JPH0751094A - アンモニアの消去方法およびそのための試薬 - Google Patents
アンモニアの消去方法およびそのための試薬Info
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- JPH0751094A JPH0751094A JP19959693A JP19959693A JPH0751094A JP H0751094 A JPH0751094 A JP H0751094A JP 19959693 A JP19959693 A JP 19959693A JP 19959693 A JP19959693 A JP 19959693A JP H0751094 A JPH0751094 A JP H0751094A
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- activated metal
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- ammonia
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 グルタミンシンセターゼを使用してアンモニ
アを消去する反応を完全に停止してから、目的の生体成
分の測定を行うことにより、定量性、正確性に優れた簡
便で廉価なアンモニア消去法およびそのための試薬を提
供する。 【構成】 グルタミンシンセターゼ、Ｌ−グルタミン
酸、ＡＴＰおよび活性化金属を特定量のＥＤＴＡ塩の共
存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因
性アンモニアを消去し、次いでＥＤＴＡ塩をさらに多量
に加えてグルタミンシンセターゼの反応を停止する。
アを消去する反応を完全に停止してから、目的の生体成
分の測定を行うことにより、定量性、正確性に優れた簡
便で廉価なアンモニア消去法およびそのための試薬を提
供する。 【構成】 グルタミンシンセターゼ、Ｌ−グルタミン
酸、ＡＴＰおよび活性化金属を特定量のＥＤＴＡ塩の共
存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因
性アンモニアを消去し、次いでＥＤＴＡ塩をさらに多量
に加えてグルタミンシンセターゼの反応を停止する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料中の尿素窒素、クレ
アチニン等の生体成分から尿素反応によりアンモニアを
生成し、このアンモニアを測定することにより、尿素窒
素、クレアチニン等の生体成分を測定する系において、
測定時に正誤差を与える内因性アンモニアまたは外因性
アンモニアを消去する方法およびそのための試薬に関す
る。
アチニン等の生体成分から尿素反応によりアンモニアを
生成し、このアンモニアを測定することにより、尿素窒
素、クレアチニン等の生体成分を測定する系において、
測定時に正誤差を与える内因性アンモニアまたは外因性
アンモニアを消去する方法およびそのための試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来、アンモニアを生成する反応系を利
用して生体成分を測定する系において、アンモニアの影
響を回避する手段として、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼとイソクエン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせてアン
モニアを消去する方法が知られている（臨床検査−機器
・試薬−第１４巻、第１８３〜１８８頁、１９９１
年）。しかし、この方法はイソクエン酸デヒドロゲナー
ゼの基質であるイソクエン酸が高価であるとの欠点を有
する。また上記酵素に代えて、グルタミンシンセターゼ
を使用するアンモニアを消去する方法が知られている
（特開平１−１８７０９６号公報）。この方法は試料中
の内因性のアンモニアに予め活性化金属、例えばマグネ
シウムイオンの存在下でグルタミンシンセターゼを作用
させて消去し、次いで活性化金属との結合性の強い結合
剤、例えばＥＤＴＡ塩などを加えてグルタミンシンセタ
ーゼの反応を止めた後、目的の生体成分を測定する方法
であり、アンモニアの消去系では下記式１の反応が進行
する。
用して生体成分を測定する系において、アンモニアの影
響を回避する手段として、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼとイソクエン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせてアン
モニアを消去する方法が知られている（臨床検査−機器
・試薬−第１４巻、第１８３〜１８８頁、１９９１
年）。しかし、この方法はイソクエン酸デヒドロゲナー
ゼの基質であるイソクエン酸が高価であるとの欠点を有
する。また上記酵素に代えて、グルタミンシンセターゼ
を使用するアンモニアを消去する方法が知られている
（特開平１−１８７０９６号公報）。この方法は試料中
の内因性のアンモニアに予め活性化金属、例えばマグネ
シウムイオンの存在下でグルタミンシンセターゼを作用
させて消去し、次いで活性化金属との結合性の強い結合
剤、例えばＥＤＴＡ塩などを加えてグルタミンシンセタ
ーゼの反応を止めた後、目的の生体成分を測定する方法
であり、アンモニアの消去系では下記式１の反応が進行
する。
【０００３】
【数１】
【０００４】上記方法では目的成分を測定する第二試薬
へＥＤＴＡ塩を添加して、第一試薬中のグルタミンシン
セターゼの反応を停止しようとする。すなわち尿素窒素
を測定するには、グルタミン酸、ＡＤＰ、α−ケトグル
タル酸、マグネシウムイオン、グルタミンシンセターゼ
およびＮＡＤＨを含む第一試薬を試料に添加してから、
ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ウ
レアーゼ、α−ケトグルタル酸およびＥＤＴＡ・２Ｎａ
を含む第二試薬を添加し、吸光度の減少を測定してい
る。しかしながら第二試薬にＥＤＴＡ塩を添加しても、
上記反応は完全に停止せずに、目的の生体成分の測定に
おいて負誤差を与えるという欠点が見出された。
へＥＤＴＡ塩を添加して、第一試薬中のグルタミンシン
セターゼの反応を停止しようとする。すなわち尿素窒素
を測定するには、グルタミン酸、ＡＤＰ、α−ケトグル
タル酸、マグネシウムイオン、グルタミンシンセターゼ
およびＮＡＤＨを含む第一試薬を試料に添加してから、
ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ウ
レアーゼ、α−ケトグルタル酸およびＥＤＴＡ・２Ｎａ
を含む第二試薬を添加し、吸光度の減少を測定してい
る。しかしながら第二試薬にＥＤＴＡ塩を添加しても、
上記反応は完全に停止せずに、目的の生体成分の測定に
おいて負誤差を与えるという欠点が見出された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はグルタ
ミンシンセターゼを使用してアンモニアを消去する反応
を完全に停止してから、目的の生体成分の測定を行うこ
とにより、定量性、正確性に優れた簡便で廉価なアンモ
ニア消去法およびそのための試薬を提供することにあ
る。
ミンシンセターゼを使用してアンモニアを消去する反応
を完全に停止してから、目的の生体成分の測定を行うこ
とにより、定量性、正確性に優れた簡便で廉価なアンモ
ニア消去法およびそのための試薬を提供することにあ
る。
【０００６】本発明者らは上記目的を達成するために鋭
意検討したところ、活性化金属との結合性の強い結合剤
を第一試薬において特定量使用して、試料中のアンモニ
アを消去した後、さらに該結合剤を添加してグルタミン
シンセターゼの反応を停止し、目的の生体成分を測定す
ることにより、上記目的が達成されることを見出した。
意検討したところ、活性化金属との結合性の強い結合剤
を第一試薬において特定量使用して、試料中のアンモニ
アを消去した後、さらに該結合剤を添加してグルタミン
シンセターゼの反応を停止し、目的の生体成分を測定す
ることにより、上記目的が達成されることを見出した。
【０００７】すなわち本発明は（ａ）グルタミンシンセ
ターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび
（ｄ）活性化金属を、（ｅ）活性化金属との結合性の強
い結合剤１〜１０ｍＭの共存下に試料に作用させて、内
因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次い
で該結合剤をさらに１〜１００ｍＭ添加して、グルタミ
ンシンセターゼ反応を停止することを特徴とするアンモ
ニアの消去法である。
ターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび
（ｄ）活性化金属を、（ｅ）活性化金属との結合性の強
い結合剤１〜１０ｍＭの共存下に試料に作用させて、内
因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次い
で該結合剤をさらに１〜１００ｍＭ添加して、グルタミ
ンシンセターゼ反応を停止することを特徴とするアンモ
ニアの消去法である。
【０００８】または本発明は（ａ）グルタミンシンセタ
ーゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび
（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ
塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）ウレ
アーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）
α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび
（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含有する第二試薬
を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴と
する試料中の尿素窒素の測定法である。
ーゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび
（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ
塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）ウレ
アーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）
α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび
（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含有する第二試薬
を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴と
する試料中の尿素窒素の測定法である。
【０００９】さらに本発明は（ａ）グルタミンシンセタ
ーゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）
活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含
む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）クレアチニ
ンデイミナーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
および（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試
薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴
とする試料中のクレアチニンの測定法である。
ーゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）
活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含
む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）クレアチニ
ンデイミナーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
および（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試
薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴
とする試料中のクレアチニンの測定法である。
【００１０】本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、
（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化
金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一
試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）グアニン、（ｇ）
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタ
ル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍ
ＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光
度変化を測定することを特徴とする試料中のグアナーゼ
の測定法である。
（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化
金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一
試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）グアニン、（ｇ）
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタ
ル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍ
ＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光
度変化を測定することを特徴とする試料中のグアナーゼ
の測定法である。
【００１１】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第
二試薬からなる尿素窒素測定用試薬である。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）ウレアーゼ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤
二試薬からなる尿素窒素測定用試薬である。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）ウレアーゼ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤
【００１２】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第
二試薬からなるクレアチニン測定用試薬である。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）クレアチニンデイミナーゼ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤
二試薬からなるクレアチニン測定用試薬である。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）クレアチニンデイミナーゼ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤
【００１３】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第
二試薬からなるグアナーゼ測定用試薬である。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）グアニン （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤
二試薬からなるグアナーゼ測定用試薬である。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）グアニン （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤
【００１４】本発明に使用されるグルタミンシンセター
ゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．１２）は、Ｌ−グルタミン酸およ
びアンモニアにＡＴＰの存在下に作用して、Ｌ−グルタ
ミン、ＡＤＰおよび無機リン酸を生成する反応を触媒す
る。このような酵素の起源は特に限定されるものではな
く、例えば各種高等動物の脳や肝臓、豆の種子、大腸菌
その他の微生物から得られ、好適にはバチルス属、ミク
ロコッカス属およびブレビバクテリウム属由来のものが
挙げられる。
ゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．１２）は、Ｌ−グルタミン酸およ
びアンモニアにＡＴＰの存在下に作用して、Ｌ−グルタ
ミン、ＡＤＰおよび無機リン酸を生成する反応を触媒す
る。このような酵素の起源は特に限定されるものではな
く、例えば各種高等動物の脳や肝臓、豆の種子、大腸菌
その他の微生物から得られ、好適にはバチルス属、ミク
ロコッカス属およびブレビバクテリウム属由来のものが
挙げられる。
【００１５】本発明に使用される活性化金属としては、
２価金属イオン、例えばマグネシウムイオン、マンガン
イオン、コバルトイオン等が好適に用いられる。これら
のイオンは通常、塩化物、炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩の形
で用いられる。具体的にはＭｇＣｌ2 , ＭｎＣｌ2 ，Ｃ
ｏＣｌ2 ，ＭｇＣＯ3 ，ＭｎＣＯ3 ，ＣｏＣＯ3 ，Ｍｇ
ＳＯ4 ，ＭｎＳＯ4 ，ＣｏＳＯ4 等が挙げられる。
２価金属イオン、例えばマグネシウムイオン、マンガン
イオン、コバルトイオン等が好適に用いられる。これら
のイオンは通常、塩化物、炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩の形
で用いられる。具体的にはＭｇＣｌ2 , ＭｎＣｌ2 ，Ｃ
ｏＣｌ2 ，ＭｇＣＯ3 ，ＭｎＣＯ3 ，ＣｏＣＯ3 ，Ｍｇ
ＳＯ4 ，ＭｎＳＯ4 ，ＣｏＳＯ4 等が挙げられる。
【００１６】本発明に使用される活性化金属との結合性
の強い結合剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（Ｅ
ＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸塩（ＮＴＡ）、エチレンジア
ミン二酢酸塩（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピ
オン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレン
ジアミン三酢酸塩（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパ
ン四酢酸塩（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、グリコールエ
ーテルジアミン四酢酸塩（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエ
チルイミノ四酢酸塩（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤ
Ａ）、ニトリロ二酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ）、ニト
リロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグ
リシン（ＤＨＥＧ）、トランス−シクロヘキサンジアミ
ン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）等及びそれらの塩類を含むキレ
ート剤、またはピロリン酸及びその塩類が挙げられる。
の強い結合剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（Ｅ
ＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸塩（ＮＴＡ）、エチレンジア
ミン二酢酸塩（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピ
オン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレン
ジアミン三酢酸塩（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパ
ン四酢酸塩（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、グリコールエ
ーテルジアミン四酢酸塩（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエ
チルイミノ四酢酸塩（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤ
Ａ）、ニトリロ二酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ）、ニト
リロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグ
リシン（ＤＨＥＧ）、トランス−シクロヘキサンジアミ
ン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）等及びそれらの塩類を含むキレ
ート剤、またはピロリン酸及びその塩類が挙げられる。
【００１７】本発明のアンモニアを消去する試薬および
目的成分を測定する第一試薬および第二試薬のｐＨは、
各種緩衝液によりｐＨ５〜１１に保たれているのが好ま
しい。好ましい緩衝液としては、例えばトリエタノール
アミン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液等が挙げら
れる。
目的成分を測定する第一試薬および第二試薬のｐＨは、
各種緩衝液によりｐＨ５〜１１に保たれているのが好ま
しい。好ましい緩衝液としては、例えばトリエタノール
アミン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液等が挙げら
れる。
【００１８】本発明の上記試薬は必要により、界面活性
剤、防腐剤、安定化剤等を加えてもよい。界面活性剤と
しては、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。防
腐剤としては、ＮａＮ3 、抗生物質が好適に用いられ
る。
剤、防腐剤、安定化剤等を加えてもよい。界面活性剤と
しては、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。防
腐剤としては、ＮａＮ3 、抗生物質が好適に用いられ
る。
【００１９】試薬の形状としては、液状試薬であって
も、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせ
てもよい。
も、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせ
てもよい。
【００２０】本発明では目的成分を測定する第一試薬に
活性化金属との結合性の強い結合剤を１〜１０ｍＭ含有
させる必要がある。第一試薬に該結合剤が１ｍＭ未満含
有すると、前記〔式１〕の反応が完全に停止せず、測定
値に負誤差を生ずる。さらに１０ｍＭを越えて含有する
と、アンモニアの消去が充分に行われない。本発明では
第二試薬に上記結合剤を１〜１００ｍＭ含有させて、グ
ルタミンシンセターゼの反応を停止する。グルタミンシ
ンセターゼの反応を停止するために、さらにグルタミン
シンセターゼ反応阻害剤、例えばＡＤＰなどを添加して
もよい。
活性化金属との結合性の強い結合剤を１〜１０ｍＭ含有
させる必要がある。第一試薬に該結合剤が１ｍＭ未満含
有すると、前記〔式１〕の反応が完全に停止せず、測定
値に負誤差を生ずる。さらに１０ｍＭを越えて含有する
と、アンモニアの消去が充分に行われない。本発明では
第二試薬に上記結合剤を１〜１００ｍＭ含有させて、グ
ルタミンシンセターゼの反応を停止する。グルタミンシ
ンセターゼの反応を停止するために、さらにグルタミン
シンセターゼ反応阻害剤、例えばＡＤＰなどを添加して
もよい。
【００２１】本発明に使用されるグルタミンシンセター
ゼの濃度はアンモニアの消去に適した濃度であれば、特
に限定されないが、好適には２〜１００Ｕ／ｍｌの範囲
で用いられる。Ｌ−グルタミン酸、ＡＴＰの使用濃度と
しては、アンモニアの消去に適した濃度であれば、特に
限定されないが、Ｌ−グルタミン酸は１〜１００ｍＭ、
ＡＴＰは５〜５０ｍＭの範囲で好適に用いられる。また
活性化金属もアンモニアの消去に適した濃度であれば、
特に限定はされないが、好適には５〜５０ｍＭの範囲で
用いられる。
ゼの濃度はアンモニアの消去に適した濃度であれば、特
に限定されないが、好適には２〜１００Ｕ／ｍｌの範囲
で用いられる。Ｌ−グルタミン酸、ＡＴＰの使用濃度と
しては、アンモニアの消去に適した濃度であれば、特に
限定されないが、Ｌ−グルタミン酸は１〜１００ｍＭ、
ＡＴＰは５〜５０ｍＭの範囲で好適に用いられる。また
活性化金属もアンモニアの消去に適した濃度であれば、
特に限定はされないが、好適には５〜５０ｍＭの範囲で
用いられる。
【００２２】本発明に使用されるウレアーゼは、尿素と
水に作用してアンモニアと二酸化炭素を生成する反応を
触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるもの
ではなく、例えば細菌、酵母、カビ、植物、下等動物な
どから広く得られる。好適にはナタマメ由来のものが挙
げられる。その濃度は特に制限されないが、尿素窒素測
定用試薬中、好適には０．５〜５０Ｕ／ｍｌである。グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼは、α−ケトグルタル酸に
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に作用して、Ｌ−グルタミン酸
と水をはＮＡＤ（Ｐ）+ を生成する反応を触媒する。こ
のような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例
えば細菌、酵母、カビなどから得られる。好適には牛肝
由来のものが挙げられる。その濃度は特に限定されない
が、好適には０．１〜１０Ｕ／ｍｌである。
水に作用してアンモニアと二酸化炭素を生成する反応を
触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるもの
ではなく、例えば細菌、酵母、カビ、植物、下等動物な
どから広く得られる。好適にはナタマメ由来のものが挙
げられる。その濃度は特に制限されないが、尿素窒素測
定用試薬中、好適には０．５〜５０Ｕ／ｍｌである。グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼは、α−ケトグルタル酸に
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に作用して、Ｌ−グルタミン酸
と水をはＮＡＤ（Ｐ）+ を生成する反応を触媒する。こ
のような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例
えば細菌、酵母、カビなどから得られる。好適には牛肝
由来のものが挙げられる。その濃度は特に限定されない
が、好適には０．１〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００２３】本発明に使用されるクレアチニンデイミナ
ーゼとは、クレアチンと水に作用してＮ−メチルヒダン
トインとアンモニアを生成する反応を触媒する。このよ
うな酵素の起源は特に限定されるものではなく、種々の
微生物、例えばクロストリジウム(Clostridium) 属、コ
リネバクテリウム(Corynebacterium) 属などから得られ
る。その濃度は特に制限されないが、クレアチニン測定
試薬中、好適には０．２〜２０Ｕ／ｍｌである。
ーゼとは、クレアチンと水に作用してＮ−メチルヒダン
トインとアンモニアを生成する反応を触媒する。このよ
うな酵素の起源は特に限定されるものではなく、種々の
微生物、例えばクロストリジウム(Clostridium) 属、コ
リネバクテリウム(Corynebacterium) 属などから得られ
る。その濃度は特に制限されないが、クレアチニン測定
試薬中、好適には０．２〜２０Ｕ／ｍｌである。
【００２４】本発明に使用れるグアニンとはグアナーゼ
の存在下に水と反応してキサンチンとアンモニアを生成
する。その濃度は特に制限されないが、グアナーゼ測定
試薬中、好適には５〜５００ｍＭである。
の存在下に水と反応してキサンチンとアンモニアを生成
する。その濃度は特に制限されないが、グアナーゼ測定
試薬中、好適には５〜５００ｍＭである。
【００２５】本発明の尿素窒素測定用試薬の一例として
は、下記組成を含むものがある。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％ 第二試薬： （ｆ）ウレアーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
は、下記組成を含むものがある。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％ 第二試薬： （ｆ）ウレアーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２６】本発明のクレアチニン測定用試薬の一例と
しては、下記組成を含むものがある。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％ 第二試薬： （ｆ）クレアチニンデイミナーゼ ０．２〜２０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
しては、下記組成を含むものがある。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％ 第二試薬： （ｆ）クレアチニンデイミナーゼ ０．２〜２０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２７】本発明のグアナーゼ測定用試薬の一例とし
ては、下記組成を含むものがある。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％ 第二試薬： （ｆ）グアニン ５〜５００ｍＭ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
ては、下記組成を含むものがある。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％ 第二試薬： （ｆ）グアニン ５〜５００ｍＭ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２８】本発明の方法を用いて目的成分を測定する
条件としては、特に厳密に規制するものではないが、反
応温度は０〜４０℃の間で、３７℃または３０℃が好適
に用いられる。反応後の吸光度は通常、３４０ｎｍにて
測定する。
条件としては、特に厳密に規制するものではないが、反
応温度は０〜４０℃の間で、３７℃または３０℃が好適
に用いられる。反応後の吸光度は通常、３４０ｎｍにて
測定する。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。 実施例１ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ（バチルス属由来） ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
る。 実施例１ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ（バチルス属由来） ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３０】試料液 尿素窒素溶液（１５、６０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添
加したもの、（アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄ
ｌ）を管理血清に添加したものおよび尿素窒素溶液又は
アンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
加したもの、（アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄ
ｌ）を管理血清に添加したものおよび尿素窒素溶液又は
アンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１の測定結果から、アンモニアを添加し
た場合にも、アンモニアの影響を受けることなく、尿素
窒素量がほぼ正確に測定できたことがわかる。
た場合にも、アンモニアの影響を受けることなく、尿素
窒素量がほぼ正確に測定できたことがわかる。
【００３３】比較例１ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ（バチルス属由来） ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３４】試料液 実施例１と同じものを使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３５】表１の測定結果より、第一試薬からＥＤＴ
Ａ・２Ｋを除くと、アンモニアを添加した場合にアンモ
ニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止し
ておらず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に
測定されていないことがわかる。
Ａ・２Ｋを除くと、アンモニアを添加した場合にアンモ
ニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止し
ておらず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に
測定されていないことがわかる。
【００３６】比較例２ 第一試薬 Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３７】試料液 実施例１と同じものを使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３８】表１の測定結果より、第一試薬ＥＤＴＡ・
２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと、アンモ
ニアを添加した場合に尿素窒素量がアンモニアの影響を
受けて正確に測定されていないことがわかる。
２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと、アンモ
ニアを添加した場合に尿素窒素量がアンモニアの影響を
受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００３９】比較例３ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４０】試料液 実施例１と同じものを使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測
定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００４１】表１の測定結果より、第一試薬のグルタミ
ンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴ
Ａ・２Ｋを添加しないと、アンモニアを添加した場合に
アンモニアの消去後グルタミンシンセターゼが完全に停
止せず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に測
定されていないことがわかる。
ンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴ
Ａ・２Ｋを添加しないと、アンモニアを添加した場合に
アンモニアの消去後グルタミンシンセターゼが完全に停
止せず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に測
定されていないことがわかる。
【００４２】実施例２ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４３】試料液 クレアチニン溶液（１．１ｍｇ／ｄｌ、５．７ｍｇ／ｄ
ｌ）を管理血清に添加したもの、アンモニア溶液（３０
ｍｇ／ｄｌ、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したも
のおよびクレアチニン溶液又はアンモニア溶液に添加し
ない管理血清を使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定
結果を表２にクレアチニン量として示す。
ｌ）を管理血清に添加したもの、アンモニア溶液（３０
ｍｇ／ｄｌ、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したも
のおよびクレアチニン溶液又はアンモニア溶液に添加し
ない管理血清を使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定
結果を表２にクレアチニン量として示す。
【００４４】比較例４〜６ 下記第一試薬および第二試薬を用いて、実施例１と同じ
試料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度測定し
た。その結果を表２にクレアチニン量として示す。 第一試薬（比較例４） グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例４） クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
試料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度測定し
た。その結果を表２にクレアチニン量として示す。 第一試薬（比較例４） グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例４） クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４５】 第一試薬（比較例５） Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例５） クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４６】 第一試薬（比較例６） グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例６） クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４７】
【表２】
【００４８】表２の測定結果から、アンモニアを添加し
た場合（実施例２）にも、アンモニアの影響を受けるこ
となく、クレアチニン量がほぼ正確に測定できているこ
とがわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと
（比較例４）、アンモニアを添加した場合にアンモニア
の消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止してお
らず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に
測定されていないことがわかる。また第一試薬にＥＤＴ
Ａ・２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと（比
較例５）、アンモニアを添加した場合にクレアチニン量
がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないこ
とがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセターゼ
濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加
しないと（比較例６）、アンモニアを添加した場合にア
ンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止
せず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に
測定されていないことがわかる。
た場合（実施例２）にも、アンモニアの影響を受けるこ
となく、クレアチニン量がほぼ正確に測定できているこ
とがわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと
（比較例４）、アンモニアを添加した場合にアンモニア
の消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止してお
らず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に
測定されていないことがわかる。また第一試薬にＥＤＴ
Ａ・２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと（比
較例５）、アンモニアを添加した場合にクレアチニン量
がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないこ
とがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセターゼ
濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加
しないと（比較例６）、アンモニアを添加した場合にア
ンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止
せず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に
測定されていないことがわかる。
【００４９】実施例３ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬 グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５０】試料液 グアナーゼ溶液（２．０、６．０Ｕ／１）を管理血清に
添加したもの、アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄ
ｌ）を管理血清に添加したものおよびグアナーゼ溶液又
はアンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定
結果を表３にグアナーゼ活性として示す。
添加したもの、アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄ
ｌ）を管理血清に添加したものおよびグアナーゼ溶液又
はアンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。 操作方法 試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５
分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、
単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定
結果を表３にグアナーゼ活性として示す。
【００５１】比較例７〜９ 下記第一試薬および第二試薬を用いて、実施例１と同じ
資料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度を測定し
た。その測定結果は表３にグアナーゼ活性として示す。 第一試薬（比較例７） グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例７） グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
資料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度を測定し
た。その測定結果は表３にグアナーゼ活性として示す。 第一試薬（比較例７） グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例７） グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５２】 第一試薬（比較例８） Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例８） グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５３】 第一試薬（比較例９） グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例９） グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５４】
【表３】
【００５５】表３の測定結果から、アンモニアを添加し
た場合（実施例３）にも、アンモニアの影響を受けるこ
となく、グアナーゼ量がほぼ正確に測定できていること
がわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと
（比較例７）、アンモニアを添加した場合にアンモニア
の消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止してお
らず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正確
に測定されていないことがわかる。 また第一試薬にＥ
ＤＴＡ・２Ｋをグルタミンシンセターゼを添加しないと
（比較例８）、アンモニア添加した場合にグアナーゼ活
性がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていない
ことがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセター
ゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添
加しないと（比較例９）、アンモニアを添加した場合に
アンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停
止せず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正
確に測定されていないことがわかる。なお、上記実施例
および比較例において、非イオン性界面活性剤として
は、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルシ
クロヘキシルエーテルを使用した。
た場合（実施例３）にも、アンモニアの影響を受けるこ
となく、グアナーゼ量がほぼ正確に測定できていること
がわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと
（比較例７）、アンモニアを添加した場合にアンモニア
の消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止してお
らず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正確
に測定されていないことがわかる。 また第一試薬にＥ
ＤＴＡ・２Ｋをグルタミンシンセターゼを添加しないと
（比較例８）、アンモニア添加した場合にグアナーゼ活
性がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていない
ことがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセター
ゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添
加しないと（比較例９）、アンモニアを添加した場合に
アンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停
止せず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正
確に測定されていないことがわかる。なお、上記実施例
および比較例において、非イオン性界面活性剤として
は、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルシ
クロヘキシルエーテルを使用した。
【００５６】
【発明の効果】活性化金属との結合性の強い結合剤を目
的成分を測定する第二試薬に含有させるだけでは、グル
タミンシンセターゼの反応を完全に停止することができ
ず、負の誤差を生じる（比較例２、３参照）。したがっ
て本発明では、特定量の結合剤の共存下にグルタミンシ
ンセターゼを反応させて内因性アンモニアおよび外因性
アンモニアを消去し、次いで目的とする測定成分、例え
ば尿素窒素、クレアチニン、グアナーゼなどの測定系に
さらに該結合剤を添加することにより、グルタミンシン
セターゼの反応を完全に消去させて目的成分を測定する
ことにより、上記欠点を解消する。
的成分を測定する第二試薬に含有させるだけでは、グル
タミンシンセターゼの反応を完全に停止することができ
ず、負の誤差を生じる（比較例２、３参照）。したがっ
て本発明では、特定量の結合剤の共存下にグルタミンシ
ンセターゼを反応させて内因性アンモニアおよび外因性
アンモニアを消去し、次いで目的とする測定成分、例え
ば尿素窒素、クレアチニン、グアナーゼなどの測定系に
さらに該結合剤を添加することにより、グルタミンシン
セターゼの反応を完全に消去させて目的成分を測定する
ことにより、上記欠点を解消する。
Claims (7)
- 【請求項１】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）
Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金
属を、（ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤１〜１
０ｍＭの共存下に試料に作用させて、内因性アンモニア
および外因性アンモニアを消去し、次いで該結合剤をさ
らに１〜１００ｍＭ添加して、グルタミンシンセダーゼ
反応を停止することを特徴とするアンモニアの消去法。 - 【請求項２】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）
Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金
属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試
薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）ウレアーゼ、（ｇ）
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタ
ル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍ
ＭのＥＤＴＡ塩を含有する第二試薬を作用させ、次いで
吸光度変化を測定することを特徴とする試料中の尿素窒
素の測定法。 - 【請求項３】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）
Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属お
よび（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を
試料に作用させ、次いで（ｆ）クレアチニンデイミナー
ゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−
ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１
〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、
次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中の
クレアチニンの測定法。 - 【請求項４】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）
Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属お
よび（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を
試料に作用させ、次いで（ｆ）グアニン、（ｇ）グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、
（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥ
ＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化
を測定することを特徴とする試料中のグアナーゼの測定
法。 - 【請求項５】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬か
らなる尿素窒素測定用試薬。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）ウレアーゼ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤 - 【請求項６】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬か
らなるクレアチニン測定用試薬。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）クレアチニンデイミナーゼ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤 - 【請求項７】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬か
らなるグアナーゼ測定用試薬。 第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 （ｃ）ＡＴＰ （ｄ）活性化金属および （ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合
剤 第二試薬： （ｆ）グアニン （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ｈ）α−ケトグルタル酸 （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび （ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結
合剤
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19959693A JP3454367B2 (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | アンモニアの消去方法およびそのための試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19959693A JP3454367B2 (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | アンモニアの消去方法およびそのための試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0751094A true JPH0751094A (ja) | 1995-02-28 |
| JP3454367B2 JP3454367B2 (ja) | 2003-10-06 |
Family
ID=16410488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19959693A Expired - Fee Related JP3454367B2 (ja) | 1993-08-11 | 1993-08-11 | アンモニアの消去方法およびそのための試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3454367B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100433683B1 (ko) * | 2001-06-18 | 2004-05-31 | 한국과학기술연구원 | 글루타민 신쎄이즈의 미세분석방법 |
| JP2019033677A (ja) * | 2017-08-10 | 2019-03-07 | アークレイ株式会社 | グルタミン合成酵素反応を効率よく行う方法、及び該方法を利用したアンモニア定量方法、並びにグルタミン合成酵素反応用試薬及びそれを含むアンモニア定量用試薬キット |
-
1993
- 1993-08-11 JP JP19959693A patent/JP3454367B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100433683B1 (ko) * | 2001-06-18 | 2004-05-31 | 한국과학기술연구원 | 글루타민 신쎄이즈의 미세분석방법 |
| JP2019033677A (ja) * | 2017-08-10 | 2019-03-07 | アークレイ株式会社 | グルタミン合成酵素反応を効率よく行う方法、及び該方法を利用したアンモニア定量方法、並びにグルタミン合成酵素反応用試薬及びそれを含むアンモニア定量用試薬キット |
| US11162123B2 (en) | 2017-08-10 | 2021-11-02 | Arkray, Inc. | Glutamine synthetase reaction and method for quantifying ammonia utilizing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3454367B2 (ja) | 2003-10-06 |
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