JP4815699B2 - γ−GTP活性測定用試薬 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)活性測定用γ−グルタミル基受容体及びこれを用いたγ−GTP活性測定用試薬に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
血中のγ−GTP活性の測定は、肝疾患の診断等に広く利用されており、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)等と共に、肝、胆道系の主要な検査項目の1つとなっている。
【0003】
γ−GTP活性の測定には、従来γ−グルタミル基供与体及びγ−グルタミル基受容体から成る試薬が使用されており、γ−グルタミル基受容体としてはグリシルグリシンが一般的に用いられている。
【0004】
しかしながら、グリシルグシリンはγ−GTP活性の至適pHであるpH8付近の溶液中では長期保存により加水分解され易く、更に分解生成物であるグリシンは微量でもγ−GTP活性を阻害することが知られている。
【0005】
そこで、グリシルグリシン溶液を長期間に亘って安定に保存しておくために、そのpHを3〜7に保っておき、γ−GTP活性の測定を行う際に、この溶液にアルカリ性物質を添加して溶液のpHをγ−GTP活性の至適pH範囲であるpH8付近にするという工夫がなされている(特開平4−299997号)。
【0006】
しかしながら、このようなpH調整が煩雑な操作を伴うことは言うまでもなく、長期間に亘って保存安定性を確保でき、且つγ−GTP活性測定時にpHの調整等の煩雑な操作を必要としないγ−GTP活性測定方法の開発が望まれている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、長期に亘る保存安定性を示すヒト血液中のγ−GTP活性測定用γ−グルタミル基受容体及びこれを用いたγ−GTP活性測定用試薬を提供することを目的とする。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明は、「アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含有させることを特徴とする、ヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬の安定化方法。」、の発明である。
【0010】
また、本発明は、「アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含んで成り、2ヶ月以上安定に保存できる、pH7〜9のヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬。」、の発明である。
【0011】
即ち、本発明は、γ−グルタミル基受容体として、アラニルグリシン又はロイシルグリシンを用いることに特徴を有するものであり、これらをγ−グルタミル基受容体として用いることによりヒト血液中のγ−GTP活性の至適pHにおいて、γ−グルタミル基受容体を含む試薬を溶液状態で長期間安定に保存できることを見出したことにより完成されたものである。
【0012】
本発明は自体公知のγ−GTP活性測定試薬中のγ−グルタミル基受容体を、アラニルグリシン又はロイシルグリシンに代えたものであり、その他の試薬等並びにその使用量等はこの分野で通常用いられるもののうちから適宜選択すればよい。
【0013】
本発明におけるアラニルグリシン又はロイシルグリシンは、市販品、或いは常法に従ってアラニンとグリシン又はロイシンとグリシンとを夫々反応させることによって得られるものの何れでもよい。
【0014】
本発明のγ−GTP活性測定用試薬に於いて用いられるγ−グルタミル基供与体としては、通常この分野で用いられるγ−グルタミル基を供与し得るものであればよく、中でもγ−グルタミル基を供与した残基が発色する性質を有するものが好ましい。その様なγ−グルタミル基供与体の好ましい具体例としては、L−γ−グルタミル−3−カルボキシ−4−ニトロアニリド、γ−グルタミル−p−ニトロアニリド等が挙げられる。
【0015】
本発明のヒト血液中のγ−GTP活性測定用試薬は、利便性の面から考えると、溶液状態のものが好ましい。
【0016】
本発明に係る試薬を用いて測定を行う場合、所謂一液法又は二液法の何れによってもよく、また所謂エンド法又はレート法の何れによってもよい。そして、これら測定に用いるための試薬としては、具体的な測定法に対応するものを、γ−グルタミル基受容体としてアラニルグリシン又はロイシルグリシンを用いる以外は公知の試薬等に準じて適宜調製すればよい。
【0017】
例えば該試薬が所謂一液法によるγ−GTP活性測定に使用される場合に用いる試薬としては、例えばγ−グルタミル基受容体であるアラニルグリシン又はロイシルグリシンと、上記した如きγ−グルタミル基供与体とを含有する緩衝溶液等が挙げられる。また、二液法に使用される場合に用いる試薬としては、上記の如くして公知のものに準じて適宜調製されたものが何れも使用できるが、その測定が所謂レート法によって行われる場合は、第1試薬に含まれる成分としては、ヒト由来γ−GTPを含有するヒト血漿或いはヒト血清等のヒト血液由来の試料と混合してもγ−GTPによる酵素反応を開始しないものとし、且つ第2試薬に含まれる成分としては、該試料及び第1試薬と混合した場合にγ−GTPによる酵素反応を開始するものとするのが好ましい。
【0018】
また、レート法且つ二液法に用いられる場合の好ましい第1試薬としては、例えばγ−グルタミル基受容体であるアラニルグリシン又はロイシルグリシンを水又は適当な緩衝液等に溶解したものが挙げられ、第2試薬としては、例えば上記した如きγ−グルタミル基供与体を水又は適当な緩衝液等に溶解したものが挙げられる。
【0019】
上記した如き試薬のうち、アラニルグリシン又はロイシルグリシンの水溶液は、例えば塩酸、水酸化ナトリウム等でそのpHが通常7〜9、好ましくは8付近となるように調整される。
【0020】
本発明における上記した如き試薬に用いられる緩衝剤としては、通常この分野で用いられる例えばN−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン(Tricine)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、3−[(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸](AMPSO)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)等のグッド緩衝剤、例えば酢酸塩、グリシン、クエン酸塩、リン酸塩、ベロナール、ホウ酸塩、コハク酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)、イミダゾール等が挙げられる。
【0021】
これら緩衝剤の中でもγ−グルタミル受容体を含む試薬に用いる場合には通常7〜9、好ましくは8付近のpH範囲で緩衝能を有するものが好ましく、その使用濃度は通常20〜300mM、好ましくは50〜150mMであり、γ−グルタミル供与体を含む試薬に用いる場合には通常3〜9、好ましくは4〜8のpH範囲で緩衝能を有するものが好ましく、その使用濃度は通常1〜200mM、好ましくは10〜100mMである。
【0022】
また、本発明の試薬には、通常γ−GTP活性測定用試薬に必要に応じて適宜添加される、例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩等のキレート剤、例えばアジ化ナトリウム等の防腐剤、例えばポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、濁り防止剤、安定化剤、賦活剤等が更に含有されていてもよく、これらの使用濃度としては、この分野に於ける使用濃度範囲から適宜選択すればよい。
【0023】
本発明の方法が1液法である場合に使用される試薬は、通常pH7〜9、好ましくはγ−GTP活性の至適pHであるpH8付近になるように調製される。
【0024】
本発明の方法が2液法である場合は、γ−グルタミル基受容体を含有する試薬は通常pH7〜9、好ましくはγ−GTP活性の至適pHであるpH8付近になるよう調整され、γ−グルタミル基供与体を含有している試薬は通常pH3〜9、好ましくは4〜8になるように調整される。尚、2液法に於いては、試料の測定時にγ−グルタミル受容体を含む試薬とγ−グルタミル基供与体を含む試薬とを混合させた後のpHが通常7〜9、好ましくは8付近となるように、使用する夫々の試薬の混合比、緩衝剤濃度等が設定される。
【0025】
本発明の試薬を用いたγ−GTP活性測定時における反応液中のγ−グルタミル基供与体の濃度は、通常1〜10mM、好ましくは3〜8mMであり、またγ−グルタミル基受容体の濃度は、通常25〜500mM、好ましくは50〜200mMである。
【0026】
測定法が1液法である場合、本発明の試薬のγ−グルタミル基供与体の濃度は通常1〜10mM、好ましくは3〜8mMであり、γ−グルタミル基受容体の濃度は通常25〜500mM、好ましくは50〜200mMである。
【0027】
測定法が2液法である場合、γ−グルタミル基供与体を含有している試薬に於けるγ−グルタミル基供与体の濃度は、γ−GTP活性測定時の反応液中の濃度が通常1〜10mM、好ましくは3〜8mMとなるように選択され、γ−グルタミル基受容体を含有している試薬に於けるγ−グルタミル基受容体の濃度は、γ−GTP活性測定時の反応液中の濃度が通常25〜500mM、好ましくは50〜200mMとなるように選択される。
【0028】
本発明のヒト血液中のγ−GTP活性測定方法としては、例えばγ−グルタミル基受容体及びγ−グルタミル基供与体を含むヒト血液中のγ−GTP活性測定用試薬にヒト血液由来試料を添加して一定時間インキュベーションした後、試料中のγ−GTPの作用によってγ−グルタミル基供与体から遊離する発色性化合物を測定し、予め作成しておいた検量線或いは分子吸光係数より試料に含まれるγ−GTPの活性を測定する所謂一液法や、或いは、ヒト血液中のγ−GTP活性測定に必要な成分を上記した如く適宜2液に分けて使用する所謂二液法で行うのが好ましい。
【0029】
上記以外の測定操作或いは条件等については自体公知のそれに準じて適宜選択すればよい。
【0030】
本発明の方法に於いて発色性化合物を測定する方法としては、遊離する発色性化合物の吸光度を直接測定する方法が主流であるが、該発色性化合物に更にジアゾニウム塩等の適当な縮合性化合物等を縮合させて発色させ、比色する方法によっても測定し得る。
【0031】
本発明の方法の中で、好ましい実施態様は以下の通りである。
【0032】
ヒト血清或いはヒト血漿等のヒト血液由来試料とγ−グルタミル基受容体であるアラニルグリシン又はロイシルグリシンを含有する緩衝液(pH約8)とを混合し、通常25〜40℃、好ましくは37℃付近で通常2〜10分間、好ましくは3〜5分間プレインキュベーションした後、γ−グルタミル基供与体である例えばL−γ−グルタミル−3−カルボキシ−4−ニトロアニリド等を添加し、試料中のγ−GTPの作用によって生じる発色性化合物である芳香族化合物の特性に応じた波長において反応液の単位時間あたりの吸光度変化を測定する。そして予めγ−GTPを添加した標準液を用いて作成しておいた検量線を利用するか或いは当該芳香族化合物の分子吸光係数に基づいて、試料に含まれるγ−GTPの活性を算出する。
【0033】
上記以外の測定操作或いは条件等については自体公知のそれに準じて適宜選択すればよい。
【0034】
本発明のγ−GTP活性測定試薬は、γ−GTPの至適pHでも安定に存在し得るアラニルグリシン或いはロイシルグリシンを基質として含んで成るものであり、試薬自体、γ−GTP活性の至適pHで分解することなく長期間安定に保存できる。
【0035】
従ってまた、本発明の方法においては、長期間保存されたアラニルグリシン或いはロイシルグリシンをγ−グルタミル受容体として含んで成る本発明の試薬をpHの調整等の煩雑な操作をすることなくそのまま用いてγ−GTP活性を測定することができる。
【0036】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【0037】
【実施例】
実施例1.γ−GTP活性測定試薬の経時変化(40℃)
[試料]ヒト血清
[試薬](1)下記のR−1を調製し、40℃で所定期間保存した後使用した。
R−1:下記のものから選ばれた所定のジペプチド体65mM水溶液を水酸化ナトリウムでpH7.9に調整したもの。
<ジペプチド体>
(1)アラニルグリシン
(2)ロイシルグリシン
(3)グリシルグリシン
(2)下記の組成からなるR−2を用時調製して使用した。
R−2:L-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド 15.6mMを含有する10mMクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 5.6)。
[測定条件]日立7170形自動分析装置[(株)日立製作所製]を使用し、測定パラメータを以下のように設定して試料中のγ−GTP活性を測定した。
測定方法:レートA[22]−[34]
試料量 :10μL
R−1 :200μL
R−2 :50μL
測定波長:570/405nm
測定温度:37℃
[結果]所定期間保存されたR−1を用いて測定したγ−GTP活性の相対値を図1に示す。尚、ここでいう相対値とは、試料血清中のγ−GTP活性を用時調製されたR−1及びR−2を用いて測定した際の測定値を100%とした場合の、試料血清中のγ−GTP活性を所定期間保存されたR−1を用いて測定したときの測定値の相対値を示すものである。
【0038】
尚、図1において、−◆−は、R−1としてグリシルグリシンを含む試薬を用いた場合、−●−は、R−1としてアラニルグリシンを含む試薬を用いた場合、−○−は、R−1としてロイシルグリシンを含む試薬を用いた場合の40℃での保存期間に対するγ−GTP活性相対値を夫々示す。
【0039】
図1から明らかな如く、R−1として約2ヶ月間40℃で保存されていたグリシルグリシンを含む試薬を用いてγ−GTP活性の測定をした場合、活性の相対値は約4%も低下した。一方、R−1として同条件で保存されたアラニルグリシン或いはロイシルグリシンを含む試薬を用いてγ−GTP活性測定した場合、活性の相対値は測定誤差と考えられる程度の変化しか見られなかった。
【0040】
即ち、図1から明らかな如く、本発明の試薬は長期間安定に保存し得ることがわかる。
【0041】
実施例2.アラニルグリシンを用いたγ−GTP活性測定
[試料]新鮮ヒト血清10検体を試料とした(検体1〜10)。
[試薬]R−1:アラニルグリシン65mM水溶液を水酸化ナトリウムでpH調整したもの(pH 7.9 、at30℃)
R−2:L-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド 15.6mMを含有する10mMクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 5.6、at 30℃)
[測定条件]日立7170形自動分析装置[(株)日立製作所製]を使用し、測定パラメータを以下のように設定して試料中のγ−GTP活性を測定した。
測定方法:レートA[22]−[34]
試料量 :10μL
R−1 :200μL
R−2 :50μL
測定波長:570/405nm
測定温度:37℃
[結果]得られた測定結果を表1に示す。
【0042】
実施例3.ロイシルグリシンを用いたγ−GTP活性測定
試料として新鮮ヒト血清検体10検体(検体11〜20)及びR−1としてロイシルグリシン65mM水溶液を水酸化ナトリウムでpH調整したもの(pH 7.9、at 30℃)を用いた以外は実施例1と同様にして試料中のγ−GTP活性を測定した。得られた結果を表2に示す。
【0043】
比較例1.グリシルグリシンを用いたγ−GTP活性測定
試料として新鮮ヒト血清検体20検体(1〜20)及びR−1としてグリシルグリシン65mM水溶液を水酸化ナトリウムでpH調整したもの(pH 7.9、at 30℃)を用いた以外は実施例1と同様にして試料中のγ−GTP活性を測定した。得られた結果を表1及び2に併せて示す。
【0044】
【表1】
【0045】
【表2】
【0046】
表1及び2から明らかな如く、本発明の方法は、既存のγ−GTP活性測定法と良好な相関性を示すことがわかる。
【0047】
【発明の効果】
本発明のγ−GTP活性測定試薬は、γ−GTP活性の至適pHで安定に存在し得るアラニルグリシン或いはロイシルグリシンを基質として含んで成るものであり、試薬自体、γ−GTP活性の至適pHで分解することなく長期間安定に保存できる。従ってまた、該試薬を使用する本発明の方法においては、長期間保存されたアラニルグリシン或いはロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含んで成る本発明の試薬をpHの調整等の煩雑な操作をすることなくそのまま用いてγ−GTPの活性を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】40℃での保存期間を横軸とし、用時調製した試薬により測定した、試料のγ−GTP活性測定値を100%とした際の、40℃で所定期間保存した試薬により測定した、試料のγ−GTP活性測定値の相対値を縦軸として表した図である。
【符号の説明】
図1において、−◆−は、R−1としてグリシルグリシンを含む試薬を用いた場合、−●−は、R−1としてアラニルグリシンを含む試薬を用いた場合、−○−は、R−1としてロイシルグリシンを含む試薬を用いた場合の40℃での保存期間に対するγ−GTP活性相対値を夫々示す。
Claims (2)
- アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含有させることを特徴とする、ヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬の安定化方法。
- アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含んで成り、2ヶ月以上安定に保存できる、pH7〜9のヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬。
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