系中のプロテアーゼの
濃度によって決まる所定時間後に停止するよう、検出可
能な応答を発するための該酵素を不活性化することがで
きるが、検出可能な応答を提供する試薬系を不活性化す
ることはできない計量したプロテアーゼに、計量した流
体試験試料を加える工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 該反応を触媒して検出可能な応答を提供
する酵素がエステラーゼであり、試薬系が、ジアゾニウ
ム塩と、エステラーゼによって加水分解されてフェノー
ル類又は疑似フェノール類を提供することができるエス
テルとを含み、そのフェノール類又は疑似フェノール類
がジアゾニウム塩とカップリングして、有色アゾ染料の
形成によって検出可能な応答を提供することができる、
請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 酵素基質がグルコースであり、酵素がグ
ルコースオキシダーゼである、請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 白血球の溶解によって放出されるエステ
ラーゼの量を計測することにより、計量した水性試験流
体中の白血球を測定するための、ジアゾニウム塩と、エ
ステラーゼによって加水分解されて、ジアゾニウムカッ
プリング反応によってジアゾニウム塩とカップリングし
て有色アゾ染料を形成することができるフェノール類又
は疑似フェノール類を提供することができるエステルと
を含む、色の明暗度(intensity)が水性試験流体中の白
血球の濃度を示す組成物において、 ジアゾニウム塩とフェノール類又は疑似フェノール類と
の間の色形成反応が、組成物中のプロテアーゼの濃度に
よって決まる所定時間後に停止するよう、エステルを分
解させることはできないが、組成物中のエステラーゼを
分解させることはできる計量したプロテアーゼを含むこ
とを特徴とする組成物。 - 【請求項5】 組成物中に界面活性剤を含ませることに
よって白血球が溶解される、請求項4記載の組成物。 - 【請求項6】 エステラーゼがヒト白血球エラスターゼ
である、請求項4記載の組成物。 - 【請求項7】 プロテアーゼが、アスパラギン酸及びグ
ルタミン酸残基のカルボキシル側のペプチド結合を切断
することができるプロテアーゼから選択される、請求項
4記載の組成物。 - 【請求項8】 水性試験流体が尿である、請求項4記載
の組成物。 - 【請求項9】 プロテアーゼがエンドプロテアーゼXVII
−Bである、請求項4記載の組成物。 - 【請求項10】 流体試験試料中の酵素活性又は酵素基
質の量を測定するための試験片において、 緩衝剤と、流体試験試料中の酵素活性にさらされたとき
検出可能な応答を提供する試薬系と、酵素活性を不活性
化することができるが、酵素基質において検出可能な応
答を生じさせることはできず、それにより、検出可能な
応答を提供する反応を所定期間後に停止させる計量した
プロテアーゼとを吸収した、流体試験試料と接触させた
ときそれを測定量(a measured amount)吸収することが
できる試験片材料のような吸収性担体を含むことを特徴
とする分析試験片。 - 【請求項11】 流体試験試料における酵素活性を測定
する方法において、請求項10記載の試験片を流体試験
試料と接触させる工程、並びに、検出可能な応答の大き
さを観察することによって酵素活性を測定する工程を含
む方法。 - 【請求項12】 流体試験試料が尿であり、酵素活性
が、試験片の吸収性材料に吸収された溶解剤による白血
球の溶解によって尿に含まれる白血球から放出されるヒ
ト白血球エラスターゼから誘導される、請求項11記載
の方法。 - 【請求項13】 検出可能な応答が、色素形成性エステ
ルがヒト白血球エラスターゼによって加水分解されて、
試薬系中に存在するジアゾニウム指示薬とカップリング
して有色アゾ染料を形成することができるフェノール類
を生成する結果である、請求項12記載の方法。 - 【請求項14】 ジアゾニウム指示薬が1−ジアゾ−2
−ナフトール−4−スルホン酸であり、エステルが2−
ヒドロキシ−5−フェニル−ピロール−N−トシル−L
−アラニンエステルであり、溶解剤が界面活性剤であ
る、請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 プロテアーゼがエンドプロテアーゼXV
II−Bである、請求項14記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/653865 | 1996-05-28 | ||
US08/653,865 US5846754A (en) | 1996-05-28 | 1996-05-28 | Enzyme determination with protease inactivation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1042895A true JPH1042895A (ja) | 1998-02-17 |
Family
ID=24622589
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9117731A Withdrawn JPH1042895A (ja) | 1996-05-28 | 1997-05-08 | 酵素検出方法、そのための組成物及びそのための試験片 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5846754A (ja) |
EP (1) | EP0810290B1 (ja) |
JP (1) | JPH1042895A (ja) |
CA (1) | CA2198951C (ja) |
DE (1) | DE69717001T2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014533105A (ja) * | 2011-11-11 | 2014-12-11 | アクシス‐シールド エーエスAxis−Shield AS | 血液サンプルのアッセイ法 |
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US6348324B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-02-19 | Hypoguard America Limited | Composition and device for detecting leukocytes in urine |
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FR2831889B1 (fr) * | 2001-11-08 | 2004-01-16 | Proteus | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre |
FR2831888A1 (fr) * | 2001-11-08 | 2003-05-09 | Proteus | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon et les systemes pour sa mise en oeuvre |
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FR2832729B1 (fr) * | 2001-11-28 | 2004-01-16 | Proteus | Methode de detection d'une activite catalytique d'un echantillon mettant en oeuvre la detection de la transformation d'un substrat |
ATE548653T1 (de) | 2006-01-19 | 2012-03-15 | Lattec I S | Neuartige trockenteststreifenvorrichtungskonstruktion und verfahren zur bestimmung eines analyten in einer probe unter verwendung der teststreifenvorrichtung |
AU2007207242B2 (en) | 2006-01-19 | 2012-08-02 | Lattec I/S | Dry stick device and method for determining an analyte in a sample |
PL228200B1 (pl) | 2008-11-18 | 2018-02-28 | Adam Saferna | Pojemnik wysokocisnieniowy |
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1997
- 1997-03-03 CA CA002198951A patent/CA2198951C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-08 JP JP9117731A patent/JPH1042895A/ja not_active Withdrawn
- 1997-05-16 DE DE69717001T patent/DE69717001T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-16 EP EP97108005A patent/EP0810290B1/en not_active Expired - Lifetime
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CA2198951A1 (en) | 1997-11-28 |
US5846754A (en) | 1998-12-08 |
CA2198951C (en) | 2003-07-22 |
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