JP3674964B2 - キサンチンデヒドロゲナーゼの安定化方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、キサンチンデヒドロゲナーゼの安定化方法および無機リン等測定用組成物、ならびにアデノシンデアミナーゼ等酵素活性測定用組成物への安定化方法、ならびにキサンチンデヒドロゲナーゼ安定化組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
キサンチンデヒドロゲナーゼは、例えば 酵素番号EC 1.2.1.37にあるように、補酵素NADの存在下にヒポキサンチンをキサンチンに、キサンチンを尿酸に転換する2段階の反応を触媒する酵素である。
【0003】
【化1】
本酵素を用いれば、ヒポキサンチン、キサンチンあるいはこれらを生成する反応系により生成されたヒポキサンチン、キサンチンを、NADの存在下に還元型NADを測定することにより、試料中に存在、あるいは生成されたヒポキサンチンまたはキサンチン、あるいはこれらの基質を生成する反応系に係わる基質もしくは酵素活性を定量できる(特開昭62−32900号公報)。
【0004】
例えば、ヒポキサンチンおよび/またはキサンチンを生成する反応系に係わる基質としては、アデノシン、アデニン、イノシン、キサントシン、グアノシン、グアニン、、アデノシン一リン酸(AMP)、イノシン一リン酸(AMP)、イノシンと無機リン等が、酵素としてはアデノシンデアミナーゼ(EC 3.5.4.4)、グアニンデアミナーゼ(EC 3.5.4.3)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(EC 2.4.2.1)、5’−ヌクレオチダーゼ(EC 3.1.3.31)等が知られており、これら各成分を対象として様々な分野で測定されている。
【0005】
これらの項目のあるものは、臨床診断や、食肉や魚介類の鮮度検査として有用であり、従って、本酵素のこれらの測定試薬成分としての実用化も望まれている。例えば、食肉や魚介類の鮮度判定にアデノシン三リン酸(ATP)の分解生成物の測定が用いられており、そのための指標として魚類鮮度判定恒数(K値)が提案されている。このK値は分子をイノシンとヒポキサンチンとし、分母をATP、ADP、AMP、IMP、イノシン、ヒポキサンチンの合計量としたときの百分率で表されるものである。ヒポキサンチンは本酵素の基質であり、イノシンは下記に示すとおり、無機リンの存在下にプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(EC 2.4.2.1)の反応によりヒポキサンチンに転換するため、いずれも本酵素により定量することができる。
【0006】
【化2】
また、臨床診断としては、例えば、グアニンデアミナーゼやアデノシンデアミナーゼは肝傷害の診断、またアデノシンデアミナーゼは更に、その欠乏症で免疫的な不全を伴うことが知られている。これらの酵素は、それぞれ以下の、単独あるいは共役酵素との組み合わせでキサンチンまたはヒポキサンチンを生成することができ、本酵素を用い酵素活性を測定することができる。
(グアニンデアミナーゼの場合)
【0007】
【化3】
(アデノシンデアミナーゼの場合)
【0008】
【化4】
これら生成したヒポキサンチンやキサンチンは、一般的には入手の容易なキサンチンオキシダーゼと組み合わせて、生成された過酸化水素として測定されることが多く、その測定試薬も市販されている。しかしながら、オキシダーゼにより生成する過酸化水素の検出系は本質的に還元物質の影響を受けることから、デヒドロゲナーゼを用いた測定系が望まれている。
【0009】
例えば、キサンチンデヒドロゲナーゼを用いた無機リン測定法に関して、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと組み合わせた測定法が報告されている(臨床化学、第22巻補冊2号、p64(1993))。
上記のように、キサンチンデヒドロゲナーゼを用いた種々の物質や酵素活性の測定法が報告されているが、酵素の供給面や安定性等の面から実用化されたものはない。
【0010】
一般に、酵素を用いた分析試薬は、含まれる酵素がどれだけ安定であるかによりその使用有効期間が決まる。しかしながら、安定性の劣る酵素を使用せざるを得ない場合も多々あり、その場合は保存中の酵素活性低下を見込んで多量の酵素を使用する必要があり経済的であるといえない。そのため酵素の安定化は、試薬開発の成否に大きくかかわるものである。とりわけ、近年、検査室の合理化、省力化のために即使用可能な無調製試薬の需要が増大しており、より安定な酵素が求められている。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、キサンチンデヒドロゲナーゼの安定化方法及びヒポキサンチンまたはキサンチン、もしくはヒポキサンチンまたはキサンチンを生成する反応系に係わる酵素の活性あるいはその基質の測定のための試薬組成物における、安定化方法に関するものであり、酵素取得時の経済性や測定用試薬組成物の経済性を高めることができる。更に、本発明は、安定化されたキサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物を提供することである。
【0012】
【課題を解決するための手段】
キサンチンデヒドロゲナーゼに関して、これまでに種々の酵素活性阻害剤が報告されている。例えば、シアン化カリウム(Biochim.Biophys.Acta、410、12−20(1975)、種々のSH試薬(Biochim.Biophys.Acta、410、12−20(1975)、J.Biol.Chem.、253(8)、2604−2614(1978))、アデニン(Biochim.Biophys.Acta、410、12−20(1975)、J.Biochem.、86、45−53(1979))、キサンチン、ヒポキサンチン、プテリン(J.Biol.Chem.、253(8)、2604−2614(1978))等が挙げられる。従って、上記各種阻害物質に対し、一般的な安定化剤としてSH基の保護剤、例えばメルカプトエタノール、ジチオスレイトール等が挙げられる。
【0013】
一方、尿酸は本酵素の最終反応生成物であるため、ある起源の酵素は尿酸により生成物阻害を受けることが報告されている。例えば、ストレプトマイセス シアノゲナス(Streptomyces cyanogenus)由来の酵素は0.5mMの尿酸で酵素活性が尿酸非存在においての約63%に低下する(J.Biochem.、86、45−53(1979))。また、ニュウロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)由来の酵素は、蛍光基質として2−アミノ−4−ヒドロキシプテリジンを用い、35μMの尿酸で活性が半分になるとの報告もある(J.Biol.Chem.、253(8)、2604(1978))。
【0014】
一方、シュウドモナス・アシドボランス(Pseudomonas acidvorans)由来酵素については、尿酸による阻害は殆ど受けない(Biochim.Biophys.Acta、410、12−20(1975))ことが報告されている。更に、グラム染色+、KOH反応−、運動性+、オキシダーゼ生産能+、カタラーゼ生産能−、キノン系Q−10の生理学的特徴を有するBacteria No.197(10)株(FERM BP−3664;特開平1−13837号公報)由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ−Tについては、1mM尿酸存在下で約10%の活性阻害が認められた。
【0015】
このように、尿酸は、キサンチンデヒドロゲナーゼにとって一般的には阻害剤として働く場合が多々あった。
ところが本発明者は、意外にも、この阻害作用を有するとされていた尿酸がキサンチンデヒドロゲナーゼの安定化剤として著しい作用を示すことを見いだしたのである。
【0016】
すなわち本発明者は、キサンチンデヒドロゲナーゼを用いた測定系について鋭意研究を重ねた結果、その過程で、尿酸によりその安定性が著しく向上することを見出し、本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼの安定化方法を完成させるに至った。更に、本方法に、キレート能を有する化合物を共存させることにより一層の安定化が計れることも併せて見出した。
【0017】
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物に尿酸を添加することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの安定化方法であり、さらに0.2〜100mMのキレート能を有する化合物を添加してなる安定化方法であり、少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物において尿酸を安定化剤として含有することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの安定化組成物であり、好ましくはさらにキレート能を有する化合物を添加してなる安定化組成物である。
【0018】
さらに本発明は、ヒポキサンチンまたはキサンチン、もしくはヒポキサンチンまたはキサンチンを生成する反応系に係わる基質もしくは酵素活性の測定のための試薬組成物における、安定化方法の応用、好適にはキサンチンデヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、反応に関与する基質および補酵素を含有してなる組成である無機リン測定用試薬組成物を少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物としてなる安定化方法または安定化組成物である。
【0019】
本発明に用いることのできるキサンチンデヒドロゲナーゼは、補酵素、例えばNADまたはその誘導体、例えばニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド(デアミノNAD)、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド(アセチルNAD)、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(チオNAD)などの共存下に、ヒポキサンチンまたはキサンチンに作用し、ヒポキサンチンの場合はキサンチンを経由し、尿酸を生成するものであれば特に限定はされない。また、キサンチンデヒドロゲナーゼ活性を示せば、NADの代わりにNADPまたはその誘導体を補酵素として用いることもできる。
【0020】
本キサンチンデヒドロゲナーゼの由来としては、ラット肝、ニワトリ肝、種々の細菌等、種々報告されている。このうち例えば、哺乳類由来の酵素は、SH基の酸化により可逆的に酸素を電子受容体とするオキシダーゼ型に変換することが知られており、また鳥類ではオキシダーゼ型へは変換されないものの微弱なオキシダーゼ活性がはじめから存在する(医学のあゆみ、Vol.154,No.12,p754,1990)。
【0021】
また、微生物由来の酵素についても種々報告されており、例えばストレプトミセス属(Agr.Biol.Chem.,41、1161(1977);J.Biochem.,86、45,(1979))、ミクロコッカス属(J.Biol.Chem.,242、4108(1967))、ノイロスポラ属(J.Biol.Chem.,253、2604(1978))、シュウドモナス属(Biochim.Biophys.Acta、410、12(1975))、ノカルディオイデス属あるいはノカルディア属(特開昭61−170386号公報)、Bacteria No.197(10)(FERM BP−3664)(特開平6−113837号公報)等のものが知られている。
【0022】
これらの中で、より好適な例としては、実質的にキサンチンオキシダーゼ活性を示さないBacteria No.197(10)(FERM BP−3664)由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ−Tが挙げられる。このBacteria No.197(10)株は平成3年12月3日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【0023】
更に本発明は、尿酸を含むキサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物として、ヒポキサンチン、キサンチン、イノシンおよび無機リンからなる群より選ばれた少なくともひとつの物質を測定するための測定用試薬組成物または、アデノシンデアミナーゼ(EC 3.5.4.4)、グアニンデアミナーゼ(EC 3.5.4.3)および5'-ヌクレオチダーゼ(EC 3.1.3.31)からなる群より選ばれた少なくともひとつの酵素活性測定用試薬組成物に本発明の安定化方法を応用することである。
【0024】
これらは、いずれもヒポキサンチン、キサンチンもしくはこれらを生成する反応系に係わる成分であり、その反応系を以下に例示する。
(1)(デオキシ)イノシン、無機リンとプリンヌクレオシドホスホリラーゼの酵素反応系によって遊離、生成するヒポキサンチンを定量するためのもので、イノシンまたは無機リンの定量、またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性測定のための反応系。
(デオキシ)イノシン+無機リン→(デオキシ)リボ−ス−1−リン酸+ヒポキサンチン
【0025】
(2)グアニンとグアニンデアミナーゼの酵素反応系によって遊離、生成するキサンチンを定量するためのもので、グアニンの定量、またはグアニンデアミナーゼの活性測定のための反応系。
グアニン+H2 O→キサンチン+NH3
【0026】
(3)(デオキシ)アデノシンとアデノシンデアミナーゼの酵素反応系によって遊離、生成する(デオキシ)イノシンを(1)の反応系により更にヒポキサンチンに転換しこれを定量するためのもので、アデノシンの定量、またはアデノシンデアミナーゼの活性測定のための反応系。
アデノシン+H2 O→イノシン+NH3
【0027】
(4)AMP(IMP)と5’−ヌクレオチダーゼの酵素反応系によって遊離、生成するアデノシン(イノシン)、無機リンを、アデノシンの場合には(3)の反応系により、イノシン、無機リンの場合には(1)の反応系により更にヒポキサンチンに転換しこれを定量するためのもので、AMP(IMP)の定量、またはイノシンを定量するためのもので、イノシンまたは無機リンの定量、または5’−ヌクレオチダーゼの活性測定のための反応系。
AMP(IMP)+H2 O→アデノシン(イノシン)+無機リン
【0028】
これらの場合、測定される被検体としては生体成分である場合が多い。その例としては、生体体液、食品等が挙げられ、例えば、血漿や尿、食肉、魚介類等が挙げられる。これら被検体は、必要に応じて抽出操作を行った後、1μl〜500μl、好ましくは3μl〜100μlの適宜な量を用いればよい。
【0029】
本発明に用いられるキサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物において、安定化剤として用いる尿酸の濃度は、0.1mM〜10mM、特に0.2mM〜4mMが好ましい。また、キサンチンデヒドロゲナーゼ量は特に限定はされないが0.02u/ml〜100u/mlが特に好ましい。
【0030】
また、キレート能を有する化合物として、少なくとも1以上のカルボン酸基、スルホン酸基、亜硫酸基を有する有機化合物またはその水溶性塩類が挙げられる。さらに少なくとも1以上のカルボン酸基を有する化合物としては、例えばポリカルボン酸化合物、ヒドロキシカルボン酸化合物、アミノカルボン酸化合物、カルボニルカルボン酸化合物またはモノカルボン酸化合物が挙げられる。
【0031】
このような例えばモノカルボン酸、スルホン酸、亜硫酸の各化合物や、ヒドロキシル基やアミノ基、カルボニル基を有するカルボン酸、スルホン酸、亜硫酸の各化合物、2以上のカルボン酸基、スルホン酸基を有するポリアシド化合物やさらにヒドロキシル基、アミノ基、カルボニル基の複数種を有する化合物は、例えばカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンに対するキレート能を測定することにより容易に本発明のキレート能を有する化合物として確認し得る。
【0032】
さらにこれらのキレート能を有する各種化合物の群に関して例示すれば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、グルタコン酸、アジピン酸、フマル酸、アコニット酸、ピメリン酸、o−、m−、p−スルホ安息香酸、1,3−ジアミノプロパン四酢酸(DPTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、エチレンジアミン二酢酸(EDDA)、エチレンジアミン二プロピオン酸(EDDP)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(EDTA−OH)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(GEDTA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、トランスジアミノシクロヘキサン四酢酸(CyDTA)、ジアミノプロパン四酢酸(Methyl−EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、エチレンジアミンジオルトヒドロキシフェニル酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸(TTHA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、ニトリロ三プロピオン酸(NTP)、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)などのポリカルボン酸化合物、乳酸、クエン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、グリセリン酸、酒石酸、オキシ酢酸、ホスホエノールピルビン酸、2−ホスホグリセリン酸、グルクロン酸、マンデル酸、サリチル酸、2,5−ジヒドロキシ安息香酸、2,6−ジヒドロキシ安息香酸、等のヒドロキシカルボン酸化合物や、グリオキシル酸、アセト酢酸、オキザロ酢酸、アセトピルビン酸、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸、α−ケト吉草酸、フェニルピルビン酸等のカルボニルカルボン酸化合物、酪酸、イソ吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、N−シクロヘキシル−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS)、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)、2−ヒドロキシ−3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸(HEPPSO)、2−モルフォリノエタンスルホン酸(MES)、3−モルフォリノプロパンエタンスルホン酸(MOPS)、2−ヒドロキシ−3−モルフォリノプロパンエタンスルホン酸(MOPSO)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、ピペラジン−1,4−ビス(2−ヒドロキシ−3−プロパンスルホン酸)(POPSO)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、2−ヒドロキシ−N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、亜硫酸ナトリウム等のモノカルボン酸化合物、グリシン、アラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、シスチン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、セリン、バリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、リジン等アミノ酸類であるアミノカルボン酸化合物が挙げられる。
【0033】
これらの中で特に好適な例としてエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(GEDTA)、グルタミン酸が挙げられる。これらは、通常、0.2mM〜100mM、特に0.4mM〜50mM添加するのが好ましく、単独もしくは組み合わせても用いることができる。更にナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩やアンモニウム塩などの水溶性塩類として用いることもできる。
【0034】
前述したように、このようなキレート能を有する化合物の併用により尿酸添加の効果が高められる。更に、媒体として、例えばトリス緩衝液、PIPESやHEPES、ADA等のグッドの緩衝液などを10mM〜400mM、特に好ましくは20mM〜200mMの濃度でpH5.5〜11.5に適宜調整して使用すればよい。さらに、防腐剤等も必要に応じ使用することができる。
【0035】
また本発明組成物が、無機リン定量用組成物である場合には、上記濃度範囲のキサンチンデヒドロゲナーゼ、尿酸以外に、更にプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPL)、例えばバチルス属由来の酵素を、0.02u/ml〜100u/ml、特に好ましくは0.1u/ml〜20u/ml、また基質として例えばイノシンを0.25mM〜40mM、特に好ましくは1mM〜10mM、補酵素としてNADまたはその誘導体を、0.1mM〜50mM、特に好ましくは0.5mM〜10mM添加すればよい。
【0036】
この無機リン測定用試薬組成物においては、その構成形態として、(1)第1群組成がキサンチンデヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、第2群組成が反応に関与する基質、補酵素を含有し、第1群組成に尿酸および必要に応じてキレート能を有する化合物を添加する場合、また(2)第1群組成がキサンチンデヒドロゲナーゼ、補酵素を含有し、第2群組成が反応に関与する基質、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、第1群組成に尿酸および必要に応じてキレート能を有する化合物を添加する場合、更に(3)第1群組成がキサンチンデヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよび補酵素を含有し、第2群組成が反応に関与する基質を含有し、第1群組成に尿酸および必要に応じてキレート能を有する化合物を添加する場合、のように2つの群に分けた組成物とすることもできる。
【0037】
これらの組成物を用いて、例えば無機リンを測定する場合、無機リン測定用被検体と各組成からなる測定用試薬組成物とを、例えば30〜37℃にて混合し、必要に応じて予備加温を行った後反応を開始せしめ、反応開始後、一般的には1分間以上、好適には2分間以上であって、一般的に10分間以内、好適には5分間程度反応せしめ、還元型補酵素の増加量を測定することによりなされる。
【0038】
例えば、補酵素としてNADを用いた場合には還元型NADの増加量を吸光波長340nm付近による吸光度の増加として測定できる。またこの還元型NADの測定に当たっては、例えばニトロテトラゾリウムブルーや2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−フェニル−2Hテトラゾリウムクロライドなどの水素受容体の存在下ジアホラーゼの酵素作用によりホルマザン色素として可視部吸光度の測定によっても定量でき、さらに蛍光試薬や発光試薬を用いて行ってよい。さらに、上記のエンド・ポイントでの測定の代わりに、反応時間中の一定時間での還元型補酵素の増加速度を求めて測定することもできる。
【0039】
また本発明組成物が、ヒポキサンチンまたは/およびキサンチンの定量用組成物である場合には、上記濃度範囲のキサンチンデヒドロゲナーゼ、尿酸以外に、更に、補酵素としてNADまたはその誘導体を、0.1mM〜50mM、特に好ましくは0.5mM〜10mM添加すればよい。
【0040】
また本発明組成物が、イノシン定量用組成物である場合には、上記濃度範囲のキサンチンデヒドロゲナーゼ、尿酸以外に、更に無機リンとして例えばリン酸二カリウムを0.5mM〜100mM、特に好ましくは2mM〜40mM、PNPLを0.02u/ml〜100u/ml、特に好ましくは0.1u/ml〜20u/ml添加すればよい。
【0041】
また本発明組成物が、アデノシンデアミナーゼ活性測定用組成物である場合には、本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物の成分として、上記濃度範囲のキサンチンデヒドロゲナーゼ、尿酸以外に、更にアデノシンを0.2mM〜20mM、特に好ましくは0.5mM〜8mM添加し、上記イノシン定量用組成物と組み合わせて用いれば良い。また、グアニンデアミナーゼ活性測定用組成物の場合は、同様にグアニンを0.1mM〜10mM、特に好ましくは0.2mM〜5mM添加すればよい。
【0042】
更に、5’−ヌクレオチダーゼ活性測定用組成物についても、適宜、基質等を選択し添加すればよいが、例えば、基質として、AMPを用いた場合には、1mM〜100mM、特に好ましくは2.5mM〜40mM添加し、上記無機リン測定用組成物と組み合わせて用いればよい。これらキサンチンデヒドロゲナーゼ組成物を用いて酵素活性を測定する場合には、反応試薬は一つまたは二つ以上に分け、二つ以上に分けた場合はそれら各成分を適宜組み合わせることもできる。
【0043】
このようにして得られた本発明方法のキサンチンデヒドロゲナーゼ含有安定化組成物は、前記に記載した各々の組成物として それぞれの目的に応じて各々単独で、叉は適当に組み合わせて配合して使用することができる。
また、これらキサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物の形態としては、溶液状はもとより凍結して保存することもできる。更に、凍結乾燥操作により粉末化して使用時に水または緩衝液を加え溶解することもできる。叉、これらの形態を適宜組み合わせて用いることもできる。
【0044】
【実施例】
ついで本発明を実施例にて説明するが、本発明はなんらこれらによって限定されるものでない。
尚、キサンチンデヒドロゲナーゼの活性測定は、100mMトリス塩酸緩衝液(pH9.0)、2mMキサンチン、2mMのNADからなる組成の反応液を用い、37度でのキサンチンの酸化に伴う還元型NADの340nmにおける吸光度の変化率を経時的に、一例として反応開始後1〜3分目の間測定することにより行い、以下に示す計算式のとおり、1分間当たり、1μmolキサンチンの減少量を1単位とした。
【0045】
【数1】
6.22:分子吸光係数(cm2 /μmol)
TV :反応液全量(ml)
SV :添加した酵素量(ml)
【0046】
実施例1
40mM Tris−HCl(pH8.0)にキサンチンデヒドロゲナーゼ−T(Bacteria No.197(10)株(FERM BP−3664)を用いて特開平6−113837号公報の実施例1および2の記載に基づいて製造した)を0.5u/mlになるように調製した。このものに、(1)何も添加しないもの、(2)2mMになるように尿酸を添加したもの、(3)(2)に更に5mMのGEDTA(調製法;(株)同仁化学研究所製GEDTAの3.8gを秤量して水に溶解し、pHを5Nの水酸化ナトリウム水溶液にて7.5に調整し、100mlにメス・アップ(0.1M)したものを使用した)を添加したもの、上記3種類のキサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物(防腐剤として4mMNaN3 を添加)を、37℃に保ち、0〜8日間までキサンチンデヒドロゲナーゼの残存活性の経時変化を追跡測定した。その結果を、調製直後の残存活性を100%とした相対値で表1に示した。
【0047】
【表1】
表1に示す通り、尿酸の添加により、保存安定性の向上が認められている。また、尿酸の存在下に更にGEDTAを添加したものはより安定性に優れ、キレート剤添加の併用効果が示された。
【0048】
実施例2
キレート能を有する化合物の併用効果を調べる目的で、1mM尿酸を添加した0.5u/mlの各種キサンチンデヒドロゲナーゼ−T溶液(防腐剤として4mMNaN3 を添加)を調製し、37℃に保ち1週間後の残存活性を測定し、調製時の活性に対する百分率で表2に示した。
【0049】
【表2】
表2に示す通り、キレート能を有する化合物としてジカルボン酸塩やスルホン酸塩の添加により安定性の向上が認められた。
【0050】
実施例3
40mM Tris−HCl(pH8.0)にキサンチンデヒドロゲナーゼ−Tを0.5u/mlになるように調製した。このものに、(1)何も添加しないもの、(2)5mMになるようにEDTA・2Naを添加したもの、(3)5mMのEDTA・2Naと1mM尿酸を添加したもの、の上記3種類のキサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物(防腐剤として4mMNaN3 を添加)を、25℃に保ち、0〜27日間までキサンチンデヒドロゲナーゼの残存活性の経時変化を追った。その結果を、調製直後の残存活性を100%とした相対値で表3に示した。
【0051】
【表3】
表3に示す通り、キレート能を有する化合物の存在下に、尿酸を添加しないものは27日目に残存活性が、それぞれ6%、55%と低下しているのに対し、尿酸を添加したものについては全く活性の低下が認められなかった。
【0052】
実施例4
40mMのMES−NaOH(pH6.5)又は40mM Tris−HCl(pH8.0)にそれぞれ5mM、0.4u/mlになるようにGEDTAとキサンチンデヒドロゲナーゼ−Tを添加した。緩衝液の異なるキサンチンデヒドロゲナーゼ組成物に対し、尿酸を0.05mM〜6mMになるように添加し、55℃、30分間熱処理し、その残存活性を求めた。その結果を、熱処理をしないものの残存活性を100%とした相対値にて表4に示した。
【表4】
表4に示す通り、尿酸濃度の増加に従い、残存活性の上昇が認められた。
【0053】
実施例5
(無機リンの定量)
(実験に供したプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)IFO13494をJ.Biol.Chem.,246(5),1475−1480(1971)に記載されている方法で培養、精製を行い取得したものを使用した。)
【0054】
<試薬1>
100mM Tris−HCl(pH9.0)
5mM GEDTA
1u/ml キサンチンデヒドロゲナーゼ−T
0.33u/ml プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
1mM 尿酸
4mM NaN3
【0055】
<試薬2>
40mM ADA緩衝液(pH6.0)
12mM イノシン
20mM NAD
4mM NaN3
【0056】
尿酸を含有した上記試薬1、0.9mlに対して、サンプルとして、2、4、6、8、10mMに調製したリン酸水素二カリウム溶液を各々12μl添加し37℃にて5分間加温し、340nmにおける吸光度を読みとった(Abs1)。その後、試薬2を0.3ml加えて37℃にて更に5分間加温し、340nmの吸光度を読みとった(Abs2)。
【0057】
各々のサンプルについて、Abs2とAbs1の差を計算し、更にサンプルの代わりに蒸留水を用いたときの計算値を試薬ブランクとして、各々の計算値から試薬ブランク値を差し引いた。比較対照として、試薬1から尿酸を除いたものを使用して同様の操作を行った。試薬1、試薬2ともに37℃に保存し、3日目と、7日目についても同じサンプルを用いて測定操作を行い、その結果を表5に示した。
【0058】
【表5】
表5から明らかなように、比較対照の試薬がすでに3日の保存で劣化が認められるのに対し、本発明組成物を用いた試薬は、7日の保存でも測定値の変動が認められない。
【0059】
実施例6
以下に示す組成の無機リン測定用試薬組成物を調製した。
<試薬1>
100mM Tris−HCl(pH7.5)
2mM EDTA・2Na
6mM NAD
1u/ml キサンチンデヒドロゲナーゼ−T
2mM 尿酸
4mM NaN3
<試薬2>
100mM グリシン−NaOH緩衝液(pH9.0)
16mM イノシン
1u/ml プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
4mM NaN3
【0060】
実施例7
以下に示す組成の無機リン測定用試薬組成物を調製した。
<試薬1>
40mM Tris−HCl(pH7.1)
5mM EDTA・2Na
6mM NAD
1u/ml キサンチンデヒドロゲナーゼ−T
0.5u/ml プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
1.5mM 尿酸
4mM NaN3
〈試薬2〉
100mM グリシン−NaOH緩衝液(pH9.0)
12mM イノシン
4mM NaN3
【0061】
実施例8
以下に示す組成のアデノシンデアミナーゼ活性測定用試薬組成物を調製した。
100mM Tris−HCl(pH8.5)
6mM アデノシン
2mM EDTA・2Na
2.5u/ml キサンチンデヒドロゲナーゼ−T
1.5u/ml プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
4mM NAD
10mM リン酸水素二カリウム
0.5mM 尿酸
4mM NaN3
【0062】
【発明の効果】
キサンチンデヒドロゲナーゼ含有組成物において尿酸を添加することにより、キサンチンデヒドロゲナーゼを安定化させることができ、従ってヒポキサンチン、キサンチン、またはこれらを生成する反応系に係わる基質もしくは酵素活性の測定のためのより安定で経済的な試薬を提供することができる。
Claims (17)
- 少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物に尿酸を0.1mM〜10mMの濃度範囲で添加することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの安定化方法。
- 少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物において、0.2〜100mMのキレート能を有する化合物を添加してなる組成物である請求項1記載の安定化方法。
- キレート能を有する化合物が、少なくとも1以上のカルボン酸基、スルホン酸基、亜硫酸基を有する有機化合物またはその水溶性塩類である請求項2記載の安定化方法。
- 1以上のカルボン酸基を有する化合物が、ポリカルボン酸化合物、ヒドロキシカルボン酸化合物、アミノカルボン酸化合物、カルボニルカルボン酸化合物またはモノカルボン酸化合物である請求項3記載の安定化方法。
- 少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物が、ヒポキサンチン、キサンチン、イノシン、無機リンからなる群より選ばれた少なくともひとつの物質を測定するための測定用試薬組成物である請求項1記載の安定化方法。
- 少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物が、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ、5’−ヌクレオチダーゼからなる群より選ばれた少なくともひとつの酵素活性測定用試薬組成物である請求項1記載の安定化方法。
- 無機リン測定用試薬組成物が、キサンチンデヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、反応に関与する基質および補酵素を含有してなる組成物である請求項5記載の安定化方法。
- 無機リン測定用試薬組成物において、第1群組成がキサンチンデヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、第2群組成が反応に関与する基質、補酵素を含有し、第1群組成に尿酸および必要に応じてキレート能を有する化合物を添加してなる請求項7記載の安定化方法。
- 無機リン測定用試薬組成物において、第1群組成がキサンチンデヒドロゲナーゼ、補酵素を含有し、第2群組成が反応に関与する基質、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、第1群組成に尿酸および必要に応じてキレート能を有する化合物を添加してなる請求項7記載の安定化方法。
- 無機リン測定用試薬組成物において、第1群組成がキサンチンデヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよび補酵素を含有し、第2群組成が反応に関与する基質を含有し、第1群組成に尿酸および必要に応じてキレート能を有する化合物を添加してなる請求項7記載の安定化方法。
- 反応に関与する基質が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質であり、かつキサンチンまたはヒポキサンチンを形成する化合物である請求項7記載の安定化方法。
- キサンチンまたはヒポキサンチンを形成する化合物が、イノシン、デオキシイノシン、キサントシンからなる群より選ばれたものである請求項11記載の安定化方法。
- 補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)またはその誘導体である請求項7記載の安定化方法。
- NAD誘導体が、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド(デアミノNAD)、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド(アセチルNAD)、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(チオNAD)からなる群より選ばれたものである請求項13記載の安定化方法。
- キサンチンデヒドロゲナーゼが、Bacteria No.197(10)株(FERM BP−3664)由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ−T酵素である請求項1記載の安定化方法。
- 少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物において尿酸を安定化剤として0.1mM〜10mMの濃度範囲で含有することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの安定化組成物。
- 少なくともキサンチンデヒドロゲナーゼを含有する組成物において、キレート能を有する化合物を添加することを特徴とする請求項16記載の安定化組成物。
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