JP4033921B2 - 試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼを測定するための組成物、方法及び試験具 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在について試料を測定するための、新規な組成物、試験具及び方法に関する。更に詳しくは、本発明は、ヒドロキシ保護5−フェニル−3−ヒドロキシ−ピロリル−(L)−乳酸エステルのような乳酸エステルを、セリンプロテアーゼをベースとする酵素の発色性基質として使用することに関する。この乳酸エステルは、白血球細胞、エステラーゼ、エラスターゼ又はプロテアーゼを含有する試験試料との接触により、検出可能な又は測定可能な応答を受ける。乳酸エステル及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む組成物は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについてより高感度の測定を可能にするため、白血球細胞濃度の検出を向上させる。本発明の乳酸エステルとジアゾニウム塩カップリング剤との組合せにより示される感度の上昇により、尿のような生物学的液体などの試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて改良された測定方法が提供される。この乳酸エステルは、本発明の乳酸エステルを組み込んだ乾燥相試験ストリップを用いる簡便な「浸して読む」方法(dip-and-read method )による試験試料中の白血球細胞濃度の検出には、特に有用である。
【0002】
【従来の技術】
個人の尿中の異常に高レベルの白血球細胞の存在は、腎臓又は尿生殖路感染症のような病的状態を示す。尿中の白血球エステラーゼの検出は、細菌尿(即ち、異常に高レベルの細菌)、そしてそのため感染症についての間接試験である。したがって、正確な尿白血球細胞測定、即ち白血球エステラーゼ測定は、腎臓及び尿生殖路感染症の診断及び治療をする医師には有用である。
【0003】
伝統的に、技師は、尿沈殿物又は遠心分離していない尿中の白血球細胞を数える視覚的な方法に頼っていた。従来の視覚的な方法は、法外な技師の時間に加えて、遠心分離機及び顕微鏡のような高価な装置を要する。更に視覚的方法の不利な点は、完全な白血球細胞のみしか数えられないことである。しかし、泌尿器系中の白血球細胞は、大量の細胞溶解を受けやすい。例えば、異常に高いpHを有する尿中では白血球細胞の半減期はわずか60分である。視覚的方法では溶解した白血球細胞は検出できないため、誤って低い、即ち偽陰性の白血球細胞についての結果がもたらされる。
【0004】
尿中の白血球細胞についての視覚的試験は、遠心分離していない尿又は尿沈殿物で行うことができる。後者の方法は、尿試料を遠心分離し、沈殿物を単離し、次いで沈殿物を視覚的に検査することを要し、ここで技師は、視界に現れる白血球細胞の数を数える。この視覚的方法は、上皮細胞や塩粒子のような尿沈殿物の他の成分の存在により複雑なものになる。種々の尿沈殿物成分の存在は、非均一試料又は顕微鏡間の異なる光学倍率のような他の因子と相俟って、実質的な測定誤差を招くことがある。
【0005】
したがって、時間のかかる計数技術や高価な装置の必要をなくす、かつ完全な及び溶解した白血球細胞について正確な測定を与える、迅速簡便な白血球細胞を測定する方法が、当該分野に著しい進歩をもたらすであろう。本発明はこのような進歩を提供する。更に、本発明は白血球細胞中のエステラーゼ又はプロテアーゼの酵素活性に基づき、完全な白血球細胞を視覚的に観察し数える能力には基づいていないため、本方法は、上述の測定誤差を受けない。
【0006】
本発明に先立ち、試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を測定するための組成物及び方法は、エステラーゼ又はプロテアーゼによる加水分解の結果としてアルコール生成物を生成する発色性エステルを利用していた。その完全な発色性エステルは、アルコール加水分解生成物とは異なる色を有する。したがって発色性エステルの加水分解により生ずる色変化により、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を検出する方法が可能になり、これが次に白血球細胞の存在又は濃度に相関する。これらの先行組成物の多くが、測定応答を向上させるために、発色性エステルと共に、促進化合物及びジアゾニウム塩カップリング剤を使用していた。
【0007】
現在の、白血球エステラーゼの尿測定(結局、白血球細胞の間接的測定になる)は、Miles, Inc., Elkhart, INから入手可能な、LEUKOSTIX (登録商標)という名の乾燥相試験ストリップである。この試験ストリップは、白血球細胞の顆粒から尿中に放出されるエステラーゼ活性を検出する。放出されたエステラーゼは、「ヒト白血球エラスターゼ」(HLE)と呼ばれ、セリンプロテアーゼを基礎とする酵素である。
【0008】
LEUKOSTIX (登録商標)ストリップを使用する白血球エステラーゼ即ちHLEの測定では、この酵素が、ストリップに組み込まれた発色性エステルを加水分解してピロール化合物を形成し、これが次にジアゾニウム塩と反応して高度に発色したアゾ色素を形成する。色転移の程度と強度は、尿中の白血球エステラーゼ即ちHLEの量と比例し、これが次に尿中の白血球細胞の数に比例する。
【0009】
LEUKOSTIX (登録商標)試験ストリップの反応化学は以下のように示される。
【0010】
【化23】
【0011】
特に、白血球エステラーゼのLEUKOSTIX (登録商標)測定法は、3−ヒドロキシ−5−フェニル−ピロール−N−トシル−L−アラニンエステル(I)の酵素による分解、即ち、加水分解により3−ヒドロキシ−5−フェニル−ピロール(II)が形成されることに基づく。次にこのヒドロキシ−ピロール(II)はジアゾニウム塩(III )(例えば、1−ジアゾ−2−ナフトール−4−スルホン酸)と反応して、紫色を有するアゾ色素(IV)が生成する。
【0012】
反応したLEUKOSTIX (登録商標)試験ストリップは、痕跡量〜3+までの増大する色強度の4つの色ブロックを有するカラーチャートと照合されるが、平均的尿で約10〜500細胞/ μL (マイクロリットル)を超える白血球細胞濃度、又は30〜1500ng/mL (ナノグラム/ミリリットル)を超えるHLEを示す。低比重試料では、更に低濃度のHLEが検出されうる。
【0013】
色の強度は、尿試料中に存在する酵素(例えばHLE)の量に比例し、したがって尿中の白血球細胞の数に正比例する。1+以上の色を生成する測定結果は、尿試料中に有意な数の白血球細胞が存在することを明確に示している。
【0014】
白血球細胞を測定するための、現在の組成物と方法は、Corey らの米国特許第4,657,855 号明細書及びSkjoldらの米国特許第4,637,979 号明細書に開示されている。そこに開示され上記で検討したように、現在のLEUKOSTIX (登録商標)試験ストリップは、アミノ酸エステル、特にアラニンエステルにより、白血球細胞の測定における色転移を与えている。エステラーゼ又はプロテアーゼ酵素の測定に関する他の特許には、Huglらの米国特許第4,806,423 号と第4,814,271 号が含まれる。
【0015】
HLE及び白血球細胞の測定に使用される現在の化合物や組成物と対照的に、本発明の方法と試験具は、ヒドロキシ保護5−フェニル−3−ヒドロキシ−ピロリル−L−乳酸エステルのような乳酸エステルを利用する。本乳酸エステルは、上述の構造式(I)を有するN−トシル−アラニンエステルのような、対応するアラニンエステルに比較して高い反応性を有する。本乳酸エステルとジアゾニウム塩カップリング剤の組合せもまた、HLEの更に高感度の測定を可能にする。乳酸エステルは、アラニンエステルのように、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼとの接触で、色転移のような検出可能な又は測定可能な応答を受ける。この応答は、試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの濃度に比例する。
【0016】
他の特許や文献は、色転移又は他の検出可能な応答を生成する、インドキシル−及びチオインドキシル−アラニンエステルの加水分解を開示している。これらの参照文献は、英国特許第1,128,371 号;Janoffら, Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 136, pp. 1045-1049 (1971) ;Sweetmanら, Jour. Hist. Soc., 22, pp. 327-339 ;及びBergerらの米国特許第4,278,763 号を含む。
【0017】
現在まで、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定に酵素基質として乳酸エステルの使用を開示した既知の特許又は文献はない。Dornらの米国特許第4,064,236 号明細書及びDornら, J. Med. Chem., 20, pp. 1464-1468 (1977) は、膵臓及び顆粒球エラスターゼの阻害剤を開示している。この幾つかの化合物は、切断の非開裂点及び開裂点に乳酸残基を含有する。これらの化合物は、強力なものから非常に弱い阻害剤まである。これらの化合物は、活性化された脱離基を含有せず、エラスターゼを阻害する選択性を上げるために、非加水分解部位に存在するアラニンに似ているカルバゼートエステルを含むエラスターゼに対する阻害剤として本来設計されている。同様に、特開昭52-057,121号公報は、強力な抗ペプシン及び抗カテプシン阻害活性を示すラクトシル−ポリペプチド化合物を開示しており、ここで再度乳酸残基は、阻害能力に組み込まれている。これに対して、本乳酸エステルは、高エステラーゼ(HLE)酵素活性を有する発色性基質であり、発色性乳酸エステルのエステル結合は加水分解部位である。
【0018】
J. Duferら, Ann. Pharm. Fr., 31, pp. 441-450 (1973) は、リンパ球中でのエステラーゼ活性を低下させた9−メトキシエリプチシン乳酸塩(9-methoxyellipticine lactate salt )を開示し、そしてこれは急性骨髄芽球性白血病に対して使用された。開示された乳酸塩は、エリプチシンの可溶化成分として使用され、エステラーゼに対して阻害活性を有する。
【0019】
H. Moorlagら, J. Org. Chem., 55, pp. 5878-5881 (1990) 及びH. Moorlagら, Tetrah.; Assym., 2, pp. 705-720 (1991)は、エナンチオ選択性を測定するために、ブタ肝臓エステラーゼを用いて、種々のα−置換マンデル酸エステル、α−置換乳酸エステル及びラセミ体α−置換α−ヒドロキシエステルの酵素的加水分解を開示している。ブタ肝臓エステラーゼは、α−置換乳酸エステルにはエナンチオ選択性を示さなかった。
【0020】
F. Kraicsovitsら, Symp. Pap. IUPAC Int. Symp. Chem. Nat. Prod., 1, pp. 37-40 (1978) は、セリンプロテアーゼである、キモトリプシンの存在下で基質の反応性に及ぼす構造の影響を開示し、その中で特定の非アミノ酸基質が乳酸残基を含有していた。これらの例では、乳酸残基は、加水分解部位にはなく、むしろ加水分解部位から除去された残基にある。
【0021】
J.W. Harper ら, Biochem., 23, pp. 2995-3002 (1984); G. Digenisら, J. Med. Chem., 29, pp. 1468-1476 (1986); A. Krantzら, J. Med. Chem., 33, pp. 464-479 (1990); 及びD.W. Ingles ら, Biochem. J., 108, pp. 561-569 (1968)のような文献は、HLE切断部位の天然基質が、アラニン又はバリンのようなアミノ酸であることを開示している。
【0022】
特にD.W. Ingles らの文献は、基質のアシルアミノ基の窒素−水素結合能力が窒素を酸素で置換する(即ち、乳酸への変換)ことにより排除される、アシル−α−キモトリプシンの脱アシル化の速度を開示している。L−フェニル−アラニルをL−フェニル−ラクチルに変化させた時、置換の酵素的速度が10倍低下した。立体特異性もまた、アミノNH残基を乳酸OR残基(ここでRは、酢酸又はカルボキシフェニルである)で置換すると700倍もの大きさで低下した。
【0023】
他に乳酸エステル及び/又はアラニンエステルの加水分解を開示している文献としては、
J. Suhら, J. Am. Chem. Soc., 107, pp. 4530-4535 (1985);
J. Suhら, J. Am. Chem. Soc., 98, pp. 1940-1947 (1976);
J. Suhら, Biochemical and Biophysical Research Communications, 64, pp.
863-869 (1975);
L.C. Kuoら, J. Mol. Biol., 163, pp. 63-105 (1983);
S.J. Hoffmanら, J. Am. Chem. Soc., 105, pp. 6971-6973 (1983);
P.L. Hall ら, J. Am. Chem. Soc., 91, pp. 485-461 (1968); 及び
M.W. Makinenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, pp. 3882-3886 (1976)が含まれる。
【0024】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、腎臓又は尿生殖路感染症の発症を検出し、進行をモニターするために、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて尿の正確かつ高感度の測定法が検査室と家庭での使用の両方に必要である。その測定法は、正確な診断をし、正しい治療法を実施し、モニターし及び維持し得る、試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの検出と測定を可能にするはずである。更に、その測定法が、尿中の白血球細胞又はHLEの簡便かつ経済的な測定のため「浸して読む」形での乾燥相の試験ストリップを利用すれば有利であろう。
【0025】
白血球細胞のための現在の試験ストリップは、測定の感度と迅速性の面で改良を要する。したがって、試験ストリップが低濃度の白血球細胞に対してより高感度であって、かつ約60秒以内に測定結果を与えるならば、当該分野に有意な進歩をもたらすであろう。本発明の組成物、装置及び方法に結実した研究が指向したのは、これらの改良を達成することであった。
【0026】
【発明が解決するための手段】
本発明の方法は、本発明の試薬組成物を組み込んだ適切な担体マトリックスを含む試験パッドを有する試験ストリップを利用することにより、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの迅速、正確かつ信頼できる測定法を提供する。本試薬組成物は、乳酸エステル、そして特に、ヒドロキシ保護5−フェニル−3−ヒドロキシ−ピロリル−L−乳酸エステルよりなる。この組成物は更に、緩衝剤、場合により促進化合物及び/又はジアゾニウム塩カップリング剤を含むことができる。この試薬組成物は、痕跡濃度の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼに高感度である。本試薬組成物は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定の感度を増強し、このため、より正確かつ信頼できる測定法を提供している。
【0027】
本発明の乳酸エステルを含む試薬組成物を使用する、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについての尿又は他の試料の既知の測定方法はない。
【0028】
簡単に述べると、本発明は、試験試料中の予め決められた成分の存在又は濃度を測定するための、新規かつ改良された組成物、試験具及び方法に関する。この試験具は、担体マトリックスを含む試験パッドを含む。この担体マトリックスは、予め決められた試験試料中の成分と相互作用して検出可能な応答を生成することのできる試薬組成物を組み込んでいる。家庭での使用のためには、本試薬組成物は視覚的に検出可能な応答を生成する。検査室での使用のためには、本試薬組成物は、視覚的に又は機械的に検出可能な応答を生成する。試験パッドの担体マトリックスには、フィルター紙のような吸湿性の材料;重合した材料のストリップ、層又は膜のような、非吸湿性の材料;又はそれらの組合せが含まれる。本試薬組成物は、担体マトリックス中に均一に組み込まれ、担体マトリックスは、試料の予め決められた成分による担体マトリックスの浸透性を維持しながら、担体マトリックス中に均一に試薬組成物を保持する。
【0029】
更に詳しくは、本発明は、新規かつ改良された試薬組成物を利用することによる、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて尿を測定する方法に関する。この試薬組成物は、(a)白血球エステラーゼとの相互作用により検出可能な応答を生むことのできる乳酸エステル;及び(b)緩衝剤を含む。
【0030】
本明細書で使用される「検出可能な応答」という用語は、試験具中でのパラメータの変化、又は発生を意味する。検出可能な応答は、視覚的に又は機械的に認めることが可能である。検出可能な応答の大きさは、水性試料中の特定の分析物の存在及び濃度に比例する。検出可能な応答の例としては、色、蛍光、反射率、pH、化学発光、分光測光法又は比色法での変化、又は発生を含むが、これらに限定されない。
【0031】
好適な実施態様において、本試薬組成物は、(a)構造式(V):
【0032】
【化24】
【0033】
(式中、Aは、アルコール保護基であり;Xは、O、S、又はNR2 であり;Rは、アリール又は低級アルキルであり;R1 は、水素又は低級アルキルであり;そしてR2 は、水素、低級アルキル又はアリールである)を有する乳酸エステル;及び(b)緩衝剤を含む。
【0034】
立体化学の面で、この乳酸エステルは、L型、D型、又はD及びL型のラセミ混合物であってよい。L型が好適である。この組成物は、場合により、3〜約15個の炭素原子を有するアルコールのような促進化合物(accelerator compound)、及び/又はジアゾニウム塩カップリング剤を含んでもよい。
【0035】
この方法は、試料を、試薬組成物、又は試薬組成物を組み込んだ試験具に接触させる工程、次に、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度について、色転移のような検出可能な応答を観察又は測定する工程を含む。
【0036】
この試薬組成物が、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定のために現在使用されている組成物に比較して対象分析物に対して高感度を示すため、本発明の重要な特徴により、試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼのより正確かつ信頼できる測定法が達成される。したがって、乳酸エステル及び場合によりジアゾニウム塩カップリング剤を含む本発明の試薬組成物を利用することにより、痕跡量から高濃度までの、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定がより正確になる。
【0037】
したがって、本発明の1つの面は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて尿又は他の液体試料を測定するための簡便、正確かつ再現性のある方法を提供することである。
【0038】
本発明の別の面は、HLEの測定において向上した感度と正確さを与える試薬組成物を利用することにより、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて尿を測定する方法を提供することである。
【0039】
本発明の別の面は、試験試料中のHLEと相互作用して、試験試料中のHLEの濃度を示す、色の変化のような可視的変化を生成するための、新規かつ改良された試験具を提供することである。
【0040】
本発明の更に別の面は、濃度範囲約5〜約500ng/mL でHLEについて尿を検出及び測定し、そしてこの測定値を尿中の白血球細胞の濃度(即ち、約2〜約175細胞/ μL )に関係づける高感度な方法を提供することである。
【0041】
【発明の実施の形態】
本発明の方法により、乳酸エステル、緩衝剤、及び場合により、促進化合物及び/又はジアゾニウム塩カップリング剤を含む試薬組成物を利用することにより、白血球細胞、エステラーゼ、プロテアーゼ又はHLEについての尿の測定が行われる。本発明の試薬組成物を使用することにより、構造式(V)の乳酸エステルのような乳酸エステルが、白血球エステラーゼ(HLE)により加水分解されて、例えば構造式(II)のヒドロキシ−ピロール化合物を与え、次にこれが場合により含まれるジアゾニウム塩と相互作用してアゾ色素を形成する。本発明の乳酸エステルは、HLEにより容易に加水分解されて、測定可能な色転移又は他の検出可能な応答を、約60〜約120秒以内に生成する。
【0042】
本発明の試薬組成物は、HLEを検出することができ、そのため白血球細胞を検出することができるが、これは一般構造式(VI):
【0043】
【化25】
【0044】
(式中、Aは、アルコール保護基であり;そしてBは、構造式(VI)の乳酸エステルが加水分解してB−OH化合物を生成する時に、検出可能な応答(好適には発色性応答)を与えることのできる残基である)を有する乳酸エステルを含む。この乳酸エステルは、D型、L型又はD及びL型のラセミ混合物であってよいが、L型が好適である。
【0045】
構造式(VI)の化合物のB−O−部分は、B−OH化合物の残基として定義される。したがって、B−O−部分は、例えば、置換又は非置換ピロール、チオフェン又はフランであってよい。B−O−残基を有する他の化合物の例は、アゾレゾルシノールエステル、フェノキシエステル(酸化的カプラーとの)、ロイコインドフェノールエステル、アゾ色素エステル、5−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニルメチレン)−2−チオキソチアゾリン−3−酢酸、WO 90/00618及びEP 399 490(両者とも本明細書に参照として組み込まれている)に開示された2−置換−6−ヒドロキシ−ベンゾチアゾール誘導体、ω−ニトロスチリルエステル、レゾルフィンエステル(resorufin ester)、アクリジノン、メロシアニン、8−ヒドロキシ−2H−ジベンズ(b,f)アゼピン−2−オン、ジベンゾアゼピノン、ジベンゾチアゼピノン、クマリンエステル、又は本明細書に参照として組み込まれているEP 254 051に開示された化学発光化合物類を含むが、これらに限定されない。
【0046】
好適な乳酸エステルは、一般構造式(V):
【0047】
【化26】
【0048】
(式中、Aは、アルコール保護基であり;Xは、O、S又はNR2 であり;Rは、アリール又は低級アルキルであり;R1 は、水素又は低級アルキルであり;そしてR2 は、水素、低級アルキル又はアリールである)を有する。一般構造式(V)の乳酸エステルは、酵素である白血球エステラーゼ又はHLEにより加水分解されて、ヒドロキシピロール(II)のようなヒドロキシ化合物を生成する。
【0049】
乳酸エステル(V)は、試薬組成物中に、約0.5〜約2mM(ミリモル)、好適には約0.8〜約1.5mMの濃度で存在する。この濃度範囲内で、痕跡量の白血球細胞を検出するのに充分な色転移又は他の検出可能な応答を与える、充分な量の乳酸エステルが試薬組成物中に存在する。
【0050】
本明細書で使用される「低級アルキル」という用語は、1〜約6個の炭素原子を含有するアルキル残基である。低級アルキル基の例は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル及びペンチルとヘキシルのすべての異性体を含むが、これらに限定されない。低級アルキル基は、非置換であってもよく、又は置換基が組成物又は試験具の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼを検出する能力を妨害しない限り、置換されていてもよい。アルキル置換基の例は、1〜6個の炭素原子を有するアルコキシ、ハロ、ニトロ、アリール及びアミノがあるが、これらに限定されない。
【0051】
アルコール保護基、即ち一般構造式(VI)の乳酸エステルのAの本体は、特に限定されず、アルコール残基を保護するために典型的に使用される本質的にいかなる保護基から選択してよい。
【0052】
アルコール保護基Aは、典型的にはスルホニルクロリド又はカルボン酸クロリド(即ち、アシルクロリド)の残基であり、構造式(VII )又は(VIII):
【0053】
【化27】
【0054】
(式中、R3 は、3〜約22個、好適には3〜約6個の炭素原子を有するアルキル基であるか、又はR3 は、アリール基である)を有する。R3 がアルキル基である時、このアルキル基は官能基化(例えば、メトキシ−スクシニル)されていてよい。
【0055】
本明細書で使用される、R、R2 及びR3 に関して「アリール」という用語は、いかなる芳香族環系をも意味する。「アリール」という用語には、例として、ピロリル、フェニル及びピリジルのような5員及び6員芳香族環系、及びナフチルのような縮合芳香族環系が含まれるが、これらに限定されない。芳香族環系は、複素環又は炭素環であってよく、置換基が発色性乳酸エステルの、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在下で加水分解する能力を妨害しない限り、置換されていても非置換であってもよい。置換基の例は、アルキル、ハロ、アシル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、スルフリル及びアミノがあるが、これらに限定されない。このアリール基は、好適には、非置換か、或はハロ基、又は1〜約10個の炭素原子を有するアルキル若しくはアルコキシ基のような、比較的非反応性の基で置換されたフェニル基である。
【0056】
アルコール保護基の例は、p−トルエンスルホニルクロリド(トシルクロリド即ちTsCl)、n−プロピルスルホニルクロリド(n−PrSO2 Cl)、塩化ベンゾイル(PhCOCl)、カルボメトキシエタンスルホニルクロリド及びチオフェンスルホニルクロリドがあるが、これらに限定されない。多くの他の具体的なアルコール保護基が当業者に既知であり、本乳酸エステルのA成分として使用することができる。例えば、多くのアルコール保護基が、本明細書に参照として組み込まれる、T.W. Greene ら, Protecting Groups in Organic Chemistry, 2d Ed., (1991)に開示されている。
【0057】
好適なアルコール保護基Aは、構造式(VII )を有し、スルホニル残基を含む。本発明の最も有利な実施のためには、構造式(VII )のアルコール保護基は、R3 としてフェニル基を有し、そしてそのフェニル基がメチル又はメトキシ残基で置換されている。
【0058】
本発明の好適な乳酸エステルは、構造式(IX):
【0059】
【化28】
【0060】
を有する発色性化合物であり、一般構造式(V)(式中、Xは、NR2 であり;Rは、フェニルであり;そしてR1 は、水素である)の乳酸エステルのL型である。更に好適な実施態様において、この発色性乳酸エステルは、構造式(X):
【0061】
【化29】
【0062】
(式中、R2 は、水素であり;そしてAは、p−トルエンスルホニル(即ち、Ts)である)を有する、即ち、構造式(V)(式中、Xは、NHであり;Aは、Tsであり;Rは、フェニルであり;そしてR1 は、Hである)の乳酸エステルのL型である。
【0063】
構造式(IX)(式中、R2 は、水素である)の種々の乳酸エステルが調製された。これらの発色性乳酸エステルは、第1表に5−フェニル−3−ヒドロキシ−ピロール−(L)−乳酸エステルとしてリストされる。第1表にリストされた発色性乳酸エステルは、乳酸のヒドロキシ(即ち、アルコール基)が保護された乳酸のエチルエステルから調製された。アルコールが保護された乳酸エチルエステルの出発物質も、第1表にリストされる。各乳酸エステルは、L型である。
【0064】
【表1】
【0065】
3−(O−トシル−(L)−ラクトイル)−5−フェニルピロール(IX)の合成は、第1表にリストされた各乳酸エステル(X)〜(XIV )を調製するために、又は一般構造式(V)又は(VI)を有する他の乳酸エステルを調製するために使用される合成経路を代表する。
【0066】
以下の実施例は、本発明の乳酸エステル、組成物及び試験具の調製方法及び使用方法を説明するために与えられる。種々の好適な実施態様は、以下本明細書の実施例に詳細に記載される。しかし、以下の実施例は、単なる例示であり、本明細書で開示され特許請求される発明の範囲を限定しようとするものではない。
【0067】
実施例及び明細書を通して、以下の略語を使用した:
mg = ミリグラム
g = グラム
kg = キログラム
cm = センチメートル
L = リットル
mL = ミリリットル
M = モル濃度
mM = ミリモル濃度
mol = モル
mmol = ミリモル
aq = 水性
hr = 時間
【0068】
赤外(IR)スペクトルは、他に記載がなければCDCl3 の溶液として、Perkin-Elmer Model 710B 又は237 赤外分光光度計により得た。ポリスチレンフィルムの1,620cm-1のバンドを外部校正標準として用いた。シグナルはcm-1として記載した。
【0069】
プロトン磁気共鳴(1H NMR)スペクトルは、300MHz でGE GN300NB分光計を使用するか、又は60MHz でVarian T-60 分光計を使用して得た;スペクトルは、他に記載がなければCDCl3 溶液中で得た。化学シフトは、内部標準(即ち、テトラメチルシラン)からの百万分率(ppm )下降で記載した。
【0070】
炭素−13磁気共鳴(13C NMR)スペクトル及びDEPT磁気共鳴スペクトルもまた、フーリエ変換及び完全プロトン広域バンドノイズデカップリング(full proton broad-band noise decoupling )を用いて、GE GN300NB分光計を使用して得た;スペクトルは、他に記載がなければ、アセトン−d6 、CD3 OD、DMSO−d6 又はCDCl3 溶液中で得た。炭素のシフトは、テトラメチルシランからの百万分率下降で記載した。
【0071】
質量スペクトル(MS)は、化学イオン化(CI)、電子衝撃(EI)又は高速原子衝撃(FAB)モードのいずれかで操作して、Hewlett-Packard 5985A 分光計で得た。高解像度質量スペクトルは、AEI MS-902分光計で得た。その他のスペクトルは、ミシガン州立大学の質量分析施設(East Lansing, MI 48824)から得た。
【0072】
旋光度は、Perkin-Elmer Corporationから入手可能な、Model 141 偏光計で得た。
【0073】
本発明の乳酸エステルの合成を例証するために、発色性乳酸エステル(X)〜(XIV )を調製した。これらの実施例は特定の出発物質と乳酸エステルを開示しているが、この合成方法が、一般的な構造式(VI)の乳酸エステルに含まれる広い範囲の分子種に適用できることは想像される。
【0074】
実施例1
構造式Xの乳酸エステルの合成
【0075】
【化30】
【0076】
トシルクロリド(TsCl)(8.1g、42.3mmol)を撹拌しながら塩化メチレン(CH2 Cl2 )(50mL)中の(L)−乳酸のエチルエステル(5.0g、4.81mL、42.3mmol)の溶液に添加し、これをアルゴン雰囲気下で0℃(氷浴)に冷却した。次にトリエチルアミン(TEA)(5.57g、7.67mL、55.0mmol)を滴下により、得られた溶液に添加した。次いで得られた反応混合物を0℃で7時間撹拌した。次にこの反応混合物を、1M 塩酸水溶液(aq HCl)(75mL)と氷(75g)の溶液に注いだ。CH2 Cl2 の有機層をHCl層から分離し、次に有機層を硫酸マグネシウム(MgSO4 )で乾燥した。濾過後、有機層を真空下で濃縮して、粗生成物の(L)−トシル乳酸エチルエステル10.5g(91%)を得た。
【0077】
粗生成物の(L)−トシル乳酸エチルエステル(10.5g、38.6mmol)を無水エタノール(12mL)に溶解し、得られた溶液を添加ロートで滴下により、蒸留水(20mL)中の水酸化ナトリウム(NaOH)(1.8g、46mmol)の冷却した(0℃の氷浴)溶液に、15分間にわたって添加した。0℃でアルゴン雰囲気下で5時間、得られた反応混合物を撹拌した後、反応混合物のpHをpH2に下げるため濃HClを滴下により添加して、注意深く反応を停止させた。次に固体塩化ナトリウム(NaCl)を反応混合物が飽和するまで添加し、水層をCH2 Cl2 50mL部で4回抽出した。合わせたCH2 Cl2 部をMgSO4 で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、粗生成物の(L)−O−トシル−乳酸(XIV )7.17g(76%)を得た。
【0078】
アルゴン雰囲気下で、粗生成物の(L)−O−トシル−乳酸(XIV )(1.5g、6.15mmol)を還流冷却器を取付けた25mL丸底フラスコに入れた。塩化チオニル(SOCl2 )(10.12g、6.2mL、85mmol)をそのフラスコに添加し、次にそのフラスコを予め加熱した(50℃)油浴に入れた。フラスコの中身を50℃で2時間撹拌した。次いでそのフラスコを室温に冷却して、最後に氷浴に入れた。次に、氷冷ヘキサン(25mL)をそのフラスコに添加した。固体生成物が観察されなかったため、そのフラスコ中の溶液を真空下で濃縮して、粗生成物の黄色油状物、即ち、(L)−O−トシル乳酸クロリド1.6g(量)を得た。
【0079】
別のフラスコに、ピリジン(1.5mL、18.6mmol)を、CH2 Cl2 (30mL)中の5−フェニル−3−ヒドロキシピロール(PPO−H)(986mg、6.2mmol)の冷却溶液(0℃の氷浴)に、アルゴン雰囲気下で迅速に滴下により添加し、続いてすぐにCH2 Cl2 (5mL)中の(L)−O−トシル−乳酸クロリド(1.6g、6.11mmol)の溶液を迅速な滴下により添加した。次に残った内容物を、追加のCH2 Cl2 5mLで滴下により添加した。得られた反応混合物を0℃で1時間撹拌して、次いで約1時間で室温に加温した。次に反応混合物を室温で一晩(16hr)撹拌した。
【0080】
次に、この反応混合物を1M のHCl水溶液25mL部で2回抽出した。次いで合わせたHCl部をCH2 Cl2 (25mL)で逆抽出した。最後にこのCH2 Cl2 抽出物を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液25mL部で2回抽出した。再度水層をCH2 Cl2 で逆抽出した後、合わせたCH2 Cl2 部をノーライトカーボン(norite carbon )とMgSO4 で処理し、次いで濾過し、そして最後に真空下で濃縮した。
【0081】
得られた油状物をヘキサン/酢酸エチル(1:1、25mL)に溶解した。得られた溶液をノーライトカーボンで処理し、次いで濾過し、最後に真空下で濃縮して、固体の粗生成物である乳酸エステル(X)1.7gを得た。この粗生成物の乳酸エステル(X)を温ヘキサン(10mL)中で粉砕し、次にヘキサン/酢酸エチル(4:1、2×8mL)8mL部中で2回粉砕した。有機溶媒をデカンテーションした後、固体生成物を真空下で乾燥して、桃色固体1.04gを得た。この桃色固体をヘキサン/酢酸エチル(1:1)に溶解し、ノーライトカーボンで処理し、濾過し、そして室温で真空下で濃縮して、クリーム色の固体として乳酸エステル(X)932mgを得た。
【0082】
構造式(X)の乳酸エステルを、プロトン(1H)及び炭素−13(13C)核磁気共鳴、元素分析(C/H/N)、質量分析(MS)、赤外分光法(IR)及び旋光度により分析した。分析データを以下に要約し、乳酸エステル(X)の構造を確認した。
【0083】
1H NMR (CDCl3,ppm): 1.65(d,3H), 2.42(s,3H), 5.12(qu.,1H), 6.26(dd,1H), 6.84(dd,1H), 7.18-7.5(m,7H), 7.84(d,2H), 8,15(brs,1H).
13C NMR (CDCl3,ppm): 18.51( メチル), 21.66( メチル), 73.96(CH,乳酸), 93.39(CH,ピロール), 107.89(CH, ピロール), 123.84(CH, 芳香環), 126.85(CH, 芳香環), 128.12(CH, 芳香環), 128.97(CH, 芳香環), 129.87(CH, 芳香環), 166.68(C=O).
C/H/N: 計算値: C: 62.39, H: 4.97, N: 3.63, S: 8.33; 実測値: C: 62.44, H: 5.03, N: 3.57, S: 8.65.
EI/ 質量分析 (18 EV, DIP): 385(M+,21.8), 227(2.3), 199(22.4), 158(67.5), 155( 基線), 91(41.7).
赤外: (CDCl3,cm-1): 3450, 3022, 1770, 1600, 1570, 1550, 1514, 1450, 1370, 1260, 1240, 1180, 1080, 1020, 980.
1cmセル中室温のメタノール(MeOH)1mL中の試料10mgの旋光度( λ=578): (-64.8 °).
【0084】
実施例2〜5
構造式(XI)〜(XIV )の乳酸エステルの合成
第1表にリストされた構造式(XI)〜(XIV )の5−フェニル−3−ヒドロキシ−ピロール乳酸エステルを、実施例1の発色性乳酸エステル(X)と本質的に同一の方法で調製した。しかし、発色性乳酸エステル(XI)〜(XIV )の合成には、異なるアルコール保護基、即ち、各々、n−プロピルスルホニル、ベンゾイル、メトキシスクシニルスルホニル及びチオフェンスルホニルを使用した。
【0085】
構造式(XI)〜(XIV )の乳酸エステルの調製は、以下に要約した分析データによって確認した。
nPr−SO 2 −(L)−Lac−OPP( XI )
1H NMR (CDCl3,ppm): 1.10(t,3H), 1.75(d,3H), 2.20(m,2H), 3.30(m,2H), 5.35(qu.,1H), 6.41(dd,1H), 6.95(dd,1H), 7.20-7.60(m,5H), 8.30(brs,1H).
13C NMR (CDCl3,ppm): 12.87( メチル), 17.23( メチレン), 18.59( メチル), 53.64( メチレン), 73.49(CH,乳酸), 98.32(CH,ピロール), 107.94(CH, ピロール), 123.86(CH, 芳香環), 126.90(CH, 芳香環), 128.96(CH, 芳香環), 166.5(C=O).
C/H/N: 計算値: C:56.97, H:5.64, N:4.15, S:9.49; 実測値: C:57.06, H:5.75, N:3.87, S:9.91.
FAB/質量分析: 337.2(M+,55), 159(基線).
赤外: (CDCl3,cm-1): 3400, 3010, 2980, 1768, 1573, 1512, 1454, 1400, 1360, 1254, 1169, 1116, 1084, 984.
1cmセル中室温のMeOH1mL中の試料13mgの旋光度( λ=578): (-48.5 °).
【0086】
PhCO−(L)−Lac−OPP( XII )
1H NMR (CDCl3,ppm): 1.75(d,3H), 5.55(qu.,1H), 6.40(dd,1H), 6.95(dd,1H), 7.15-7.7(m,8H), 8.1(d,2H), 8.2(brs,1H).
13C NMR (CDCl3,ppm): 17.13( メチル), 69.08(CH,乳酸), 98.57(CH,ピロール), 108.03(CH, ピロール), 123.82(CH, 芳香環), 126.68(CH, 芳香環), 128.41(CH, 芳香環), 128.89(CH, 芳香環), 129.91(CH, 芳香環), 133.33(CH, 芳香環), 165.98(C=O), 166.48(C=O).
C/H/N: 計算値: C:71.64, H:5.07, N:4.18; 実測値: C:71.92, H:5.22, N:4.28.
EI/ 質量分析 (18 EV, DIP): 333(M+,3.1), 177(42.8), 149(22.2), 105(基線), 77(0.7).
赤外: (CDCl3,cm-1): 3400, 3000, 1763, 1723, 1606, 1585, 1573, 1512, 1452, 1318, 1177, 1113.
1cmセル中室温のMeOH1mL中の試料12mgの旋光度( λ=578): (+13.3 °).
【0087】
MeOSucc−SO 2 −(L)−Lac−OPP( XIII )
1H NMR (CDCl3,ppm): 1.78(d,3H), 1.98(t,2H), 2.75(t,2H), 2.75(s,3H), 5.37(qu.,1H), 6.42(brs,1H), 6.98(brs,1H), 7.2-7.55(m,5H), 8.2(brs,1H).
13C NMR (CDCl3,ppm): 18.52( メチル), 28.42( メチレン), 47.29( メチレン), 52.4(メチル), 74.14(CH,乳酸), 98.37(CH,ピロール), 107.93(CH, ピロール), 123.89(CH, 芳香環), 126.94(CH, 芳香環), 128.98(CH, 芳香環).
C/H/N: 計算値: C:53.54, H:4.99, N:3.67, S:8.39; 実測値: C:53.05, H:5.07, N:3.41, S:7.75.
FAB/質量分析: 381(M+,63), 186(8.5), 159(基線), 91(12), 55(24.5).
赤外: (CDCl3,cm-1): 3450, 3000, 1751, 1741, 1572, 1513, 1453, 1439, 1359, 1319, 1255, 1208, 1030, 984.
1cmセル中室温のMeOH1mL中の試料7mgの旋光度( λ=578): (-27.1 °).
【0088】
2−チオフェン−SO 2 −(L)−Lac−OPP( XIV )
1H NMR (CDCl3,ppm): 1.70(d,3H), 5.19(qu.,1H), 6.32(dd,1H), 6.85(dd,1H), 7.12(t,1H), 7.20-7.50(m,5H), 7.70(dd,1H), 7.79(dd,1H), 8.19(brs,1H).
13C NMR (CDCl3,ppm): 18.44( メチル), 74.91(CH,乳酸), 98.34(CH,ピロール), 107.90(CH, ピロール), 123.85(CH, 芳香環), 126.85(CH, 芳香環), 127.54(CH, チオフェン), 128.95(CH, 芳香環), 134.09(CH, チオフェン), 134.71(CH, チオフェン).
C/H/N: 計算値: C:54.1, H:3.98, N:3.71, S:16.98; 実測値: C:53.4, H:4.16, N:3.69, S:16.81.
EI/ 質量分析: (18 EV, DIP): 377(M+,63.1), 236(4.4), 191(13.8), 164(4.9), 159( 基線), 147(66.1), 99(8.2), 83(1.1).
赤外: (CDCl3,cm-1): 3450, 3050, 2940, 1760, 1573, 1509, 1453, 1404, 1378, 1084, 1018.
1cmセル中室温のMeOH1mL中の試料12mgの旋光度( λ=578): (-34.3 °).
【0089】
組成物と試験具
一般構造式(VI)を有する乳酸エステルに加えて、試薬組成物は緩衝剤を含む。この緩衝剤は、水性試料と接触した時に反応のための適切なpHを与える化合物である。好適には、緩衝剤は、約7〜約10、最適には約8.5〜約9.0の範囲のpHを与えることができる。
【0090】
緩衝剤は、約200〜約600mMの濃度で本発明の試薬組成物に含まれるが、特定の情況では緩衝剤の濃度はこの範囲を超えても下回ってもよい。
【0091】
したがって、本発明の試薬組成物は、炭酸;BICINE;CHES;ホウ酸;リン酸;2,2−ビス(ヒドロキシメチル)−2,2’,2”−ニトリロトリエタノール;3,3−ジメチルグルタル酸;3−N−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS);1,3−ビス〔トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ〕プロパン(ビス−TRIS);トリ(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS);トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−マレイン酸(TRIS−マレイン酸);トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−マロン酸(TRIS−マロン酸);3−N−(トリスヒドロキシメチル)メチルアミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(TAPSO);2−(〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕アミノ)エタンスルホン酸(TES);N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES);及び当該分野で既知の他の緩衝剤又はそれらの組合せのような緩衝剤で適切なpHに緩衝化される。好適な緩衝剤は、ホウ酸−NaOHである。
【0092】
したがって、本発明の組成物は、構造式(VI)を有する乳酸エステル及び緩衝剤を含む。前述のように、構造式(VI)を有する乳酸エステル及び緩衝剤の特異的な本体は、特に限定されない。しかし、構造式(V)の乳酸エステルのような好適な乳酸エステル、及び緩衝剤は、最適な測定結果、即ち、検出可能な区別しうる応答を短時間で出すことができる。測定の最適化は、試薬組成物中に促進化合物及び/又はジアゾニウム塩カップリング剤を含むことにより更に促進される。
【0093】
「促進化合物」は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼにより構造式(V)又は(VI)の乳酸エステルの加水分解の速度を上昇させるすべての化合物である。促進化合物は、アルコール、並びにピリジン、イミダゾール及びそれらの誘導体のような化学的に多様なクラスの物質から選択される。これらの促進化合物は、本明細書に参照として組み込まれる、Bergerらの米国特許第4,299,917 号明細書に開示されている。疎水性アルコールは、白血球の活性を上昇させる特に有用な促進化合物である。分岐鎖アルコールもまた、エステラーゼ活性の有用な促進剤であることが示された。本発明の最も有利な実施のためには、促進化合物としてデカノールが使用される。促進化合物は、試薬組成物中に、組成物の0〜約4%(v/v )、好適には約0.1〜約2%(v/v )の量で存在する。本発明の最も有利な実施のためには、促進化合物は、組成物の約1%〜約2%(v/v )の量で存在する。
【0094】
本試薬組成物はまた、カップリング剤としてジアゾニウム塩を含むことができる。このジアゾニウム塩は、0〜約2mM、好適には0.1〜約1mMの濃度で存在する。本発明の最も有利な実施のためには、ジアゾニウム塩カップリング剤は、約0.5〜約1mMの濃度で存在する。このジアゾニウム塩は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼによる構造式(VI)の乳酸エステルの加水分解により生成する、ヒドロキシ−ピロール(II)のような、ヒドロキシ化合物であるB−OHと相互作用する。次にこのヒドロキシ化合物は、ジアゾニウム塩と相互作用して、濃い特有の色を示すアゾ色素を生成し、これが白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在を示す。
【0095】
しばしば、ヒドロキシ−ピロール(II)のようなヒドロキシ化合物は、それ自体明瞭な紫外(UV)吸収化合物であり、このため試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を検出するための指示薬として働くこともできる。試薬組成物の色変化の程度と強度は、ヒドロキシ−ピロール(II)の濃度が上昇するにつれて上昇する。ヒドロキシ−ピロール(II)の濃度は、試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はエラスターゼの量に正比例する。したがって、発色性乳酸エステル(V)の加水分解におけるヒドロキシ−ピロール(II)の生成(又は発色性乳酸エステル(VI)の加水分解におけるヒドロキシ化合物B−OHの生成)により生じた吸収の上昇は、試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はエラスターゼの量に関係する。しかし、よりめざましい青又は赤色転移は、ヒドロキシ化合物B−OH又はヒドロキシ−ピロール(II)と相互作用してアゾ色素を形成する、ジアゾニウム塩が存在する時に生じる。よりめざましい色変化は、より区別しうる色変化をもたらし、したがってより正確な測定結果を与える。
【0096】
このジアゾニウム塩カップリング剤は、一般構造式:
ArN+ ≡N
(式中、Arはアリール基である)を有する。更に詳しくは、ジアゾニウム塩は典型的には一般構造式(XVI ):
【0097】
【化31】
【0098】
(式中、R4 は、同一又は異なって、水素、低級アルキル又はアリールであるか、或は2つの隣接するR4 基は、一緒になって縮合環系を形成し(但し、いずれの場合もR4 の1つは、−N+ ≡N、即ち、ジアゾニウムである);Yは、N又はCR5 (ここで、R5 は、水素又は低級アルキルである)であり;そしてD- は、塩化物、臭化物又は他の適切なジアゾニウム残基の対イオンのような陰イオンである)を有する芳香族ジアゾニウム塩である。
【0099】
本明細書で使用される「縮合環系」という用語は、1対の炭素原子を共有する2つ以上の芳香族環を意味する。例えば、構造式(XVII):
【0100】
【化32】
【0101】
を有するジアゾニウム塩において、両方のG基は、一緒に縮合環系を形成することができ、ここで両方のG基は、例えば、構造式(XVIII )
【0102】
【化33】
【0103】
のジアゾニウム塩のように一緒に−(CH)4 −を構成する。F基は、水素、低級アルキル又はヒドロキシである。
縮合環系の別の例は、構造式(XIX ):
【0104】
【化34】
【0105】
(式中、式(XVII)の両方のG基は、一緒に−(CH=CH−CH=N)−を構成する)の構成物である。したがって、縮合環系は、多核、芳香族、かつ複素環又は同素環である。
【0106】
双性イオンであるジアゾニウム塩は、好適なカップリング剤である。双性イオンのジアゾニウム化合物は、ジアゾニウム残基の対イオン(即ち、陰イオン)が環系に共有結合しているジアゾニウム塩である。このような陰イオンの例は、スルホン酸(SO3 -)、炭酸(CO2 -)及びホスホン酸(PO3 -)を含むが、これらに限定されない。双性ジアゾニウム塩は、上述の一般構造式(XVII)(式中、Fは、水素、低級アルキル又はヒドロキシであり;D- は、共有結合陰イオンであり;Gは、同一又は異なって、水素、低級アルキル又はアリールであるか、或は両方のG基は、一緒になって縮合環系を形成する)を有する。
【0107】
種々のジアゾニウム塩が、本明細書に参照として組み込まれる、Skjoldらの米国特許第4,637,979 号明細書;Huglらの米国特許第4,806,423 号明細書;及びHuglらの米国特許第4,814,271 号明細書に開示されている。本発明の組成物と方法に有用な具体的なジアゾニウム塩の例は、1−ジアゾ−2−ナフトール−4−スルホナート及び1−ジアゾフェニル−3−カルボナートであるが、これらに限定されない。ジアゾニウム塩の他の例は、各々以下に構造式(XX)〜(XXVI)により図示した、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−1−ナフチルスルホナート(DNSA)、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ニトロ−1−ナフチルスルホナート(NDNSA)、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−1,7−ナフチルジスルホナート、2−メトキシ−4−(N−モルホリニル)ベンゼンジアゾニウムクロリド、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ブロモ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−シアノ−1−ナフチルスルホナート、及び4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−〔1−オキソプロピル〕−1−ナフチルスルホナートがあるが、これらに限定されない。
【0108】
【化35】
【0109】
好適なジアゾニウム塩は、構造式(XXI )の化合物であり、これは色転移を増強して、このため白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼに対する測定の感度を増強する。
【0110】
したがって、構造式(VI)の乳酸エステル、緩衝剤、及び場合により促進化合物及び/又はジアゾニウム塩カップリング剤を含む本発明の試薬組成物は、液体試料中の白血球細胞、エステラーゼ若しくはプロテアーゼ、又はHLEの存在又は濃度を測定する改良された方法に利用される。試薬組成物はHLEと相互作用して、構造式(VI)の乳酸エステルを加水分解し、これが色転移のような区別しうる測定可能な応答を生成する。この応答は、視覚的に又は機械により検出することができる。更に、上述の成分に加えて、本発明の試薬組成物は、場合により充分量の種々の他の成分を含むこともできる。
【0111】
本質的な成分の性質又は機能を著しく改変することなく、かつ白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定を妨害することのない成分も、場合により試薬組成物に含まれてよい。例えば、試薬組成物は、場合により、液体試料による試験具の試験パッドの湿潤を改善する化合物を含んでもよい。この化合物は、典型的には陰イオン性表面活性剤又は非イオン性表面活性剤である。ペンチル〜ドデシルの硫酸塩又はスルホン酸塩、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどの、長鎖炭素鎖硫酸塩又はスルホン酸塩のような、陰イオン性表面活性剤は、好適な表面活性剤である。表面活性剤は、試薬組成物中に、試薬組成物の全重量の0%〜約0.4%の濃度、好適には約0.05%〜約0.2%の濃度で含まれる。
【0112】
試薬組成物はまた、試験具の色転移の均一性のために重合性物質を含んでもよい。重合性物質は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン、カラゲーニン、カゼイン、アルブミン、メチルセルロース及び同様な天然及び合成重合性物質を含むが、これらに限定されない。好適な重合性物質は、ISP Corp., New York, NY から市販されている平均分子量約10,000〜約200,000のポリビニルピロリドンである。この重合性物質は、一般に試薬組成物の全重量の0%〜約4%、好適には約0.5%〜約2%の量で試薬組成物に含まれる。
【0113】
試薬組成物に含まれるそれら成分の担体は、水を含む。しかし、特定の成分の制限された水溶性のため、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び同様の溶媒のような有機溶媒が、担体に含まれてもよい。水とともに試薬組成物の担体に含ませる適切な有機溶媒の選択は、診断用測定方法を設計する当業者の能力の範囲内である。
【0114】
前述のように、試薬組成物は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を測定するための試料と接触して、応答、好適には色転移を受ける。色転移の強度と程度が、試料中の白血球細胞の濃度を定量的に測定するのに使用される。本発明の重要な特徴により、本発明の試薬組成物は、充分に分離され区別された色転移を与えるため、試料中の白血球細胞の濃度を、分光光度計又は比色計のような色測定機械を使用することなく、測定し正確に決定することができる。しかし、必要であれば、試験試料と、既知濃度の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼを含む溶液との色の程度と強度の差を測定するために、このような色測定機械を使用してもよい。
【0115】
本発明の方法を説明するために、一般構造式(V)の乳酸エステルと緩衝剤を含む試薬組成物を、HLEの乾燥相の試験ストリップ測定に使用した。この試薬組成物はまた、HLEの湿潤相測定にも使用できる。HLEの乾燥相又は湿潤相測定結果は、試験試料の白血球細胞濃度に関係づけることができる。
【0116】
本試薬組成物を利用する乾燥相の試験ストリップ測定方法は、当該分野で既知の方法により行われる。一般に、HLEの測定は、尿又は他の試験試料を、この試薬組成物を組み込んだ被検体検出具に接触させることにより行われる。被検体検出具は、試験試料中に浸すことができるか、又は試料は、被検体検出具に滴下により適用することができる。生じた被検体検出具の色の変化は、HLEの存在を証明し;そして、もしそう設計されるならば、生じた色転移は、標準化された色のチャートと比較して試料中のHLE、及びこれにより白血球細胞の濃度の定量測定を可能にする。
【0117】
典型的には、被検体検出具は、単一パッド試験ストリップ(単一被検体のみの測定のため)又は多数パッド試験ストリップ(同時に数種の被検体を測定するため)として設計された、試薬を含浸した試験ストリップである。どちらの型の試薬含浸試験ストリップについても、試験ストリップは、通常疎水性プラスチックから作成されるハンドル又は支持ストリップ及び試薬組成物を組み込んだ吸湿性又は非吸湿性担体マトリックスよりなる試薬試験パッドを含む。一般に、担体マトリックスは吸収性材料であり、試験試料が毛管作用に応じて担体マトリックスを通って動くことができ、試薬組成物と接触して検出可能な又は測定可能な色転移を生成する。
【0118】
担体マトリックスは、担体マトリックスが化学試薬に関して実質的に不活性であり、かつ液体試料の可溶性成分に関して多孔性又は吸収性である限り、目的の測定を行うために要する化学試薬を組み込むことのできるいかなる物質であってよい。「担体マトリックス」という表現は、水及び他の生理学的液体に不溶性である吸湿性又は非吸湿性マトリックスをいう。適切な吸湿性マトリックスは、フィルター紙、スポンジ物質、セルロース、木、織布や不織布などを含む。非吸湿性マトリックスは、ガラス繊維、ポリマーフィルム、及びプリフォームの又は微孔性の膜を含む。他の適切な担体マトリックスは、シリカゲル、アルミナ、珪藻土などのような疎水性無機粉末;粘土質物質;布;親水性天然重合性物質、特にセルロースビーズのようなセルロース物質、及びとりわけクロマトグラフィー紙のフィルター紙のような繊維含有紙;架橋ゼラチン、酢酸セルロース、ポリビニルクロリド、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリウレタン、架橋デキストラン、アガロース、及び他のそのような架橋及び非架橋水不溶性親水性ポリマーのような、合成又は修飾天然ポリマーを含む。疎水性かつ非吸収性物質は、本発明の担体マトリックスとしての使用には適切ではない。担体マトリックスは、異なる化学組成又は化学組成の混合物からなっていてもよい。このマトリックスはまた、硬さと柔らかさに関係した平滑さと粗さについても、変化してよい。しかし、すべての場合に、担体マトリックスは、親水性又は吸収性物質を含む。担体マトリックスは、吸湿性フィルター紙又は非吸湿性ポリマーフィルムから最も有利に作成される。そのハンドルは、通常、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート又はポリスチレンのような疎水性物質から形成される。
【0119】
試験ストリップが試験試料中のHLEを測定するよう設計されているならば、担体マトリックスは、試験試料中の可溶性成分が、試薬組成物を含浸した試験ストリップの試験パッドに浸透して飽和させることのできるいかなる吸湿性又は非吸湿性物質であってよい。好適な担体マトリックスは、紙(好適にはフィルター紙)のようなセルロース物質を含む親水性の吸湿性マトリックスである。担体マトリックスはまた、ポリウレタン又は架橋ゼラチンのようなポリマーフィルムを含む、親水性の非吸湿性マトリックスであってもよい。このような担体マトリックスは、試薬組成物に含まれる成分を懸濁し配置すること、及び担体マトリックスを通る試験試料の可溶性成分の浸透性のような、本発明の担体マトリックスに要求される性質のすべてを有する。
【0120】
本発明の最も有利な実施のためには、試薬組成物は適切な担体マトリックス中に含浸されて、試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定のための乾燥相試験ストリップで使用される。本発明の方法は、家庭又は検査室で行うことができる、試験試料中のHLE、したがって白血球細胞の存在又は濃度についての経済的で正確かつ信頼できる測定方法を与える。更に、本発明の方法により、試料中の痕跡量の白血球細胞の検出、区別及び測定が可能になり、このため測定を臨床的により有用なものにしている。
【0121】
本発明の方法により、白血球エステラーゼの存在に感受性のある試験具を調製した。0.8M のホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.8)と1重量%のポリビニルピロリドン(ISP Corp., Wayne, NJから入手可能なPVP K-60)を含む水溶液を、最初に調製した。次に、Whatman, Ltd., Maidenhead, Kent, U.K. から入手可能なWHATMAN 3MM フィルター紙の4インチ幅のストリップを、この水溶液で含浸した。次いでこの含浸したフィルター紙ストリップを、Thermoelectron, Kaukauna, WIから入手可能なAir Foil紙乾燥機中で、79℃〜121℃で約5〜6分間乾燥した。
【0122】
次に、この乾燥した含浸フィルター紙ストリップを、1.1mMの構造式(IX)〜(XIII)の乳酸エステル、0.7mMの4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ニトロ−1−ナフチルスルホナート(即ち、6−ニトロ−1,2−ナフトキノンジアジドとも呼ばれる、構造式(XX)の化合物)、1.5%(v/v )1−デカノール及び3%(v/v )ジメチルスルホキシドを含有するアセトン溶液中に浸漬することにより2回目の含浸を行った。2回目の含浸後、フィルター紙ストリップを60℃で約5〜6分間乾燥して、オフホワイトのフィルター紙ストリップを得た。この乾燥し2回含浸したフィルター紙パッドを、両面粘着テープで不透明な又は透明な疎水性プラスチックハンドルに固定した。次にこの乾燥し2回含浸したフィルター紙ストリップを、例えばパッドが約0.2インチ(0.5cm)×約0.2インチ(0.5cm)の大きさを有するように、試験ストリップ測定に適したサイズに切った。
【0123】
本発明の方法と組成物を利用して白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの定量方法を設計するために、試薬パッドのサイズ、試薬組成物溶液の濃度、試験試料の量、及び浸すよりはピペット操作によるかなどの、試験試料を試験ストリップに導入する方法の間の適正なバランスを決定することは、当業者の実験技術の範囲内であることが理解されるべきである。
【0124】
更に、担体マトリックスを、単一の水性、又は水性−有機溶媒の、試薬組成物のすべての必須及び任意成分を含んだ溶液中に、担体マトリックスを浸漬することにより飽和又は含浸できることが理解されるべきである。しかし、特定の試薬組成物成分が比較的低い水溶性を有するため、2回の浸漬を利用する2段階法が好適である。
【0125】
白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定を行うために、得られた試験ストリップを、試験パッドが尿試料で飽和されるのに充分な時間、その試料と接触させる。例えば約1〜約2分のような、予め決めた時間待って、応答について試験ストリップを視覚的に又は機械により検査した。試験パッドの色転移は、試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を現わす。
【0126】
多くの場合に、試験ストリップの単純な視覚による観察により、必要な情報が得られる。より正確な情報が必要であれば、試験ストリップに使用される特定の試薬組成物のために、種々の既知濃度の白血球細胞に対応する色点を有する色チャートを調製することができる。次に、試験試料に接触した後試験ストリップに生じた色をチャート上の色点と比較して、試験試料中の白血球細胞の濃度を測定することができる。更に、乾燥相試験ストリップ測定法は、視覚法とは反対に機械による分光光度法又は比色法を用いて、特に痕跡量から低濃度での色転移の程度と強度を測定できるように、より正確にすることができる。
【0127】
本発明の方法により得られる新規な予期せぬ結果を説明するために、本発明の試薬組成物を組み込んだ乾燥相試験ストリップを、HLEを含む標準化した溶液を測定するために使用した。各々1つの構造式(X)〜(XIV )を有する発色性乳酸エステルとジアゾニウム塩カップリング剤を組み込んだ個々の試験ストリップを、0、19又は48ng/mL のHLEを含有する標準化した溶液中に迅速に浸漬し、取り出した。標準化したHLE溶液を接触させた約2分後、試験ストリップの試験パッドの反射率を、Miles, Inc., Elkhart, INから入手可能なCLINITEK(登録商標)10臨床用反射率計で557nm(ナノメートル)で測定した。
【0128】
反射率の尺度を0〜1でとった反射率Rを、Kubelka-Munk関数中に組み込んだ:
K/S=(1−R2 /2R)
(式中、Kは、吸光係数であり;Sは、散乱係数であり;そしてRは、反射率である)。557nmで測定した反射率値をK/S値を計算するために使用した。K/S値は試験ストリップの色に比例するため、K/S値が大きい程、試験ストリップの色転移の程度と強度が大きく、かつ試験ストリップ中のHLEの濃度が高い。
【0129】
各々構造式(X)〜(XIV )を有する異なる発色性乳酸エステルを組み込んだ試験ストリップを、HLEの測定能力について、対応するアミノ酸エステル、即ち、アラニンエステルと比較した。例えば、構造式(X)のL型の乳酸エステルは、下記式:
【0130】
【化36】
【0131】
で示される構造を有する。HLE、したがって白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて尿を測定する能力について、乳酸エステル(X)を、対応するアラニン化合物(I)と比較した。対応するアラニン化合物(I)は、現在LEUKOSTIX (登録商標)試験ストリップで使用されている。
【0132】
【化37】
【0133】
構造式(XI)〜(XIV )の乳酸エステルも、対応するアラニンエステルと比較した。
【0134】
したがって、以下の実施例は、HLEの基質として作用し、これにより白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて試験試料を測定する構造式(VI)、特に構造式(V)の発色性乳酸エステルの能力を証明する。化合物(I)のようなアミノ酸エステルが、HLEを検出するために比色法の基質として使用されてきたことは既知である。以下の実施例は、本発明の、新規な非アミノ酸である乳酸をベースとする比色法の基質が、HLEのようなセリンプロテアーゼをベースとする酵素により容易に加水分解されて、検出可能で区別しうる色転移を与えることを説明する。
【0135】
実施例6
構造式(X)の乳酸エステルを組み込んだ、上述のとおり調製した乾燥相試験ストリップを、対応するアラニン誘導体(I)を組み込んだ乾燥相試験ストリップと、尿中のHLEを検出する能力について比較した。ジアゾニウム塩カップリング剤DNSA(XX)とNDNSA(XXI )の間の比較も行った。試験ストリップは、他は同一であった。個々の試薬ストリップを標準化したHLE溶液中に迅速に浸漬した後、下記表の結果を得た。浸漬の2分後、上述のように発色性応答について試験ストリップを検査した。
【0136】
【表2】
【0137】
驚くべきことに、構造式(X)の乳酸エステルは、酵素HLEにより容易に加水分解されて、構造式(I)のアラニン誘導体と少なくとも同じ強度の色転移を与えた。K/S値と、0と19ng/mL HLE間のK/S値の変化量は、アラニン誘導体(I)よりも構造式(X)の乳酸エステルが大きかった。したがって、構造式(X)の乳酸エステルは、HLEに対する応答において、アラニン誘導体(I)よりも強くかつ区別しうる色転移を与えた。更に、ジアゾニウム塩NDNSA(XXI )は、ジアゾニウム塩DNSA(XX)よりも大きなK/SとK/Sの変化量を与えた。ジアゾニウム塩(XXII)〜(XXVI)は、ジアゾニウム塩(XX)と(XXI )の間のK/SとK/Sの変化量であった。したがって、乳酸エステルとジアゾニウム塩NDNSA(XXI )の組合せが、現在使用されているアラニン誘導体(I)に比べて、試験試料中の痕跡量から低濃度の白血球細胞を検出する高められた能力を与えた。
【0138】
実施例7
構造式(XI)の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリップを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験ストリップと、実施例6に記載したのと同じ方法で比較した。すべての試験ストリップに、ジアゾニウム塩NDNSA(XX)を組み込んだ。測定結果を下記に要約した。
【0139】
【表3】
【0140】
実施例6と同様に、構造式(X)の乳酸エステルは、対応するアラニン誘導体よりも大きなK/S変化量を与えて、このためより強い区別しうる色転移を与えることにより、より高感度の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの測定法を与えた。
【0141】
実施例8
構造式(XII )の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリップを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験ストリップと、実施例6に記載したのと同じ方法で比較した。すべての試験ストリップにジアゾニウム塩NDNSA(XXI )を組み込んだ。測定結果を下記に要約した。
【0142】
【表4】
【0143】
実施例6及び7と同様に、構造式(XII )の乳酸エステルは、対応するアラニン誘導体よりも大きなK/SとK/S変化量を与えた。カルボニル基を有するベンゾイルブロッキング剤を含む化合物についての応答は、スルホニル基を有するブロッキング剤を含む化合物ほど大きくなかった。この低い応答は、実施例6、7、9及び10で試験した化合物に比較して小さいK/S変化量で観察された。したがって、スルホニル基を含み構造(VII )を有するアルコール保護基は、カルボニル基を含み構造(VIII)を有するアルコール保護基よりも好適であった。
【0144】
実施例9
構造式(XIII)の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリップを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験ストリップと、実施例6に記載したのと同じ方法で比較した。すべての試験ストリップにジアゾニウム塩NDNSA(XXI )を組み込んだ。測定結果を下記に要約した。
【0145】
【表5】
【0146】
構造式(XIII)の乳酸エステルが示すK/SとK/S変化量は、低いエステラーゼレベルでは、対応するアラニン誘導体のK/SとK/S変化量と同様であったが、高いエステラーゼレベルでは、対応するアラニン誘導体が示すK/SとK/S変化量よりも小さかった。しかし、式(XIII)の乳酸エステルのK/SとK/S変化量は、HLEの測定に充分であった。
【0147】
実施例10
構造式(XIV )の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリップを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験ストリップと、実施例6に記載したのと同じ方法で比較した。測定結果を下記に要約した。
【0148】
【表6】
【0149】
実施例6〜8と同様に、発色性乳酸エステル(XIV )は、対応するアラニン誘導体よりも大きなK/SとK/S変化量を示し、このため、試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの高感度かつ正確な測定法を提供した。
【0150】
実施例6〜10で証明されたように、本発明の発色性乳酸エステルは、試料中のHLEの非存在と存在の区別をつけることができ、かつ試料中のHLEの濃度を測定することができた。更に、この発色性乳酸エステルは、構造式(I)のアラニン誘導体のような従来法のアミノ酸を含有するHLE基質と同等の性能、かつ典型的にはそれよりも性能が優れていた。したがって、本発明の乳酸エステルは、尿のような生物学的液体中の、白血球細胞、又はエラスターゼ若しくはエステラーゼ活性を検出するのに有用な、新規なクラスの化合物である。
【0151】
種々の濃度のHLEに対する発色性乳酸エステルの感度を測定するための試験も行った。構造式(X)の発色性乳酸エステルについて、その対応するアラニン誘導体との測定結果を比較して、結果を第2表に示した。すべての測定にジアゾニウム塩NDNSA(XXI )を使用した。
【0152】
【表7】
【0153】
そのアラニン誘導体は、5〜500ng/mL (即ち、約2〜約175細胞/ μL )の範囲でHLEの測定に使用することができた。5ng/mL 未満では、アラニン誘導体の色転移は、区別しうる応答を与えるほど充分な強度がなかった。更に、200及び500ng/mL のHLEを有する溶液に対する応答に違いがなかった。したがって、技師は、200、500又は500ng/mL を超えるHLEを含有する試験試料を容易に区別することができなかった。
【0154】
しかし、第2表に示されるように、本乳酸エステルは、5ng/mL のHLEの存在で比較的高いK/Sを示したため、試験試料中の低いレベルのHLEを検出することができた。更に、乳酸エステル(XI)のK/S値は200及び500ng/mL のHLE間で上昇を続けたため、色転移の区別が向上した(例えば、機械的識別が向上した)。対照的に、アラニン誘導体を使用した時は、200〜500ng/mL のHLE間の色形成が充分に暗いため、技師は200又は500ng/mL のHLEを含有する試料を区別するのが困難であった。これらの結果により、低濃度のHLEに対する本発明の発色性乳酸エステルの高感度が更に証明され、このため、広い濃度範囲にわたって、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの正確な測定結果が得られた。
【0155】
本発明のヒドロキシ保護5−フェニル−3−ヒドロキシ−ピロリル−(L)−乳酸エステルは、現在市販の白血球細胞の試験ストリップ測定に使用されている、対応する5−フェニル−3−ヒドロキシ−ピロリル−トシル−(L)−アラニン酸基質に比べて、上昇した又は同等の反応性を有する、新規なクラスの発色性エステラーゼ基質である。セリンプロテアーゼをベースとする酵素に対する本乳酸をベースとする基質はまた、新規であって当該分野に進歩をもたらした。本組成物、方法及び試験具は、白血球細胞測定の感度を、わずか5ng/mL のHLEさえ2分以内に検出できるほど上昇させたため、痕跡レベルの白血球細胞の改善された検出を可能にした。本発明はまた、読み取り時間を120〜60秒に短縮することができる利点も有する。
【0156】
本明細書に記載された本発明の多くの修飾及び改変が、その精神と範囲を逸脱することなくなされることは明白であり、添付した請求の範囲により限定されるのみである。
Claims (33)
- 促進化合物及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む、請求項2記載の組成物。
- 乳酸エステルが、0.5〜2mMの濃度で存在する、請求項2記載の組成物。
- 緩衝剤が、7以上のpHを与える、請求項2記載の組成物。
- 緩衝剤が、7〜10のpHを与える、請求項2記載の組成物。
- 緩衝剤が、200〜600mMの濃度で存在する、請求項2記載の組成物。
- 促進化合物が、該組成物の0〜4%(v/v)の量で存在する、請求項2記載の組成物。
- 促進化合物が、3〜15個の炭素原子を有するアルコールを含む、請求項2記載の組成物。
- ジアゾニウム塩が、0〜2mMの濃度で存在する、請求項2記載の組成物。
- ジアゾニウム塩が、0.1〜1mMの濃度で存在し、かつ促進化合物が、該組成物の0.1%〜2%(v/v)の量で存在する、請求項3記載の組成物。
- ジアゾニウム塩が、1−ジアゾ−2−ナフトール−4−スルホナート、1−ジアゾフェニル−3−カルボナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ニトロ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−1,7−ナフチルジスルホナート、2−メトキシ−4−(N−モルホリニル)ベンゼンジアゾニウムクロリド、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ブロモ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−シアノ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−〔1−オキソプロピル〕−1−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項3記載の組成物。
- 促進化合物が、8〜15個の炭素原子を有するアルコールを含み、かつジアゾニウム塩カップリング剤が、1−ジアゾ−2−ナフトール−4−スルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ニトロ−1−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項13記載の組成物。
- 0重量%〜4重量%の重合体、0重量%〜0.4重量%の表面活性剤、又はそれらの混合物を更に含む、請求項2記載の組成物。
- 試験試料に接触した時に、試験試料中の白血球細胞の存在又は濃度を示すのに充分な色転移を示すことのできる組成物であって、
(a)0.5〜1.5mMの下記式:
(b)7〜10のpHを与えることのできる緩衝剤;
(c)0.1%〜2%(v/v)の、8〜15個の炭素原子を有するアルコール;及び
(d)0.1〜1mMの、1−ジアゾ−2−ナフトール−4−スルホナート、1−ジアゾフェニル−3−カルボナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ニトロ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−1,7−ナフチルジスルホナート、2−メトキシ−4−(N−モルホリニル)ベンゼンジアゾニウムクロリド、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ブロモ−1−ナフチルスルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−シアノ−1−ナフチルスルホナート、及び4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−〔1−オキソプロピル〕−1−ナフチルスルホナート、並びにそれらの混合物よりなる群から選択されるジアゾニウム塩カップリング剤
を含むことを特徴とする組成物。 - 試験試料が、完全な及び溶解した白血球細胞について測定される、請求項18記載の方法。
- エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度が、溶解した及び完全な白血球細胞の存在又は濃度に相関する、請求項18記載の方法。
- エステラーゼが、ヒト白血球エラスターゼである、請求項18記載の方法。
- 液体試験試料が、尿である、請求項18記載の方法。
- 試薬組成物が、試験試料1ml当たり5〜500ngのエステラーゼ又はプロテアーゼ濃度を検出及び測定できる、請求項18記載の方法。
- 試薬組成物が、試験試料1μl 当たり2〜175細胞の白血球細胞濃度を検出及び測定できる、請求項18記載の方法。
- 試薬組成物が、試験試料との接触の1分後に応答について試験される、請求項18記載の方法。
- 試薬組成物が、促進化合物及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む、請求項18記載の方法。
- 促進化合物が、8〜15個の炭素原子を有するアルコールを含み、かつジアゾニウム塩カップリング剤が、1−ジアゾ−2−ナフトール−4−スルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ニトロ−1−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項26記載の方法。
- 白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度の測定が、乾燥相(dry phase)測定である、請求項18記載の方法。
- 試薬組成物が、促進化合物及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む、請求項29記載の試験具。
- 促進化合物が、8〜15個の炭素原子を有するアルコールを含み、かつジアゾニウム塩カップリング剤が、1−ジアゾ−2−ナフトール−4−スルホナート、4−ジアゾ−3−ヒドロキシ−7−ニトロ−1−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項30記載の試験具。
- 試薬組成物が、促進化合物及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む、請求項32記載の被分析物検出具。
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