JP3656251B2 - プロテアーゼの保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、臨床検査に用いられるα２−プラスミンインヒビターを測定する方法及びα２−プラスミンインヒビター測定試薬、プラスミンを保存する方法、並びにプロテアーゼを保存する方法に関する。

α２−プラスミンインヒビター（以下、α２−ＰＩと記載することもある）はプラスミンと即時的に反応し、α２−ＰＩ・プラスミン錯体を形成することによりプラスミン酵素活性を阻害する。また、α２−ＰＩは、フィブリノ−ゲンによるプラスミンへの結合を阻害する性質を有する線溶阻害因子として知られており、血液中のその濃度低下が問題とされる。α２−ＰＩの濃度が低下する疾患としては、α２−ＰＩ先天性欠損症、α２−ＰＩ異常症、肝疾患、ＤＩＣ（広汎性凝固症侯群）等が知られている。従って、α２−ＰＩは、これらの病気の診断のための、重要な指標となっている。

α２−ＰＩを測定する方法としては免疫学的測定法と活性測定法に大別される。免疫学的測定法は、α２−ＰＩの構造部分を認識してα２−ＰＩを測定する方法であるため、不活性なα２−ＰＩ・プラスミン錯体も、活性なα２−ＰＩと同様、測定する。そのため、この測定方法では、活性を有するα２−ＰＩを正確に反映するデータを得られないという欠点がある。その結果、α２−ＰＩを測定する方法としては活性測定法が一般的である。

活性測定法の場合、通常、α２−ＰＩを含む試料に、過剰量のプラスミン試薬を添加して、プラスミンとそのα２−ＰＩとを反応させ、次いで、残存プラスミン活性を測定することにより、試料中のα２−ＰＩを測定する方法が主流となっている。特に、試料に一定過剰量のプラスミンを添加して、プラスミンとそのα２−ＰＩとを反応させ、反応を行わせた後、残存プラスミンとプラスミン用合成基質とを反応させて残存プラスミン活性を測定し、用いた試薬のプラスミン活性とその残存プラスミン活性との比較からα２−ＰＩ活性を算出する測定方法が用いられる。このような合成基質によるα２−ＰＩ測定方法としては、例えば、非特許文献１等に記載されている。

このような合成基質法によるα２−ＰＩ測定試薬は、過剰量のプラスミンを含むプラスミン試薬ユニットと、プラスミン用合成基質試薬ユニットとから、構成されている。しかし、これらの構成試薬中、特にプラスミン試薬は自己分解性のプロテアーゼであるプラスミンが主成分であるため非常に不安定である。その結果、これらの試薬を液状で保存しておくと、試料中のプラスミン活性が低下するため、試料中のα２−ＰＩを正確に測定できないという問題があった。

一方、プラスミン試薬を安定に保存する方法がいくつか開発されてきている。その方法としては、凍結乾燥品とする方法、又は液状で保存する方法が知られている。

凍結乾燥品を用いる方法では、あらかじめ、プラスミンを溶解して、液状のプラスミン試薬を調製し、その試薬を凍結乾燥して凍結乾燥品として冷蔵保存し、さらに、測定の際、その凍結乾燥品を再溶解して、試料中のα２−ＰＩを測定しなければならない。そのため、α２−ＰＩを測定する使用者側にとっては試薬を溶解して調製しなければならないという不便性、溶解時の調製ミスの可能性、また、専用の溶解液の添付のため試薬数が多いことによる保管場所の問題がある。また、製造者側にとっては凍結乾燥という製造工程が必要であり、その結果、試薬の調製に長時間かかるという問題点がある。

液状でプラスミンを保存して使用する方法としては、３．２Ｍの硫酸アンモニウムに懸濁し冷蔵保存する方法、２５％グリセロールを含む０．０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−０．０２Ｍリジン−０．１Ｍ塩化ナトリウム−０．００１Ｍエチレンジアミン４酢酸（２ナトリウム塩），ｐＨ９．０緩衝液中濃厚液として−２０℃から−３０℃で冷蔵する方法〔非特許文献２〕等が知られている。しかし、これらの方法では、いずれのプラスミン試薬も、α２−ＰＩを測定する際、そのまま、使用することはできず、再溶解したり、希釈したり、なんらかの前処理をしたうえで、α２−ＰＩを測定することが必要であった。また、グリセロ−ルを使用する場合は、プラスミン試薬が粘稠になりやすく、そのため、測定値に誤差を与えやすくなるという問題があった。
Ｐｅｔｔｅｒ Ｆｒｉｂｅｒｇｅｒ、Ｔｈｅ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉ ｎｉｃａｌ ＆Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，４２巻，４１−４８頁（１９８２年） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，１９巻，１８４〜１９９頁

上記のα２−ＰＩ測定試薬の問題を解決し、再溶解したり、希釈したりせず、すなわち、試薬調製に時間と手間のかからない、かつ、長時間、測定試薬を保存しておいても、正確にα２−ＰＩを測定できる方法及びそのための試薬を提供するというのが本発明の課題である。また、液状で長期間保存しても、プラスミン活性が低下しないプラスミン試薬、及びプラスミンを保存する方法を提供することである。

このような課題に鑑み、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、その不安定性のために試薬の液状化を妨げていたプラスミンが、試薬組成中にある種の非還元性糖類を存在させることにより長期にわたり活性が保持され、その結果、それを用いて、α２−ＰＩを正確に測定でき得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。

第１の本発明は、α２−プラスミンインヒビターを含む試料と、過剰量のプラスミン試薬とを混合することにより、プラスミンとそのα２−プラスミンインヒビターとを反応させ、次に、残存プラスミン活性を測定することにより、その試料中のα２−プラスミンインヒビターを測定する方法において、そのプラスミン試薬が、炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬であることを特徴とする試料中のα２−プラスミンインヒビターを測定する方法である。
第２の本発明は、試料中のα２−プラスミンインヒビターを測定するキットであって、炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬ユニット、及びプラスミン用合成基質を含む試薬ユニットを、必須ユニットとして含むα２−プラスミンインヒビター測定試薬である。

第３の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬が、濃度１〜６０％の炭素数４〜２４の非還元性糖を含む、プラスミン試薬である上記第２の発明のα２−プラスミンインヒビター測定試薬である。
第４の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖が、炭素数６〜１８の非還元性糖である上記第２又は第３の発明のα２−プラスミンインヒビター測定試薬である。

第５の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖がソルビトール、トレハロース、スクロースから選ばれる上記第２又は第３の発明のα２−プラスミンインヒビター測定試薬である。
第６の本発明は、プラスミン試薬が液状である上記第２，３，４，５の発明から選ばれるα２−プラスミンインヒビター測定試薬である。

第７の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬である。第８の本発明は、濃度０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミン、濃度１〜６０％の炭素数４〜２４の非還元性糖、及び濃度０．００５〜３．０Ｍの塩を含む、ｐＨ６〜１０の液状プラスミン試薬である。

第９の本発明は、濃度０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミン、濃度１〜６０％の炭素数４〜２４の非還元性糖、及び濃度０．００５〜３．０Ｍの塩を含む、ｐＨ６〜１０のプラスミン溶液で該溶液中のプラスミンを保存する方法。
第１０の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖がソルビトール、トレハロース、スクロースから選ばれる上記第９の発明のプラスミンを保存する方法である。
第１１の本発明は、プロテアーゼに炭素数４〜２４の非還元性糖を存在させることにより該プロテアーゼを保存する方法である。

プラスミン試薬の安定化によって、液状のα２−ＰＩ測定試薬の供給が可能となる。使用者側にとっては試薬調製の手間が省ける。さらに、試薬調製の際の調製ミスの回避等の利便性を与える。そのうえ、保管時における省スペース化を可能にできる。一方、製造者側では従来の製法である凍結乾燥という工程を経る必要がないため、製造期間の短縮や設備の面で大きな経費の節減が可能となる。

第１の本発明は、α２−プラスミンインヒビターを含む試料と、過剰量のプラスミン試薬とを混合することにより、プラスミンとそのα２−プラスミンインヒビターとを反応させ、次に、残存プラスミン活性を測定することにより、その試料中のα２−プラスミンインヒビターを測定する方法において、そのプラスミン試薬が、炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬であることを特徴とする試料中のα２−プラスミンインヒビターを測定する方法である。

第１の本発明は、
ｉ） プラスミン試薬が、液状で適当な温度で保存しておいても安定であり、しかも、粘稠でないので、α２−ＰＩを正確に測定でき；ｉｉ）試薬を調製して、液状で保存しておいても、再溶解、希釈、その他の前処理が必要がなく、そのまま、測定できるという効果を有する。なお、適当な温度とは、通常、１〜３０℃である。

α２−ＰＩを含む試料は、種々のものを使用でき、α２−ＰＩを測定したいものなら特に制限はない。例えば、血漿、血清等の体液やそれらの希釈液及び処理液が挙げられる。

第１の本発明においては、プラスミン試薬が過剰量であり、かつ、炭素数４〜２４の非還元性糖を含む。プラスミンが過剰量必要なのは、試料中のα２−ＰＩをプラスミンによりα２−ＰＩ・プラスミン錯体に変換させ、さらに、第１段階終了後の液に、測定でき得る残存プラスミンを存在させるための十分な量のプラスミンを確保するためである。

過剰量のプラスミン試薬とは、試料中のα２−ＰＩのプラスミン阻害活性を消失させることができ、その消失の後、測定できうる残存プラスミンを存在させ得る量のプラスミンを含む試薬である。

プラスミン試薬中のプラスミン濃度は、試料のα２−ＰＩ濃度により異なるが、通常、０．００１から１００単位／ｍｌ、好ましくは０．０１から１０単位／ｍｌである。なお、本明細書において、プラスミン１単位は基質ＮＳ−２２００を１分間に１μｍｏｌｅ水解する酵素量をいうものとする。

第１の本発明においては、プラスミン試薬が炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬であることを特徴とする。このため、本発明のプラスミン試薬は、液状で適当な条件で保存しておけば、プラスミン活性が減少しずらいので、試薬を調製した後、長期間経過しても、試料中のα２−ＰＩを正確に測定できるという好ましい効果を有する。本明細書において、非還元性糖とは、遊離の還元基を持たない糖類を表わし、非還元性オリゴ糖、糖アルコール、配糖体、多糖類を含む。好ましくは非還元性オリゴ糖、糖アルコール、である。第１の本発明において、炭素数４〜２４の非還元性糖としては、炭素数５〜１８の非還元性二糖又は糖アルコールが好ましい。炭素数５〜１８の非還元性二糖としては、トレハロース、スクロース等を例示することができる。炭素数５〜１８の糖アルコールとしては、ソルビトール、イノシトール等を例示することができる。

本発明において、プラスミン試薬に含まれる、炭素数４〜２４の非還元性糖の濃度は、好ましくは１〜６０％、さらに好ましくは５〜４５％、特に好ましくは１０〜３０％である。その濃度が薄すぎると、プラスミンの安定性が悪くなる結果、プラスミン試薬を長く放置すると、請求項１に係る測定方法で、試料中のα２−ＰＩを正確に測定できにくい。また、その濃度が濃すぎると、試薬が粘稠となり、α２−ＰＩを正確に測定できにくい。

プラスミン試薬のｐＨは、プラスミンとα２−ＰＩとの反応の至適の点から、好ましくはｐＨ６．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ７．０〜９．０である。プラスミン試薬は、ｐＨ調整等のため、緩衝剤を含むことができる。プラスミン試薬の緩衝剤濃度は、好ましくは０．００５〜１．０００Ｍ、より好ましくは０．０２〜０．３０Ｍである。

ｐＨ調整の緩衝剤としてはトリス、りん酸、バルビタール、イミダゾール、ベロナール、グリシルグリシン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ，ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等を使用できる。第２の本発明のプラスミン用合成基質を含む試薬においても、これら、各種のｐＨ調整の緩衝剤を適時添加することができる。

プラスミン試薬は、安定性のため、さらに、塩を含むことが好ましい。この場合、塩は水溶性の塩であり、好ましくは水溶性の有機塩、ハロゲン化無機塩である。水溶性の有機塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムを例示できる。水溶性のハロゲン化無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムを例示できる。塩濃度は通常０００５〜３．０Ｍ、好ましくは０．０５〜１．０Ｍ、より好ましくは０．２〜０．８Ｍである。

第１の本発明においては、プラスミン試薬は；
ｉ）過剰量であり、かつ、ｉｉ）炭素数４〜２４の非還元性糖を含む、という要件に加え；
測定しようとする試料のα２−ＰＩの量により異なるが、通常、
ｉｉｉ）プラスミン濃度が０．００１から１００単位／ｍｌであり、
ｉｖ）該非還元性糖の濃度が１〜６０％であり、
ｖ）ｐＨが６．０〜１０．０であり、
ｖｉ）濃度０．００５〜１．０００Ｍの緩衝剤を含み、かつ、
ｖｉｉ）濃度０００５〜３．０Ｍの塩を含む、ことが好ましい。

このようなプラスミン試薬に、試薬の性能等の面からＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ等のキレート剤、ポリブレン、プロタミン等のヘパリン阻害物質、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、糖類、アミノ酸類、アルブミン等の蛋白質、モノエチルアミン等のアミン化合物、ポリエチレングリコール、グリセロール等、各種の物質を適宜添加することができる。なお、第２の本発明のプラスミン用合成基質を含む試薬にも、これらの添加物を、適宜、添加することもできる。

第１の本発明の第１段階では、α２−プラスミンインヒビターを含む試料と、過剰量のプラスミン試薬とを混合することにより、プラスミンとそのα２−プラスミンインヒビターとを反応させる。これにより、試料中のα２−ＰＩのプラスミン阻害活性を失わせることができる。このとき、該プラスミン試薬に該試料を加えても良いし、該試料に該プラスミン試薬を加えても良い。

第１の本発明の第２段階では、残存プラスミン活性を測定する。その方法としては、残存プラスミンとプラスミン用合成基質とを反応させ、残存プラスミンを測定する方法が好ましい。短時間で、簡単に、かつ、正確に残存プラスミンを測定できるからである。残存プラスミンとプラスミン用合成基質とを反応させると、その合成基質が開裂する。開裂して生成される物質を測定することにより残存プラスミンを測定することができる。

このような開裂して生成される物質は、色素、反応して色素を生成する物質等の色原体、蛍光物質、波長２７０〜３４０ｎｍで吸光度を持つ物質等であることが測定しやすさの点から好ましい。そのうち、５ＡＢ，ｐＮＡ等の色原体が好ましい。なお、５ＡＢとは５−アミノ−２−ニトロ安息香酸残基を表わし、ｐＮＡとはｐ−ニトロアニリン残基を表わす。また、プラスミン用合成基質とは、プラスミンの酵素作用により選択的に開裂し、その開裂により生成する物質を測定できる合成基質をいう。

残存プラスミン活性を測定した後、あらかじめ作成した検量線から、試料中のα２−ＰＩ活性を求めることができる。また、試料とプラスミン用合成基質を混合した後、該プラスミン試薬を加えて測定することもできる。

プラスミン用合成基質は溶液状態で安定なものが好ましい。
そのような合成基質としては、ＮＳ−２２００（Ｈ−Ｄ−Ｇｌｎ（Ｃ６Ｈ１１）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−５ＡＢ）、Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）、Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ（Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）等の公知の基質がいずれも使用可能である。なお、本明細書において、Ｃ６Ｈ１１とは、シクロヘキシル基を表すものとする。

プラスミン用合成基質を含む試薬は、通常のα２−ＰＩ測定の合成基質法の、プラスミン用合成基質を含む試薬を、そのまま、用いることができる。例えば、血漿中のα−ＰＩ測定する場合、該プラスミン用合成基質の濃度は、通常、０．０１〜５０ｍＭである。

第１の本発明に係る測定方法のうち、そのようなプラスミン用合成基質を用いる測定は、第２の本発明の測定試薬を使用してできる。第２の本発明は、試料中のα２−プラスミンインヒビタ−を測定するキットであって；炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬ユニット、及びプラスミン用合成基質を含む試薬ユニットを、必須ユニットとして含むα２−プラスミンインヒビタ−測定試薬である。第２の本発明のプラスミン試薬、プラスミン用合成基質、プラスミン用合成基質を含む試薬、及び炭素数４〜２４の非還元性糖は、第１の本発明のものをそのまま用いることができる。

第３の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬が；１〜６０％の濃度の炭素数４〜２４の非還元性糖を含む、プラスミン試薬である第２の本発明のα２−プラスミンインヒビター測定試薬である。

第４の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖が、炭素数６〜１８の非還元性糖で第２又は第３の本発明のα２−プラスミンインヒビター測定試薬が好ましい。

第５の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖がソルビトール、トレハロース、スクロースから選ばれる第２又は第３の本発明のα２−プラスミンインヒビター測定試薬が好ましい。

第２から第５の本発明は、
ｉ） 試薬を、溶解して液状にした後、適当な温度で保存しておけば、プラスミン試薬が安定であり、さらに、試薬が粘稠でないため、
試料中のα２−ＰＩを正確に測定でき；
ｉｉ） 試薬を調製して保存しておいても、再溶解、希釈、その他の前処理が必要がない、
という効果を有する簡便なα２−ＰＩの測定試薬である。

第６の本発明は、プラスミン試薬が液状である第２、３、４、５の本発明から選ばれるα２−プラスミンインヒビター測定試薬である。第６の本発明のα２−プラスミンインヒビター測定試薬は、第２，３３，４，５の本発明の効果に加え、液状でもプラスミン試薬が安定なので、その試薬を溶解することなく、適当な温度で長時間、試薬を放置しても、α２−ＰＩの測定に使用できる。

第７の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖を含むプラスミン試薬である。第７の本発明は、
ｉ） 溶解して液状にした後、適当な温度で保存しておいても安定なので、
ｉｉ） 一度調製すると、再溶解、希釈、その他の前処理が特に必要でないという効果を有する簡便なプラスミン試薬である。このプラスミン試薬は、α２−ＰＩの測定に使用できる。

第８の本発明は、濃度０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミン、濃度１〜６０％の炭素数４〜２４の非還元性糖、及び濃度０．００５〜３．０Ｍの塩を含む、ｐＨ６〜１０の液状プラスミン試薬である。第８の本発明は、第７の本発明効果に加え、通常では、液状ではプラスミン活性の保持が困難な、低濃度の０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミンを含む液状プラスミン試薬を、活性を十分保持しながら、保存できるという効果を有する液状プラスミン試薬である。

第９の本発明は、濃度０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミン、濃度１〜６０％の炭素数４〜２４の非還元性糖、及び濃度０．００５〜３．０Ｍの塩を含む、ｐＨ６〜１０のプラスミン溶液で該溶液中のプラスミンを保存する方法である。第１０の本発明は、炭素数４〜２４の非還元性糖がソルビトール、トレハロース、スクロースから選ばれるプラスミンを保存する方法である。第９又は第１０の本発明は、通常では、プラスミン活性の保持が困難な、低濃度の０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミンを液状で保存できる効果を有する。
第１１の本発明は、プロテアーゼに炭素数４〜２４の非還元性糖を存在させることにより該プロテアーゼを保存する方法である。第１１の本発明は、プラスミン等のプロテアーゼを安定に保存できる。

第１、２又は７の本発明で、例えば、自動分析装置で血漿中のα２−ＰＩを測定するときは次のようにしてできる。

プラスミン試薬は；
ｉ）健常人血漿中のα２−ＰＩに対し、１．１〜１００当量のプラスミンを含み、
ｉｉ）炭素数４〜２４の非還元性糖を含む、
ｉｉｉ）該非還元性糖の濃度が１〜６０％であり、
ｉｖ）プラスミン濃度が０．００１から１００単位／ｍｌであり、ｖ）ｐＨが６．０〜１０．０であり、
ｖｉ）濃度０．００５〜３．０Ｍの緩衝剤を含み、かつ、
ｖｉｉ）濃度０．００５〜３．０Ｍの塩を含む、
プラスミン試薬ユニットを使用する。

プラスミン用合成基質は、濃度０．０１〜５０ｍＭのプラスミンを用合成基質試薬ユニットを用いる。そのプラスミン試薬とそのプラスミン用合成基質試薬とを１〜１０℃で０〜１８０日保存して以下の実施に用いる。

血漿１〜２０μｌにプラスミン試薬５０〜５００μｌを添加し、３０〜３８℃で１〜１０分間、反応させる。得られる混合液に、酵素開裂した後に適当な波長で測定可能な、プラスミン用合成基質を含む試薬５０〜５００μｌを添加し、３０〜３８℃で、酵素反応させ、合成基質添加後、反応終了前の、１分間当たりの適当な波長の吸光度変化を、プラスミン活性の指標として求め、あらかじめこれらの試薬を用いて作成した、検量線より、試料中のα２−ＰＩ量を正確に求めることができる。

第９の本発明は、濃度０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミン、濃度１〜６０％の炭素数４〜２４の非還元性糖、及び濃度０００５〜３．０Ｍの塩を含む、ｐＨ６〜１０のプラスミン溶液を１〜３０℃で長期間、プラスミンを保存できる。

実施例１〜３及び比較例１〜５
Ａ．プラスミン試薬の１４日までの安定性
８０ｍＭモノメチルアミン及び２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．８を基本組成とし、（ａ）基本組成（比較例１）、（ｂ）基本組成＋２０％ソルビトール（２０％濃度のソルビトールを含む基本組成，実施例１）、（ｃ）基本組成＋２０％トレハロース（実施例２）、（ｄ）基本組成＋２０％スクロース（実施例３）、（ｅ）基本組成＋２０％グルコース（比較例２）、（ｆ）基本組成＋２０％ラクトース（比較例３）、（ｇ）基本組成＋２０％マルトース（比較例４）、（ｈ）基本組成＋２０％マルトトリオース（比較例５）の８種の緩衝液にヒトプラスミン（ＩＩＣ Ｊａｐａｎ社製）を添加したものを、実施例１，２，３及び比較例１〜５のプラスミン試薬とした。このプラスミン試薬は、０．０８単位／ｍｌである。このプラスミン試薬を５℃及び２５℃で１４日間保存し、安定性を検討した。

プラスミン試薬を５℃及び２５℃で１〜１４日保存し、そのプラスミン活性の変化を経時的に追跡した。測定は日立７０５０自動分析機を使用し、プラスミン合成基質ＮＳ−２２００（Ｈ−Ｄ−Ｇｌｎ（Ｃ６ Ｈ１１）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−５ＡＢ）８．９ｍＭ水溶液をプラスミン用合成基質試薬として、用いた。

生理食塩水３μｌにプラスミン試薬２５０μｌを添加し、３７℃で５分間加温した後、プラスミン用合成基質試薬１５０μｌを添加し、添加後６０秒後から１５０秒後までの４０５ｎｍの吸光度を測定し、プラスミン活性の指標として、１分間当たりの吸光度変化を求めた。なお、この吸光度の変化は、合成基質が開裂して生成する５ＡＢに由来する吸光度の変化に基ずく。

各試薬組成での５℃、及び２５℃でのプラスミン活性の経時変化を図１〜１６に示した。また、試薬調製初日の活性を１００％とした１４日後の活性％値を表１及び表２に示した。

その結果、ソルビトール、トレハロース、スクロースでプラスミン活性が高度に維持されており、プラスミン試薬の安定化に際し、これらの非還元性糖が大きく関与していることが判明した。

Ｂ．プラスミン試薬の１８０日間の安定性
上記Ａのプラスミン試薬のうち、比較例１、実施例２、実施例３のプラスミン試薬について、更に長期の安定性の確認を行った。測定方法は上記Ａと同様、合成基質法で行ない、５℃と２５℃における１８０日間の安定性を追跡した。５℃の結果を図１７、２５℃の結果を図１８に示す。比較例１のプラスミン試薬においては５℃及び２５℃において明かにプラスミン活性の低下を示すのに対し、実施例２又は実施例３のプラスミン試薬では、５℃においては活性の低下はほとんどなく、２５℃においても活性の低下は小さいことが判明した。

実施例４．α２−ＰＩの測定
Ｃ． α２−ＰＩ測定の検量線
上記Ａで使用した実施例３（スクロース添加）のプラスミン試薬及びプラスミン用合成基質試薬を調製して、５℃で１８０日保存した。次ぎに、調製の当日及び１８０日保存後の試薬での検量線を以下の方法で作成した。なお、検量線作成用のα２−ＰＩを含む試料は、市販の標準血漿を使用して調製し希釈して行った。

既知濃度のα２−ＰＩを含む試料３μｌに、実施例３のプラスミン試薬２５０μｌを、添加して、該試薬中のプラスミンと試料中のα２−ＰＩとを３７℃で５分間、反応させ、次ぎに、得られる混合液に、プラスミン用合成基質試薬１５０μｌを添加し、添加後６０秒後から１５０秒後までの４０５ｎｍの吸光度を測定し、１分間当たりの吸光度変化を、プラスミン活性の指標として求め、検量線を作成した。

調製当日の検量線の結果を図１９、調製後１８０日経過した試薬での検量線の結果を図２０に示す。試薬調製後１８０日を経ても検量線の形状はほとんど変化せず、プラスミン試薬に非還元性糖類を添加することで、α２−ＰＩ測定試薬の性能が調製後長期に渡って保持されることが示された。なお、スクロースの代わりに、トレハロース又はソルビトール添加のプラスミン試薬を使用しても、同様の結果が得られた。

一方、１８０日保存後の、比較例１の糖無添加のプラスミン試薬で上記と同様に検量線を作成しようとしたが、α２−ＰＩを含まない試料と、１００％のα２−ＰＩを含む試料とで、１分間当たりの吸光度変化はほとんど同じ値を示し、検量線を作成することができなかった。

実施例５ α２−ＰＩの測定実際の血漿検体を、本発明の測定方法で測定した。実施例４で使用した試薬で、血漿検体中のα２−ＰＩを測定し、試薬調製当日及び調製後１８０日での測定値の相関性をみた。

α２−プラスミンインヒビターを含む血漿３μｌに、調製後５℃で１８０日保存の、実施例３のプラスミン試薬を、添加して、該試薬中のプラスミンとそのα２−プラスミンインヒビターとを３７℃で５分間、反応させ、次ぎに、得られる混合液に、調製後５℃で１８０日保存の、プラスミン合成基質試薬１５０μｌを、添加し、添加後６０秒後から１５０秒後までの４０５ｎｍの吸光度を測定し、１分間当たりの吸光度変化を、プラスミン活性の指標として求め、あらかじめ作成した検量線より、試料中のα２−ＰＩ量を求めた。調製当日のプラスミン試薬及びプラスミン合成基質試薬を用いて同様に同一の試料中のα２−ＰＩ量を求めた。

いくつかの血漿を同様にして血漿検体中のα２−ＰＩを測定し、試薬調製当日及び調製後１８０日の場合の相関を求めた。その結果を図２１に示す。回帰式Ｙ＝０．９６Ｘ＋３．８２、相関係数ｒ＝０．９９と良好な相関性を示し、スクロースを含むプラスミン試薬ユニットとプラスミン用合成基質試薬ユニットからなるα２−ＰＩ測定試薬は、液状で長期に５℃で保存しても、正確にα２−ＰＩを測定できることが示された。なお、スクロースの代わりに、トレハロース又はソルビトール添加のプラスミン試薬を使用しても、相関係数はｒ＝０．９９であった。

糖無添加のプラスミン試薬（比較例１）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。縦軸に１分当たりの吸光度変化量、横軸に経過日数を表わす（縦軸及び横軸は、図１〜図１６に関しても同じ）。 糖無添加のプラスミン試薬（比較例１）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 ソルビトール添加のプラスミン試薬（実施例１）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 ソルビトール添加のプラスミン試薬（実施例１）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 トレハロース添加のプラスミン試薬（実施例２）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 トレハロース添加のプラスミン試薬（実施例２）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 スクロース添加のプラスミン試薬（実施例３）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 スクロース添加のプラスミン試薬（実施例３）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 グルコース添加のプラスミン試薬（比較例２）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 グルコース添加のプラスミン試薬（比較例２）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 ラクトース添加のプラスミン試薬（比較例３）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 ラクトース添加のプラスミン試薬（比較例３）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 マルトース添加のプラスミン試薬（比較例４）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 マルトース添加のプラスミン試薬（比較例４）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 マルトトリオース添加のプラスミン試薬（比較例５）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 マルトトリオース添加のプラスミン試薬（比較例５）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１４日の変化を表わす。 糖無添加のプラスミン試薬（比較例１）、トレハロース添加のプラスミン試薬（実施例２）及びスクロース添加のプラスミン試薬（実施例３）の５℃保存下におけるプラスミン活性の１８０日の変化を表わす。 糖無添加のプラスミン試薬（比較例１）、トレハロース添加のプラスミン試薬（実施例２）及びスクロース添加のプラスミン試薬（実施例３）の２５℃保存下におけるプラスミン活性の１８０日の変化を表わす。 調製当日のα２−ＰＩの検量線を示す。縦軸に１分当たりの吸光度変化量（△Ｅ／ｍｉｎ）、横軸にα２−ＰＩの量を表わす。 調製後１８０日（６カ月）後のα２−ＰＩの検量線を示す。縦軸に１分当たりの吸光度変化量（△Ｅ／ｍｉｎ）、横軸にα２−ＰＩの量（％）を表わす。 本発明測定方法での、試薬調製当日の測定と調製後１８０日（６カ月）保存後の測定との相関性を示す。縦軸に、調製後１８０日（６カ月）保存後のプラスミン試薬及びプラスミン用合成基質試薬を用いた場合の、血漿中のα２−ＰＩの量（％）を表わし、横軸に調製当日の試薬を用いた場合の血漿中のα２−ＰＩの量（％）を表わす。

Claims (3)

1. プラスミンに炭素数４〜１８の非還元性糖を存在させることにより該プラスミンを保存する方法。
2. 炭素数４〜１８の非還元性糖がソルビトール、トレハロース、スクロースから選ばれる請求項１記載のプラスミンを保存する方法。
3. 濃度０．００１〜１００単位／ｍｌのプラスミン、濃度１〜６０％の炭素数４〜１８の非還元性糖、及び濃度０．００５〜３．０Ｍの塩を含む、ｐＨ６〜１０のプラスミン溶液で該溶液中のプラスミンを保存する、請求項１または２に記載のプラスミンを保存する方法。

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