JPS5856698A - 基質又は酵素の改良された定量方法 - Google Patents
基質又は酵素の改良された定量方法Info
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- JPS5856698A JPS5856698A JP15396181A JP15396181A JPS5856698A JP S5856698 A JPS5856698 A JP S5856698A JP 15396181 A JP15396181 A JP 15396181A JP 15396181 A JP15396181 A JP 15396181A JP S5856698 A JPS5856698 A JP S5856698A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
方法に関する。
近年、酵素法による生体成分の分析法が広く普及し、生
体中の酵素あるいは非酵素成分の測定系に０種々の酵素
の共役反応を利用する場合が非常に多くなった・中でも
脱水素酵素群は、検出が容易なＮＡＤ又はＮＡＤＰが関
与するため適用範囲が広く、クレアチンキナーゼ測定系
におけるグルコース−６−リン酸脱水素酵素、トリノリ
セライト測定系におけるグリセロール脱水素＊素などが
そのよい例である。現在、 ＮＡＤＨ又は、 ＮＡＤＰ
Ｈの検出は、一般にホルマザン発色系の共役によって行
なわれているが、この方法では色素が水に難溶性であり
、又・反応条件により発色度が異なるので正確な分子吸
光係数を適用しにくい、さらに測定器具に色素が吸着す
るなどの欠点がある。
体中の酵素あるいは非酵素成分の測定系に０種々の酵素
の共役反応を利用する場合が非常に多くなった・中でも
脱水素酵素群は、検出が容易なＮＡＤ又はＮＡＤＰが関
与するため適用範囲が広く、クレアチンキナーゼ測定系
におけるグルコース−６−リン酸脱水素酵素、トリノリ
セライト測定系におけるグリセロール脱水素＊素などが
そのよい例である。現在、 ＮＡＤＨ又は、 ＮＡＤＰ
Ｈの検出は、一般にホルマザン発色系の共役によって行
なわれているが、この方法では色素が水に難溶性であり
、又・反応条件により発色度が異なるので正確な分子吸
光係数を適用しにくい、さらに測定器具に色素が吸着す
るなどの欠点がある。
最近８これらの諸問題を解決する新しい発色系の利用が
報告されている０例えば、脱水素酵素−基質−ＮＡＤの
反応系にＦａ” ｅ電子伝達剤及びＦａ”＋に特異的
に反応するキレート剤を添加した緩衝液中で次の反応を
行なわせ。
報告されている０例えば、脱水素酵素−基質−ＮＡＤの
反応系にＦａ” ｅ電子伝達剤及びＦａ”＋に特異的
に反応するキレート剤を添加した緩衝液中で次の反応を
行なわせ。
結果として生成した着色化合物を比色定量するととＫよ
る。トリグリセライドの測定法がある（特開昭和５４−
８０１９２）。
る。トリグリセライドの測定法がある（特開昭和５４−
８０１９２）。
ＮＡＤ十基質μＩ札μ」４！→ＮＡＤＨ＋生成物ＮＡＤ
Ｈ＋２Ａｌｆｊ１子（汰１１届−ＮＡＤ＋２ＦＡ”ＦＪ
”＋！１（キレート剤）−−一一→錯化合物（着色）こ
の方法は、生成する着色物が水溶性゛であり、感度もか
なう高い１．シかしながら試薬ブランク値の経時変化が
著しいので比色時には。
Ｈ＋２Ａｌｆｊ１子（汰１１届−ＮＡＤ＋２ＦＡ”ＦＪ
”＋！１（キレート剤）−−一一→錯化合物（着色）こ
の方法は、生成する着色物が水溶性゛であり、感度もか
なう高い１．シかしながら試薬ブランク値の経時変化が
著しいので比色時には。
検体ごとに試薬ブランク値による分光々変針のゼロ調整
をしなければならず、・測定する試料件数が限られ・多
検体処理には不適当であった。
をしなければならず、・測定する試料件数が限られ・多
検体処理には不適当であった。
本発明者らは、この試薬ブランク値の経時変化を抑制し
、比色時の煩雑な操作を除くことで多検体処理を可能に
するため、ａｌ々研究を行なった結果、試薬ブランク値
の上昇は試薬中に含まれる種々の成分によるＦａ”＋の
非特１異的遺元に帰因するもので、特に酵素蛋白ヤ七の
夾雑物量に依存して増大する傾向が判明したことから、
それに効果的な隠ぺい剤すなわちＦａ”＋と錯化合物を
形成する隠ぺい剤を使用することにより試薬ブランク値
の経時変化の抑制が可能であることを発見し本発明を完
成した０以上の経緯から本発明方法は広く一般に脱水素
酵素及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系への応用が十
分に可能であり、ホルマザン法にかわる比色法として、
ＮＡＤＨ又は。
、比色時の煩雑な操作を除くことで多検体処理を可能に
するため、ａｌ々研究を行なった結果、試薬ブランク値
の上昇は試薬中に含まれる種々の成分によるＦａ”＋の
非特１異的遺元に帰因するもので、特に酵素蛋白ヤ七の
夾雑物量に依存して増大する傾向が判明したことから、
それに効果的な隠ぺい剤すなわちＦａ”＋と錯化合物を
形成する隠ぺい剤を使用することにより試薬ブランク値
の経時変化の抑制が可能であることを発見し本発明を完
成した０以上の経緯から本発明方法は広く一般に脱水素
酵素及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系への応用が十
分に可能であり、ホルマザン法にかわる比色法として、
ＮＡＤＨ又は。
ＮＡＤＰＨの検出に適用できることは明らかである。
本発明は、電子伝達剤の存在下、脱水素酵素反応より生
成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨｉｌｋ対応してＦａ”＋
から還元生成するＰ−１を錯化合試薬ブランク値の経時
変化を抑制することを特徴とする酵素又は基質の改良さ
れた定量方法である。
成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨｉｌｋ対応してＦａ”＋
から還元生成するＰ−１を錯化合試薬ブランク値の経時
変化を抑制することを特徴とする酵素又は基質の改良さ
れた定量方法である。
本発明方法における隠ぺい剤の効果は、〃“と声定な錯
化合物を形成し１元３＋が還元され７ｇのを抑制する作
用で説明される。従って。
化合物を形成し１元３＋が還元され７ｇのを抑制する作
用で説明される。従って。
反応時に隠ぺい剤を共存させた揚台０艮応に由来するＦ
−の還元を阻害する可能性がある・そこで、実際には、
基質の定量の場合には反応が終結した時点で、酵素の定
量の場合には。
−の還元を阻害する可能性がある・そこで、実際には、
基質の定量の場合には反応が終結した時点で、酵素の定
量の場合には。
規定時間反応させた直後に酵素反応停止剤と共に隠ぺい
剤を加える。隠ぺい剤が同時に酵素反応を停止する作用
を有する場合もある。
剤を加える。隠ぺい剤が同時に酵素反応を停止する作用
を有する場合もある。
本発明で使用される隠ぺい剤として、たとえば次の如き
ものが挙げられる： エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） ヒドロキシエチルエチレンジアミン三ＷｆＨ（ＥＤＴＡ
−ＯＨ）ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ジア
ミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＲ）ニトリロ三
酢酸（ＮＴＡ） トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）
ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）リン酸塩 隠ぺい剤は、そのＳ＠と濃度及びｐｇによりその効果が
かなり左右されるため、使用する際には条件設定が重要
となる０次にその実例を示す０表１，２は、後述の実施
例１の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）測定試薬を・用いて、
試験した結果である・表１には、 ｐｉｔが試薬ブラン
ク値の経時変化に及ぼす影響を示した。これより、 ｐ
Ｈの選択によっては、かえって逆効果となってしまうこ
とがわかる。表２には、隠ぺい剤の濃度が試薬ブランク
値の、経時変化と呈色に及ぼす影蕃を示した。これより
隠ぺい剤が高濃度になるに従って経時的に試薬ブランク
値は減少するが・反応による呈色をも減少させる傾向に
あることがわかる。従ってＬＤＨな測定する場合の隠ぺ
い剤には、１〜８ｍＭＥＤＴＡ−ＯＨｐｌｉａ６ ’ｐ
１〜８ ｍＭ ＤＰＴＡ−ＯＨｐＨａｓ。
ものが挙げられる： エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） ヒドロキシエチルエチレンジアミン三ＷｆＨ（ＥＤＴＡ
−ＯＨ）ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ジア
ミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＲ）ニトリロ三
酢酸（ＮＴＡ） トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）
ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）リン酸塩 隠ぺい剤は、そのＳ＠と濃度及びｐｇによりその効果が
かなり左右されるため、使用する際には条件設定が重要
となる０次にその実例を示す０表１，２は、後述の実施
例１の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）測定試薬を・用いて、
試験した結果である・表１には、 ｐｉｔが試薬ブラン
ク値の経時変化に及ぼす影響を示した。これより、 ｐ
Ｈの選択によっては、かえって逆効果となってしまうこ
とがわかる。表２には、隠ぺい剤の濃度が試薬ブランク
値の、経時変化と呈色に及ぼす影蕃を示した。これより
隠ぺい剤が高濃度になるに従って経時的に試薬ブランク
値は減少するが・反応による呈色をも減少させる傾向に
あることがわかる。従ってＬＤＨな測定する場合の隠ぺ
い剤には、１〜８ｍＭＥＤＴＡ−ＯＨｐｌｉａ６ ’ｐ
１〜８ ｍＭ ＤＰＴＡ−ＯＨｐＨａｓ。
４〜８ ｍＭ ＣｙＤＴＡｐＨ３６が有効と考えられる
・表３．４は同様に後述の実施例３のトリグリセライド
測定時に用いる隠ぺい剤を検討した結果である０表から
、 １〜４ ｍＷ ＥＤＴＡ ｐＨａａ。
・表３．４は同様に後述の実施例３のトリグリセライド
測定時に用いる隠ぺい剤を検討した結果である０表から
、 １〜４ ｍＷ ＥＤＴＡ ｐＨａａ。
１〜８ ｍＷ ＤＴＰＡＩ）１１８ｇ。
４〜８ ｙｄＭ ＣｙＤＴＡｐＨＧ及び５０ｍＭリン酸
緩衝液−ａＯが使用可能なものと判断した。後述の実施
例２に従ってＣＫを測定する場合には。
緩衝液−ａＯが使用可能なものと判断した。後述の実施
例２に従ってＣＫを測定する場合には。
ここで生じる色素が中性ＤＴＰム以上のｐｎで不安定な
ため羅べい剤は、 Ｉｌｌ！−性の条件で用いることが
望ましい、又表５に示す様に使用する緩衝液の１ａｌｌ
Ｉによって、効果の異なるものもある・濃度をかえての
実験結果は表６゛に示゛シ？、： −コレＪ ’） ８
５〜２ｍＭノＥＤＴＡ、ＩＣＤＴＡ−ＯＨ１ＤＴＰム及
びＣ７ＤＴＡが有効と考えられる・本発明方法に用いら
れるＦａ”十は、硫酸第二鉄アンモニウム、塩化第二鉄
などであり。
ため羅べい剤は、 Ｉｌｌ！−性の条件で用いることが
望ましい、又表５に示す様に使用する緩衝液の１ａｌｌ
Ｉによって、効果の異なるものもある・濃度をかえての
実験結果は表６゛に示゛シ？、： −コレＪ ’） ８
５〜２ｍＭノＥＤＴＡ、ＩＣＤＴＡ−ＯＨ１ＤＴＰム及
びＣ７ＤＴＡが有効と考えられる・本発明方法に用いら
れるＦａ”十は、硫酸第二鉄アンモニウム、塩化第二鉄
などであり。
Ｆ１１＋に特異的に反応するキレート剤としてはメトえ
ば、バソフェナンスルリン、スルホン酸ナトリウム１．
２−ピリジルアルドキシム。
ば、バソフェナンスルリン、スルホン酸ナトリウム１．
２−ピリジルアルドキシム。
３−（２−ピリジル）−４６−ビス（４−スルフォニル
）−１，２，４−）’ｊアジンスルホン酸ナトリウム、
オルトフェナンスロリンが適当である。又、電子伝達剤
としては、たとえば７エナジンメトサル７エー） ＣＰ
ＭＳ）、メルトラブル−、メトキシフェナジンメトサル
７！ −） （Ｍ−ＰＭ８）、ディアフォラーゼが適し
ている。緩衝液には、トリエタノ−ルア電ン緩衝液の他
１反応に関わる酵素勢の反応至適条件を満足するような
成分と−を選択することができる。
）−１，２，４−）’ｊアジンスルホン酸ナトリウム、
オルトフェナンスロリンが適当である。又、電子伝達剤
としては、たとえば７エナジンメトサル７エー） ＣＰ
ＭＳ）、メルトラブル−、メトキシフェナジンメトサル
７！ −） （Ｍ−ＰＭ８）、ディアフォラーゼが適し
ている。緩衝液には、トリエタノ−ルア電ン緩衝液の他
１反応に関わる酵素勢の反応至適条件を満足するような
成分と−を選択することができる。
表 １
１）＃１度は全て４−とした。
２）隠ぺい剤を６０ｍＭシュウ酸を含むαＩＭコバク駿
緩衝液に溶解（ｐｉｌ ａ Ｏ） 緩衝液に溶解（ｐＭｌｏｏ） 表 ２ １） 隠ぺい剤添加直後に測定した吸光度に対する６０
分後に測定した吸光度の百分率で示した。
緩衝液に溶解（ｐｉｌ ａ Ｏ） 緩衝液に溶解（ｐＭｌｏｏ） 表 ２ １） 隠ぺい剤添加直後に測定した吸光度に対する６０
分後に測定した吸光度の百分率で示した。
！！３
１）濃度は、全て４ ｍＭとした。
２）隠ぺい剤をＱＩＭコハク酸緩衝液に溶解 （ｐｎａ
ｏ）３） ＃ ）す：１−タンー
／Ｉ／７ミ７ ＃ （１）［１ａ６）４）
ｚ 炭酸 ＃ （ｐＩＩＩα
０）表 ４ 表 ５ １）隠ぺい剤の溶解緩衝液 ム ＱＩＭコハク酸緩衝液−＆０ １１＃ ＊ｐＨａＯ Ｃｇ＆Ｂ−ジメチルグルタ橿緩衝液−＆ＯＤ＃
＃ ＃ｐｉｌａＯ２）濃度は全て１
ｍＭ 表 ６ ） 書 」 量 １）ＱＩＭ ３．３−ジメチルグルタル酸−６０に溶解
次に実施例により本発明を更に詳しく説明する・ 実施例１ 血清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測
定 ｌ）試薬 溶液Ａ ： ＩＬ６ ｍＭオルトフエナンスロリ７ｅ４
００ｍＭ乳酸リチウムを含む２００ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液ｐＩｉ＆０゜溶ｉ１ Ｂ ： ２０ ｍＭ
ＮＡＤ、 ３ Ｕ／１ｍ１ｇディア７オラーゼ、１２
５ｍＭ２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニラムラｍＭ ）リエ
タノールアミン緩衝液ｐＦｉ７．２゜ 溶液Ｃ（隠ぺい剤）：５０ｍＭシュウ酸。
ｏ）３） ＃ ）す：１−タンー
／Ｉ／７ミ７ ＃ （１）［１ａ６）４）
ｚ 炭酸 ＃ （ｐＩＩＩα
０）表 ４ 表 ５ １）隠ぺい剤の溶解緩衝液 ム ＱＩＭコハク酸緩衝液−＆０ １１＃ ＊ｐＨａＯ Ｃｇ＆Ｂ−ジメチルグルタ橿緩衝液−＆ＯＤ＃
＃ ＃ｐｉｌａＯ２）濃度は全て１
ｍＭ 表 ６ ） 書 」 量 １）ＱＩＭ ３．３−ジメチルグルタル酸−６０に溶解
次に実施例により本発明を更に詳しく説明する・ 実施例１ 血清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測
定 ｌ）試薬 溶液Ａ ： ＩＬ６ ｍＭオルトフエナンスロリ７ｅ４
００ｍＭ乳酸リチウムを含む２００ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液ｐＩｉ＆０゜溶ｉ１ Ｂ ： ２０ ｍＭ
ＮＡＤ、 ３ Ｕ／１ｍ１ｇディア７オラーゼ、１２
５ｍＭ２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニラムラｍＭ ）リエ
タノールアミン緩衝液ｐＦｉ７．２゜ 溶液Ｃ（隠ぺい剤）：５０ｍＭシュウ酸。
４ ｍＭ ＥＤＴＡ−ＯＨを含む０１Ｍ）リエタノール
アミン緩＠ ＠ ｐＨ＆ ６− ２）操作方法 血清３０μｔ、溶液Ｂα５−を試験管にとり、溶液ＡＱ
＆−を加えて３７℃で正確に１０分間反応させた後、た
だちに溶液Ｃ２−を添加して室温に戻す、別に血清を加
えずに、同様に操作したものを試薬ブランクとして、５
１０ｎｍの吸光度を測定する・次に血清試料と同一方法
で処理した既知ＬＤＨ活性の溶液によって示される吸光
度と測定吸光度との比較によって。
アミン緩＠ ＠ ｐＨ＆ ６− ２）操作方法 血清３０μｔ、溶液Ｂα５−を試験管にとり、溶液ＡＱ
＆−を加えて３７℃で正確に１０分間反応させた後、た
だちに溶液Ｃ２−を添加して室温に戻す、別に血清を加
えずに、同様に操作したものを試薬ブランクとして、５
１０ｎｍの吸光度を測定する・次に血清試料と同一方法
で処理した既知ＬＤＨ活性の溶液によって示される吸光
度と測定吸光度との比較によって。
血清試料のＬＤＨ活性を算出する。上記の諸条件下で、
直線的な吸光度の応答が図１の通り約１２００ウロプレ
ウスキー （Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ ）単位のＬＤ）Ｉ活性のレベ
ルまで認められた。
直線的な吸光度の応答が図１の通り約１２００ウロプレ
ウスキー （Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ ）単位のＬＤ）Ｉ活性のレベ
ルまで認められた。
実施例２ 血清中のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性の
測定 り試薬 溶液ム： ６ ｍＭ ３− （２−ビクジル）−５，６
−ビス（４−スルフォニル） −１，２，４−トリアジ
ンスルホン酸ナトリウム、４０−クレアチンリン酸を含
む２００ ｍＭ ）リエタノールアさン緩衝液ｐＨ７，
６・ 溶１１ Ｂ ： ２ ｍＭ ＮＡＤＰ、 ４０ｆｉＭ
ＰＭ８．４ｍＭアデノシン−２−リン酸、６ｍＭ硫酸第
二嫉アンモニウム・１２ｍＭ塩化マグネナーゼを含む５
０ ｍＷ ）リエタノール７オン緩衝液ｐｉｌ？、２゜ 溶１１Ｅｃ（隠ぺい剤） ： １ ｍＭ ＤＴＰＡを含
む０１Ｍ３．３− ジメチルグルタル酸緩衝液ｐＨａＯ
− ２）操作方法 血清１０μｔ＠ＩＩ［Ａ Ｑ２５ ｍを試験管にとり、
溶液Ｂα２５−を加えて３７℃で正確に１０分間反応さ
せた後、ただちに溶液Ｃ４−を添加し、室温に戻す、別
に血清を加えずに同様に操作したものを試薬ブランクと
して、 ５６４ ｎｍ の吸光度を測定する０次に血清
試料と同一方法で処理した既知ＣＫ活性溶ｔＩＫよって
示される吸光度と測定吸光度との比較によって血清試料
のＣＫ活性を算出゛する。上記の諸条件下で直線的な吸
光度の応答が図２の通、す２００１．Ｕ、μのＣＫ活性
のレベルまで認−められた。
測定 り試薬 溶液ム： ６ ｍＭ ３− （２−ビクジル）−５，６
−ビス（４−スルフォニル） −１，２，４−トリアジ
ンスルホン酸ナトリウム、４０−クレアチンリン酸を含
む２００ ｍＭ ）リエタノールアさン緩衝液ｐＨ７，
６・ 溶１１ Ｂ ： ２ ｍＭ ＮＡＤＰ、 ４０ｆｉＭ
ＰＭ８．４ｍＭアデノシン−２−リン酸、６ｍＭ硫酸第
二嫉アンモニウム・１２ｍＭ塩化マグネナーゼを含む５
０ ｍＷ ）リエタノール７オン緩衝液ｐｉｌ？、２゜ 溶１１Ｅｃ（隠ぺい剤） ： １ ｍＭ ＤＴＰＡを含
む０１Ｍ３．３− ジメチルグルタル酸緩衝液ｐＨａＯ
− ２）操作方法 血清１０μｔ＠ＩＩ［Ａ Ｑ２５ ｍを試験管にとり、
溶液Ｂα２５−を加えて３７℃で正確に１０分間反応さ
せた後、ただちに溶液Ｃ４−を添加し、室温に戻す、別
に血清を加えずに同様に操作したものを試薬ブランクと
して、 ５６４ ｎｍ の吸光度を測定する０次に血清
試料と同一方法で処理した既知ＣＫ活性溶ｔＩＫよって
示される吸光度と測定吸光度との比較によって血清試料
のＣＫ活性を算出゛する。上記の諸条件下で直線的な吸
光度の応答が図２の通、す２００１．Ｕ、μのＣＫ活性
のレベルまで認−められた。
実施例３ 血清中のトリグリセライドの測定り°試薬
溶液Ａ ： ＆８ ｍＭバソ７エナンスロリンスルホン
酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化カリウ、ムを含む２００
ｍＭ ）リエタノールアミン緩衝液ｐＨ＆ｏ。
酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化カリウ、ムを含む２００
ｍＭ ）リエタノールアミン緩衝液ｐＨ＆ｏ。
溶液Ｂ ： ４０ ｍＭ ＮＡＤ、 ４０４Ｍメトキ
Ｖ ＰＭ８ 、２５ ｍＭ硫酸第二鉄アンモニ′ウムＱ
１ｗ／マ優ウシ血清アルブミン、４００Ｕ／ｍｅリボプ
ロティンリパーゼ、 ３２ ｌｉｄグリセロール脱水素
酵素を含む５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐｉ
１？２−溶液Ｃ： ５０ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝
液 ２）操６作方法 血、清ｌＯμｔ、溶液Ａ０２５−を試験管にとり、溶＠
８０２Ｂ−を加えて、３７℃で２０分間インキュペ、−
トし−た後、ただちに溶液０４ｍｌを添加して室温に戻
す。別に血清を加えずに同様に操作したものを試薬ブラ
ンクとして５３５ ｎｍ の吸光度を測定する。次に血
清試料のトリグリセライド含量を血清試料と同一方法で
処理した既知トリグリセライド含量の溶液によって示さ
れる吸光度と測定吸光度との比較によって算出する。上
記の諸条件下で直線的な吸光度の応答が図３の通りほぼ
１００ｗ９／ｄＡ’ のトリグリセライドのレベルま
で認められた。
Ｖ ＰＭ８ 、２５ ｍＭ硫酸第二鉄アンモニ′ウムＱ
１ｗ／マ優ウシ血清アルブミン、４００Ｕ／ｍｅリボプ
ロティンリパーゼ、 ３２ ｌｉｄグリセロール脱水素
酵素を含む５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐｉ
１？２−溶液Ｃ： ５０ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝
液 ２）操６作方法 血、清ｌＯμｔ、溶液Ａ０２５−を試験管にとり、溶＠
８０２Ｂ−を加えて、３７℃で２０分間インキュペ、−
トし−た後、ただちに溶液０４ｍｌを添加して室温に戻
す。別に血清を加えずに同様に操作したものを試薬ブラ
ンクとして５３５ ｎｍ の吸光度を測定する。次に血
清試料のトリグリセライド含量を血清試料と同一方法で
処理した既知トリグリセライド含量の溶液によって示さ
れる吸光度と測定吸光度との比較によって算出する。上
記の諸条件下で直線的な吸光度の応答が図３の通りほぼ
１００ｗ９／ｄＡ’ のトリグリセライドのレベルま
で認められた。
以上述べたことから、本発明方法は広（一般に脱水素酵
素及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系への応用が十分
可能であり、比色時の煩雑な操作は必要とせず、信頼度
の高い測定を多検体にわたり可能とする。又、本性は高
い感度を期待できるため、反応時間の短縮や試料の微量
化も可能であることが明らかである。
素及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系への応用が十分
可能であり、比色時の煩雑な操作は必要とせず、信頼度
の高い測定を多検体にわたり可能とする。又、本性は高
い感度を期待できるため、反応時間の短縮や試料の微量
化も可能であることが明らかである。
第１図は本発明による血清中のＬＤＩｌ活性の測定にお
けるウロプレウスキ一単位と吸光度とのグラフを、第２
図はＣＫ活性の測定グラフを、第３図はトリグリセライ
ドの測定グラフをそれぞれ示す。 第１１Ｉ ウロフ′°レウ又キー 華イ立 第２図
けるウロプレウスキ一単位と吸光度とのグラフを、第２
図はＣＫ活性の測定グラフを、第３図はトリグリセライ
ドの測定グラフをそれぞれ示す。 第１１Ｉ ウロフ′°レウ又キー 華イ立 第２図
Claims (7)
- （１）脱水票酵素及び酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）又は、酸化型ニコチンアミド−
アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含む酵素
反応系により生成する還元型ニコチンアミド−アデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸 （ＮＡＤＰＨ）量に対応して、電子伝達剤の存在下、第
二鉄イオン（Ｆａ ”” ）から還元生成する第一鉄イ
オン（ＦＪ”）量をｈ”＋に特異的に反応するキレート
剤と作用させ１着色化合物として比色定量する方法にお
いて、一定時間反応後余剰のＦａ”＋を隠ぺいする隠ぺ
い剤を添加して試薬ブランク値の経時変化を抑制するこ
とを特徴とする。酵素又は基質の定量の方法。 - （２） 隠ぺい剤としてエチレンジアミン四酢酸 ・
（ＥＤＴＡ）を用いる特許請求範囲第１項に記載の方法
。 - （３） 隠ヘイ剤としてヒドロキシエチルエチレンジ
アミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）を用いる特許請求範囲
第１項に記載の方法。 - （４） 隠ぺい剤としてジエチレントリアミン五酢酸
（ＤＴＰＡ）を用いる特許請求範囲第１項に記載、の方
法。 - （５） 隠ぺい剤としてジアミノプロパノ−、ル四酢
酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）を用いる特許請求範囲第１項に記
載の方法。 - （６）隠ぺい剤としてトランスシクロヘキサンジアミン
四酢酸（Ｃ７ＤＴＡ）を用いる特許請求範囲第１項に記
載の方法。 - （７） 隠ぺい剤としてリン酸塩類を用いる特許請求
範囲第１項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15396181A JPS5856698A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 基質又は酵素の改良された定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15396181A JPS5856698A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 基質又は酵素の改良された定量方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15768390A Division JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | 基質又は酵素の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5856698A true JPS5856698A (ja) | 1983-04-04 |
| JPH0253039B2 JPH0253039B2 (ja) | 1990-11-15 |
Family
ID=15573847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15396181A Granted JPS5856698A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 基質又は酵素の改良された定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5856698A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0198286A2 (en) * | 1985-04-01 | 1986-10-22 | EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) | Analytical compositions, elements and methods utilizing reduction of ferric ion chelates to form detectable dyes |
-
1981
- 1981-09-30 JP JP15396181A patent/JPS5856698A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0198286A2 (en) * | 1985-04-01 | 1986-10-22 | EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) | Analytical compositions, elements and methods utilizing reduction of ferric ion chelates to form detectable dyes |
| US4701420A (en) * | 1985-04-01 | 1987-10-20 | Eastman Kodak Company | Analytical compositions, elements and methods utilizing reduction of ferric ion chelates to form detectable dyes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0253039B2 (ja) | 1990-11-15 |
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