CN109385409B - 谷氨酰胺合成酶反应方法、氨定量方法、谷氨酰胺合成酶反应用试剂和氨定量用试剂盒 - Google Patents

谷氨酰胺合成酶反应方法、氨定量方法、谷氨酰胺合成酶反应用试剂和氨定量用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及谷氨酰胺合成酶反应方法、氨定量方法、谷氨酰胺合成酶反应用试剂和氨定量用试剂盒。[解决手段]一种谷氨酰胺合成酶反应用试剂，其包含螯合剂和谷氨酰胺合成酶；以及一种氨定量用试剂，其包含螯合剂和ATP、谷氨酸、谷氨酰胺合成酶、葡萄糖、氧化型的NAD系化合物、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶。

Description

谷氨酰胺合成酶反应方法、氨定量方法、谷氨酰胺合成酶反应 用试剂和氨定量用试剂盒
技术领域
本发明涉及利用了酶反应的生物化学领域的技术，更详细而言，涉及利用了酶反应的分析技术。
背景技术
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase：GST)是利用氨将谷氨酸转换为谷氨酰胺的酶，其被用于利用了酶反应的物质生产和分析技术等中。例如，已知以被谷氨酰胺合成酶消耗的底物的量为指标、对试样中的氨和ATP进行测定的技术(专利文献1和2)。已知谷氨酰胺合成酶受到L-蛋氨酸亚砜亚胺、草铵膦(Glufosinate)的抑制。
专利文献1：日本特开昭62-3800号公报
专利文献2：日本特开昭62-142272号公报
发明内容
本发明的课题在于提供一种用于更高效地进行谷氨酰胺合成酶的反应的试剂。另外，本发明的课题在于提供一种用于对氨进行定量的试剂，其不受抑制物质的影响，使谷氨酰胺合成酶的反应更高效地进行，其结果，以更高的精度对氨进行定量。
本发明人开发出了利用谷氨酰胺合成酶的新的氨定量法，并申请了专利(日本特愿2016-208760(日本特开2018-68278)、美国专利公开2018-0112250)。
此外，以提高精度为目标进行了研究，结果发现，在利用了谷氨酰胺合成酶的氨的定量中，若反应体系中存在钙，则氨量的测定结果会产生偏差。作为反应体系中存在钙的理由，考虑有含有于试样或试剂中的情况、从测定构件或装置中溶出的情况等。并且，为了阐明其原因进一步进行了研究，结果发现，钙抑制了第一阶段的谷氨酰胺合成酶的活性。并且发现，通过在反应体系中加入螯合剂，可阻碍第一阶段的谷氨酰胺合成酶的活性抑制，能够不受钙的影响而以良好的精度对氨进行定量，从而完成了本发明。
根据本发明的一个方式，提供一种进行谷氨酰胺合成酶反应的方法，其特征在于，在包含螯合剂的反应体系中进行谷氨酰胺合成酶反应。此处，螯合剂优选为在分子内包含4个以上羧基的化合物，螯合剂更优选为乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N”,N”-五乙酸(DTPA)或反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)。
根据本发明的其他方式，提供一种氨的定量方法，其特征在于，使用含氨试样在包含螯合剂的反应体系中进行谷氨酰胺合成酶反应，由此生成二磷酸腺苷(ADP)，基于所生成的ADP的量或利用了该ADP的反应产物的量对氨进行定量。此处，优选使葡萄糖和ADP依赖性己糖激酶作用于所述ADP，生成葡萄糖-6-磷酸，使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作用于所述葡萄糖-6-磷酸和氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)系化合物，生成还原型的NAD系化合物，对所述还原型的NAD系化合物进行定量，由此进行氨的定量；更优选使显色剂与所述还原型的NAD系化合物反应，对生成的色素进行定量，由此进行氨的定量。
根据本发明的其他方式，提供一种谷氨酰胺合成酶反应用试剂，其包含螯合剂和谷氨酰胺合成酶。此处，螯合剂优选为在分子内包含4个以上羧基的化合物，螯合剂更优选为EDTA、DTPA或CyDTA。
根据本发明的其他方式，提供一种谷氨酰胺合成酶反应用试剂盒，其包含螯合剂与三磷酸腺苷(ATP)、谷氨酸和谷氨酰胺合成酶。该试剂盒优选为氨定量用试剂盒，优选进一步包含葡萄糖、氧化型的NAD系化合物、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，更优选进一步包含显色剂和电子载体。
根据本发明，能够不受反应体系中的钙的影响而高效地进行谷氨酰胺合成酶的反应，能够更高效地进行利用了谷氨酰胺合成酶的分析和物质生产。特别是在利用谷氨酰胺合成酶的反应进行试样中的氨的定量的情况下，能够不受试样中的钙的影响而以良好的精度对氨进行定量。
附图说明
图1是在利用了谷氨酰胺合成酶的氨测定体系(液体反应体系)中示出钙浓度与氨测定值的关系的图。◇表示无EDTA，□表示有EDTA。
图2是示出在利用了谷氨酰胺合成酶的氨测定体系(液体反应体系)中将作为试样的ADP加入到反应体系中时的钙浓度与氨测定值的关系的图。◇表示无EDTA，□表示有EDTA。
图3是在利用了谷氨酰胺合成酶的氨测定体系(固相反应体系)中示出钙浓度与氨测定值的关系的图。分别对无EDTA、添加5mM EDTA、添加10mM EDTA、添加20mMEDTA进行了测定。
具体实施方式
在本发明的一个方式的方法中，在包含螯合剂的反应体系中进行谷氨酰胺合成酶反应。
<利用谷氨酰胺合成酶的反应>
如下述反应式(1)所示，利用谷氨酰胺合成酶的反应为下述反应：通过使氨(NH3)、ATP和L-谷氨酸盐(L-Glutamate)反应，生成ADP、磷酸盐(Orthophosphate)和L-谷氨酰胺(L-Glutamine)。
【化1】
只要能够催化上述反应，则谷氨酰胺合成酶的来源没有特别限制，另外，谷氨酰胺合成酶可以为由天然得到的酶，也可以为通过基因重组得到的酶。
<螯合剂>
螯合剂的种类没有特别限制，只要能够对钙离子发挥出螯合效果即可，优选在分子内具有2个以上羧基的螯合剂，更优选在分子内具有4个以上羧基的螯合剂。
作为螯合剂，更具体而言，例如可以举出以下的化合物或它们的盐。
单或多亚烷基多胺多羧酸…乙二胺四乙酸(EDTA)、1,6-六亚甲基二胺-N,N,N',N'-四乙酸(HDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N”,N”-五乙酸(DTPA)、羟乙基乙二胺三乙酸(EDTA-OH)、N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸(HBED)等
多氨基烷烃多羧酸…二氨基丙烷四乙酸(Methyl-EDTA)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷四乙酸(BAPTA)等
多氨基烷醇多羧酸…二氨基丙醇四乙酸(DPTA-OH)等
羟烷基醚多胺多羧酸…乙二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)等
烷基亚氨基多羧酸…羟乙基亚氨基二乙酸(HIDA)、亚氨基二乙酸(IDA)等
次氮基多羧酸…次氮基三乙酸(NTA)等
这些之中，更优选EDTA、CyDTA、DTPA、GEDTA、TTHA、Methyl-EDTA。
作为螯合剂的用量，只要是为了使反应体系中存在的钙不对谷氨酰胺合成酶的活性产生影响而能够发挥出螯合效果的量，就没有特别限定。根据所使用的螯合剂的种类、反应体系的种类和钙浓度等而异，因此不能一概地定义，通常为0.5mM以上、优选为1mM以上、更优选为2mM以上、进一步优选为5mM以上，上限没有特别限定，若考虑到溶解度、经济性等，为200mM以下、优选为100mM以下、更优选为60mM以下、进一步优选为20mM以下。
另外，在谷氨酰胺合成酶的反应体系中，除了螯合剂与谷氨酸、氨和ATP以外，从高效进行反应的观点出发，也可以存在镁离子(Mg2+)和锰离子(Mn2+)中的至少一者作为催化剂。Mg2+和Mn2+的浓度例如为1mM～100mM。需要说明的是，由于Mg2+和Mn2+有可能被螯合剂螯合，因此，Mg2+和Mn2+的浓度优选为比螯合剂更高的浓度。
在反应体系中可以进一步存在缓冲剂、表面活性剂等。
反应条件只要是谷氨酰胺合成酶的反应可进行的条件即可，可以为通常的条件，例如可以在10℃～50℃、优选15℃～40℃反应1分钟～3小时。
<谷氨酰胺合成酶反应用试剂>
本发明的一个方式的谷氨酰胺合成酶反应用试剂包含上述螯合剂和谷氨酰胺合成酶。
本发明的谷氨酰胺合成酶反应用试剂也可以为上述螯合剂与谷氨酸、ATP和/或谷氨酰胺合成酶等一起被制成试剂盒的形态。
<氨定量方法>
本发明的一个方式的氨定量方法为下述方法：使用含氨试样进行谷氨酰胺合成酶反应，基于该反应中消耗的氨的量对试样中的氨进行定量，该方法的特征在于，使谷氨酰胺合成酶反应体系中存在上述说明的螯合剂。
作为含氨试样，只要含有氨即可，例如可以举出含有通过酶反应生成的氨的试样、和含有通过化学反应(例如水解)生成或游离的氨的试样。更具体而言，可以举出血液、血清、尿、唾液等。
如上述反应式(1)所示，氨被谷氨酰胺合成酶反应所消耗，生成与氨相同量(等摩尔)的ADP和磷酸盐(Orthophosphate)。因此，通过测定ADP或磷酸盐的量或者利用了ADP或磷酸盐的反应的产物的量，能够对氨进行定量。
对利用了所生成的磷酸盐的反应的产物的量进行测定的方法只要是利用了谷氨酰胺合成酶反应中生成的磷酸盐的测定法，就没有特别限制，例如可以例示专利文献2中记载的利用嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷的方法等。
对利用了所生成的ADP的反应的产物的量进行测定的方法只要是利用了谷氨酰胺合成酶反应中生成的ADP的测定法，就没有特别限制，例如可以举出专利文献1中记载的以ADP为辅酶并利用激酶及其底物的方法。
另外，作为对利用了ADP的反应的产物的量进行测定的方法的优选方式，例如可以举出下述方法。
首先，使葡萄糖和ADP依赖性己糖激酶作用于在谷氨酰胺合成酶反应中生成的ADP。具体而言，如下述反应式(2)所示，使ADP依赖性己糖激酶(ADP-HK)作用于ADP和D-葡萄糖，生成葡萄糖-6-磷酸(G6P)和AMP(单磷酸腺苷)。
【化2】
接着，使氧化型的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)系化合物和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作用于在反应式(2)的反应中生成的葡萄糖-6-磷酸。具体而言，如下述反应式(3)所示，使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)作用于葡萄糖-6-磷酸和氧化型NAD(NAD+)，由此生成还原型NAD(NADH)和6-磷酸葡糖酸内酯(6-Phosphogluconolactone)。
【化3】
此处，作为NAD系化合物，不限定于上述NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，除此以外还可以举出硫代NAD(硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、硫代NADP(硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)等。
如上所述，通过使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作用于葡萄糖-6-磷酸和氧化型的NAD系化合物，生成还原型的NAD系化合物。通过对所生成的还原型的NAD系化合物(例如NADH)进行定量，能够进行氨的定量。例如可以举出：对还原型的NAD系化合物自身进行定量从而对氨进行定量的方法；使还原型的NAD系化合物与显色剂反应，对所得到的色素进行定量从而对氨进行定量的方法；等等。例如，作为前者，测定生成还原型的NAD系化合物时的电流值、或者测定来自所生成的还原型的NAD系化合物的吸光度(340nm)增加量即可；作为后者，测定基于色素生成而产生的、来自色素的吸光度增加量即可。此处，由于还原型的NAD系化合物所吸收的特定波长(340nm)下的吸光度的增加量和氨浓度与所生成的色素所吸收的特定波长下的吸光度的增加量和氨浓度处于成比例的关系，因此通过测定特定波长下的吸光度，能够进行氨的定量。
从能够通过目视区分色调的观点、以及在氨浓度低的情况下也能得到高测定精度的观点出发，优选使还原型的NAD系化合物与显色剂反应，对所得到的色素进行定量从而对氨进行定量的方法。
另外，也可以通过使所生成的色素附着于滤纸等基材上，对所得到的试纸的反射率进行测定而进行氨的定量。例如，可以通过将基材浸渍于含有氨定量中所用的各底物、各酶等的液体中而得到试纸，使含氨试样附着于所得到的试纸上后，测定附着有含氨试样的部位的反射率而进行氨的定量。
作为对色素进行定量从而对氨进行定量的方法的一例，使作为电子载体的黄递酶(DI)作用于所生成的作为还原型的NAD系化合物的NADH和作为显色剂的四唑紫(TV)，如下述反应式(4)所示，生成甲色素(Formazan Dye)，560nm的吸光度增加。
【化4】
作为显色剂，只要是通过与还原型的NAD系化合物的反应而生成色素的显色剂、即从还原型的NAD系化合物接受电子而生成色素的显色剂，就没有特别限定，例如可以举出四唑鎓化合物。
作为四唑鎓化合物，只要是具有四唑环的化合物即可，优选为在四唑环的至少两个位置具有环结构取代基的化合物，更优选为在四唑环的至少三个位置具有环结构取代基的化合物。四唑鎓化合物在四唑环的至少两个位置具有环结构取代基的情况下，优选在四唑环的2位和3位具有环结构取代基。另外，四唑鎓化合物在四唑环的至少三个位置具有环结构取代基的情况下，优选在四唑环的2位、3位和5位具有环结构取代基。作为环结构取代基，例如可以举出具有或不具有取代基的苯环(苯环结构取代基)、具有或不具有取代基的噻吩基、具有或不具有取代基的噻唑基等。
作为在四唑环的2位、3位和5位具有环结构取代基的四唑鎓化合物，例如可以举出2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3,3'-(1,1'-联苯基-4,4'-二基)-双(2,5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3,3'-[3,3'-二甲氧基-(1,1'-联苯基)-4,4'-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]、2,3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐、2,5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐、2,3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2,5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2,5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐、2,5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐等。
作为四唑鎓化合物，除此以外，也可以为在四唑环的两个位置具有苯环结构取代基、并且在一个位置具有其他环结构取代基的化合物，例如可以举出2,3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2,2'-二苯并噻唑基-5,5'-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3'-(3,3'-二甲氧基-4,4'-亚联苯基)双四唑鎓盐、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。
另外，作为四唑鎓化合物，除此以外，也可以为在四唑环的两个位置具有苯环结构取代基、并且在一个位置具有不为环结构的取代基的化合物，例如可以举出2,3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2,3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2,3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、2,3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。
在上述四唑鎓化合物中，优选具有3个环结构取代基的化合物，更优选具有3个苯环结构取代基且具有吸电子性官能团的化合物，进一步优选2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。
作为电子载体，可以举出黄递酶、吩嗪硫酸甲酯、甲氧基吩嗪硫酸甲酯、二甲氨基苯并吩噁嗪鎓氯化物(麦尔多拉蓝)等，其中，优选黄递酶。
反应式(1)～(3)的反应和反应式(1)～(4)的反应优选在同一反应体系中同时进行。
本方式的定量方法中，反应温度优选为10℃～50℃、更优选为15℃～40℃、进一步优选为20℃～30℃。另外，反应时间优选为1分钟～60分钟、更优选为2分钟～30分钟、进一步优选为5分钟～15分钟。
本方式的定量方法中，为了将含氨试样调整为适于酶反应的pH(例如pH为6.0～9.0)，可以使用缓冲液。作为缓冲液，可以使用pH优选为6.0～9.0、更优选为6.0～8.0的缓冲液。作为缓冲液，例如可以举出N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)等Good's缓冲液、磷酸缓冲液、咪唑酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液等。
另外，本方式的定量方法中，可以根据需要在含氨试样中添加上述成分以外的其他成分。作为其他成分，例如可以举出表面活性剂、防腐剂、稳定剂等。
[氨的定量用试剂]
另外，本发明的一个方式涉及氨的定量试剂。
氨的定量试剂只要包含上述螯合剂与谷氨酰胺合成酶、ATP和谷氨酸即可，在基于通过谷氨酰胺合成酶反应生成的ADP或磷酸盐对氨量进行定量的情况下，优选还包含用于对ADP或磷酸盐的量进行测定的试剂。
例如，在基于通过谷氨酰胺合成酶反应生成的磷酸盐的量对氨进行定量的情况下，例如，也可以包含专利文献2中记载的嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷等
另外，在基于通过谷氨酰胺合成酶反应生成的ADP的量对氨进行定量的情况下，例如，也可以包含专利文献1中记载的激酶及其底物等。
各试剂可以分别含有于不同的试剂盒中以在使用时进行混合，也可以预先将部分或全部试剂进行了混合。
在本发明的优选方式中，为用于进行上述反应式(1)～(3)的反应的试剂或用于进行上述反应式(1)～(4)的反应的试剂盒。
具体而言，可以举出一种氨定量用的试剂盒，其除了包含上述螯合剂与谷氨酰胺合成酶、ATP和谷氨酸以外，还包含葡萄糖、氧化型的NAD系化合物、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；更优选可以举出一种氨定量用的试剂盒，其进一步包含显色剂和电子载体。
在使用试纸以固相进行氨的定量的情况下，上述试剂可以以全部被混合的状态配置于试纸上，并以干燥的状态进行保存。其中，可以将这些试剂分别添加到试纸上，也可以先混合后同时添加到试纸上。
以液相进行氨的定量的情况下，上述试剂优选在即将反应前进行混合。其中，优选将上述试剂分成若干个组，预先将各组的试剂混合，在即将使用前将组之间进行混合。
例如，可以例示下述氨的定量试剂盒：其具备含有葡萄糖的第1试剂以及含有谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的第2试剂，ATP、L-谷氨酸和氧化型的NAD系化合物各自独立地含有于第1试剂和第2试剂中的至少一者中。
该情况下，从底物和酶在试剂中不发生反应的观点出发，优选ATP、L-谷氨酸和氧化型的NAD系化合物含有于第1试剂中。
另外，本方式的定量试剂盒中，从使还原型的NAD系化合物与显色剂反应、对所得到的色素进行定量从而对氨进行定量的观点出发，优选第1试剂进一步含有显色剂、第2试剂进一步含有电子载体。
实施例
下面，举出实施例来更具体地说明本发明。但本发明不限定于下述实施例的方式。
实施例1.液体体系中的研究
按照表1的配方制备试剂，在即将反应前将试剂A与试样混合，向其中加入试剂B而进行反应。氨浓度以反应开始300秒后的340nm的吸光度的增加作为指标。需要说明的是，在试样中加入各浓度(180、340、530、700ppm)的钙。试剂的液量为试剂A：140μL、试剂B：35μL、试样：10μL。
图1是在利用了谷氨酰胺合成酶的氨测定体系(液体反应体系)中示出钙浓度与氨测定值的关系的图。◇表示无EDTA，□表示有EDTA。其结果，如图1所示，可知氨的测定值依赖于钙的浓度而减少。与此相对，可知：在反应体系中添加了EDTA时，氨的测定值不再依赖于钙浓度。
接着，对钙在氨测定反应的哪个阶段产生影响进行了研究。图2是示出在利用了谷氨酰胺合成酶的氨测定体系(液体反应体系)中将作为试样的ADP加入反应体系中时的钙浓度与氨测定值的关系的图。◇表示无EDTA(配方-1)，□表示有EDTA(配方-2)。由于ADP成为ADP依赖性己糖激酶的底物，因此能够确认试样中的钙对于除谷氨酰胺合成酶以外的酶反应的影响。其结果，将ADP加入反应体系中后，如图2所示，不再观察到钙的影响。此外，同样地将作为试样的G6P、NADH加入反应体系中，对以G6P和NADH为底物的反应也分别进行了调查，但未观察到钙的影响。其结果，可知钙对氨测定反应的第一阶段的谷氨酰胺合成酶产生了影响。需要说明的是，关于谷氨酰胺合成酶的活性抑制，确认到不仅在液体体系中、在以固相的反应中也显示出同样的结果。
表1
实施例2.以固相的研究
按照表2中记载的配方制备试剂，将它们混合后，浸渗到基材中。使基材干燥后，添加被测液(在10000N-μg/dL氨水溶液中添加了0、10、30、60或80ppm的钙的液体)，在室温下反应300秒后，测定反射率(ΔR)。求出未添加钙的试样的反射率R与添加了钙的试样的反射率R之差(ΔR)，由此可以确认氨测定体系中的钙的影响。
将结果示于图3。测定值依赖于钙浓度而发生变化，但通过加入EDTA，钙所致的反射率的变动(ΔR的变化)得到改善。
表2
由上述验证试验可知，通过在谷氨酰胺合成酶的反应体系中添加螯合剂，能够阻碍谷氨酰胺合成酶的活性抑制。在实施例2中，以氨测定为例进行了试验，若结合实施例1的结果来考虑，通过在氨测定以外、例如ATP测定或谷氨酸的测定等使用谷氨酰胺合成酶反应的反应体系中添加螯合剂，也能够阻碍谷氨酰胺合成酶的活性抑制。

Claims (9)

1.一种氨的定量方法，其特征在于，使用含氨试样通过在包含氨、三磷酸腺苷ATP和谷氨酸、还包含螯合剂的反应体系中进行谷氨酰胺合成酶反应的方法进行谷氨酰胺合成酶反应，由此生成二磷酸腺苷ADP，基于所生成的ADP的量或利用了该ADP的反应产物的量对氨进行定量。
2.如权利要求1所述的氨的定量方法，其中，螯合剂是在分子内包含4个以上羧基的化合物。
3.如权利要求2所述的氨的定量方法，其中，螯合剂为乙二胺四乙酸EDTA、二亚乙基三胺-N,N,N',N”,N”-五乙酸DTPA或反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸CyDTA。
4.如权利要求1～3中任一项所述的氨的定量方法，其中，使葡萄糖和ADP依赖性己糖激酶作用于所述ADP，生成葡萄糖-6-磷酸，
使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作用于所述葡萄糖-6-磷酸和氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD系化合物，生成还原型的NAD系化合物，
对所述还原型的NAD系化合物进行定量，由此进行氨的定量。
5.如权利要求4所述的氨的定量方法，其中，使显色剂与所述还原型的NAD系化合物反应，对生成的色素进行定量，由此进行氨的定量。
6.一种氨定量用的谷氨酰胺合成酶反应用试剂盒，其包含含有螯合剂、谷氨酰胺合成酶的谷氨酰胺合成酶反应用试剂、三磷酸腺苷ATP和谷氨酸，进一步包含葡萄糖、氧化型的NAD系化合物、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，螯合剂是在分子内包含4个以上羧基的化合物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中，螯合剂为EDTA、DTPA或CyDTA。
9.如权利要求6～8中任一项所述的试剂盒，其中，进一步包含显色剂和电子载体。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7263838B2 (ja) 2019-02-27 2023-04-25 セイコーエプソン株式会社 三次元造形物の造形方法
CN112226483A (zh) * 2020-11-05 2021-01-15 洛阳恒恩生物科技有限公司 一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5916761A (en) * 1995-12-27 1999-06-29 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for assaying vital sample
JP2000253898A (ja) * 1999-03-11 2000-09-19 Kyowa Medex Co Ltd 物質または酵素の定量方法および定量試薬
CN101464349A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 苏州艾杰生物科技有限公司 氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS623800A (ja) 1985-06-27 1987-01-09 Takara Shuzo Co Ltd アンモニアまたはａｔｐの定量法
JPS62142272A (ja) 1985-12-17 1987-06-25 Takara Shuzo Co Ltd アンモニアまたはａｔｐの定量法
JP3454367B2 (ja) * 1993-08-11 2003-10-06 東洋紡績株式会社 アンモニアの消去方法およびそのための試薬
JP4155415B2 (ja) * 1996-02-19 2008-09-24 旭化成ファーマ株式会社 生体試料の測定法
CN107974485B (zh) 2016-10-25 2024-01-16 爱科来株式会社 氨定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置
JP6989300B2 (ja) 2016-10-25 2022-01-05 アークレイ株式会社 アンモニアの定量方法、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5916761A (en) * 1995-12-27 1999-06-29 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for assaying vital sample
JP2000253898A (ja) * 1999-03-11 2000-09-19 Kyowa Medex Co Ltd 物質または酵素の定量方法および定量試薬
CN101464349A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 苏州艾杰生物科技有限公司 氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法

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