JP2019033677A - グルタミン合成酵素反応を効率よく行う方法、及び該方法を利用したアンモニア定量方法、並びにグルタミン合成酵素反応用試薬及びそれを含むアンモニア定量用試薬キット - Google Patents
グルタミン合成酵素反応を効率よく行う方法、及び該方法を利用したアンモニア定量方法、並びにグルタミン合成酵素反応用試薬及びそれを含むアンモニア定量用試薬キット Download PDFInfo
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Abstract
Description
さらに、精度向上を目指して研究を進めたところ、グルタミン合成酵素を利用したアンモニアの定量において、反応系にカルシウムが存在するとアンモニア量の測定結果にばらつきが生じることを見出した。反応系にカルシウムが存在する理由としては、試料や試薬に含有されている場合や、測定部材や装置から溶出する場合などが考えられる。そして、その原因を解明すべくさらに検討した結果、カルシウムにより第一段階のグルタミン合成酵素の活性が阻害されることを見出した。キレート剤を反応系に加えることで、第一段階のグルタミン合成酵素の活性阻害を抑制し、カルシウムの影響を受けず精度よくアンモニアを定量できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
ことがより好ましい。
本発明の他の態様によれば、アンモニア含有試料を用いて、キレート剤を含む反応系でグルタミン合成酵素反応を行うことによりアデノシン二リン酸(ADP)を生成させ、生成したADPの量又は該ADPを利用した反応生成物の量に基づいてアンモニアを定量する
ことを特徴とする、アンモニアの定量方法が提供される。ここで、前記ADPに、グルコースとADP依存性ヘキソキナーゼを作用させてグルコース−6−リン酸を生成し、前記グルコース−6−リン酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)系化合物の酸化型にグルコース−6−リン酸脱水素酵素を作用させてNAD系化合物の還元型を生成し、前記NAD系化合物の還元型を定量することでアンモニアの定量を行うことが好ましく、前記NAD系化合物の還元型に発色剤を反応させ、生成した色素を定量することでアンモニアの定量を行うことがより好ましい。
本発明の他の態様によれば、キレート剤とグルタミン合成酵素を含む、グルタミン合成酵素反応用試薬が提供される。ここで、キレート剤が分子内にカルボキシル基を4つ以上含む化合物であることが好ましく、キレート剤がEDTA、DTPA又はCyDTAであることがより好ましい。
本発明の他の態様によれば、キレート剤と、アデノシン三リン酸(ATP)、グルタミン酸及びグルタミン合成酵素を含む、グルタミン合成酵素反応用試薬キットが提供される。該試薬キットはアンモニア定量用試薬キットであることが好ましく、グルコース、NAD系化合物の酸化型、ADP依存性ヘキソキナーゼ及びグルコース−6−リン酸脱水素酵素をさらに含むことが好ましく、発色剤及び電子キャリアーをさらに含むことがより好ましい。
グルタミン合成酵素による反応は下記の反応式(1)に示すように、アンモニア(NH3
)とATPとL−グルタミン酸(L−Glutamate)とを反応させることにより、ADP、リン酸塩(Orthophosphate)及びL−グルタミン(L−Glutamine)を生成させる反応である。
キレート剤の種類は、カルシウムイオンイオンに対してキレート効果を発揮できるものであれば特に制限されないが、分子内に2個以上のカルボキシル基を有するキレート剤が好ましく、分子内に4個以上のカルボキシル基を有するキレート剤がより好ましい。
モノ又はポリアルキレンポリアミンポリカルボン酸・・・エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1,6-ヘキサメチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸(HDTA)、トリエチレンテ
トラミン六酢酸(TTHA)、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸(DTPA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(EDTA−OH)、N,N-ビス(2-ヒドロキシベンジル)エチレンジアミン-N,N-二酢酸(HBED)等
ポリアミノアルカンポリカルボン酸・・・ジアミノプロパン四酢酸(Methyl−EDTA)、trans-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸(CyDTA)、1,2
−ビス(o−アミノフェノキシ)エタン四酢酸(BAPTA)等
ポリアミノアルカノールポリカルボン酸・・・ジアミノプロパノール四酢酸(DPTA−OH)等
ヒドロキシアルキルエーテルポリアミンポリカルボン酸・・・グリコールエーテルジアミン四酢酸(GEDTA)等
アルキルイミノポリカルボン酸・・・ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、イミノ二酢酸(IDA)等
ニトリロポリカルボン酸・・・ニトリロ三酢酸(NTA)等
これらの中では、EDTA、CyDTA、DTPA、GEDTA、TTHA、Methyl−EDTAがより好ましい。
反応条件はグルタミン合成酵素の反応が進行する条件であればよく、一般的な条件でよいが、例えば、10〜50℃、好ましくは15〜40℃で1分〜3時間反応させることができる。
本発明の一態様にかかるグルタミン合成酵素反応用試薬は上記のキレート剤及びグルタミン合成酵素を含む。
本発明のグルタミン合成酵素反応用試薬は上記のキレート剤が、グルタミン酸、ATP及び/又はグルタミン合成酵素などとともにキット化されている形態でもよい。
本発明の一態様にかかるアンモニア定量方法は、アンモニア含有試料を用いてグルタミン合成酵素反応を行い、該反応で消費されるアンモニアの量に基づいて試料中のアンモニアを定量する方法であり、グルタミン合成酵素反応系に上記で説明したキレート剤を存在させることを特徴とする。
生成したリン酸塩を利用した反応の生成物の量を測定する方法は、グルタミン合成酵素反応で生じたリン酸塩を利用した測定法であれば特に制限されないが、例えば、特許文献2に記載のプリンヌクレオシドホスホリラーゼとプリンヌクレオシドを利用する方法などが例示される。
また、ADPを利用した反応による生成物の量を測定する方法の好ましい態様として、例えば、以下の方法が挙げられる。
せることにより、NAD還元型(NADH)及びD−グルコノ−1,5−ラクトン−6−リン酸(6−Phosphogluconolactone)が生成される。
テトラゾリウム化合物としては、テトラゾール環を有する化合物であればよく、テトラゾ
ール環の少なくとも二箇所に環構造置換基を有する化合物であることが好ましく、テトラゾール環の少なくとも三箇所に環構造置換基を有する化合物であることがより好ましい。テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも二箇所に環構造置換基を有する場合、環構造置換基をテトラゾール環の2位及び3位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも三箇所に環構造置換基を有する場合、環構造置換基をテトラゾール環の2位、3位及び5位に有することが好ましい。環構造置換基としては、例えば、置換基を有していてよいベンゼン環(ベンゼン環構造置換基)、置換基を有していてよいチエニル基、置換基を有していてよいチアゾイル基等が挙げられる。
テトラゾール環の2位、3位及び5位に環構造置換基を有するテトラゾリウム化合物としては、例えば、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩、2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩、2−(2−メトキシ−4−ニトロフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−フェニル−2H−テトラゾリウム塩、3,3'−
(1,1'−ビフェニル−4,4'−ジル)−ビス(2,5−ジフェニル)−2H−テトラゾリウム塩、3,3'−[3,3'−ジメトキシ−(1,1'−ビフェニル)−4,4'−ジル]−ビス[2−(4−ニトロフェニル)−5−フェニル−2H−テトラゾリウム塩]、2,3−ジフェニル−5−(4−クロロフェニル)テトラゾリウム塩、2,5−ジフェニル−3−(p−ジフェニル)テトラゾリウム塩、2,3−ジフェニル−5−(p−ジフェニル)テトラゾリウム塩、2,5−ジフェニル−3−(4−スチリルフェニル)テトラゾリウム塩、2,5−ジフェニル−3−(m−トリル)テトラゾリウム塩、2,5−ジフェニル−3−(p−トリル)テトラゾリウム塩等が挙げられる。
テトラゾリウム化合物としては、他にも、テトラゾール環の2箇所にベンゼン環構造置換基を有し、かつ1箇所にその他の環構造置換基を有する化合物であってもよく、例えば、2,3−ジフェニル−5−(2−チエニル)テトラゾリウム塩、2−ベンゾチアゾイル−3−(4−カルボキシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−スルホエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾリウム塩、2,2'−ジベンゾチアゾイル−5,5'−ビス[4−ジ(2−スルホエチル)カルバモイルフェニル]−3,3'−(3,3'−ジメトキシ−4,4'−ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩、3−(4,5−ジメチル−2
−チアゾイル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム塩等が挙げられる。
また、テトラゾリウム化合物としては、他にも、テトラゾール環の2箇所にベンゼン環構造置換基を有し、かつ1箇所に環構造でない置換基を有する化合物であってもよく、例えば、2,3−ジフェニル−5−シアノテトラゾリウム塩、2,3−ジフェニル−5−カルボキシテトラゾリウム塩、2,3−ジフェニル−5−メチルテトラゾリウム塩、2,3−ジフェニル−5−エチルテトラゾリウム塩等が挙げられる。
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、環構造置換基を3つ有する化合物が好ましく、ベンゼン環構造置換基を3つ有し、かつ電子吸引性官能基を有する化合物がより好ましく、2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩がさらに好ましい。
本態様の定量方法では、反応温度は、10℃〜50℃であることが好ましく、15℃〜40℃であることがより好ましく、20℃〜30℃であることがさらに好ましい。また、反
応時間は、1分間〜60分間であることが好ましく、2分間〜30分間であることがより好ましく、5分間〜15分間であることがさらに好ましい。
また、本発明の一態様は、アンモニアの定量試薬に関する。
アンモニアの定量試薬は、上記キレート剤とグルタミン合成酵素、ATP及びグルタミン酸を含むものであればよいが、グルタミン合成酵素反応によって生じたADP又はリン酸塩に基づいてアンモニア量を定量する場合は、ADP又はリン酸塩の量を測定するための試薬も含むことが好ましい。
例えば、グルタミン合成酵素反応で生じたリン酸塩の量に基づいてアンモニアを定量する場合は、例えば、特許文献2に記載されたような、プリンヌクレオシドホスホリラーゼとプリンヌクレオシドなどが含まれてもよい。
また、グルタミン合成酵素反応で生じたADPの量に基づいてアンモニアを定量する場合は、例えば、特許文献1に記載されたような、キナーゼとその基質などが含まれてもよい。
各試薬は使用時に混合されるように別々に試薬キットに含まれていてもよいし、一部又は全部の試薬が予め混合されていてもよい。
具体的には、上記キレート剤とグルタミン合成酵素、ATP及びグルタミン酸に加え、グルコース、NAD系化合物の酸化型、ADP依存性ヘキソキナーゼ及びグルコース−6−リン酸脱水素酵素を含む、アンモニア定量用の試薬キットが挙げられ、より好ましくは発色剤及び電子キャリアーをさらに含む、アンモニア定量用の試薬キットが挙げられる。
例えば、グルコースを含有する第1試薬と、グルタミン合成酵素、ADP依存性ヘキソキナーゼ及びグルコース−6−リン酸脱水素酵素を含有する第2試薬と、を備え、ATP、L−グルタミン酸及びNAD系化合物の酸化型はそれぞれ独立に、第1試薬及び第2試薬の少なくとも一方に含有されるアンモニアの定量試薬キットが例示される。
この場合、基質及び酵素が試薬中にて反応しないようにする観点から、ATP、L−グルタミン酸及びNAD系化合物の酸化型は第1試薬に含有されることが好ましい。
また、本態様の定量試薬キットでは、NAD系化合物の還元型と発色剤とを反応させて得られる色素を定量してアンモニアを定量する観点から、第1試薬は、発色剤をさらに含有し、第2試薬は、電子キャリアーをさらに含有することが好ましい。
表1の処方で試薬を調製し、反応直前に試薬Aと試料を混合し、そこに試薬Bを加えて反応を行った。アンモニア濃度は反応開始300秒後の340nmの吸光度の増加を指標とした。なお、試料には各濃度(180、340、530、700ppm)のカルシウムを加えた。試薬の液量は、試薬A:140μL、試薬B:35μL、試料:10μLである。
表2に記載の処方で試薬を調製し、これらを混合した後、基材に含浸した。基材を乾燥させたのち、被検液(10000 N-μg/dL アンモニア水溶液に、0、10、30、60又は8
0ppmのカルシウムを添加したもの)を添加し、室温で300秒間反応させた後、反射率(ΔR)を測定した。カルシウムを添加していない試料の反射率Rとカルシウムを添加した試料の反射率Rの差(ΔR)を求めることで、アンモニア測定系におけるカルシウムの影響を確認することができる。
Claims (13)
- キレート剤を含む反応系でグルタミン合成酵素反応を行うことを特徴とする、グルタミン合成酵素反応を行う方法。
- キレート剤が分子内にカルボキシル基を4つ以上含む化合物である、請求項1に記載の方法。
- キレート剤がエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸(DTPA)又はtrans-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸(C
yDTA)である、請求項2に記載の方法。 - アンモニア含有試料を用いて、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法によりグルタミン合成酵素反応を行うことによりアデノシン二リン酸(ADP)を生成させ、生成したADPの量又は該ADPを利用した反応生成物の量に基づいてアンモニアを定量することを特徴とする、アンモニアの定量方法。
- 前記ADPに、グルコースとADP依存性ヘキソキナーゼを作用させてグルコース−6−リン酸を生成し、
前記グルコース−6−リン酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)系化合物の酸化型にグルコース−6−リン酸脱水素酵素を作用させてNAD系化合物の還元型を生成し、
前記NAD系化合物の還元型を定量することでアンモニアの定量を行う、請求項4に記載のアンモニアの定量方法。 - 前記NAD系化合物の還元型に発色剤を反応させ、生成した色素を定量することでアンモニアの定量を行う、請求項5に記載のアンモニアの定量方法。
- キレート剤とグルタミン合成酵素を含む、グルタミン合成酵素反応用試薬。
- キレート剤が分子内にカルボキシル基を4つ以上含む化合物である、請求項7に記載の試薬。
- キレート剤がEDTA、DTPA又はCyDTAである、請求項8に記載の試薬。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載の試薬と、アデノシン三リン酸(ATP)及びグルタミン酸を含む、グルタミン合成酵素反応用試薬キット。
- アンモニア定量用である、請求項10に記載の試薬キット。
- グルコース、NAD系化合物の酸化型、ADP依存性ヘキソキナーゼ及びグルコース−6−リン酸脱水素酵素をさらに含む、請求項11に記載のアンモニア定量用の試薬キット。
- 発色剤及び電子キャリアーをさらに含む、請求項11又は12に記載のアンモニア定量用の試薬キット。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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