JP2024032168A - 試料中のクエン酸の定量用試薬キットおよび定量方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】汎用品よりも安定に保存可能でより長期の使用期限を確保可能な試料中のクエン酸の定量用試薬キットおよび測定方法を提供する。【解決手段】本発明に係る試料中のクエン酸の定量用試薬キットは、ＮＡＤＨと金属塩を含む第１試薬と、クエン酸リアーゼ、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）、キレート剤を含む第２試薬とを含む。本発明に係る試料中のクエン酸の定量方法は、ＮＡＤＨと金属塩を含む第１の溶液を得る工程、クエン酸リアーゼ、ＭＤＨ、キレート剤を含む第２の溶液を得る工程、第１の溶液と試料を混合して試料混合液を得る工程、試料混合液の吸光度を測定してＮＡＤＨの濃度を算出する工程、試料混合液に第２の溶液を添加して酵素反応液を得る工程、酵素反応液の吸光度を測定してＮＡＤＨの濃度を算出する工程、クエン酸の酵素反応開始前から反応終了までの間のＮＡＤＨの濃度の算出結果に基づき試料中のクエン酸の量を定量する工程、を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、試料中のクエン酸の定量用試薬キットおよび定量方法に関するものである。
生体試料、清涼飲料水や食品中に含まれる検査対象物質の量を測定する分析方法の一つとして、検査対象物質に対して酵素反応を生じさせ、検査対象物質または添加した試薬がその反応系中で変化して生成した化合物の量を測定する方法が知られている。例えば、清涼飲料水や食品等の中に含有されるクエン酸を測定する方法として、（１）測定対象試料に対し、クエン酸を基質とするクエン酸リアーゼを用いた酵素反応により、試料中に含有されるクエン酸からオキサロ酢酸と酢酸とを生じさせ、（２）生じたオキサロ酢酸をリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）存在下でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と反応させ、（３）（２）の反応によるＮＡＤＨの減少量に基づいて、測定対象試料に含まれていたクエン酸の量を算出する、といった手法が採用されている。一例として、非特許文献１には、クエン酸リアーゼを用いた血清クエン酸測定法が開示されている。
安川ら、日本泌尿器化学会誌、１９９１年、８２巻、１１号、１７４８－１７５３頁
クエン酸は、尿路結石の抑制に関与する物質の一つとして知られている。近年、尿路結石の生涯罹患率は、男性では７人に１人、女性では１５人に１人と増加してきており、その再発率も５０％以上と高い。このため、尿路結石の再発を効果的に防ぐことができるよう、より日常的に行うことができる尿検査方法が求められている。
尿路結石は、尿中のシュウ酸がカルシウムと反応してシュウ酸カルシウムを形成し、結晶化することで生じる。クエン酸は、尿中で、シュウ酸とカルシウムとの結合を抑制する作用を有する。このため、尿路結石の再発を防ぐために、クエン酸を積極的に摂取することが推奨されている。
尿路結石の現在または過去の罹患者について、尿中のクエン酸排泄量の変化を追跡することができれば、摂取したクエン酸の量が尿路結石の生成を抑制するために十分であるか否かを確認することができる。しかしながら、現在までに、食品等を分析するための試薬キットの市販品はあるものの、日本国内で認可された尿中クエン酸の体外診断用医薬品はない。
クエン酸の量を測定する方法の一つとして、上述した、クエン酸を基質とした酵素反応により変動するＮＡＤＨの量を測定し、ＮＡＤＨの減少量からもとの試料中のクエン酸の量を算出する方法があり、この方法を用いたクエン酸測定試薬キットが市販されている。体外診断用医薬品は、一般に６ヶ月以上安定に保存できることが求められる。しかしながら、市販されているクエン酸測定試薬キットで液状のものには、冷蔵保存下（１０℃以下）でも５日程度しかその品質が維持されないものがあるように、クエン酸リアーゼを長期間安定に保存することは容易でない。クエン酸リアーゼを長期間安定に保存することができれば、クエン酸量に関する検査を頻繁には行わない状況であっても、クエン酸測定試薬の買い換えの回数を減らすことができるため、検査のコストを抑制することにつながる。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、従来品と比較してより安定に長期間保存可能であり、より長期の使用期限を確保することができる、試料中のクエン酸の定量用試薬キットおよび測定方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明の試料中のクエン酸の定量用試薬キットおよび定量方法は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、試料中のクエン酸の定量用試薬キットであって、ＮＡＤＨと、金属塩と、を含む、第１試薬と、クエン酸リアーゼと、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）と、キレート剤と、を含む、第２試薬と、を含む、クエン酸の定量用試薬キットを提供する。
前記第１の態様においては、金属塩が、２価の陽イオンを生じさせる金属の塩であり、第１試薬と第２試薬とを混合した溶液中に、金属塩がキレート剤に対して濃度比で１．０倍～５．０倍量存在することとしてもよい。
前記第１の態様においては、キレート剤がＥＤＴＡであり、金属塩がマグネシウム塩であってもよい。
前記第１の態様においては、試料が尿であってもよい。
前記第１の態様においては、第１試薬が、さらに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含んでいてもよい。
本発明の第２の態様は、試料中のクエン酸の定量方法であって、ＮＡＤＨと、金属塩と、を含む、第１の溶液を得る工程と、クエン酸リアーゼと、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）と、キレート剤と、を含む第２の溶液を得る工程と、第１の溶液と試料とを混合して試料混合液を得る工程と、試料混合液の吸光度を測定し、試料混合液中のＮＡＤＨの濃度を算出する工程と、試料混合液に第２の溶液を添加して酵素反応液を得る工程と、酵素反応液の吸光度を測定し、酵素反応液中におけるＮＡＤＨの濃度を算出する工程と、クエン酸の酵素反応開始前から反応終了までの間のＮＡＤＨの濃度の算出結果に基づき、試料中のクエン酸の量を定量する工程と、を含む、クエン酸の定量方法を提供する。
前記第２の態様においては、金属塩が、２価の陽イオンを生じさせる金属の塩であり、酵素反応液中に、金属塩をキレート剤に対して濃度比で１．０倍～５．０倍量存在させてもよい。
前記第２の態様においては、キレート剤がＥＤＴＡであり、金属塩がマグネシウム塩であってもよい。
前記第２の態様においては、試料が尿であってもよい。
前記第２の態様においては、第１の溶液が、さらに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含んでいてもよい。
前記第２の態様においては、試料中のクエン酸の量を定量する工程においては、酵素反応液中のＮＡＤＨの濃度の算出を、クエン酸の反応開始前から反応終了までのＮＡＤＨに由来する吸光度の変化量を測定することにより行ってもよい。
本発明のクエン酸定量用試薬キットおよび定量方法においては、使用前はクエン酸リアーゼを含む試薬にキレート剤を共存させることとした。これにより、市販の測定試薬キットと比較して、クエン酸リアーゼをより安定に長期間保存することができ、よって試薬キットの使用期限をより長く確保することができる。
一方で、キレート剤は、クエン酸リアーゼによる酵素反応を阻害し、クエン酸リアーゼを不活化する作用を有する。そこで、本発明のクエン酸定量用試薬キットには、クエン酸とクエン酸リアーゼとの反応溶液中でキレート剤がクエン酸リアーゼを不活化することを抑制するために、適切な量の金属塩を含有させている。本発明のクエン酸定量用試薬キットの使用前は、金属塩が、クエン酸リアーゼとキレート剤とを含有する試薬からは独立した試薬に含まれている。使用時には、まず、ＮＡＤＨと金属塩とを含む溶液を調製し、その溶液に測定対象であるクエン酸を含む試料を添加して、試料混合液を得る。この試料混合液に対し、キレート剤、クエン酸リアーゼ、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）を添加して酵素反応液を作成する。酵素反応液中で金属イオンがキレート剤に結合することで、キレート剤によりクエン酸リアーゼが不活化されることを抑制し、クエン酸リアーゼとクエン酸との酵素反応が化学量論的に適切に進行する。このようにすることで、クエン酸リアーゼの酵素反応を効率よく進行させることができ、クエン酸の定量を正確に行うことができる。
以下に、本発明に係る試料中のクエン酸の定量用試薬キットおよび定量方法の一実施形態について説明する。対象となる試料としては、尿、食品、清涼飲料水などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本実施形態に係るクエン酸の定量用試薬キットおよび定量方法は、尿中のクエン酸を定量するのに好適である。
本実施形態の試料中のクエン酸の定量用試薬キットは、検査対象物質であるクエン酸を基質とするクエン酸リアーゼ（ＣＬ）を用いる。以下の反応式に示すように、クエン酸リアーゼとクエン酸との反応により生じるオキサロ酢酸と、系中に添加されているＮＡＤＨとをリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）により反応させ、反応液中に存在するＮＡＤＨの量の変化を測定することにより、試料中のクエン酸が定量される。下記反応式中の反応が理論値どおりに進行した場合には、２段階目の反応で消費されるＮＡＤＨのモル数は、系中に存在するクエン酸のモル数と等しい。これにより、反応前後で消費されたＮＡＤＨのモル量が算出されることで、系中に存在したクエン酸のモル数が算出され、試料中に含まれていたクエン酸が定量される。
発明者らは、クエン酸リアーゼをより長期間安定に保存することができるよう種々検討を行い、クエン酸リアーゼをキレート剤共存下で保管することで、クエン酸リアーゼを含む試薬キットの長期安定保存に成功し、本発明を完成するに至った。
本実施形態に係るクエン酸の定量用試薬キットは、第１試薬および第２試薬を備えている。第１試薬および第２試薬は、使用直前まで、それぞれ独立に保管されている。
第１試薬は、ＮＡＤＨと、金属塩と、を含む。第１試薬は、使用前には、ｐＨ７．０から弱アルカリ性の液性を示す溶液に溶解される。本明細書における「弱アルカリ性」とは、ｐＨ８．０から９．０である。本明細書における「ｐＨ７．０から弱アルカリ性の液性」とは、ｐＨ７．０からｐＨ９．０の液性を示す溶液をいう。第１試薬であるＮＡＤＨと金属塩とを溶解した溶液（第１の溶液）の液性を、例えばｐＨ７．２から８．９とすると、ＮＡＤＨが安定に存在する。別の例として、第１試薬の液性をｐＨ７．５、ｐＨ７．８、ｐＨ８．０、ｐＨ８．２、ｐＨ８．４、ｐＨ８．６、ｐＨ８．８などとすることも可能である。
本実施形態に係る定量用試薬キットに含める金属塩として、２価の陽イオンを生じさせる金属の塩を用いると好適である。一例として、マグネシウム塩、亜鉛塩、鉄（ＩＩ）塩等を用いることができるが、これらに限定されない。本実施形態に係る金属塩として、マグネシウム塩を用いるとより好適である。また、陽イオンと対になる陰イオンとしては、塩化物イオン、硫酸イオンが好ましい。
第２試薬は、クエン酸リアーゼと、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）と、キレート剤と、を含む。
キレート剤は、クエン酸リアーゼによる酵素反応を阻害し、クエン酸リアーゼを不活化する作用を有する。そこで、本実施形態に係るクエン酸定量用試薬キットは、使用前の段階では、金属塩を、クエン酸リアーゼとキレート剤とを含有する試薬からは独立した試薬に含有させておく。
本実施形態に係るクエン酸の定量用試薬キットに含めるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）等を用いることができるが、これらに限定されない。本実施形態に係るクエン酸の定量用試薬キットに含めるキレート剤としてＥＤＴＡを用いると好適である。
第２試薬は、溶液であってもよく、粉末状としてもよい。第２試薬は、使用前に、中性の溶液に溶解される。本明細書における「中性」とは、ｐＨ６．５から８．０である。このような範囲とすることで、クエン酸リアーゼを安定な状態で保存することができる。第２試薬であるクエン酸リアーゼ、ＭＤＨ、キレート剤を溶解した溶液（第２の溶液）の液性としては、例えば、ｐＨ６．６、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．４、ｐＨ７．８などとすることも可能である。
本実施形態において、２価の陽イオンを生じさせる金属の塩を用いる場合には、すべての酵素と金属塩とキレート剤とが混合された酵素反応液中に、金属塩がキレート剤に対して濃度比で１．０倍以上５．０倍以下の量で存在するように調製される。
例えば、キレート剤としてＥＤＴＡを用いる場合には、ＥＤＴＡに対する金属塩の量を上記範囲とすることで、系中において、ＥＤＴＡに対して金属イオンが十分にキレートする。これにより、ＥＤＴＡのクエン酸リアーゼに対するキレート作用が不活化し、ＥＤＴＡによるクエン酸リアーゼの酵素反応の阻害を確実に抑制することができる。
一例として、キレート剤としてＥＤＴＡを用い、金属塩としてマグネシウム塩を選択する場合、後述する実施例で示されたように、マグネシウム塩をＥＤＴＡに対して１倍から５倍程度添加することで、系中に存在するＥＤＴＡに対してマグネシウムイオンが十分にキレートすることができる。金属塩は、キレート剤に対して１．０倍以上５．０倍以下添加すると好ましいが、１．１倍以上としてもよく、２．０倍以下としてもよい。
市販されているクエン酸の分析用試薬キットには、クエン酸を基質とした酵素反応によって生じるＮＡＤＨの量の減少に基づいてもとの試料中のクエン酸の量を求めるという同様のメカニズムを採用しているものがある。しかしながら、クエン酸リアーゼを安定に長期間保存することは容易ではない。一例として、クエン酸リアーゼを含有する粉末状試薬を含む市販のキットでは、溶液として溶解させた後、冷蔵保存下では５日程度の使用期間しか確保できないものがあった。
これに対し、本実施形態に係る定量用試薬キットでは、クエン酸リアーゼを含む試薬にキレート剤を共存させて保管する。これにより、既存のクエン酸量測定試薬キットと比較して、クエン酸リアーゼをより安定に長期間にわたって保存することができる。クエン酸リアーゼとキレート剤とを含む第２の試薬を溶解させた中性の溶液は、冷蔵環境下（１０℃以下）で１ヶ月間、その定量性能を確保できる。
本実施形態に係るクエン酸の定量方法は、以下のステップＳ１～Ｓ７を含む。
（Ｓ１）ＮＡＤＨと、金属塩と、を含む第１の溶液を得る。
（Ｓ２）クエン酸リアーゼと、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）と、キレート剤と、を含む第２の溶液を得る。
（Ｓ３）第１の溶液と試料とを混合して、試料混合液を得る。
（Ｓ４）試料混合液の吸光度を測定し、試料混合液中のＮＡＤＨの濃度を算出する。
（Ｓ５）試料混合液に第２の溶液を添加して、酵素反応液を得る。
（Ｓ６）酵素反応液の吸光度を測定し、反応液中におけるＮＡＤＨの濃度を算出する。
（Ｓ７）クエン酸の反応開始前から反応終了までのＮＡＤＨの濃度の算出結果に基づいて、試料中のクエン酸の量を定量する。
（Ｓ１）ＮＡＤＨと、金属塩と、を含む第１の溶液を得る。
（Ｓ２）クエン酸リアーゼと、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）と、キレート剤と、を含む第２の溶液を得る。
（Ｓ３）第１の溶液と試料とを混合して、試料混合液を得る。
（Ｓ４）試料混合液の吸光度を測定し、試料混合液中のＮＡＤＨの濃度を算出する。
（Ｓ５）試料混合液に第２の溶液を添加して、酵素反応液を得る。
（Ｓ６）酵素反応液の吸光度を測定し、反応液中におけるＮＡＤＨの濃度を算出する。
（Ｓ７）クエン酸の反応開始前から反応終了までのＮＡＤＨの濃度の算出結果に基づいて、試料中のクエン酸の量を定量する。
本実施形態に係るクエン酸定量方法においては、まず、ステップＳ１でＮＡＤＨと金属塩とを含む第１の溶液を調製する。これとは別に、ステップＳ２として、クエン酸リアーゼ、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）、およびキレート剤を含む第２の溶液を調製する。次いで、ステップＳ３で、測定対象であるクエン酸を含む試料を第１の溶液に添加して、試料混合液を得る。続くステップＳ４で、ステップＳ３で得られた試料混合液の３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。得られた測定値から、クエン酸に対する酵素反応開始前に系中に存在するＮＡＤＨの量が算出される。
続くステップＳ５において、ステップＳ４で吸光度を測定した試料混合液に対し、ステップＳ２で得られた第２の溶液を添加して酵素反応液を作成する。これにより、クエン酸リアーゼによるクエン酸への酵素反応が開始される。ステップＳ６では、ステップＳ５で得られた酵素反応液の吸光度を測定することで系中のＮＡＤＨの濃度を算出する。最後に、ステップＳ７において、反応開始前から反応終了までの間での、反応液中におけるＮＡＤＨの濃度の変化の程度を算出する。その算出結果に基づいて、試料中に含まれていたクエン酸の定量を行う。本明細書において、「酵素反応液」とは、クエン酸リアーゼによる酵素反応が進行する条件になった溶液をいう。酵素反応液は、少なくとも、クエン酸リアーゼと、試料中にクエン酸が含まれている場合にはクエン酸と、ＮＡＤＨと、ＭＤＨと、を含む。本実施形態に係る定量方法を実施した場合、得られた酵素反応液中には、ＮＡＤＨと、金属塩と、クエン酸リアーゼと、ＭＤＨと、キレート剤と、が含まれ、さらに、試料中にクエン酸が含まれている場合にはクエン酸が含まれる。ステップＳ５からステップＳ７は、クエン酸リアーゼによる酵素反応に適した温度条件下で行われる。
上述のような手順とすることで、ステップＳ１で第１の溶液中の金属塩から生じた金属イオンが、ステップＳ２で得られた第２の溶液中でクエン酸リアーゼと共存していたキレート剤に対してキレートする。これにより、キレート剤のキレート作用が不活化するため、キレート剤によるクエン酸リアーゼの酵素反応の阻害を抑制することができる。よって、クエン酸リアーゼの酵素反応を効率よく進行させることができ、クエン酸の定量を正確に行うことができる。
ステップＳ７における、クエン酸の反応開始前から反応終了までの間での、酵素反応液中におけるＮＡＤＨの濃度の算出は、例えば、反応液中のＮＡＤＨ由来の吸光度の変化量を測定および算出することにより行う。
ステップＳ７における反応開始前から反応終了までの間での、反応液中におけるＮＡＤＨの濃度の算出は、上述した吸光度の変化量の測定および算出に代えて、反応液中のＮＡＤＨ由来の吸光度の変化速度を測定することでも行うことができる。
本実施形態に係る定量用試薬キットの第１試薬は、さらに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含んでもよい。ＬＤＨは、ピルビン酸とＮＡＤＨとを反応させて、乳酸とＮＡＤ＋とを生じさせる脱水素酵素である。
検査対象とする試料中にカルボキシラーゼが含まれていた場合、または、オキサロ酢酸の安定性に起因した自然分解等によって、クエン酸から生成したオキサロ酢酸の一部がピルビン酸へと変換される可能性がある。このピルビン酸への変換が生じると、系中でクエン酸から生じたオキサロ酢酸が消費されてしまう。この場合、ＭＤＨ存在下でクエン酸から生成したオキサロ酢酸との酵素反応で消費されるはずのＮＡＤＨの量もまた理論値より小さくなってしまう。その結果、ＮＡＤＨの変化量の追跡を介したクエン酸の定量を正確に行うことができなくなる。
そこで本実施形態に係る定量用試薬キットにＬＤＨをさらに含ませておくことで、オキサロ酢酸の分解により生じたピルビン酸が、ＬＤＨによりＮＡＤＨが消費されてＮＡＤ＋が生成する。これにより、クエン酸から生成したオキサロ酢酸との酵素反応で消費されるはずのＮＡＤＨ量が理論値より小さくなることを防ぎ、クエン酸の定量をより精度良く行うことができる。
本実施形態に係る定量用試薬キットは、吸光度測定時に使用するキャリブレータやコントロール物質、また試薬の混合に用いる使い捨て可能な器具等を同梱した測定キットとすることもできる。そのようなキットとすることで、例えば尿中のクエン酸の定量にあたって多くの試料を測定したい場合に、器具の洗浄等の手間を少なくして、より簡便に定量を行うことができる。
本実施形態に係る定量用試薬キットは、一例として、以下の成分を含む構成とすることができる。以下の成分の他に、防腐剤、抗生物質等を含有させることも可能である。
（ａ） 以下の成分を含有する試薬ミックス１
・ＮＡＤＨ
・金属塩
（ｂ） 以下の成分を含有する試薬ミックス２
・クエン酸リアーゼ
・リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）
・キレート剤
（ｃ） 試薬ミックス１の溶解用ｐＨ７．０～弱アルカリ性バッファー
（ｄ） 試薬ミックス２の溶解用中性バッファー
（ａ） 以下の成分を含有する試薬ミックス１
・ＮＡＤＨ
・金属塩
（ｂ） 以下の成分を含有する試薬ミックス２
・クエン酸リアーゼ
・リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）
・キレート剤
（ｃ） 試薬ミックス１の溶解用ｐＨ７．０～弱アルカリ性バッファー
（ｄ） 試薬ミックス２の溶解用中性バッファー
本実施形態に係る定量用試薬キットの別の例として、以下の成分を含む構成とすることができる。以下の成分の他に、防腐剤、抗生物質等を含有させることも可能である。
（ａ） 以下の成分を含有する試薬ミックス１
・ＮＡＤＨ
・金属塩
・乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
（ｂ） 以下の成分を含有する試薬ミックス２
・クエン酸リアーゼ
・リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）
・キレート剤
（ｃ） 試薬ミックス１の溶解用ｐＨ７．０～弱アルカリ性バッファー
（ｄ） 試薬ミックス２の溶解用中性バッファー
（ａ） 以下の成分を含有する試薬ミックス１
・ＮＡＤＨ
・金属塩
・乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
（ｂ） 以下の成分を含有する試薬ミックス２
・クエン酸リアーゼ
・リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）
・キレート剤
（ｃ） 試薬ミックス１の溶解用ｐＨ７．０～弱アルカリ性バッファー
（ｄ） 試薬ミックス２の溶解用中性バッファー
本実施形態に係る定量用試薬キットのさらに別の例として、以下の成分を含む構成とすることができる。以下の成分の他に、防腐剤、抗生物質等を含有させることも可能である。（ａ） 以下の成分を含有する試薬ミックス溶液１
・ＮＡＤＨ
・金属塩
・乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
・ｐＨ７．０～弱アルカリ性バッファー
（ｂ） 以下の成分を含有する試薬ミックス溶液２
・クエン酸リアーゼ
・リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）
・キレート剤
・中性バッファー
・ＮＡＤＨ
・金属塩
・乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
・ｐＨ７．０～弱アルカリ性バッファー
（ｂ） 以下の成分を含有する試薬ミックス溶液２
・クエン酸リアーゼ
・リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）
・キレート剤
・中性バッファー
本実施形態に係る定量方法は、上述した本実施形態に係る定量用試薬キットを用いて行うことも可能である。本実施形態に係る定量用試薬キットには、試料中のクエン酸の量を定量するために必須であるクエン酸リアーゼに加えて、クエン酸リアーゼによるクエン酸の酵素反応の生成物であるオキサロ酢酸をＮＡＤＨと反応させるＭＤＨ等、必要な酵素類が含まれている。これにより、別途試薬を追加することなく簡便に試料中のクエン酸の定量を行うことができる。
本実施形態に係るクエン酸の定量用試薬キットを用いた定量方法においては、試料中のクエン酸の量を定量する工程における系中のＮＡＤＨの変化の程度の算出を、ＮＡＤＨに由来する吸光度の変化を測定することにより行うこととしてもよい。一例としては、分光光度計を用いて、ＮＡＤＨに由来する３４０ｎｍ付近の吸光度の、クエン酸リアーゼによる反応前からの減少量を測定することを介して、試料中のクエン酸の濃度を算出し、定量することができる。
本実施形態における、反応液中におけるＮＡＤＨの変化の程度の算出は、上述した変化量の測定および算出に代えて、反応液中のＮＡＤＨの量の変化速度を測定することでも行うことができる。
実施例１．試薬キットに添加するキレート剤の検討
本実施形態の定量用試薬キットに用いるキレート剤について、比較検討を行った。検体としてクエン酸の生理食塩水溶液を用い、金属塩として塩化マグネシウムが存在する系中に加えるキレート剤として、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ＥＤＴＡ・３Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｋのいずれかを用い、ＮＡＤＨの吸光度の変化を追跡した。キレート剤を何も添加しない生理食塩水溶液を対照溶液として同様の実験に供した。
本実施形態の定量用試薬キットに用いるキレート剤について、比較検討を行った。検体としてクエン酸の生理食塩水溶液を用い、金属塩として塩化マグネシウムが存在する系中に加えるキレート剤として、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ＥＤＴＡ・３Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｋのいずれかを用い、ＮＡＤＨの吸光度の変化を追跡した。キレート剤を何も添加しない生理食塩水溶液を対照溶液として同様の実験に供した。
実施例１で用いた試薬キットの構成は以下の通りである。検体としては、クエン酸ナトリウム二水和物（ナカライテスク）の生理食塩水溶液を１２ｍＭから５段階で希釈して調製したもの（２．４ｍＭ、４．８ｍＭ、７．２ｍＭ、９．６ｍＭ、１２ｍＭ）と、クエン酸を含まないもの（０ｍＭ。以下、「対照検体」という。）を用いた。キレート剤は、ＮＴＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、ＥＤＴＡ・３Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｋのいずれかを用いた（いずれも同仁化学社製品）。なお、以下の試薬液Ａ、試薬液Ｂには、目的とする酵素反応を阻害しない範囲で、さらに安定化剤や抗生物質、防腐剤などを添加した場合にも、クエン酸の定量を精度よく行うことができることを確認している。
（試薬液Ａ） 以下の成分を含有する溶液
・ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母） ０．４ｍＭ
・塩化マグネシウム六水和物（和光純薬） １５ｍＭ
・ＬＤＨ（東洋紡） １Ｕ／ｍＬ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）バッファー ５０ｍＭ
（試薬液Ｂ） 以下の成分を含有する溶液
・クエン酸リアーゼ（ロシュ） １Ｕ／ｍＬ
・ＭＤＨ（東洋紡） ２Ｕ／ｍＬ
・キレート剤 １５ｍＭ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）バッファー １５０ｍＭ
（試薬液Ａ） 以下の成分を含有する溶液
・ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母） ０．４ｍＭ
・塩化マグネシウム六水和物（和光純薬） １５ｍＭ
・ＬＤＨ（東洋紡） １Ｕ／ｍＬ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）バッファー ５０ｍＭ
（試薬液Ｂ） 以下の成分を含有する溶液
・クエン酸リアーゼ（ロシュ） １Ｕ／ｍＬ
・ＭＤＨ（東洋紡） ２Ｕ／ｍＬ
・キレート剤 １５ｍＭ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）バッファー １５０ｍＭ
調製した直後の試薬液Ａおよび試薬液Ｂと、調製後に１ヶ月冷蔵保存（約４℃）した後の試薬液Ａおよび試薬液Ｂとをそれぞれ用いて、はじめに試薬液Ａとクエン酸検体または対照検体とを混合し、５分後に試薬液Ｂを加え、反応液を得た。クエン酸検体または対照検体、試薬液Ａ、試薬液Ｂは、体積比が１：４０：２０となるように混合した。各検体について、試薬液Ａと検体との混合直後を０分とし、５分後に試薬液Ｂを加えることで反応を開始させた。試薬液Ａと検体との混合直後（０分）から、検体を含む溶液の吸光度を経時測定した。ＮＡＤＨに由来する吸光度は、汎用自動分析装置（日立ハイテク、日立自動分析装置７１８０）を用い、約３７℃、２ポイントエンド方式で主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定を行った。
結果を図１－１および図１－２に示す。各グラフの縦軸は吸光度、横軸は試薬液Ａと検体との混合直後を０分とした経過時間（分）を示す。すなわち、各グラフの「０分」、「５分」、「１０分」は、それぞれ、試薬液Ａと検体との混合直後、試薬液Ｂを加えて反応を開始させた時点、反応開始から５分後を示している。キレート剤を含まない対照溶液（図１－２の「ｎｏｎｅ」）を用いた実験では、１ヶ月冷蔵保存後の試薬液を用いたところ、反応速度が大幅に低下しており、反応開始から５分経過後も反応が完了しなかった。これに対し、各キレート剤を添加した系では、１ヶ月冷蔵保存後の試薬液を用いても反応が完了していることを示し、キレート剤を添加したことによって試薬の安定性が向上したことを確認できた。
また、調製直後の試薬と１ヶ月冷蔵保存後の試薬との反応の進行具合を比較した。対照検体では、１ヶ月保存後の試薬液を用いると、調製直後の試薬液と比べて反応の進行が明らかに低下した。これに対し、キレート剤を添加した系では、調製直後には反応開始から７分以内には反応が完了し、１ヶ月保存後の試薬液を用いてもいずれも１０分以内に反応が完了していた。以上の結果から、キレート剤を反応系に予め添加しておくことで、試薬液の安定性を長期間保つことができることを確認した。
さらに、キレート剤の種類で結果を比較したところ、ＮＴＡ、ＴＴＨＡ、ＥＤＴＡ・３Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・２Ｋは、試薬液に対して高い安定化効果を有していることが分かった。これらの中で、反応系の溶液に高い溶解度を示したＥＤＴＡ・３Ｎａを、以降の実験のキレート剤として用いることとした。
試験例２．試薬キットに添加する金属塩の検討
本実施形態の試薬液におけるキレート剤としてＥＤＴＡ・３Ｎａを選択する場合に、反応系に添加する金属塩の種類について比較検討を行った。ＥＤＴＡとのキレート形成の観点から、金属塩としては、塩化アルミニウム、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化マグネシウム、塩化亜鉛のいずれか（いずれも和光純薬社製品）を用い、実施例１と同様に、ＮＡＤＨに由来する吸光度の変化を追跡した。対照溶液として、金属塩を含有していない試薬液Ａを用いて同様の実験に供した。
本実施形態の試薬液におけるキレート剤としてＥＤＴＡ・３Ｎａを選択する場合に、反応系に添加する金属塩の種類について比較検討を行った。ＥＤＴＡとのキレート形成の観点から、金属塩としては、塩化アルミニウム、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化マグネシウム、塩化亜鉛のいずれか（いずれも和光純薬社製品）を用い、実施例１と同様に、ＮＡＤＨに由来する吸光度の変化を追跡した。対照溶液として、金属塩を含有していない試薬液Ａを用いて同様の実験に供した。
実施例２で用いた試薬キットの構成は以下の通りである。実験に供するクエン酸検体としては、実施例１と同様に、クエン酸ナトリウム生理食塩水溶液を５段階で希釈して調製した検体（２．４ｍＭ、４．８ｍＭ、７．２ｍＭ、９．６ｍＭ、１２ｍＭ）と、クエン酸を含まない対照検体を用いた。ＥＤＴＡ・３Ｎａの濃度は、各金属塩の濃度と同じ濃度（１．０ｍＭまたは０．１ｍＭ）とした。塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）の濃度が０．１ｍＭと低いのは、反応溶液への溶解度が低いためである。金属塩の添加による効果を確認する実験においては、試薬液Ａに金属塩を添加する一方で、試薬液ＢにＥＤＴＡ・３Ｎａを加えないサンプル（０ｍＭ）を調製して用いた。
（試薬液Ａ） 以下の成分を含有する溶液
・ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母） ０．４ｍＭ
・金属塩
・ＬＤＨ（東洋紡） １Ｕ／ｍＬ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）バッファー ５０ｍＭ
（試薬液Ｂ） 以下の成分を含有する溶液
・クエン酸リアーゼ（ロシュ） １Ｕ／ｍＬ
・ＭＤＨ（東洋紡） ２Ｕ／ｍＬ
・ＥＤＴＡ・３Ｎａ（同仁化学） ０．１ｍＭ、１．０ｍＭ，または０ｍＭ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）バッファー １５０ｍＭ
（試薬液Ａ） 以下の成分を含有する溶液
・ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母） ０．４ｍＭ
・金属塩
・ＬＤＨ（東洋紡） １Ｕ／ｍＬ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）バッファー ５０ｍＭ
（試薬液Ｂ） 以下の成分を含有する溶液
・クエン酸リアーゼ（ロシュ） １Ｕ／ｍＬ
・ＭＤＨ（東洋紡） ２Ｕ／ｍＬ
・ＥＤＴＡ・３Ｎａ（同仁化学） ０．１ｍＭ、１．０ｍＭ，または０ｍＭ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）バッファー １５０ｍＭ
用時調製した試薬液Ａおよび試薬液Ｂを用いて、はじめに試薬液Ａとクエン酸含有検体または対照検体とを混合し、５分後に試薬液Ｂを加えた。クエン酸検体または対照検体、試薬液Ａ、試薬液Ｂは、体積比が１：４０：２０となるように混合した。各検体について、試薬液Ａと検体との混合直後を０分とし、５分後に試薬液Ｂを加えることで反応を開始させた。試薬液Ａと検体との混合直後（０分）から、検体を含む溶液の吸光度を経時測定した。ＮＡＤＨに由来する吸光度は、汎用自動分析装置（日立ハイテク、日立自動分析装置７１８０）を用い、約３７℃、２ポイントエンド方式で主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定を行った。
結果を図２－１および図２－２に示す。各グラフの縦軸は吸光度、横軸は反応開始からの経過時間（分）を示す。まず、ＥＤＴＡ・３Ｎａを存在させない系中における金属塩の添加による効果の違いを比較した（図２－１および図２－２の金属塩ごとのグラフの上の段、Ｒ２：キレート剤が「ｎｏｎｅ」）。塩化カルシウム、塩化コバルトを添加した場合には、金属塩を添加しなかった場合（対照溶液、図２－２のＲ１：金属塩が「ｎｏｎｅ」）よりも反応速度が低下した。その他の金属塩では、金属塩を添加しなかった場合と反応速度が同程度または反応速度が向上した。
次に、ＥＤＴＡ・３Ｎａを系中に存在させた溶液を用いて、金属塩の種類による影響の違いを比較した。金属塩を添加しない対照溶液では、ＥＤＴＡ存在下ではＥＤＴＡが存在しなかった系よりも反応速度が低下したことから、ＥＤＴＡにより反応が抑制されていることが分かった。これに対し、金属塩を添加した系では、ＥＤＴＡ存在下で反応が促進されたことを確認した。特に、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を添加した系では反応が良好に進行した。以上の結果と取り扱いのしやすさの観点から、以降は金属塩として塩化マグネシウムを用いることとした。塩化マグネシウムは、クエン酸リアーゼを活性化させる観点からも好適である。
実施例３．試薬キットに添加するマグネシウム塩の量の検討
添加する金属塩としてマグネシウム塩を選択する場合の、適切な添加量について検討を行った。
添加する金属塩としてマグネシウム塩を選択する場合の、適切な添加量について検討を行った。
実施例３で用いた試薬キットの構成は以下の通りである。実験に供するクエン酸検体としては、実施例１と同様に、クエン酸ナトリウム生理食塩水溶液を５段階で希釈して調製した検体（２．４ｍＭ、４．８ｍＭ、７．２ｍＭ、９．６ｍＭ、１２ｍＭ）と、クエン酸を含まない対照検体を用いた。塩化マグネシウムの濃度は、反応系中でのＥＤＴＡの量に対して、０．６７倍、１．０倍、１．１倍、２．０倍、５．０倍の量となるように調製して添加した。ＥＤＴＡ１分子に対してマグネシウムイオンが１つキレートすることが知られている。本実施例では、ＥＤＴＡ１分子に対して１分子の塩化マグネシウムを、「ＥＤＴＡの量に対して１．０倍の塩化マグネシウムの量」が存在している、という。
（試薬液Ａ） 以下の成分を含有する溶液
・ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母） ０．４ｍＭ
・塩化マグネシウム六水和物（和光純薬） １０ｍＭ、１５ｍＭ、１６．５ｍＭ、３０ｍＭまたは７５ｍＭ
・ＬＤＨ（東洋紡） １Ｕ／ｍＬ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）バッファー ５０ｍＭ
（試薬液Ｂ） 以下の成分を含有する溶液
・クエン酸リアーゼ（ロシュ） １Ｕ／ｍＬ
・ＭＤＨ（東洋紡） ２Ｕ／ｍＬ
・ＥＤＴＡ・３Ｎａ（同仁化学） ３０ｍＭ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）バッファー １５０ｍＭ
（試薬液Ａ） 以下の成分を含有する溶液
・ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母） ０．４ｍＭ
・塩化マグネシウム六水和物（和光純薬） １０ｍＭ、１５ｍＭ、１６．５ｍＭ、３０ｍＭまたは７５ｍＭ
・ＬＤＨ（東洋紡） １Ｕ／ｍＬ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）バッファー ５０ｍＭ
（試薬液Ｂ） 以下の成分を含有する溶液
・クエン酸リアーゼ（ロシュ） １Ｕ／ｍＬ
・ＭＤＨ（東洋紡） ２Ｕ／ｍＬ
・ＥＤＴＡ・３Ｎａ（同仁化学） ３０ｍＭ
・Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．１）バッファー １５０ｍＭ
用時調製した試薬液Ａおよび試薬液Ｂを用いて、はじめに試薬液Ａとクエン酸検体または対照検体とを混合し、５分後に試薬液Ｂを加えた。クエン酸検体または対照検体、試薬液Ａ、試薬液Ｂは、体積比が１：４０：２０となるように混合した。各検体について、試薬液Ａと検体との混合直後を０分とし、５分後に試薬液Ｂを加えることで反応を開始させた。試薬液Ａと検体との混合直後（０分）から、検体を含む溶液の吸光度を経時測定した。ＮＡＤＨに由来する吸光度は、汎用自動分析装置（日立ハイテク、日立自動分析装置７１８０）を用い、約３７℃、２ポイントエンド方式で主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定を行った。
結果を図３に示す。ＥＤＴＡに対するマグネシウム量が０．６７倍の場合には、反応速度が著しく低下した。これは、反応系中でＥＤＴＡの量の方がマグネシウムの量よりも多いことから、反応抑制効果を有するＥＤＴＡをマグネシウムが完全にはキレートできなかったためと考えられる。これに対し、ＥＤＴＡに対するマグネシウム量が１．０倍から５倍の場合には、１０分以内に反応が完了していることが分かった。この中でも、ＥＤＴＡに対して１．１倍量の場合が最も短時間で反応が完了、すなわち最も反応性が良好であった。このことから、反応系中にマグネシウムがＥＤＴＡに対してやや過剰に存在する条件が反応に最適であることが示唆された。その一方で、ＥＤＴＡに対して２．０倍量、５．０倍量のマグネシウムを用いても、反応が大きく促進される傾向は見られなかった。以上から、一方の試薬液中にＥＤＴＡ・３Ｎａを３０ｍＭ添加する場合には、他方の試薬液に塩化マグネシウムを１６．５ｍＭ添加することとした。
実施例１から３の結果から、適切なキレート剤、金属塩の種類およびその量を選択した本実施形態に係る試薬キットを用いることで、試料中のクエン酸濃度の定量を行うことができる。
一方で、キレート剤は、クエン酸リアーゼによる酵素反応を阻害し、クエン酸リアーゼを不活化する作用を有する。そこで、本発明のクエン酸定量用試薬キットには、クエン酸とクエン酸リアーゼとの反応溶液中でキレート剤がクエン酸リアーゼを不活化することを抑制するため、適切な量の金属塩を含有させている。本実施形態に係るクエン酸定量用試薬キットは、その使用前は、クエン酸リアーゼとキレート剤とを含有する試薬からは独立した試薬に金属塩を含有させておく。使用時には、まず、ＮＡＤＨと金属塩とを含む溶液を調製し、その溶液に測定対象であるクエン酸を含む試料を添加して、試料混合液を得る。この試料混合液に対し、キレート剤、クエン酸リアーゼ、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）を添加して酵素反応液を作成する。金属イオンがキレート剤に結合することで、クエン酸リアーゼの反応を阻害するキレート剤のキレート活性が不活化し、クエン酸リアーゼとクエン酸との反応が化学量論的に適切に進行する。このようにすることで、クエン酸リアーゼをより長く安定に保存できるようになるとともに、クエン酸リアーゼの酵素反応を効率よく進行させることができ、クエン酸の定量を正確に行うことができる。
Claims (11)
- 試料中のクエン酸の定量用試薬キットであって、
ＮＡＤＨと、金属塩と、を含む第１試薬と、
クエン酸リアーゼと、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）と、キレート剤と、を含む第２試薬と、
を含む、試料中のクエン酸の定量用試薬キット。 - 前記金属塩が、２価の陽イオンを生じさせる金属の塩であり、
前記第１試薬と前記第２試薬とが混合された溶液中に、前記金属塩が前記キレート剤に対して濃度比で１．０倍以上５．０倍以下の量で存在する、請求項１に記載の定量用試薬キット。 - 前記キレート剤がＥＤＴＡであり、
前記金属塩がマグネシウム塩である、請求項１に記載の定量用試薬キット。 - 前記試料が尿である、請求項１に記載の定量用試薬キット。
- 前記第１試薬が、さらに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含む、請求項１に記載の定量用試薬キット。
- 試料中のクエン酸の定量方法であって、
ＮＡＤＨと、金属塩と、を含む、第１の溶液を得る工程と、
クエン酸リアーゼと、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）と、キレート剤と、を含む第２の溶液を得る工程と、
前記第１の溶液と試料とを混合して試料混合液を得る工程と、
前記試料混合液の吸光度を測定し、前記試料混合液中のＮＡＤＨの濃度を算出する工程と、
前記試料混合液に前記第２の溶液を添加して酵素反応液を得る工程と、
前記酵素反応液の吸光度を測定して、前記酵素反応液中におけるＮＡＤＨの濃度を算出する工程と、
クエン酸の酵素反応開始前から反応終了までの間のＮＡＤＨの濃度の算出結果に基づいて、試料中のクエン酸の量を定量する工程と、
を含む、試料中のクエン酸の定量方法。 - 前記金属塩が、２価の陽イオンを生じさせる金属の塩であり、前記酵素反応液中に、前記金属塩を前記キレート剤に対して濃度比で１．０倍以上５．０倍以下の量で存在させる、請求項６に記載の定量方法。
- 前記キレート剤がＥＤＴＡであり、
前記金属塩がマグネシウム塩である、請求項６に記載の定量方法。 - 前記試料が尿である、請求項６に記載の定量方法。
- 前記第１の溶液に、さらに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含む、請求項６に記載の定量方法。
- 試料中のクエン酸の量を定量する工程においては、前記酵素反応液中のＮＡＤＨの濃度の算出を、クエン酸の反応開始前から反応終了までのＮＡＤＨに由来する吸光度の変化量を測定することにより行う、請求項６に記載の定量方法。
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