JP2018023364A - アンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置 - Google Patents
アンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018023364A JP2018023364A JP2017118044A JP2017118044A JP2018023364A JP 2018023364 A JP2018023364 A JP 2018023364A JP 2017118044 A JP2017118044 A JP 2017118044A JP 2017118044 A JP2017118044 A JP 2017118044A JP 2018023364 A JP2018023364 A JP 2018023364A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ammonia
- reaction
- produced
- pyruvate
- act
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】安価、且つ簡便にアンモニアを定量することが可能なアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置を提供する。
【解決手段】アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法。
【選択図】なし
【解決手段】アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、アンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置に関する。
アンモニア定量方法としては、化学測定方法及び酵素測定方法が知られている。化学測定方法としては、インドフェノール法が主に用いられている。一方、酵素測定方法としては、グルタミン酸脱水素酵素を用いる方法の他、グルタミン合成酵素、カルバメートキナーゼ、カルバモイルリン酸合成酵素等を用いる方法がある。
グルタミン合成酵素を用いた酵素測定方法としては、例えば、アンモニア、アデノシン三リン酸(ATP)及びL−グルタミン酸の存在下でグルタミン酸合成酵素を作用させ、生成したADPとキナーゼ基質用リン化合物にキナーゼを作用させて、生成したキナーゼ反応生成物を定量することでアンモニアを定量する方法が提案されている(例えば、特許文献1を参照)。
より具体的には、特許文献1には、以下の4段階の反応にてアンモニアを定量する方法が開示されている。
(1)アンモニア、ATP及びL−グルタミン酸の存在下、グルタミン合成酵素を作用させ、L−グルタミン、アデノシン二リン酸(ADP)及びリン酸を生成する。
(2)生成されたADP及びホスホエノールピルビン酸の存在下、ピルビン酸キナーゼを作用させ、ATP及びピルビン酸を生成する。
(3)生成されたピルビン酸、生成されたリン酸及び酸素の存在下、ピルビン酸オキシダーゼを作用させ、アセチルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生成する。
(4)生成された過酸化水素、フェノール及び4−アミノアンチピリンの存在下、ペルオキシダーゼを作用させてキノン系色素を生成する。500nmの吸光度の増加量からアンモニアを定量する。
(1)アンモニア、ATP及びL−グルタミン酸の存在下、グルタミン合成酵素を作用させ、L−グルタミン、アデノシン二リン酸(ADP)及びリン酸を生成する。
(2)生成されたADP及びホスホエノールピルビン酸の存在下、ピルビン酸キナーゼを作用させ、ATP及びピルビン酸を生成する。
(3)生成されたピルビン酸、生成されたリン酸及び酸素の存在下、ピルビン酸オキシダーゼを作用させ、アセチルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生成する。
(4)生成された過酸化水素、フェノール及び4−アミノアンチピリンの存在下、ペルオキシダーゼを作用させてキノン系色素を生成する。500nmの吸光度の増加量からアンモニアを定量する。
特許文献1に記載されたアンモニアの定量方法では、上述のように、4段階の反応を経てアンモニアが定量される。反応経路が多い場合、必要な試薬数が増えるという問題がある。また、特許文献1に記載されたアンモニアの定量方法では、高価なホスホエノールピルビン酸を使用しているため、測定費用が増加するという問題がある。そこで、安価、且つ簡便にアンモニアを定量する方法が求められている。
本発明は、安価、且つ簡便にアンモニアを定量することが可能なアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するための具体的な手段は、以下の通りである。
<1> 本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。
<2> 本発明の一態様は、更に、触媒であるマグネシウムイオン(Mg2+)及びマンガンイオン(Mn2+)の少なくとも一方の存在下にて前記被検液にグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成する<1>に記載のアンモニアの定量方法である。
<3> 本発明の一態様は、更に、補酵素であるチアミンピロリン酸及びフラビンアデニンヌクレオチドの存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させる<1>又は<2>に記載のアンモニアの定量方法である。
<4> 本発明の一態様は、前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生成された過酸化水素を測定する<1>〜<3>のいずれか1つに記載のアンモニアの定量方法である。
<5> 本発明の一態様は、呈色反応又は電気化学反応を行い、生成された前記過酸化水素を測定する<4>に記載のアンモニアの定量方法である。
<6> 本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬である。
<7> 本発明の一態様は、水素供与体を含有する第1試薬と、カップラーを含有する第2試薬と、を含有し、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、前記第1試薬及び前記第2試薬の少なくとも一方に含有され、酵素は、前記グルタミン合成酵素、前記ピルビン酸オキシダーゼ及び前記ペルオキシダーゼからなる定量試薬キットである。
<8> 本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片である。
<9> 本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置である。
<10> 本発明の一態様は、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる酵素と、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記L−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、かつ、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて反応を行う反応部と、前記反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置である。
<11> 本発明の一態様は、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる酵素と、水素供与体と、カップラーと、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記L−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、かつ、生成された前記過酸化水素、前記水素供与体、及び前記カップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させて色素を生成する反応を行う反応部と、前記反応部での反応により生成された前記色素を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置である。
<1> 本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。
<2> 本発明の一態様は、更に、触媒であるマグネシウムイオン(Mg2+)及びマンガンイオン(Mn2+)の少なくとも一方の存在下にて前記被検液にグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成する<1>に記載のアンモニアの定量方法である。
<3> 本発明の一態様は、更に、補酵素であるチアミンピロリン酸及びフラビンアデニンヌクレオチドの存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させる<1>又は<2>に記載のアンモニアの定量方法である。
<4> 本発明の一態様は、前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生成された過酸化水素を測定する<1>〜<3>のいずれか1つに記載のアンモニアの定量方法である。
<5> 本発明の一態様は、呈色反応又は電気化学反応を行い、生成された前記過酸化水素を測定する<4>に記載のアンモニアの定量方法である。
<6> 本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬である。
<7> 本発明の一態様は、水素供与体を含有する第1試薬と、カップラーを含有する第2試薬と、を含有し、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、前記第1試薬及び前記第2試薬の少なくとも一方に含有され、酵素は、前記グルタミン合成酵素、前記ピルビン酸オキシダーゼ及び前記ペルオキシダーゼからなる定量試薬キットである。
<8> 本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片である。
<9> 本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置である。
<10> 本発明の一態様は、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる酵素と、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記L−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、かつ、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて反応を行う反応部と、前記反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置である。
<11> 本発明の一態様は、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる酵素と、水素供与体と、カップラーと、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記L−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、かつ、生成された前記過酸化水素、前記水素供与体、及び前記カップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させて色素を生成する反応を行う反応部と、前記反応部での反応により生成された前記色素を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置である。
本発明の一態様によれば、安価、且つ簡便にアンモニアを定量することが可能なアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置を提供することができる。
以下、本発明の一態様のアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置について説明する。
本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本明細書において、アンモニアを含有する被検液は、アンモニア及びアンモニウムイオンの少なくとも一方を含む被検液を意味し、アンモニア濃度及びアンモニア量はそれぞれ、アンモニアとアンモニウムイオンとの合計濃度及び合計量を意味している。
本明細書において、L−グルタミン酸、リン酸、ピルビン酸及びアセチルリン酸は、それぞれ塩であってもよい。
本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本明細書において、アンモニアを含有する被検液は、アンモニア及びアンモニウムイオンの少なくとも一方を含む被検液を意味し、アンモニア濃度及びアンモニア量はそれぞれ、アンモニアとアンモニウムイオンとの合計濃度及び合計量を意味している。
本明細書において、L−グルタミン酸、リン酸、ピルビン酸及びアセチルリン酸は、それぞれ塩であってもよい。
〔アンモニアの定量方法〕
本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸(ATP)及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸(ADP)からATPを生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。
本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸(ATP)及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸(ADP)からATPを生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。
本態様の定量方法では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の2段階反応を経て、消費された成分又は生成された成分を測定することで被検液に含有されるアンモニア(アンモニア及びアンモニウムイオンの合計)を定量することができる。
従来公知のアンモニアの定量方法では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の他、ピルビン酸キナーゼを介した反応を行っており、少なくとも3段階反応を経て、被検液に含有されるアンモニアを定量している。ピルビン酸キナーゼを介した反応として、より詳細には、ホスホエノールピルビン酸及びグルタミン合成酵素を介した反応により生じたADPの存在下にて、ピルビン酸キナーゼを作用させ、ATP及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応に用いられるピルビン酸を生成している。従来公知のアンモニアの定量方法では、ATP及びADPのサイクリング反応の一部としてピルビン酸キナーゼを介した反応を行っている。
しかしながら、従来公知のアンモニアの定量方法では、ATP及びADPのサイクリング反応の一部としてホスホエノールピルビン酸を用いた反応が必要であり、ホスホエノールピルビン酸はATP、ピルビン酸等と比較して高価であるため、測定費用が増加するという問題がある。さらに、アンモニアの定量を好適に行う観点から、サイクリング対象ではないホスホエノールピルビン酸を多めに使用してピルビン酸オキシダーゼを作用させる反応を安定的に行うことが想定されるため、測定費用がより増加することが懸念される。
一方、本態様は、ピルビン酸キナーゼを介してADPからATPを生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。そのため、本態様の定量方法は、従来公知のアンモニアの定量方法に比べて反応経路が少なく必要な試薬数を削減することができる。したがって、本態様の定量方法では、より簡便にアンモニアを定量することができる。さらに、本態様の定量方法では、高価なホスホエノールピルビン酸を使用しないため、より安価でアンモニアを定量することができる。
本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液を用いる。被検液としては、アンモニアを含有するものであればよく、例えば、酵素反応により生成されたアンモニアを含有するもの、及び、化学反応(例えば、加水分解)により生成又は遊離されたアンモニアを含有するものが挙げられる。被検液として、より具体的には、血液、血清、尿等が挙げられる。なお、本態様の定量方法では、分析対象となる被検液に、後述の各成分をそれぞれ添加してアンモニアの定量を行ってもよく、後述の各成分を含浸させたろ紙等にアンモニアを含有する被検液を付着させてアンモニアの定量を行ってもよい。
本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液に、ATP及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させることでリン酸を生成する。例えば、アンモニア(NH3)を含有する被検液に、ATP及びL−グルタミン酸塩(L−Glutamate)の存在下にてグルタミン合成酵素(Glutamine Synthetase)を作用させることにより、以下の反応式(1)に示すように、ADP、リン酸塩(Orthophosphate)及びL−グルタミン(L−Glutamine)が生成される。
また、本態様の定量方法では、リン酸の合成反応を効率よく行う観点から、触媒であるマグネシウムイオン(Mg2+)及びマンガンイオン(Mn2+)の少なくとも一方の存在下にて、アンモニアを含有する被検液にグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成することが好ましい。
本態様の定量方法では、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させる。例えば、生成されたリン酸塩、ピルビン酸塩(Pyruvate)及び酸素の存在下(これらを含有する水溶液中)にてピルビン酸オキシダーゼ(Pyruvate Oxidase)を作用させることにより、以下の反応式(2)に示すように、アセチルリン酸塩(Acetyl phosphate)、二酸化炭素及び過酸化水素が生成される。
また、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行う。例えば、リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させる際に消費された酸素を測定してアンモニアの定量を行ってもよく、リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させる際に生成された過酸化水素を測定してアンモニアの定量を行ってもよい。
消費された酸素を測定してアンモニアの定量を行う場合、例えば、酸素電極を用いて溶液中における溶存酸素量を測定することが好ましい。
生成された過酸化水素を測定してアンモニアの定量を行う場合、例えば、呈色反応又は電気化学反応を行うことが好ましい。
呈色反応を行う場合、例えば、生成された過酸化水素、水素供与体、及びカップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させればよい。これにより、水素供与体及びカップラーが酸化縮合反応して色素が生成される。生成された色素が吸収する特定波長における吸光度と、被検液に含有されるアンモニア濃度とは比例関係にあるため、特定波長における吸光度を測定することでアンモニアの定量を行うことが可能である。
また、ろ紙等に生成された色素を付着させて得られた試験紙の反射率を測定することでアンモニアの定量を行ってもよい。例えば、生成された過酸化水素、水素供与体及びペルオキシダーゼを含有する液体並びにカップラーを含有する液体にろ紙等を含浸して得られた試験紙の反射率を測定することでアンモニアの定量を行ってもよい。
一例として、生成された過酸化水素、水素供与体である1−ナフトール−3,6−ジスルホン酸二ナトリウム(NDSA)及びカップラーである4−アミノアンチピリンの存在下にてペルオキシダーゼ(Peroxidase)を作用させることにより、以下の反応式(3)に示すように、キノンイミン系色素(Quinoneimine dye)が生成され、560nmの吸光度が増加する。
水素供与体としては、カップラーとの酸化縮合反応により色素が生成されるものであれば特に限定されず、フェノール、フェノール誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、アニリン、アニリン誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が挙げられる。中でも、得られる色素における感度及び波長の観点から、アニリン及びアニリン誘導体が好ましい。
アニリン誘導体としては、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−2,5−ジメチルアニリン等が挙げられる。
カップラーとしては、水素供与体との酸化縮合反応により色素が生成されるものであれば特に限定されず、4−アミノアンチピリン、4−アミノアンチピリン誘導体、フェニレンジアミン、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等が挙げられる。
次に、電気化学反応を行う場合、例えば、生成された過酸化水素の電気化学反応で生じる電流の値を測定すればよい。測定された電流値と、被検液に含有されるアンモニア濃度とは比例関係にあるため、電流値を測定することでアンモニアの定量を行うことが可能である。
本態様の定量方法では、ピルビン酸オキシダーゼの補酵素であるチアミンピロリン酸及びフラビンアデニンヌクレオチドの存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させることが好ましい。
本態様の定量方法では、反応温度は、10℃〜50℃であることが好ましく、20℃〜40であることがより好ましく、30℃〜37℃であることが更に好ましい。また、反応時間は、1分間〜60分間であることが好ましく、2分間〜30分間であることがより好ましく、5分間〜15分間であることが更に好ましい。
本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液を酵素反応に適したpH(例えば、pHが6.0〜9.0)に調整するため、緩衝液を用いてもよい。緩衝液としては、pHが好ましくは6.0〜9.0、より好ましくは6.0〜8.0のものを用いてもよい。緩衝液としては、例えば、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。
また、本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液に、必要に応じて上述した成分以外のその他の成分を添加してもよい。その他の成分としては、例えば、界面活性剤、防腐剤、安定化剤等が挙げられる。
〔定量試薬、定量試薬キット及び試験片〕
本発明の一態様は、ピルビン酸、ATP、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬である。本態様の定量試薬は、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
また、本発明の一態様は水素供与体を含有する第1試薬と、カップラーを含有する第2試薬と、を含有し、ピルビン酸、ATP、L−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、第1試薬及び第2試薬の少なくとも一方に含有され、酵素は、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる定量試薬キットである。本態様の定量試薬キットは、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
また、本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片である。本態様の試験片は、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
本発明の一態様は、ピルビン酸、ATP、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬である。本態様の定量試薬は、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
また、本発明の一態様は水素供与体を含有する第1試薬と、カップラーを含有する第2試薬と、を含有し、ピルビン酸、ATP、L−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、第1試薬及び第2試薬の少なくとも一方に含有され、酵素は、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる定量試薬キットである。本態様の定量試薬キットは、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
また、本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片である。本態様の試験片は、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
本態様の定量試薬、定量試薬キット及び試験片では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の2段階反応を経て、消費された成分又は生成された成分を測定することで被検液に含有されるアンモニア(アンモニア及びアンモニウムイオンの合計)を定量することができる。
本態様の定量試薬、定量試薬キット及び試験片を用いることで、ピルビン酸キナーゼを介してADPからATPを生成する反応を行わずにアンモニアを定量することができる。そのため、本態様の定量試薬及び定量試薬キットでは、より簡便にアンモニアを定量することができる。
さらに、本態様の定量試薬キットを用いることで、生成された過酸化水素、水素供与体、及びカップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させることにより、水素供与体及びカップラーが酸化縮合反応して色素が生成され、本態様の定量方法と同様、アンモニアの定量を行うことが可能である。
なお、本態様の定量試薬及び試験片並びに定量試薬キットにおける第1試薬及び第2試薬は、前述のアンモニアの定量方法に記載されている触媒、補酵素、緩衝液及び他の成分を含んでいてもよい。本態様の定量試薬キットにおける水素供与体及びカップラーは、前述のアンモニアの定量方法に記載されているものと同様であるため、その説明を省略する。また、本態様の試験片は、例えば、水素供与体及びカップラーをさらに含有していてもよく、ろ紙等であってもよく、ろ紙等に各成分が含浸されたものであってもよい。
〔アンモニアの定量装置〕
本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置である。
本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置である。
本態様の定量装置では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の2段階反応を経て、消費された成分又は生成された成分を測定することで被検液に含有されるアンモニア(アンモニア及びアンモニウムイオンの合計)を定量することができる。
本態様の定量装置を用いることで、ピルビン酸キナーゼを介してADPからATPを生成する反応を行わずにアンモニアを定量することができる。そのため、本態様の定量装置では、より簡便にアンモニアを定量することができる。
本態様の定量装置の具体例について以下に説明する。まず、本態様の定量装置の具体例1としては、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる酵素と、を含有する被検対象が配置され、被検対象中にて、アンモニア、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、かつ、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させて反応を行う反応部と、反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部と、を備える定量装置が挙げられる。例えば、本発明の一実施形態に係る定量装置100は、図3に示すように、前述の反応を行う反応部1と、反応部1での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部2と、を少なくとも備えていればよい。
具体例1の定量装置は、前述の反応部を備える。反応部は、前述の被検対象を配置可能な構成を有し、例えば、被検対象である被検液が貯留された採血管、採尿管等が配置される箇所、被検液が貯留される容器、アンモニアの定量に用いる各成分が含浸され、アンモニアを含有する被検液が付着したろ紙などを備える構成であればよい。
また、反応部は、前述の反応式(1)に示すリン酸の生成反応及び前述の反応式(2)に示す過酸化水素の生成反応が効率よく生じるように反応条件(反応温度、被検液のpH等)を調整できる構成であることが好ましい。
具体例1の定量装置は、反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部を備える。測定部は、例えば、反応部での反応により消費された酸素又は反応部での反応により生成された過酸化水素を測定することでアンモニアを定量する。
測定部が反応部での反応により消費された酸素を測定する場合、測定部は、酸素電極を備え、酸素電極を用いて溶液中における溶存酸素量を測定する構成であることが好ましい。
測定部が反応部での反応により生成された過酸化水素を測定する場合、測定部は、生成された過酸化水素の電気化学反応で生じる電流の値を測定する構成であることが好ましい。
次に、本態様の定量装置の具体例2としては、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる酵素と、水素供与体と、カップラーと、を含有する被検対象が配置され、被検対象中にて、アンモニア、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、かつ、生成された過酸化水素、水素供与体、及びカップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させて色素を生成する反応を行う反応部と、反応部での反応により生成された色素を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置が挙げられる。
色素を測定する測定部としては、色素が吸収する特定波長における吸光度を測定する構成、色素を付着させた試験紙の反射率を測定する構成等を備えていればよい。
本態様の定量装置における分析対象となるアンモニアを含有する被検対象は、前述のアンモニアの定量方法に記載されている触媒、補酵素、緩衝液及び他の成分を含んでいてもよい。
アンモニアと、前述の各成分と、を含有する被検対象は予め準備され、本態様の定量装置は、準備された被検対象が反応部に配置される構成であってもよい。
また、本態様の定量装置は、前述の定量試薬、前述の第1試薬及び前述の第2試薬、又は前述の各成分を貯留する貯留部を更に備え、反応部に配置されたアンモニアを含有する被検液に各試薬又は各成分が供給される構成であってもよい。あるいは、本態様の定量装置は、反応部に配置されたアンモニアの定量に用いる各成分が含浸されたろ紙等にアンモニアを含有する被検液を付着させる構成であってもよい。
次に、本発明の一態様を以下の実施例に基づき説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
以下に示す試薬1及び試薬2を調製した。なお、試薬2としては、硫酸アンモニウムの濃度が異なる4種類のものを調製した。
<試薬1>
BES−水酸化ナトリウム緩衝液(同仁化学社製、pH7.0) 100mmol/L
L−グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製) 15mmol/L
1−ナフトール−3,6−ジスルホン酸二ナトリウム(和光純薬工業社製) 5mmol/L
チアミンピロリン酸(東京化成工業社製) 1mmol/L
フラビンアデニンジヌクレオチド(東京化成工業社製) 1mmol/L
塩化マグネシウム六水和物 20mmol/L
アデノシン三リン酸二水和物(Roche社製) 15mmol/L
ピルビン酸カリウム(ナカライテスク社製) 15mmol/L
グルタミン合成酵素(キッコーマン社製) 10U/mL
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 10U/mL
<試薬2>
4−アミノアンチピリン(和光純薬工業社製) 5mmol/L
ピルビン酸オキシダーゼ(旭化成社製) 10U/mL
硫酸アンモニウム(ナカライテスク社製) 0mmol/L、1.8mmol/L、3.6mmol/L、7.2mmol/L
以下に示す試薬1及び試薬2を調製した。なお、試薬2としては、硫酸アンモニウムの濃度が異なる4種類のものを調製した。
<試薬1>
BES−水酸化ナトリウム緩衝液(同仁化学社製、pH7.0) 100mmol/L
L−グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製) 15mmol/L
1−ナフトール−3,6−ジスルホン酸二ナトリウム(和光純薬工業社製) 5mmol/L
チアミンピロリン酸(東京化成工業社製) 1mmol/L
フラビンアデニンジヌクレオチド(東京化成工業社製) 1mmol/L
塩化マグネシウム六水和物 20mmol/L
アデノシン三リン酸二水和物(Roche社製) 15mmol/L
ピルビン酸カリウム(ナカライテスク社製) 15mmol/L
グルタミン合成酵素(キッコーマン社製) 10U/mL
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 10U/mL
<試薬2>
4−アミノアンチピリン(和光純薬工業社製) 5mmol/L
ピルビン酸オキシダーゼ(旭化成社製) 10U/mL
硫酸アンモニウム(ナカライテスク社製) 0mmol/L、1.8mmol/L、3.6mmol/L、7.2mmol/L
次に、200μLの試薬2をそれぞれ、800μLの試薬1と混和し、37℃で10分間反応させた。次に、混和した試薬の吸光度を測定したところ、図1に示すように、試薬2のアンモニア量と560nmの吸光度の増加量との間で良好な直線関係が得られた。
〔実施例2〕
以下に示す含浸液1及び含浸液2を調製し、ろ紙を準備した。
<含浸液1>
BES−水酸化ナトリウム緩衝液(同仁化学社製、pH7.5) 150mmol/L
L−グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製) 150mmol/L
1−ナフトール−3,6−ジスルホン酸二ナトリウム(和光純薬工業社製) 10mmol/L
チアミンピロリン酸(東京化成工業社製) 1.5mmol/L
フラビンアデニンジヌクレオチド(東京化成工業社製) 1.5mmol/L
塩化マグネシウム六水和物 50mmol/L
アデノシン三リン酸二水和物(Roche社製) 15mmol/L
ピルビン酸カリウム(ナカライテスク社製) 30mmol/L
グルタミン合成酵素(キッコーマン社製) 45U/mL
ピルビン酸オキシダーゼ(旭化成社製) 70U/mL
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 70U/mL
<含浸液2>
4−アミノアンチピリン(和光純薬工業社製) 15mmol/L
<ろ紙>
3MM HP(Whatman社製)
以下に示す含浸液1及び含浸液2を調製し、ろ紙を準備した。
<含浸液1>
BES−水酸化ナトリウム緩衝液(同仁化学社製、pH7.5) 150mmol/L
L−グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製) 150mmol/L
1−ナフトール−3,6−ジスルホン酸二ナトリウム(和光純薬工業社製) 10mmol/L
チアミンピロリン酸(東京化成工業社製) 1.5mmol/L
フラビンアデニンジヌクレオチド(東京化成工業社製) 1.5mmol/L
塩化マグネシウム六水和物 50mmol/L
アデノシン三リン酸二水和物(Roche社製) 15mmol/L
ピルビン酸カリウム(ナカライテスク社製) 30mmol/L
グルタミン合成酵素(キッコーマン社製) 45U/mL
ピルビン酸オキシダーゼ(旭化成社製) 70U/mL
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製) 70U/mL
<含浸液2>
4−アミノアンチピリン(和光純薬工業社製) 15mmol/L
<ろ紙>
3MM HP(Whatman社製)
次に、含浸液1及び含浸液2をろ紙に含浸し、乾燥させて試験片を得た。得られた試験片に図2に示すアンモニア濃度の硫酸アンモニウム水溶液を点着し、常温にて10分間放置した後に、硫酸アンモニウム水溶液を点着させた箇所の反射率(560nm)を読み取り、以下に示すK/S値に変換した。
K/S値=(1−R)2/2R(Kubelka−Munk式、Rは反射率)
K/S値=(1−R)2/2R(Kubelka−Munk式、Rは反射率)
図2に示すように、アンモニア濃度と560nmにおけるK/S値との間で良好な直線関係が得られた。
以上により、本実施例では、簡便な方法で高感度なアンモニアの定量が可能であることが示された。
1 反応部、2 測定部、100 定量装置
Claims (11)
- アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、
生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、
ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法。 - 更に、触媒であるマグネシウムイオン(Mg2+)及びマンガンイオン(Mn2+)の少なくとも一方の存在下にて前記被検液に前記グルタミン合成酵素を作用させて前記リン酸を生成する請求項1に記載のアンモニアの定量方法。
- 更に、補酵素であるチアミンピロリン酸及びフラビンアデニンヌクレオチドの存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させる請求項1又は請求項2に記載のアンモニアの定量方法。
- 前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生成された過酸化水素を測定する請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のアンモニアの定量方法。
- 呈色反応又は電気化学反応を行い、生成された前記過酸化水素を測定する請求項4に記載のアンモニアの定量方法。
- ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、
前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬。 - 水素供与体を含有する第1試薬と、
カップラーを含有する第2試薬と、を含有し、
ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、前記第1試薬及び前記第2試薬の少なくとも一方に含有され、
酵素は、前記グルタミン合成酵素、前記ピルビン酸オキシダーゼ及び前記ペルオキシダーゼからなる定量試薬キット。 - ピルビン酸、アデノシン三リン酸、L−グルタミン酸及び酵素を含有し、
前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片。 - アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びL−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、
生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、
ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置。 - アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる酵素と、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記L−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、かつ、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて反応を行う反応部と、
前記反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部と、
を備えるアンモニアの定量装置。 - アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、L−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる酵素と、水素供与体と、カップラーと、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記L−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、かつ、生成された前記過酸化水素、前記水素供与体、及び前記カップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させて色素を生成する反応を行う反応部と、
前記反応部での反応により生成された前記色素を測定する測定部と、
を備えるアンモニアの定量装置。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15/667,172 US20180037927A1 (en) | 2016-08-05 | 2017-08-02 | Quantification Method for Ammonia, Quantification Reagent, Quantification Reagent Kit, Test Piece, and Ammonia Quantification Device |
CN201710655702.7A CN107688017A (zh) | 2016-08-05 | 2017-08-03 | 氨的定量方法、定量试剂、定量试剂盒、测试片和氨定量装置 |
EP17184904.5A EP3279658A1 (en) | 2016-08-05 | 2017-08-04 | Quantification method for ammonia, quantification reagent, quantification reagent kit, and ammonia quantification device |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016154872 | 2016-08-05 | ||
JP2016154872 | 2016-08-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018023364A true JP2018023364A (ja) | 2018-02-15 |
Family
ID=61193305
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017118044A Pending JP2018023364A (ja) | 2016-08-05 | 2017-06-15 | アンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2018023364A (ja) |
-
2017
- 2017-06-15 JP JP2017118044A patent/JP2018023364A/ja active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20060199238A1 (en) | ADP detection using an enzyme-coupled reaction | |
CN101498662A (zh) | 单胺氧化酶mao单试剂测定试剂盒 | |
Xu et al. | Fluorescence determination of hydrogen peroxide using hemoglobin as a mimetic enzyme of peroxidase | |
EP3315611B1 (en) | Quantification test piece for ammonia, and ammonia quantification device | |
CN109385409B (zh) | 谷氨酰胺合成酶反应方法、氨定量方法、谷氨酰胺合成酶反应用试剂和氨定量用试剂盒 | |
CN101403691A (zh) | 一种三聚氰胺或三聚氰酸的测定方法及它的试剂盒或试纸条 | |
JP6989300B2 (ja) | アンモニアの定量方法、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置 | |
EP3279658A1 (en) | Quantification method for ammonia, quantification reagent, quantification reagent kit, and ammonia quantification device | |
JP2018023364A (ja) | アンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置 | |
JP2006187251A (ja) | ピロリン酸の定量方法 | |
WO2012050536A1 (en) | Method of the adenosine diphosphate quantitative determination | |
JP2000253898A (ja) | 物質または酵素の定量方法および定量試薬 | |
JP2804079B2 (ja) | Nad(p)hの定量法 | |
US5447847A (en) | Quantitative determination of pyruvic acid and quantitative analysis for component of living body making use of such determination | |
CN111575339A (zh) | 1,5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂 | |
JP2020048473A (ja) | Nadh及びnadphの安定化法 | |
JP7234923B2 (ja) | 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法 | |
JP5633669B2 (ja) | Adpの測定方法およびadp測定用キット | |
JP2000232898A (ja) | 物質の定量方法および定量試薬 | |
Wimmer et al. | Peroxidase-coupled method for kinetic colorimetry of total creatine kinase activity in serum. | |
US20220112537A1 (en) | Stabilization of nadph or nadh in ammonia detection assays | |
JPS61173799A (ja) | 基質又は酵素活性の定量方法 | |
US6696266B1 (en) | Method for assaying ammonia using an NAD-based cycling reaction system | |
JPH01174399A (ja) | 高感度比色定量法 | |
JPH0595798A (ja) | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 |