JPH0867651A

JPH0867651A - 試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼを測定するための組成物、方法及び試験具

Info

Publication number: JPH0867651A
Application number: JP7211648A
Authority: JP
Inventors: Gary M Johnson; ゲーリー・マイケル・ジョンソン; Robert J Schaeper; ロバート・ジェイ・シェーパー
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1994-08-22
Filing date: 1995-08-21
Publication date: 1996-03-12
Anticipated expiration: 2015-08-21
Also published as: EP0698600B1; DE69513248D1; DE69513248T2; JP4033921B2; EP0698600A1; US5464739A; US5512450A

Abstract

(57)【要約】【課題】試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又は
プロテアーゼの測定において向上した感度と正確さを与
える化合物、組成物及び試験具、並びに測定方法を提供
することである。【解決手段】下記式：【化３８】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；そしてＢ−Ｏ
−は、Ｂ−ＯＨ化合物の残基であって、かつこの乳酸エ
ステルが加水分解してＢ−ＯＨ化合物を生成する時に検
出可能な応答を与える）で示される構造を有する乳酸エ
ステル、これを含む組成物及び試験具、並びにこれを利
用する測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、白血球細胞、エス
テラーゼ又はプロテアーゼの存在について試料を測定す
るための、新規な組成物、試験具及び方法に関する。更
に詳しくは、本発明は、ヒドロキシ保護５−フェニル−
３−ヒドロキシ−ピロリル−（Ｌ）−乳酸エステルのよ
うな乳酸エステルを、セリンプロテアーゼをベースとす
る酵素の発色性基質として使用することに関する。この
乳酸エステルは、白血球細胞、エステラーゼ、エラスタ
ーゼ又はプロテアーゼを含有する試験試料との接触によ
り、検出可能な又は測定可能な応答を受ける。乳酸エス
テル及びジアゾニウム塩カップリング剤を含む組成物
は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについ
てより高感度の測定を可能にするため、白血球細胞濃度
の検出を向上させる。本発明の乳酸エステルとジアゾニ
ウム塩カップリング剤との組合せにより示される感度の
上昇により、尿のような生物学的液体などの試験試料中
の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて
改良された測定方法が提供される。この乳酸エステル
は、本発明の乳酸エステルを組み込んだ乾燥相試験スト
リップを用いる簡便な「浸して読む」方法（dip-and-re
ad method ）による試験試料中の白血球細胞濃度の検出
には、特に有用である。

【０００２】

【従来の技術】個人の尿中の異常に高レベルの白血球細
胞の存在は、腎臓又は尿生殖路感染症のような病的状態
を示す。尿中の白血球エステラーゼの検出は、細菌尿
（即ち、異常に高レベルの細菌）、そしてそのため感染
症についての間接試験である。したがって、正確な尿白
血球細胞測定、即ち白血球エステラーゼ測定は、腎臓及
び尿生殖路感染症の診断及び治療をする医師には有用で
ある。

【０００３】伝統的に、技師は、尿沈殿物又は遠心分離
していない尿中の白血球細胞を数える視覚的な方法に頼
っていた。従来の視覚的な方法は、法外な技師の時間に
加えて、遠心分離機及び顕微鏡のような高価な装置を要
する。更に視覚的方法の不利な点は、完全な白血球細胞
のみしか数えられないことである。しかし、泌尿器系中
の白血球細胞は、大量の細胞溶解を受けやすい。例え
ば、異常に高いｐＨを有する尿中では白血球細胞の半減
期はわずか６０分である。視覚的方法では溶解した白血
球細胞は検出できないため、誤って低い、即ち偽陰性の
白血球細胞についての結果がもたらされる。

【０００４】尿中の白血球細胞についての視覚的試験
は、遠心分離していない尿又は尿沈殿物で行うことがで
きる。後者の方法は、尿試料を遠心分離し、沈殿物を単
離し、次いで沈殿物を視覚的に検査することを要し、こ
こで技師は、視界に現れる白血球細胞の数を数える。こ
の視覚的方法は、上皮細胞や塩粒子のような尿沈殿物の
他の成分の存在により複雑なものになる。種々の尿沈殿
物成分の存在は、非均一試料又は顕微鏡間の異なる光学
倍率のような他の因子と相俟って、実質的な測定誤差を
招くことがある。

【０００５】したがって、時間のかかる計数技術や高価
な装置の必要をなくす、かつ完全な及び溶解した白血球
細胞について正確な測定を与える、迅速簡便な白血球細
胞を測定する方法が、当該分野に著しい進歩をもたらす
であろう。本発明はこのような進歩を提供する。更に、
本発明は白血球細胞中のエステラーゼ又はプロテアーゼ
の酵素活性に基づき、完全な白血球細胞を視覚的に観察
し数える能力には基づいていないため、本方法は、上述
の測定誤差を受けない。

【０００６】本発明に先立ち、試料中の白血球細胞、エ
ステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を測定する
ための組成物及び方法は、エステラーゼ又はプロテアー
ゼによる加水分解の結果としてアルコール生成物を生成
する発色性エステルを利用していた。その完全な発色性
エステルは、アルコール加水分解生成物とは異なる色を
有する。したがって発色性エステルの加水分解により生
ずる色変化により、エステラーゼ又はプロテアーゼの存
在又は濃度を検出する方法が可能になり、これが次に白
血球細胞の存在又は濃度に相関する。これらの先行組成
物の多くが、測定応答を向上させるために、発色性エス
テルと共に、促進化合物及びジアゾニウム塩カップリン
グ剤を使用していた。

【０００７】現在の、白血球エステラーゼの尿測定（結
局、白血球細胞の間接的測定になる）は、Miles, Inc.,
Elkhart, INから入手可能な、LEUKOSTIX （登録商標）
という名の乾燥相試験ストリップである。この試験スト
リップは、白血球細胞の顆粒から尿中に放出されるエス
テラーゼ活性を検出する。放出されたエステラーゼは、
「ヒト白血球エラスターゼ」（ＨＬＥ）と呼ばれ、セリ
ンプロテアーゼを基礎とする酵素である。

【０００８】LEUKOSTIX （登録商標）ストリップを使用
する白血球エステラーゼ即ちＨＬＥの測定では、この酵
素が、ストリップに組み込まれた発色性エステルを加水
分解してピロール化合物を形成し、これが次にジアゾニ
ウム塩と反応して高度に発色したアゾ色素を形成する。
色転移の程度と強度は、尿中の白血球エステラーゼ即ち
ＨＬＥの量と比例し、これが次に尿中の白血球細胞の数
に比例する。

【０００９】LEUKOSTIX （登録商標）試験ストリップの
反応化学は以下のように示される。

【００１０】

【化２３】

【００１１】特に、白血球エステラーゼのLEUKOSTIX
（登録商標）測定法は、３−ヒドロキシ−５−フェニル
−ピロール−Ｎ−トシル−Ｌ−アラニンエステル（Ｉ）
の酵素による分解、即ち、加水分解により３−ヒドロキ
シ−５−フェニル−ピロール（II）が形成されることに
基づく。次にこのヒドロキシ−ピロール（II）はジアゾ
ニウム塩（III ）（例えば、１−ジアゾ−２−ナフトー
ル−４−スルホン酸）と反応して、紫色を有するアゾ色
素（IV）が生成する。

【００１２】反応したLEUKOSTIX （登録商標）試験スト
リップは、痕跡量〜３＋までの増大する色強度の４つの
色ブロックを有するカラーチャートと照合されるが、平
均的尿で約１０〜５００細胞/ μL （マイクロリット
ル）を超える白血球細胞濃度、又は３０〜１５００ng/m
L （ナノグラム／ミリリットル）を超えるＨＬＥを示
す。低比重試料では、更に低濃度のＨＬＥが検出されう
る。

【００１３】色の強度は、尿試料中に存在する酵素（例
えばＨＬＥ）の量に比例し、したがって尿中の白血球細
胞の数に正比例する。１＋以上の色を生成する測定結果
は、尿試料中に有意な数の白血球細胞が存在することを
明確に示している。

【００１４】白血球細胞を測定するための、現在の組成
物と方法は、Corey らの米国特許第4,657,855 号明細書
及びSkjoldらの米国特許第4,637,979 号明細書に開示さ
れている。そこに開示され上記で検討したように、現在
のLEUKOSTIX （登録商標）試験ストリップは、アミノ酸
エステル、特にアラニンエステルにより、白血球細胞の
測定における色転移を与えている。エステラーゼ又はプ
ロテアーゼ酵素の測定に関する他の特許には、Huglらの
米国特許第4,806,423 号と第4,814,271 号が含まれる。

【００１５】ＨＬＥ及び白血球細胞の測定に使用される
現在の化合物や組成物と対照的に、本発明の方法と試験
具は、ヒドロキシ保護５−フェニル−３−ヒドロキシ−
ピロリル−Ｌ−乳酸エステルのような乳酸エステルを利
用する。本乳酸エステルは、上述の構造式（Ｉ）を有す
るＮ−トシル−アラニンエステルのような、対応するア
ラニンエステルに比較して高い反応性を有する。本乳酸
エステルとジアゾニウム塩カップリング剤の組合せもま
た、ＨＬＥの更に高感度の測定を可能にする。乳酸エス
テルは、アラニンエステルのように、白血球細胞、エス
テラーゼ又はプロテアーゼとの接触で、色転移のような
検出可能な又は測定可能な応答を受ける。この応答は、
試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアー
ゼの濃度に比例する。

【００１６】他の特許や文献は、色転移又は他の検出可
能な応答を生成する、インドキシル−及びチオインドキ
シル−アラニンエステルの加水分解を開示している。こ
れらの参照文献は、英国特許第1,128,371 号；Janoff
ら, Proc. Soc. Exper. Biol.Med., 136, pp. 1045-104
9 (1971) ；Sweetmanら, Jour. Hist. Soc., 22, pp.32
7-339 ；及びBergerらの米国特許第4,278,763 号を含
む。

【００１７】現在まで、白血球細胞、エステラーゼ又は
プロテアーゼの測定に酵素基質として乳酸エステルの使
用を開示した既知の特許又は文献はない。Dornらの米国
特許第4,064,236 号明細書及びDornら, J. Med. Chem.,
20, pp. 1464-1468 (1977)は、膵臓及び顆粒球エラス
ターゼの阻害剤を開示している。この幾つかの化合物
は、切断の非開裂点及び開裂点に乳酸残基を含有する。
これらの化合物は、強力なものから非常に弱い阻害剤ま
である。これらの化合物は、活性化された脱離基を含有
せず、エラスターゼを阻害する選択性を上げるために、
非加水分解部位に存在するアラニンに似ているカルバゼ
ートエステルを含むエラスターゼに対する阻害剤として
本来設計されている。同様に、特開昭52-057,121号公報
は、強力な抗ペプシン及び抗カテプシン阻害活性を示す
ラクトシル−ポリペプチド化合物を開示しており、ここ
で再度乳酸残基は、阻害能力に組み込まれている。これ
に対して、本乳酸エステルは、高エステラーゼ（ＨＬ
Ｅ）酵素活性を有する発色性基質であり、発色性乳酸エ
ステルのエステル結合は加水分解部位である。

【００１８】J. Duferら, Ann. Pharm. Fr., 31, pp. 4
41-450 (1973) は、リンパ球中でのエステラーゼ活性を
低下させた９−メトキシエリプチシン乳酸塩（9-methox
yellipticine lactate salt ）を開示し、そしてこれは
急性骨髄芽球性白血病に対して使用された。開示された
乳酸塩は、エリプチシンの可溶化成分として使用され、
エステラーゼに対して阻害活性を有する。

【００１９】H. Moorlagら, J. Org. Chem., 55, pp. 5
878-5881 (1990) 及びH. Moorlagら, Tetrah.; Assym.,
2, pp. 705-720 (1991)は、エナンチオ選択性を測定す
るために、ブタ肝臓エステラーゼを用いて、種々のα−
置換マンデル酸エステル、α−置換乳酸エステル及びラ
セミ体α−置換α−ヒドロキシエステルの酵素的加水分
解を開示している。ブタ肝臓エステラーゼは、α−置換
乳酸エステルにはエナンチオ選択性を示さなかった。

【００２０】F. Kraicsovitsら, Symp. Pap. IUPAC In
t. Symp. Chem. Nat. Prod., 1, pp.37-40 (1978) は、
セリンプロテアーゼである、キモトリプシンの存在下で
基質の反応性に及ぼす構造の影響を開示し、その中で特
定の非アミノ酸基質が乳酸残基を含有していた。これら
の例では、乳酸残基は、加水分解部位にはなく、むしろ
加水分解部位から除去された残基にある。

【００２１】J.W. Harper ら, Biochem., 23, pp. 2995
-3002 (1984); G. Digenisら, J. Med. Chem., 29, pp.
1468-1476 (1986); A. Krantzら, J. Med. Chem., 33,
pp.464-479 (1990); 及びD.W. Ingles ら, Biochem.
J., 108, pp. 561-569 (1968)のような文献は、ＨＬＥ
切断部位の天然基質が、アラニン又はバリンのようなア
ミノ酸であることを開示している。

【００２２】特にD.W. Ingles らの文献は、基質のアシ
ルアミノ基の窒素−水素結合能力が窒素を酸素で置換す
る（即ち、乳酸への変換）ことにより排除される、アシ
ル−α−キモトリプシンの脱アシル化の速度を開示して
いる。Ｌ−フェニル−アラニルをＬ−フェニル−ラクチ
ルに変化させた時、置換の酵素的速度が１０倍低下し
た。立体特異性もまた、アミノＮＨ残基を乳酸ＯＲ残基
（ここでＲは、酢酸又はカルボキシフェニルである）で
置換すると７００倍もの大きさで低下した。

【００２３】他に乳酸エステル及び／又はアラニンエス
テルの加水分解を開示している文献としては、J. Suh
ら, J. Am. Chem. Soc., 107, pp. 4530-4535 (1985);
J. Suhら, J. Am. Chem. Soc., 98, pp. 1940-1947 (19
76);J. Suhら, Biochemical and Biophysical Research
Communications, 64, pp.863-869 (1975);L.C. Kuoら,
J. Mol. Biol., 163, pp. 63-105 (1983);S.J. Hoffma
nら, J. Am. Chem. Soc., 105, pp. 6971-6973 (1983);
P.L. Hall ら, J. Am. Chem. Soc., 91, pp. 485-461
(1968); 及びM.W. Makinenら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 73, pp. 3882-3886 (1976)が含まれる。

【００２４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、腎臓又は
尿生殖路感染症の発症を検出し、進行をモニターするた
めに、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼにつ
いて尿の正確かつ高感度の測定法が検査室と家庭での使
用の両方に必要である。その測定法は、正確な診断を
し、正しい治療法を実施し、モニターし及び維持し得
る、試験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテ
アーゼの検出と測定を可能にするはずである。更に、そ
の測定法が、尿中の白血球細胞又はＨＬＥの簡便かつ経
済的な測定のため「浸して読む」形での乾燥相の試験ス
トリップを利用すれば有利であろう。

【００２５】白血球細胞のための現在の試験ストリップ
は、測定の感度と迅速性の面で改良を要する。したがっ
て、試験ストリップが低濃度の白血球細胞に対してより
高感度であって、かつ約６０秒以内に測定結果を与える
ならば、当該分野に有意な進歩をもたらすであろう。本
発明の組成物、装置及び方法に結実した研究が指向した
のは、これらの改良を達成することであった。

【００２６】

【発明が解決するための手段】本発明の方法は、本発明
の試薬組成物を組み込んだ適切な担体マトリックスを含
む試験パッドを有する試験ストリップを利用することに
より、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの迅
速、正確かつ信頼できる測定法を提供する。本試薬組成
物は、乳酸エステル、そして特に、ヒドロキシ保護５−
フェニル−３−ヒドロキシ−ピロリル−Ｌ−乳酸エステ
ルよりなる。この組成物は更に、緩衝剤、場合により促
進化合物及び／又はジアゾニウム塩カップリング剤を含
むことができる。この試薬組成物は、痕跡濃度の白血球
細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼに高感度である。
本試薬組成物は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテ
アーゼの測定の感度を増強し、このため、より正確かつ
信頼できる測定法を提供している。

【００２７】本発明の乳酸エステルを含む試薬組成物を
使用する、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼ
についての尿又は他の試料の既知の測定方法はない。

【００２８】簡単に述べると、本発明は、試験試料中の
予め決められた成分の存在又は濃度を測定するための、
新規かつ改良された組成物、試験具及び方法に関する。
この試験具は、担体マトリックスを含む試験パッドを含
む。この担体マトリックスは、予め決められた試験試料
中の成分と相互作用して検出可能な応答を生成すること
のできる試薬組成物を組み込んでいる。家庭での使用の
ためには、本試薬組成物は視覚的に検出可能な応答を生
成する。検査室での使用のためには、本試薬組成物は、
視覚的に又は機械的に検出可能な応答を生成する。試験
パッドの担体マトリックスには、フィルター紙のような
吸湿性の材料；重合した材料のストリップ、層又は膜の
ような、非吸湿性の材料；又はそれらの組合せが含まれ
る。本試薬組成物は、担体マトリックス中に均一に組み
込まれ、担体マトリックスは、試料の予め決められた成
分による担体マトリックスの浸透性を維持しながら、担
体マトリックス中に均一に試薬組成物を保持する。

【００２９】更に詳しくは、本発明は、新規かつ改良さ
れた試薬組成物を利用することによる、白血球細胞、エ
ステラーゼ又はプロテアーゼについて尿を測定する方法
に関する。この試薬組成物は、（ａ）白血球エステラー
ゼとの相互作用により検出可能な応答を生むことのでき
る乳酸エステル；及び（ｂ）緩衝剤を含む。

【００３０】本明細書で使用される「検出可能な応答」
という用語は、試験具中でのパラメータの変化、又は発
生を意味する。検出可能な応答は、視覚的に又は機械的
に認めることが可能である。検出可能な応答の大きさ
は、水性試料中の特定の分析物の存在及び濃度に比例す
る。検出可能な応答の例としては、色、蛍光、反射率、
ｐＨ、化学発光、分光測光法又は比色法での変化、又は
発生を含むが、これらに限定されない。

【００３１】好適な実施態様において、本試薬組成物
は、（ａ）構造式（Ｖ）：

【００３２】

【化２４】

【００３３】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ² であり；Ｒは、アリール又は
低級アルキルであり；Ｒ¹ は、水素又は低級アルキルで
あり；そしてＲ² は、水素、低級アルキル又はアリール
である）を有する乳酸エステル；及び（ｂ）緩衝剤を含
む。

【００３４】立体化学の面で、この乳酸エステルは、Ｌ
型、Ｄ型、又はＤ及びＬ型のラセミ混合物であってよ
い。Ｌ型が好適である。この組成物は、場合により、３
〜約１５個の炭素原子を有するアルコールのような促進
化合物（accelerator compound）、及び／又はジアゾニ
ウム塩カップリング剤を含んでもよい。

【００３５】この方法は、試料を、試薬組成物、又は試
薬組成物を組み込んだ試験具に接触させる工程、次に、
白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は
濃度について、色転移のような検出可能な応答を観察又
は測定する工程を含む。

【００３６】この試薬組成物が、白血球細胞、エステラ
ーゼ又はプロテアーゼの測定のために現在使用されてい
る組成物に比較して対象分析物に対して高感度を示すた
め、本発明の重要な特徴により、試料中の白血球細胞、
エステラーゼ又はプロテアーゼのより正確かつ信頼でき
る測定法が達成される。したがって、乳酸エステル及び
場合によりジアゾニウム塩カップリング剤を含む本発明
の試薬組成物を利用することにより、痕跡量から高濃度
までの、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの
測定がより正確になる。

【００３７】したがって、本発明の１つの面は、白血球
細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについて尿又は他
の液体試料を測定するための簡便、正確かつ再現性のあ
る方法を提供することである。

【００３８】本発明の別の面は、ＨＬＥの測定において
向上した感度と正確さを与える試薬組成物を利用するこ
とにより、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼ
について尿を測定する方法を提供することである。

【００３９】本発明の別の面は、試験試料中のＨＬＥと
相互作用して、試験試料中のＨＬＥの濃度を示す、色の
変化のような可視的変化を生成するための、新規かつ改
良された試験具を提供することである。

【００４０】本発明の更に別の面は、濃度範囲約５〜約
５００ng/mL でＨＬＥについて尿を検出及び測定し、そ
してこの測定値を尿中の白血球細胞の濃度（即ち、約２
〜約１７５細胞/ μL ）に関係づける高感度な方法を提
供することである。

【００４１】

【発明の実施の形態】本発明の方法により、乳酸エステ
ル、緩衝剤、及び場合により、促進化合物及び／又はジ
アゾニウム塩カップリング剤を含む試薬組成物を利用す
ることにより、白血球細胞、エステラーゼ、プロテアー
ゼ又はＨＬＥについての尿の測定が行われる。本発明の
試薬組成物を使用することにより、構造式（Ｖ）の乳酸
エステルのような乳酸エステルが、白血球エステラーゼ
（ＨＬＥ）により加水分解されて、例えば構造式（II）
のヒドロキシ−ピロール化合物を与え、次にこれが場合
により含まれるジアゾニウム塩と相互作用してアゾ色素
を形成する。本発明の乳酸エステルは、ＨＬＥにより容
易に加水分解されて、測定可能な色転移又は他の検出可
能な応答を、約６０〜約１２０秒以内に生成する。

【００４２】本発明の試薬組成物は、ＨＬＥを検出する
ことができ、そのため白血球細胞を検出することができ
るが、これは一般構造式（VI）：

【００４３】

【化２５】

【００４４】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；
そしてＢは、構造式（VI）の乳酸エステルが加水分解し
てＢ−ＯＨ化合物を生成する時に、検出可能な応答（好
適には発色性応答）を与えることのできる残基である）
を有する乳酸エステルを含む。この乳酸エステルは、Ｄ
型、Ｌ型又はＤ及びＬ型のラセミ混合物であってよい
が、Ｌ型が好適である。

【００４５】構造式（VI）の化合物のＢ−残基は、Ｂ−
ＯＨ化合物の残基として定義される。したがって、Ｂ−
残基は、例えば、置換又は非置換ピロール類、チオフェ
ン類又はフラン類残基であってよい。Ｂ−残基を有する
他の化合物の例は、アゾレゾルシノールエステル類、フ
ェノキシエステル類（酸化的カプラーとの）、ロイコイ
ンドフェノールエステル類、アゾ色素エステル類、５−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニルメチレ
ン）−２−チオキソチアゾリン−３−酢酸、WO90/00618
及びEP 399 490（両者とも本明細書に参照として組み
込まれている）に開示された２−置換−６−ヒドロキシ
−ベンゾチアゾール誘導体類、ω−ニトロスチリルエス
テル類、レソルフィンエステル（resorufin ester ）
類、アクリジノン類、メロシアニン類、８−ヒドロキシ
−２Ｈ−ジベンズ（ｂ，ｆ）アゼピン−２−オン類、ジ
ベンゾアゼピノン類、ジベンゾチアゼピノン類、クマリ
ンエステル類、又は本明細書に参照として組み込まれて
いるEP 254 051に開示された化学発光化合物類を含む
が、これらに限定されない。

【００４６】好適な乳酸エステルは、一般構造式
（Ｖ）：

【００４７】

【化２６】

【００４８】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ² であり；Ｒは、アリール又は低
級アルキルであり；Ｒ¹ は、水素又は低級アルキルであ
り；そしてＲ² は、水素、低級アルキル又はアリールで
ある）を有する。一般構造式（Ｖ）の乳酸エステルは、
酵素である白血球エステラーゼ又はＨＬＥにより加水分
解されて、ヒドロキシピロール（II）のようなヒドロキ
シ化合物を生成する。

【００４９】乳酸エステル（Ｖ）は、試薬組成物中に、
約０．５〜約２mM（ミリモル）、好適には約０．８〜約
１．５mMの濃度で存在する。この濃度範囲内で、痕跡量
の白血球細胞を検出するのに充分な色転移又は他の検出
可能な応答を与える、充分な量の乳酸エステルが試薬組
成物中に存在する。

【００５０】本明細書で使用される「低級アルキル」と
いう用語は、１〜約６個の炭素原子を含有するアルキル
残基である。低級アルキル基の例は、メチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブ
チル、ｔｅｒｔ−ブチル及びペンチルとヘキシルのすべ
ての異性体を含むが、これらに限定されない。低級アル
キル基は、非置換であってもよく、又は置換基が組成物
又は試験具の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアー
ゼを検出する能力を妨害しない限り、置換されていても
よい。アルキル置換基の例は、１〜６個の炭素原子を有
するアルコキシ、ハロ、ニトロ、アリール及びアミノが
あるが、これらに限定されない。

【００５１】アルコール保護基、即ち一般構造式（VI）
の乳酸エステルのＡの本体は、特に限定されず、アルコ
ール残基を保護するために典型的に使用される本質的に
いかなる保護基から選択してよい。

【００５２】アルコール保護基Ａは、典型的にはスルホ
ニルクロリド又はカルボン酸クロリド（即ち、アシルク
ロリド）の残基であり、構造式（VII ）又は（VIII）：

【００５３】

【化２７】

【００５４】（式中、Ｒ³ は、３〜約２２個、好適には
３〜約６個の炭素原子を有するアルキル基であるか、又
はＲ³ は、アリール基である）を有する。Ｒ³ がアルキ
ル基である時、このアルキル基は官能基化（例えば、メ
トキシ−スクシニル）されていてよい。

【００５５】本明細書で使用される、Ｒ、Ｒ² 及びＲ³
に関して「アリール」という用語は、いかなる芳香族環
系をも意味する。「アリール」という用語には、例とし
て、ピロリル、フェニル及びピリジルのような５員及び
６員芳香族環系、及びナフチルのような縮合芳香族環系
が含まれるが、これらに限定されない。芳香族環系は、
複素環又は炭素環であってよく、置換基が発色性乳酸エ
ステルの、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼ
の存在下で加水分解する能力を妨害しない限り、置換さ
れていても非置換であってもよい。置換基の例は、アル
キル、ハロ、アシル、アリール、ヒドロキシ、アルコキ
シ、スルフリル及びアミノがあるが、これらに限定され
ない。このアリール基は、好適には、非置換か、或はハ
ロ基、又は１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル若
しくはアルコキシ基のような、比較的非反応性の基で置
換されたフェニル基である。

【００５６】アルコール保護基の例は、ｐ−トルエンス
ルホニルクロリド（トシルクロリド即ちＴｓＣｌ）、ｎ
−プロピルスルホニルクロリド（ｎ−ＰｒＳＯ₂ Ｃ
ｌ）、塩化ベンゾイル（ＰｈＣＯＣｌ）、カルボメトキ
シエタンスルホニルクロリド及びチオフェンスルホニル
クロリドがあるが、これらに限定されない。多くの他の
具体的なアルコール保護基が当業者に既知であり、本乳
酸エステルのＡ成分として使用することができる。例え
ば、多くのアルコール保護基が、本明細書に参照として
組み込まれる、T.W. Greene ら, Protecting Groups in
Organic Chemistry, 2d Ed., (1991)に開示されてい
る。

【００５７】好適なアルコール保護基Ａは、構造式（VI
I ）を有し、スルホニル残基を含む。本発明の最も有利
な実施のためには、構造式（VII ）のアルコール保護基
は、Ｒ³ としてフェニル基を有し、そしてそのフェニル
基がメチル又はメトキシ残基で置換されている。

【００５８】本発明の好適な乳酸エステルは、構造式
（IX）：

【００５９】

【化２８】

【００６０】を有する発色性化合物であり、一般構造式
（Ｖ）（式中、Ｘは、ＮＲ² であり；Ｒは、フェニルで
あり；そしてＲ¹ は、水素である）の乳酸エステルのＬ
型である。更に好適な実施態様において、この発色性乳
酸エステルは、構造式（Ｘ）：

【００６１】

【化２９】

【００６２】（式中、Ｒ² は、水素であり；そしてＡ
は、ｐ−トルエンスルホニル（即ち、Ｔｓ）である）を
有する、即ち、構造式（Ｖ）（式中、Ｘは、ＮＨであ
り；Ａは、Ｔｓであり；Ｒは、フェニルであり；そして
Ｒ¹ は、Ｈである）の乳酸エステルのＬ型である。

【００６３】構造式（IX）（式中、Ｒ² は、水素であ
る）の種々の乳酸エステルが調製された。これらの発色
性乳酸エステルは、第１表に５−フェニル−３−ヒドロ
キシ−ピロール−（Ｌ）−乳酸エステルとしてリストさ
れる。第１表にリストされた発色性乳酸エステルは、乳
酸のヒドロキシ（即ち、アルコール基）が保護された乳
酸のエチルエステルから調製された。アルコールが保護
された乳酸エチルエステルの出発物質も、第１表にリス
トされる。各乳酸エステルは、Ｌ型である。

【００６４】

【表１】

【００６５】３−（Ｏ−トシル−（Ｌ）−ラクトイル）
−５−フェニルピロール（IX）の合成は、第１表にリス
トされた各乳酸エステル（Ｘ）〜（XIV ）を調製するた
めに、又は一般構造式（Ｖ）又は（VI）を有する他の乳
酸エステルを調製するために使用される合成経路を代表
する。

【００６６】以下の実施例は、本発明の乳酸エステル、
組成物及び試験具の調製方法及び使用方法を説明するた
めに与えられる。種々の好適な実施態様は、以下本明細
書の実施例に詳細に記載される。しかし、以下の実施例
は、単なる例示であり、本明細書で開示され特許請求さ
れる発明の範囲を限定しようとするものではない。

【００６７】実施例及び明細書を通して、以下の略語を
使用した： mg ＝ミリグラムｇ＝グラム kg ＝キログラム cm ＝センチメートル L ＝リットル mL ＝ミリリットル M ＝モル濃度 mM ＝ミリモル濃度 mol ＝モル mmol ＝ミリモル aq ＝水性 hr ＝時間

【００６８】赤外（ＩＲ）スペクトルは、他に記載がな
ければＣＤＣｌ₃ の溶液として、Perkin-Elmer Model 7
10B 又は237 赤外分光光度計により得た。ポリスチレン
フィルムの１，６２０cm^-1のバンドを外部校正標準とし
て用いた。シグナルはcm^-1として記載した。

【００６９】プロトン磁気共鳴(¹ＨＮＭＲ）スペクト
ルは、３００MHz でGE GN300NB分光計を使用するか、又
は６０MHz でVarian T-60 分光計を使用して得た；スペ
クトルは、他に記載がなければＣＤＣｌ₃ 溶液中で得
た。化学シフトは、内部標準（即ち、テトラメチルシラ
ン）からの百万分率（ppm ）下降で記載した。

【００７０】炭素−１３磁気共鳴（¹³ＣＮＭＲ）スペ
クトル及びＤＥＰＴ磁気共鳴スペクトルもまた、フーリ
エ変換及び完全プロトン広域バンドノイズデカップリン
グ（full proton broad-band noise decoupling ）を用
いて、GE GN300NB分光計を使用して得た；スペクトル
は、他に記載がなければ、アセトン−ｄ₆ 、ＣＤ₃ Ｏ
Ｄ、ＤＭＳＯ−ｄ₆ 又はＣＤＣｌ₃ 溶液中で得た。炭素
のシフトは、テトラメチルシランからの百万分率下降で
記載した。

【００７１】質量スペクトル（ＭＳ）は、化学イオン化
（ＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）又は高速原子衝撃（ＦＡ
Ｂ）モードのいずれかで操作して、Hewlett-Packard 59
85A 分光計で得た。高解像度質量スペクトルは、AEI MS
-902分光計で得た。その他のスペクトルは、ミシガン州
立大学の質量分析施設（East Lansing, MI 48824）から
得た。

【００７２】旋光度は、Perkin-Elmer Corporationから
入手可能な、Model 141 偏光計で得た。

【００７３】本発明の乳酸エステルの合成を例証するた
めに、発色性乳酸エステル（Ｘ）〜（XIV ）を調製し
た。これらの実施例は特定の出発物質と乳酸エステルを
開示しているが、この合成方法が、一般的な構造式（V
I）の乳酸エステルに含まれる広い範囲の分子種に適用
できることは想像される。

【００７４】実施例１構造式Ｘの乳酸エステルの合成

【００７５】

【化３０】

【００７６】トシルクロリド（ＴｓＣｌ）（８．１ｇ、
４２．３mmol）を撹拌しながら塩化メチレン（ＣＨ₂ Ｃ
ｌ₂ ）（５０mL）中の（Ｌ）−乳酸のエチルエステル
（５．０ｇ、４．８１mL、４２．３mmol）の溶液に添加
し、これをアルゴン雰囲気下で０℃（氷浴）に冷却し
た。次にトリエチルアミン（ＴＥＡ）（５．５７ｇ、
７．６７mL、５５．０mmol）を滴下により、得られた溶
液に添加した。次いで得られた反応混合物を０℃で７時
間撹拌した。次にこの反応混合物を、１M 塩酸水溶液
（aq ＨＣｌ）（７５mL）と氷（７５ｇ）の溶液に注い
だ。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ の有機層をＨＣｌ層から分離し、次に
有機層を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄ ）で乾燥した。
濾過後、有機層を真空下で濃縮して、粗生成物の（Ｌ）
−トシル乳酸エチルエステル１０．５ｇ（９１％）を得
た。

【００７７】粗生成物の（Ｌ）−トシル乳酸エチルエス
テル（１０．５ｇ、３８．６mmol）を無水エタノール
（１２mL）に溶解し、得られた溶液を添加ロートで滴下
により、蒸留水（２０mL）中の水酸化ナトリウム（Ｎａ
ＯＨ）（１．８ｇ、４６mmol）の冷却した（０℃の氷
浴）溶液に、１５分間にわたって添加した。０℃でアル
ゴン雰囲気下で５時間、得られた反応混合物を撹拌した
後、反応混合物のｐＨをｐＨ２に下げるため濃ＨＣｌを
滴下により添加して、注意深く反応を停止させた。次に
固体塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を反応混合物が飽和す
るまで添加し、水層をＣＨ₂ Ｃｌ₂ ５０mL部で４回抽出
した。合わせたＣＨ₂ Ｃｌ₂ 部をＭｇＳＯ₄で乾燥し、
濾過し、真空下で濃縮して、粗生成物の（Ｌ）−Ｏ−ト
シル−乳酸（XIV ）７．１７ｇ（７６％）を得た。

【００７８】アルゴン雰囲気下で、粗生成物の（Ｌ）−
Ｏ−トシル−乳酸（XIV ）（１．５ｇ、６．１５mmol）
を還流冷却器を取付けた２５mL丸底フラスコに入れた。
塩化チオニル（ＳＯＣｌ₂ ）（１０．１２ｇ、６．２m
L、８５mmol）をそのフラスコに添加し、次にそのフラ
スコを予め加熱した（５０℃）油浴に入れた。フラスコ
の中身を５０℃で２時間撹拌した。次いでそのフラスコ
を室温に冷却して、最後に氷浴に入れた。次に、氷冷ヘ
キサン（２５mL）をそのフラスコに添加した。固体生成
物が観察されなかったため、そのフラスコ中の溶液を真
空下で濃縮して、粗生成物の黄色油状物、即ち、（Ｌ）
−Ｏ−トシル乳酸クロリド１．６ｇ（量）を得た。

【００７９】別のフラスコに、ピリジン（１．５mL、１
８．６mmol）を、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （３０mL）中の５−フェ
ニル−３−ヒドロキシピロール（ＰＰＯ−Ｈ）（９８６
mg、６．２mmol）の冷却溶液（０℃の氷浴）に、アルゴ
ン雰囲気下で迅速に滴下により添加し、続いてすぐにＣ
Ｈ₂ Ｃｌ₂ （５mL）中の（Ｌ）−Ｏ−トシル−乳酸クロ
リド（１．６ｇ、６．１１mmol）の溶液を迅速な滴下に
より添加した。次に残った内容物を、追加のＣＨ₂ Ｃｌ
₂ ５mLで滴下により添加した。得られた反応混合物を０
℃で１時間撹拌して、次いで約１時間で室温に加温し
た。次に反応混合物を室温で一晩（１６hr）撹拌した。

【００８０】次に、この反応混合物を１M のＨＣｌ水溶
液２５mL部で２回抽出した。次いで合わせたＨＣｌ部を
ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２５mL）で逆抽出した。最後にこのＣＨ
₂ Ｃｌ₂ 抽出物を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液２５mL
部で２回抽出した。再度水層をＣＨ₂ Ｃｌ₂ で逆抽出し
た後、合わせたＣＨ₂ Ｃｌ₂ 部をノーライトカーボン
（norite carbon ）とＭｇＳＯ₄ で処理し、次いで濾過
し、そして最後に真空下で濃縮した。

【００８１】得られた油状物をヘキサン／酢酸エチル
（１：１、２５mL）に溶解した。得られた溶液をノーラ
イトカーボンで処理し、次いで濾過し、最後に真空下で
濃縮して、固体の粗生成物である乳酸エステル（Ｘ）
１．７ｇを得た。この粗生成物の乳酸エステル（Ｘ）を
温ヘキサン（１０mL）中で粉砕し、次にヘキサン／酢酸
エチル（４：１、２×８mL）８mL部中で２回粉砕した。
有機溶媒をデカンテーションした後、固体生成物を真空
下で乾燥して、桃色固体１．０４ｇを得た。この桃色固
体をヘキサン／酢酸エチル（１：１）に溶解し、ノーラ
イトカーボンで処理し、濾過し、そして室温で真空下で
濃縮して、クリーム色の固体として乳酸エステル（Ｘ）
９３２mgを得た。

【００８２】構造式（Ｘ）の乳酸エステルを、プロトン
(¹Ｈ）及び炭素−１３（¹³Ｃ）核磁気共鳴、元素分析
（Ｃ／Ｈ／Ｎ）、質量分析（ＭＳ）、赤外分光法（Ｉ
Ｒ）及び旋光度により分析した。分析データを以下に要
約し、乳酸エステル（Ｘ）の構造を確認した。

【００８３】¹H NMR (CDCl₃,ppm): 1.65(d,3H), 2.42
(s,3H), 5.12(qu.,1H), 6.26(dd,1H),6.84(dd,1H), 7.1
8-7.5(m,7H), 7.84(d,2H), 8,15(brs,1H).¹³ C NMR (CDCl₃,ppm): 18.51( メチル), 21.66( メチ
ル), 73.96(CH,乳酸), 93.39(CH,ピロール), 107.89(C
H, ピロール), 123.84(CH, 芳香環), 126.85(CH,芳香
環), 128.12(CH, 芳香環), 128.97(CH, 芳香環), 129.8
7(CH, 芳香環), 166.68(C=O). C/H/N: 計算値: C: 62.39, H: 4.97, N: 3.63, S: 8.3
3; 実測値: C: 62.44, H: 5.03, N: 3.57, S: 8.65. EI/ 質量分析 (18 EV, DIP): 385(M+,21.8), 227(2.3),
199(22.4), 158(67.5), 155( 基線), 91(41.7). 赤外: (CDCl₃,cm^-1): 3450, 3022, 1770, 1600, 1570,
1550, 1514, 1450, 1370, 1260, 1240, 1180, 1080, 10
20, 980. １cmセル中室温のメタノール（ＭｅＯＨ）１mL中の試料
１０mgの旋光度( λ=578): (-64.8 °).

【００８４】実施例２〜５構造式（XI）〜（XIV ）の乳酸エステルの合成第１表にリストされた構造式（XI）〜（XIV ）の５−フ
ェニル−３−ヒドロキシ−ピロール乳酸エステルを、実
施例１の発色性乳酸エステル（Ｘ）と本質的に同一の方
法で調製した。しかし、発色性乳酸エステル（XI）〜
（XIV ）の合成には、異なるアルコール保護基、即ち、
各々、ｎ−プロピルスルホニル、ベンゾイル、メトキシ
スクシニルスルホニル及びチオフェンスルホニルを使用
した。

【００８５】構造式（XI）〜（XIV ）の乳酸エステルの
調製は、以下に要約した分析データによって確認した。ｎＰｒ−ＳＯ ₂ −（Ｌ） −Ｌａｃ−ＯＰＰ（XI） ¹ H NMR (CDCl₃,ppm): 1.10(t,3H), 1.75(d,3H), 2.20
(m,2H), 3.30(m,2H), 5.35(qu.,1H), 6.41(dd,1H), 6.9
5(dd,1H), 7.20-7.60(m,5H), 8.30(brs,1H).¹³ C NMR (CDCl₃,ppm): 12.87( メチル), 17.23( メチレ
ン), 18.59( メチル),53.64( メチレン), 73.49(CH,乳
酸), 98.32(CH,ピロール), 107.94(CH, ピロール), 12
3.86(CH, 芳香環), 126.90(CH, 芳香環), 128.96(CH,
芳香環), 166.5(C=O). C/H/N: 計算値: C:56.97, H:5.64, N:4.15, S:9.49;
実測値: C:57.06, H:5.75, N:3.87, S:9.91. FAB/質量分析: 337.2(M+,55), 159(基線). 赤外: (CDCl₃,cm^-1): 3400, 3010, 2980, 1768, 1573,
1512, 1454, 1400, 1360, 1254, 1169, 1116, 1084, 98
4. １cmセル中室温のＭｅＯＨ１mL中の試料１３mgの旋光度
( λ=578): (-48.5 °).

【００８６】ＰｈＣＯ−（Ｌ）−Ｌａｃ−ＯＰＰ（XII ） ¹ H NMR (CDCl₃,ppm): 1.75(d,3H), 5.55(qu.,1H), 6.40
(dd,1H), 6.95(dd,1H), 7.15-7.7(m,8H), 8.1(d,2H),
8.2(brs,1H).¹³ C NMR (CDCl₃,ppm): 17.13( メチル), 69.08(CH,乳
酸), 98.57(CH,ピロール), 108.03(CH, ピロール), 12
3.82(CH, 芳香環), 126.68(CH, 芳香環), 128.41(CH,
芳香環), 128.89(CH, 芳香環), 129.91(CH, 芳香環), 1
33.33(CH, 芳香環),165.98(C=O), 166.48(C=O). C/H/N: 計算値: C:71.64, H:5.07, N:4.18; 実測値:
C:71.92, H:5.22, N:4.28. EI/ 質量分析 (18 EV, DIP): 333(M+,3.1), 177(42.8),
149(22.2), 105(基線), 77(0.7). 赤外: (CDCl₃,cm^-1): 3400, 3000, 1763, 1723, 1606,
1585, 1573, 1512, 1452, 1318, 1177, 1113. １cmセル中室温のＭｅＯＨ１mL中の試料１２mgの旋光度
( λ=578): (+13.3 °).

【００８７】ＭｅＯＳｕｃｃ−ＳＯ ₂ −（Ｌ）−Ｌａｃ
−ＯＰＰ（XIII） ¹ H NMR (CDCl₃,ppm): 1.78(d,3H), 1.98(t,2H), 2.75
(t,2H), 2.75(s,3H), 5.37(qu.,1H), 6.42(brs,1H), 6.
98(brs,1H), 7.2-7.55(m,5H), 8.2(brs,1H).¹³ C NMR (CDCl₃,ppm): 18.52( メチル), 28.42( メチレ
ン), 47.29( メチレン), 52.4(メチル), 74.14(CH,乳
酸), 98.37(CH,ピロール), 107.93(CH, ピロール), 12
3.89(CH, 芳香環), 126.94(CH, 芳香環), 128.98(CH,
芳香環). C/H/N: 計算値: C:53.54, H:4.99, N:3.67, S:8.39;
実測値: C:53.05, H:5.07, N:3.41, S:7.75. FAB/質量分析: 381(M+,63), 186(8.5), 159(基線), 91
(12), 55(24.5). 赤外: (CDCl₃,cm^-1): 3450, 3000, 1751, 1741, 1572,
1513, 1453, 1439, 1359, 1319, 1255, 1208, 1030, 98
4. １cmセル中室温のＭｅＯＨ１mL中の試料７mgの旋光度(
λ=578): (-27.1 °).

【００８８】２−チオフェン−ＳＯ ₂ −（Ｌ）−Ｌａｃ
−ＯＰＰ（XIV ） ¹ H NMR (CDCl₃,ppm): 1.70(d,3H), 5.19(qu.,1H), 6.32
(dd,1H), 6.85(dd,1H), 7.12(t,1H), 7.20-7.50(m,5H),
7.70(dd,1H), 7.79(dd,1H), 8.19(brs,1H).¹³ C NMR (CDCl₃,ppm): 18.44( メチル), 74.91(CH,乳
酸), 98.34(CH,ピロール), 107.90(CH, ピロール), 12
3.85(CH, 芳香環), 126.85(CH, 芳香環), 127.54(CH,
チオフェン), 128.95(CH, 芳香環), 134.09(CH, チオフ
ェン), 134.71(CH,チオフェン). C/H/N: 計算値: C:54.1, H:3.98, N:3.71, S:16.98;
実測値: C:53.4, H:4.16, N:3.69, S:16.81. EI/ 質量分析: (18 EV, DIP): 377(M+,63.1), 236(4.
4), 191(13.8), 164(4.9), 159( 基線), 147(66.1), 99
(8.2), 83(1.1). 赤外: (CDCl₃,cm^-1): 3450, 3050, 2940, 1760, 1573,
1509, 1453, 1404, 1378, 1084, 1018. １cmセル中室温のＭｅＯＨ１mL中の試料１２mgの旋光度
( λ=578): (-34.3 °).

【００８９】組成物と試験具一般構造式（VI）を有する乳酸エステルに加えて、試薬
組成物は緩衝剤を含む。この緩衝剤は、水性試料と接触
した時に反応のための適切なｐＨを与える化合物であ
る。好適には、緩衝剤は、約７〜約１０、最適には約
８．５〜約９．０の範囲のｐＨを与えることができる。

【００９０】緩衝剤は、約２００〜約６００mMの濃度で
本発明の試薬組成物に含まれるが、特定の情況では緩衝
剤の濃度はこの範囲を超えても下回ってもよい。

【００９１】したがって、本発明の試薬組成物は、炭
酸；ＢＩＣＩＮＥ；ＣＨＥＳ；ホウ酸；リン酸；２，２
−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリ
ロトリエタノール；３，３−ジメチルグルタル酸；３−
Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；１，
３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕
プロパン（ビス−ＴＲＩＳ）；トリ（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）；トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン−マレイン酸（ＴＲＩＳ−マレイン
酸）；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マロ
ン酸（ＴＲＩＳ−マロン酸）；３−Ｎ−（トリスヒドロ
キシメチル）メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパンス
ルホン酸（ＴＡＰＳＯ）；２−（〔トリス（ヒドロキシ
メチル）メチル〕アミノ）エタンスルホン酸（ＴＥ
Ｓ）；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２
−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；及び当該分野で既
知の他の緩衝剤又はそれらの組合せのような緩衝剤で適
切なｐＨに緩衝化される。好適な緩衝剤は、ホウ酸−Ｎ
ａＯＨである。

【００９２】したがって、本発明の組成物は、構造式
（VI）を有する乳酸エステル及び緩衝剤を含む。前述の
ように、構造式（VI）を有する乳酸エステル及び緩衝剤
の特異的な本体は、特に限定されない。しかし、構造式
（Ｖ）の乳酸エステルのような好適な乳酸エステル、及
び緩衝剤は、最適な測定結果、即ち、検出可能な区別し
うる応答を短時間で出すことができる。測定の最適化
は、試薬組成物中に促進化合物及び／又はジアゾニウム
塩カップリング剤を含むことにより更に促進される。

【００９３】「促進化合物」は、白血球細胞、エステラ
ーゼ又はプロテアーゼにより構造式（Ｖ）又は（VI）の
乳酸エステルの加水分解の速度を上昇させるすべての化
合物である。促進化合物は、アルコール、並びにピリジ
ン、イミダゾール及びそれらの誘導体のような化学的に
多様なクラスの物質から選択される。これらの促進化合
物は、本明細書に参照として組み込まれる、Bergerらの
米国特許第4,299,917号明細書に開示されている。疎水
性アルコールは、白血球の活性を上昇させる特に有用な
促進化合物である。分岐鎖アルコールもまた、エステラ
ーゼ活性の有用な促進剤であることが示された。本発明
の最も有利な実施のためには、促進化合物としてデカノ
ールが使用される。促進化合物は、試薬組成物中に、組
成物の０〜約４％（v/v ）、好適には約０．１〜約２％
（v/v ）の量で存在する。本発明の最も有利な実施のた
めには、促進化合物は、組成物の約１％〜約２％（v/v
）の量で存在する。

【００９４】本試薬組成物はまた、カップリング剤とし
てジアゾニウム塩を含むことができる。このジアゾニウ
ム塩は、０〜約２mM、好適には０．１〜約１mMの濃度で
存在する。本発明の最も有利な実施のためには、ジアゾ
ニウム塩カップリング剤は、約０．５〜約１mMの濃度で
存在する。このジアゾニウム塩は、白血球細胞、エステ
ラーゼ又はプロテアーゼによる構造式（VI）の乳酸エス
テルの加水分解により生成する、ヒドロキシ−ピロール
（II）のような、ヒドロキシ化合物であるＢ−ＯＨと相
互作用する。次にこのヒドロキシ化合物は、ジアゾニウ
ム塩と相互作用して、濃い特有の色を示すアゾ色素を生
成し、これが白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアー
ゼの存在を示す。

【００９５】しばしば、ヒドロキシ−ピロール（II）の
ようなヒドロキシ化合物は、それ自体明瞭な紫外（Ｕ
Ｖ）吸収化合物であり、このため試験試料中の白血球細
胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を検
出するための指示薬として働くこともできる。試薬組成
物の色変化の程度と強度は、ヒドロキシ−ピロール（I
I）の濃度が上昇するにつれて上昇する。ヒドロキシ−
ピロール（II）の濃度は、試験試料中の白血球細胞、エ
ステラーゼ又はエラスターゼの量に正比例する。したが
って、発色性乳酸エステル（Ｖ）の加水分解におけるヒ
ドロキシ−ピロール（II）の生成（又は発色性乳酸エス
テル（VI）の加水分解におけるヒドロキシ化合物Ｂ−Ｏ
Ｈの生成）により生じた吸収の上昇は、試料中の白血球
細胞、エステラーゼ又はエラスターゼの量に関係する。
しかし、よりめざましい青又は赤色転移は、ヒドロキシ
化合物Ｂ−ＯＨ又はヒドロキシ−ピロール（II）と相互
作用してアゾ色素を形成する、ジアゾニウム塩が存在す
る時に生じる。よりめざましい色変化は、より区別しう
る色変化をもたらし、したがってより正確な測定結果を
与える。

【００９６】このジアゾニウム塩カップリング剤は、一
般構造式：ＡｒＮ⁺ ≡Ｎ（式中、Ａｒはアリール基である）を有する。更に詳し
くは、ジアゾニウム塩は典型的には一般構造式（XVI
）：

【００９７】

【化３１】

【００９８】（式中、Ｒ⁴ は、同一又は異なって、水
素、低級アルキル又はアリールであるか、或は２つの隣
接するＲ⁴ 基は、一緒になって縮合環系を形成し（但
し、いずれの場合もＲ⁴ の１つは、−Ｎ⁺ ≡Ｎ、即ち、
ジアゾニウムである）；Ｙは、Ｎ又はＣＲ⁵ （ここで、
Ｒ⁵ は、水素又は低級アルキルである）であり；そして
Ｄ^-は、塩化物、臭化物又は他の適切なジアゾニウム残
基の対イオンのような陰イオンである）を有する芳香族
ジアゾニウム塩である。

【００９９】本明細書で使用される「縮合環系」という
用語は、１対の炭素原子を共有する２つ以上の芳香族環
を意味する。例えば、構造式（XVII）：

【０１００】

【化３２】

【０１０１】を有するジアゾニウム塩において、両方の
Ｇ基は、一緒に縮合環系を形成することができ、ここで
両方のＧ基は、例えば、構造式（XVIII ）

【０１０２】

【化３３】

【０１０３】のジアゾニウム塩のように一緒に−（Ｃ
Ｈ）₄ −を構成する。Ｆ基は、水素、低級アルキル又は
ヒドロキシである。縮合環系の別の例は、構造式（XIX
）：

【０１０４】

【化３４】

【０１０５】（式中、式（XVII）の両方のＧ基は、一緒
に−（ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ）−を構成する）の構成物
である。したがって、縮合環系は、多核、芳香族、かつ
複素環又は同素環である。

【０１０６】双性イオンであるジアゾニウム塩は、好適
なカップリング剤である。双性イオンのジアゾニウム化
合物は、ジアゾニウム残基の対イオン（即ち、陰イオ
ン）が環系に共有結合しているジアゾニウム塩である。
このような陰イオンの例は、スルホン酸（ＳＯ₃ ^-）、炭
酸（ＣＯ₂ ^-）及びホスホン酸（ＰＯ₃ ^-）を含むが、これ
らに限定されない。双性ジアゾニウム塩は、上述の一般
構造式（XVII）（式中、Ｆは、水素、低級アルキル又は
ヒドロキシであり；Ｄ^- は、共有結合陰イオンであり；
Ｇは、同一又は異なって、水素、低級アルキル又はアリ
ールであるか、或は両方のＧ基は、一緒になって縮合環
系を形成する）を有する。

【０１０７】種々のジアゾニウム塩が、本明細書に参照
として組み込まれる、Skjoldらの米国特許第4,637,979
号明細書；Huglらの米国特許第4,806,423 号明細書；及
びHuglらの米国特許第4,814,271 号明細書に開示されて
いる。本発明の組成物と方法に有用な具体的なジアゾニ
ウム塩の例は、１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スル
ホナート及び１−ジアゾフェニル−３−カルボナートで
あるが、これらに限定されない。ジアゾニウム塩の他の
例は、各々以下に構造式（XX）〜（XXVI）により図示し
た、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−１−ナフチルスルホ
ナート（ＤＮＳＡ）、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７
−ニトロ−１−ナフチルスルホナート（ＮＤＮＳＡ）、
４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−１，７−ナフチルジスル
ホナート、２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリニル）ベ
ンゼンジアゾニウムクロリド、４−ジアゾ−３−ヒドロ
キシ−７−ブロモ−１−ナフチルスルホナート、４−ジ
アゾ−３−ヒドロキシ−７−シアノ−１−ナフチルスル
ホナート、及び４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−〔１
−オキソプロピル〕−１−ナフチルスルホナートがある
が、これらに限定されない。

【０１０８】

【化３５】

【０１０９】好適なジアゾニウム塩は、構造式（XXI ）
の化合物であり、これは色転移を増強して、このため白
血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼに対する測定
の感度を増強する。

【０１１０】したがって、構造式（VI）の乳酸エステ
ル、緩衝剤、及び場合により促進化合物及び／又はジア
ゾニウム塩カップリング剤を含む本発明の試薬組成物
は、液体試料中の白血球細胞、エステラーゼ若しくはプ
ロテアーゼ、又はＨＬＥの存在又は濃度を測定する改良
された方法に利用される。試薬組成物はＨＬＥと相互作
用して、構造式（VI）の乳酸エステルを加水分解し、こ
れが色転移のような区別しうる測定可能な応答を生成す
る。この応答は、視覚的に又は機械により検出すること
ができる。更に、上述の成分に加えて、本発明の試薬組
成物は、場合により充分量の種々の他の成分を含むこと
もできる。

【０１１１】本質的な成分の性質又は機能を著しく改変
することなく、かつ白血球細胞、エステラーゼ又はプロ
テアーゼの測定を妨害することのない成分も、場合によ
り試薬組成物に含まれてよい。例えば、試薬組成物は、
場合により、液体試料による試験具の試験パッドの湿潤
を改善する化合物を含んでもよい。この化合物は、典型
的には陰イオン性表面活性剤又は非イオン性表面活性剤
である。ペンチル〜ドデシルの硫酸塩又はスルホン酸
塩、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びドデシル
ベンゼンスルホン酸ナトリウムなどの、長鎖炭素鎖硫酸
塩又はスルホン酸塩のような、陰イオン性表面活性剤
は、好適な表面活性剤である。表面活性剤は、試薬組成
物中に、試薬組成物の全重量の０％〜約０．４％の濃
度、好適には約０．０５％〜約０．２％の濃度で含まれ
る。

【０１１２】試薬組成物はまた、試験具の色転移の均一
性のために重合性物質を含んでもよい。重合性物質は、
ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アラビ
アゴム、ゼラチン、アルギン、カラゲーニン、カゼイ
ン、アルブミン、メチルセルロース及び同様な天然及び
合成重合性物質を含むが、これらに限定されない。好適
な重合性物質は、ISP Corp., New York, NY から市販さ
れている平均分子量約１０，０００〜約２００，０００
のポリビニルピロリドンである。この重合性物質は、一
般に試薬組成物の全重量の０％〜約４％、好適には約
０．５％〜約２％の量で試薬組成物に含まれる。

【０１１３】試薬組成物に含まれるそれら成分の担体
は、水を含む。しかし、特定の成分の制限された水溶性
のため、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコ
ール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、及び同様の溶媒のような有機溶媒が、担体に
含まれてもよい。水とともに試薬組成物の担体に含ませ
る適切な有機溶媒の選択は、診断用測定方法を設計する
当業者の能力の範囲内である。

【０１１４】前述のように、試薬組成物は、白血球細
胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を測
定するための試料と接触して、応答、好適には色転移を
受ける。色転移の強度と程度が、試料中の白血球細胞の
濃度を定量的に測定するのに使用される。本発明の重要
な特徴により、本発明の試薬組成物は、充分に分離され
区別された色転移を与えるため、試料中の白血球細胞の
濃度を、分光光度計又は比色計のような色測定機械を使
用することなく、測定し正確に決定することができる。
しかし、必要であれば、試験試料と、既知濃度の白血球
細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼを含む溶液との色
の程度と強度の差を測定するために、このような色測定
機械を使用してもよい。

【０１１５】本発明の方法を説明するために、一般構造
式（Ｖ）の乳酸エステルと緩衝剤を含む試薬組成物を、
ＨＬＥの乾燥相の試験ストリップ測定に使用した。この
試薬組成物はまた、ＨＬＥの湿潤相測定にも使用でき
る。ＨＬＥの乾燥相又は湿潤相測定結果は、試験試料の
白血球細胞濃度に関係づけることができる。

【０１１６】本試薬組成物を利用する乾燥相の試験スト
リップ測定方法は、当該分野で既知の方法により行われ
る。一般に、ＨＬＥの測定は、尿又は他の試験試料を、
この試薬組成物を組み込んだ被検体検出具に接触させる
ことにより行われる。被検体検出具は、試験試料中に浸
すことができるか、又は試料は、被検体検出具に滴下に
より適用することができる。生じた被検体検出具の色の
変化は、ＨＬＥの存在を証明し；そして、もしそう設計
されるならば、生じた色転移は、標準化された色のチャ
ートと比較して試料中のＨＬＥ、及びこれにより白血球
細胞の濃度の定量測定を可能にする。

【０１１７】典型的には、被検体検出具は、単一パッド
試験ストリップ（単一被検体のみの測定のため）又は多
数パッド試験ストリップ（同時に数種の被検体を測定す
るため）として設計された、試薬を含浸した試験ストリ
ップである。どちらの型の試薬含浸試験ストリップにつ
いても、試験ストリップは、通常疎水性プラスチックか
ら作成されるハンドル又は支持ストリップ及び試薬組成
物を組み込んだ吸湿性又は非吸湿性担体マトリックスよ
りなる試薬試験パッドを含む。一般に、担体マトリック
スは吸収性材料であり、試験試料が毛管作用に応じて担
体マトリックスを通って動くことができ、試薬組成物と
接触して検出可能な又は測定可能な色転移を生成する。

【０１１８】担体マトリックスは、担体マトリックスが
化学試薬に関して実質的に不活性であり、かつ液体試料
の可溶性成分に関して多孔性又は吸収性である限り、目
的の測定を行うために要する化学試薬を組み込むことの
できるいかなる物質であってよい。「担体マトリック
ス」という表現は、水及び他の生理学的液体に不溶性で
ある吸湿性又は非吸湿性マトリックスをいう。適切な吸
湿性マトリックスは、フィルター紙、スポンジ物質、セ
ルロース、木、織布や不織布などを含む。非吸湿性マト
リックスは、ガラス繊維、ポリマーフィルム、及びプリ
フォームの又は微孔性の膜を含む。他の適切な担体マト
リックスは、シリカゲル、アルミナ、珪藻土などのよう
な疎水性無機粉末；粘土質物質；布；親水性天然重合性
物質、特にセルロースビーズのようなセルロース物質、
及びとりわけクロマトグラフィー紙のフィルター紙のよ
うな繊維含有紙；架橋ゼラチン、酢酸セルロース、ポリ
ビニルクロリド、ポリアクリルアミド、セルロース、ポ
リビニルアルコール、ポリスルホン、ポリエステル、ポ
リアクリレート、ポリウレタン、架橋デキストラン、ア
ガロース、及び他のそのような架橋及び非架橋水不溶性
親水性ポリマーのような、合成又は修飾天然ポリマーを
含む。疎水性かつ非吸収性物質は、本発明の担体マトリ
ックスとしての使用には適切ではない。担体マトリック
スは、異なる化学組成又は化学組成の混合物からなって
いてもよい。このマトリックスはまた、硬さと柔らかさ
に関係した平滑さと粗さについても、変化してよい。し
かし、すべての場合に、担体マトリックスは、親水性又
は吸収性物質を含む。担体マトリックスは、吸湿性フィ
ルター紙又は非吸湿性ポリマーフィルムから最も有利に
作成される。そのハンドルは、通常、酢酸セルロース、
ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート又はポ
リスチレンのような疎水性物質から形成される。

【０１１９】試験ストリップが試験試料中のＨＬＥを測
定するよう設計されているならば、担体マトリックス
は、試験試料中の可溶性成分が、試薬組成物を含浸した
試験ストリップの試験パッドに浸透して飽和させること
のできるいかなる吸湿性又は非吸湿性物質であってよ
い。好適な担体マトリックスは、紙（好適にはフィルタ
ー紙）のようなセルロース物質を含む親水性の吸湿性マ
トリックスである。担体マトリックスはまた、ポリウレ
タン又は架橋ゼラチンのようなポリマーフィルムを含
む、親水性の非吸湿性マトリックスであってもよい。こ
のような担体マトリックスは、試薬組成物に含まれる成
分を懸濁し配置すること、及び担体マトリックスを通る
試験試料の可溶性成分の浸透性のような、本発明の担体
マトリックスに要求される性質のすべてを有する。

【０１２０】本発明の最も有利な実施のためには、試薬
組成物は適切な担体マトリックス中に含浸されて、試験
試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの
測定のための乾燥相試験ストリップで使用される。本発
明の方法は、家庭又は検査室で行うことができる、試験
試料中のＨＬＥ、したがって白血球細胞の存在又は濃度
についての経済的で正確かつ信頼できる測定方法を与え
る。更に、本発明の方法により、試料中の痕跡量の白血
球細胞の検出、区別及び測定が可能になり、このため測
定を臨床的により有用なものにしている。

【０１２１】本発明の方法により、白血球エステラーゼ
の存在に感受性のある試験具を調製した。０．８M のホ
ウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）と１重量
％のポリビニルピロリドン（ISP Corp., Wayne, NJから
入手可能なPVP K-60）を含む水溶液を、最初に調製し
た。次に、Whatman, Ltd., Maidenhead, Kent, U.K. か
ら入手可能なWHATMAN 3MM フィルター紙の４インチ幅の
ストリップを、この水溶液で含浸した。次いでこの含浸
したフィルター紙ストリップを、Thermoelectron, Kauk
auna, WIから入手可能なAir Foil紙乾燥機中で、７９℃
〜１２１℃で約５〜６分間乾燥した。

【０１２２】次に、この乾燥した含浸フィルター紙スト
リップを、１．１mMの構造式（IX）〜（XIII）の乳酸エ
ステル、０．７mMの４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−
ニトロ−１−ナフチルスルホナート（即ち、６−ニトロ
−１，２−ナフトキノンジアジドとも呼ばれる、構造式
（XX）の化合物）、１．５％（v/v ）１−デカノール及
び３％（v/v ）ジメチルスルホキシドを含有するアセト
ン溶液中に浸漬することにより２回目の含浸を行った。
２回目の含浸後、フィルター紙ストリップを６０℃で約
５〜６分間乾燥して、オフホワイトのフィルター紙スト
リップを得た。この乾燥し２回含浸したフィルター紙パ
ッドを、両面粘着テープで不透明な又は透明な疎水性プ
ラスチックハンドルに固定した。次にこの乾燥し２回含
浸したフィルター紙ストリップを、例えばパッドが約
０．２インチ（０．５cm）×約０．２インチ（０．５c
m）の大きさを有するように、試験ストリップ測定に適
したサイズに切った。

【０１２３】本発明の方法と組成物を利用して白血球細
胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの定量方法を設計す
るために、試薬パッドのサイズ、試薬組成物溶液の濃
度、試験試料の量、及び浸すよりはピペット操作による
かなどの、試験試料を試験ストリップに導入する方法の
間の適正なバランスを決定することは、当業者の実験技
術の範囲内であることが理解されるべきである。

【０１２４】更に、担体マトリックスを、単一の水性、
又は水性−有機溶媒の、試薬組成物のすべての必須及び
任意成分を含んだ溶液中に、担体マトリックスを浸漬す
ることにより飽和又は含浸できることが理解されるべき
である。しかし、特定の試薬組成物成分が比較的低い水
溶性を有するため、２回の浸漬を利用する２段階法が好
適である。

【０１２５】白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアー
ゼの測定を行うために、得られた試験ストリップを、試
験パッドが尿試料で飽和されるのに充分な時間、その試
料と接触させる。例えば約１〜約２分のような、予め決
めた時間待って、応答について試験ストリップを視覚的
に又は機械により検査した。試験パッドの色転移は、試
験試料中の白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼ
の存在又は濃度を現わす。

【０１２６】多くの場合に、試験ストリップの単純な視
覚による観察により、必要な情報が得られる。より正確
な情報が必要であれば、試験ストリップに使用される特
定の試薬組成物のために、種々の既知濃度の白血球細胞
に対応する色点を有する色チャートを調製することがで
きる。次に、試験試料に接触した後試験ストリップに生
じた色をチャート上の色点と比較して、試験試料中の白
血球細胞の濃度を測定することができる。更に、乾燥相
試験ストリップ測定法は、視覚法とは反対に機械による
分光光度法又は比色法を用いて、特に痕跡量から低濃度
での色転移の程度と強度を測定できるように、より正確
にすることができる。

【０１２７】本発明の方法により得られる新規な予期せ
ぬ結果を説明するために、本発明の試薬組成物を組み込
んだ乾燥相試験ストリップを、ＨＬＥを含む標準化した
溶液を測定するために使用した。各々１つの構造式
（Ｘ）〜（XIV ）を有する発色性乳酸エステルとジアゾ
ニウム塩カップリング剤を組み込んだ個々の試験ストリ
ップを、０、１９又は４８ng/mL のＨＬＥを含有する標
準化した溶液中に迅速に浸漬し、取り出した。標準化し
たＨＬＥ溶液を接触させた約２分後、試験ストリップの
試験パッドの反射率を、Miles, Inc., Elkhart, INから
入手可能なCLINITEK（登録商標）１０臨床用反射率計で
５５７nm（ナノメートル）で測定した。

【０１２８】反射率の尺度を０〜１でとった反射率Ｒ
を、Kubelka-Munk関数中に組み込んだ：Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ² ／２Ｒ）（式中、Ｋは、吸光係数であり；Ｓは、散乱係数であ
り；そしてＲは、反射率である）。５５７nmで測定した
反射率値をＫ／Ｓ値を計算するために使用した。Ｋ／Ｓ
値は試験ストリップの色に比例するため、Ｋ／Ｓ値が大
きい程、試験ストリップの色転移の程度と強度が大き
く、かつ試験ストリップ中のＨＬＥの濃度が高い。

【０１２９】各々構造式（Ｘ）〜（XIV ）を有する異な
る発色性乳酸エステルを組み込んだ試験ストリップを、
ＨＬＥの測定能力について、対応するアミノ酸エステ
ル、即ち、アラニンエステルと比較した。例えば、構造
式（Ｘ）のＬ型の乳酸エステルは、下記式：

【０１３０】

【化３６】

【０１３１】で示される構造を有する。ＨＬＥ、したが
って白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼについ
て尿を測定する能力について、乳酸エステル（Ｘ）を、
対応するアラニン化合物（Ｉ）と比較した。対応するア
ラニン化合物（Ｉ）は、現在LEUKOSTIX （登録商標）試
験ストリップで使用されている。

【０１３２】

【化３７】

【０１３３】構造式（XI）〜（XIV ）の乳酸エステル
も、対応するアラニンエステルと比較した。

【０１３４】したがって、以下の実施例は、ＨＬＥの基
質として作用し、これにより白血球細胞、エステラーゼ
又はプロテアーゼについて試験試料を測定する構造式
（VI）、特に構造式（Ｖ）の発色性乳酸エステルの能力
を証明する。化合物（Ｉ）のようなアミノ酸エステル
が、ＨＬＥを検出するために比色法の基質として使用さ
れてきたことは既知である。以下の実施例は、本発明
の、新規な非アミノ酸である乳酸をベースとする比色法
の基質が、ＨＬＥのようなセリンプロテアーゼをベース
とする酵素により容易に加水分解されて、検出可能で区
別しうる色転移を与えることを説明する。

【０１３５】実施例６構造式（Ｘ）の乳酸エステルを組み込んだ、上述のとお
り調製した乾燥相試験ストリップを、対応するアラニン
誘導体（Ｉ）を組み込んだ乾燥相試験ストリップと、尿
中のＨＬＥを検出する能力について比較した。ジアゾニ
ウム塩カップリング剤ＤＮＳＡ（XX）とＮＤＮＳＡ（XX
I ）の間の比較も行った。試験ストリップは、他は同一
であった。個々の試薬ストリップを標準化したＨＬＥ溶
液中に迅速に浸漬した後、下記表の結果を得た。浸漬の
２分後、上述のように発色性応答について試験ストリッ
プを検査した。

【０１３６】

【表２】

【０１３７】驚くべきことに、構造式（Ｘ）の乳酸エス
テルは、酵素ＨＬＥにより容易に加水分解されて、構造
式（Ｉ）のアラニン誘導体と少なくとも同じ強度の色転
移を与えた。Ｋ／Ｓ値と、０と１９ng/mL ＨＬＥ間のＫ
／Ｓ値の変化量は、アラニン誘導体（Ｉ）よりも構造式
（Ｘ）の乳酸エステルが大きかった。したがって、構造
式（Ｘ）の乳酸エステルは、ＨＬＥに対する応答におい
て、アラニン誘導体（Ｉ）よりも強くかつ区別しうる色
転移を与えた。更に、ジアゾニウム塩ＮＤＮＳＡ（XXI
）は、ジアゾニウム塩ＤＮＳＡ（XX）よりも大きなＫ
／ＳとＫ／Ｓの変化量を与えた。ジアゾニウム塩（XXI
I）〜（XXVI）は、ジアゾニウム塩（XX）と（XXI ）の
間のＫ／ＳとＫ／Ｓの変化量であった。したがって、乳
酸エステルとジアゾニウム塩ＮＤＮＳＡ（XXI ）の組合
せが、現在使用されているアラニン誘導体（Ｉ）に比べ
て、試験試料中の痕跡量から低濃度の白血球細胞を検出
する高められた能力を与えた。

【０１３８】実施例７構造式（XI）の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリッ
プを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験ストリ
ップと、実施例６に記載したのと同じ方法で比較した。
すべての試験ストリップに、ジアゾニウム塩ＮＤＮＳＡ
（XX）を組み込んだ。測定結果を下記に要約した。

【０１３９】

【表３】

【０１４０】実施例６と同様に、構造式（Ｘ）の乳酸エ
ステルは、対応するアラニン誘導体よりも大きなＫ／Ｓ
変化量を与えて、このためより強い区別しうる色転移を
与えることにより、より高感度の白血球細胞、エステラ
ーゼ又はプロテアーゼの測定法を与えた。

【０１４１】実施例８構造式（XII ）の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリ
ップを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験スト
リップと、実施例６に記載したのと同じ方法で比較し
た。すべての試験ストリップにジアゾニウム塩ＮＤＮＳ
Ａ（XXI ）を組み込んだ。測定結果を下記に要約した。

【０１４２】

【表４】

【０１４３】実施例６及び７と同様に、構造式（XII ）
の乳酸エステルは、対応するアラニン誘導体よりも大き
なＫ／ＳとＫ／Ｓ変化量を与えた。カルボニル基を有す
るベンゾイルブロッキング剤を含む化合物についての応
答は、スルホニル基を有するブロッキング剤を含む化合
物ほど大きくなかった。この低い応答は、実施例６、
７、９及び１０で試験した化合物に比較して小さいＫ／
Ｓ変化量で観察された。したがって、スルホニル基を含
み構造（VII ）を有するアルコール保護基は、カルボニ
ル基を含み構造（VIII）を有するアルコール保護基より
も好適であった。

【０１４４】実施例９構造式（XIII）の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリ
ップを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験スト
リップと、実施例６に記載したのと同じ方法で比較し
た。すべての試験ストリップにジアゾニウム塩ＮＤＮＳ
Ａ（XXI ）を組み込んだ。測定結果を下記に要約した。

【０１４５】

【表５】

【０１４６】構造式（XIII）の乳酸エステルが示すＫ／
ＳとＫ／Ｓ変化量は、低いエステラーゼレベルでは、対
応するアラニン誘導体のＫ／ＳとＫ／Ｓ変化量と同様で
あったが、高いエステラーゼレベルでは、対応するアラ
ニン誘導体が示すＫ／ＳとＫ／Ｓ変化量よりも小さかっ
た。しかし、式（XIII）の乳酸エステルのＫ／ＳとＫ／
Ｓ変化量は、ＨＬＥの測定に充分であった。

【０１４７】実施例１０構造式（XIV ）の乳酸エステルを組み込んだ試験ストリ
ップを、対応するアラニン誘導体を組み込んだ試験スト
リップと、実施例６に記載したのと同じ方法で比較し
た。測定結果を下記に要約した。

【０１４８】

【表６】

【０１４９】実施例６〜８と同様に、発色性乳酸エステ
ル（XIV ）は、対応するアラニン誘導体よりも大きなＫ
／ＳとＫ／Ｓ変化量を示し、このため、試験試料中の白
血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの高感度かつ
正確な測定法を提供した。

【０１５０】実施例６〜１０で証明されたように、本発
明の発色性乳酸エステルは、試料中のＨＬＥの非存在と
存在の区別をつけることができ、かつ試料中のＨＬＥの
濃度を測定することができた。更に、この発色性乳酸エ
ステルは、構造式（Ｉ）のアラニン誘導体のような従来
法のアミノ酸を含有するＨＬＥ基質と同等の性能、かつ
典型的にはそれよりも性能が優れていた。したがって、
本発明の乳酸エステルは、尿のような生物学的液体中
の、白血球細胞、又はエラスターゼ若しくはエステラー
ゼ活性を検出するのに有用な、新規なクラスの化合物で
ある。

【０１５１】種々の濃度のＨＬＥに対する発色性乳酸エ
ステルの感度を測定するための試験も行った。構造式
（Ｘ）の発色性乳酸エステルについて、その対応するア
ラニン誘導体との測定結果を比較して、結果を第２表に
示した。すべての測定にジアゾニウム塩ＮＤＮＳＡ（XX
I ）を使用した。

【０１５２】

【表７】

【０１５３】そのアラニン誘導体は、５〜５００ng/mL
（即ち、約２〜約１７５細胞/ μL）の範囲でＨＬＥの
測定に使用することができた。５ng/mL 未満では、アラ
ニン誘導体の色転移は、区別しうる応答を与えるほど充
分な強度がなかった。更に、２００及び５００ng/mL の
ＨＬＥを有する溶液に対する応答に違いがなかった。し
たがって、技師は、２００、５００又は５００ng/mL を
超えるＨＬＥを含有する試験試料を容易に区別すること
ができなかった。

【０１５４】しかし、第２表に示されるように、本乳酸
エステルは、５ng/mL のＨＬＥの存在で比較的高いＫ／
Ｓを示したため、試験試料中の低いレベルのＨＬＥを検
出することができた。更に、乳酸エステル（XI）のＫ／
Ｓ値は２００及び５００ng/mL のＨＬＥ間で上昇を続け
たため、色転移の区別が向上した（例えば、機械的識別
が向上した）。対照的に、アラニン誘導体を使用した時
は、２００〜５００ng/mL のＨＬＥ間の色形成が充分に
暗いため、技師は２００又は５００ng/mL のＨＬＥを含
有する試料を区別するのが困難であった。これらの結果
により、低濃度のＨＬＥに対する本発明の発色性乳酸エ
ステルの高感度が更に証明され、このため、広い濃度範
囲にわたって、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテア
ーゼの正確な測定結果が得られた。

【０１５５】本発明のヒドロキシ保護５−フェニル−３
−ヒドロキシ−ピロリル−（Ｌ）−乳酸エステルは、現
在市販の白血球細胞の試験ストリップ測定に使用されて
いる、対応する５−フェニル−３−ヒドロキシ−ピロリ
ル−トシル−（Ｌ）−アラニン酸基質に比べて、上昇し
た又は同等の反応性を有する、新規なクラスの発色性エ
ステラーゼ基質である。セリンプロテアーゼをベースと
する酵素に対する本乳酸をベースとする基質はまた、新
規であって当該分野に進歩をもたらした。本組成物、方
法及び試験具は、白血球細胞測定の感度を、わずか５ng
/mL のＨＬＥさえ２分以内に検出できるほど上昇させた
ため、痕跡レベルの白血球細胞の改善された検出を可能
にした。本発明はまた、読み取り時間を１２０〜６０秒
に短縮することができる利点も有する。

【０１５６】本明細書に記載された本発明の多くの修飾
及び改変が、その精神と範囲を逸脱することなくなされ
ることは明白であり、添付した請求の範囲により限定さ
れるのみである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｃ 69/76 Ｚ 9546−4Ｈ 69/92 309/64 7419−4Ｈ 309/72 7419−4ＨＣ０７Ｄ 207/36 307/58 333/32 Ｃ１２Ｑ 1/04 6807−4Ｂ 1/37 6807−4Ｂ 1/44 6807−4ＢＧ０１Ｎ 33/50 Ｋ 33/52 Ｂ // Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ 6807−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式：【化１】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；そしてＢ−Ｏ
−は、Ｂ−ＯＨ化合物の残基であって、かつこの乳酸エ
ステルが加水分解してＢ−ＯＨ化合物を生成する時に検
出可能な応答を与える）で示される構造を有する乳酸エ
ステル。
【請求項２】検出可能な応答が、発色性、蛍光性、反
射率変化、ｐＨ変化、化学発光性、比色法的、又は分光
測光法的応答である、請求項１記載のエステル。
【請求項３】Ｂが、ピロール類、チオフェン類、フラ
ン類、アゾレゾルシン類、フェノール類、ロイコインド
フェノール類、アゾ色素類、５−（４−ヒドロキシ−
３，５−ジメトキシフェニルメチレン）−２−チオキソ
チアゾリン−３−酢酸、２−置換−６−ヒドロキシ−ベ
ンゾチアゾール誘導体類、ω−ニトロスチリルエステル
類、レソルフィン（resorufin ）類、アクリジノン類、
メロシアニン類、８−ヒドロキシ−２Ｈ−ジベンズ
（ｂ，ｆ）アゼピン−２−オン類、ジベンゾアゼピノン
類、ジベンゾチアゼピノン類、クマリンエステル類、及
びそれらの混合物よりなる群から選択される化合物の残
基である、請求項１記載のエステル。
【請求項４】Ｂが、置換若しくは非置換ピロール、置
換若しくは非置換チオフェン、置換若しくは非置換フラ
ン、或はそれらの混合物よりなる群から選択される化合
物の残基である、請求項１記載のエステル。
【請求項５】Ａが、下記式：【化２】（式中、Ｒ³ は、３〜約２２個の炭素原子を有する置換
又は非置換アルキル基であるか、或はＲ³ は、置換又は
非置換アリール基である）で示される構造を有する、請
求項１記載のエステル。
【請求項６】Ａが、下記式：【化３】（式中、Ｒ³ は、３〜約２２個の炭素原子を有する置換
又は非置換アルキル基であるか、或はＲ³ は、置換又は
非置換アリール基である）で示される構造を有する、請
求項１記載のエステル。
【請求項７】Ｒ³ が、フェニル、ピロリル、ピリジ
ル、ナフチル、アルキル置換フェニル、及びアルコキシ
置換フェニル（ここで、アルキル又はアルコキシ置換基
は、１〜約１０個の炭素原子を有する）よりなる群から
選択される、請求項５及び６のいずれか１項記載のエス
テル。
【請求項８】Ａが、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−プ
ロピルスルホニル、ベンゾイル、カルボメトキシエタン
スルホニル、及びチオフェンスルホニルよりなる群から
選択される、請求項１記載のエステル。
【請求項９】下記式：【化４】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ
又はＮＲ² であり；Ｒは、アリール又は低級アルキルで
あり；Ｒ¹ は、水素又は低級アルキルであり；そしてＲ
² は、水素、低級アルキル又はアリールである）で示さ
れる構造を有する、請求項１記載のエステル。
【請求項１０】Ａが、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−
プロピルスルホニル、ベンゾイル、カルボメトキシエタ
ンスルホニル、及びチオフェンスルホニルよりなる群か
ら選択される、請求項９記載のエステル。
【請求項１１】Ｘが、ＮＲ² である、請求項９記載の
エステル。
【請求項１２】Ｒ² が、水素である、請求項１１記載
のエステル。
【請求項１３】Ｒが、フェニルである、請求項９記載
のエステル。
【請求項１４】Ｒ¹ が、水素である、請求項１記載の
エステル。
【請求項１５】下記式：【化５】（式中、Ａは、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−プロピル
スルホニル、ベンゾイル、カルボメトキシエタンスルホ
ニル、及びチオフェンスルホニルよりなる群から選択さ
れる）で示される構造を有する、請求項１記載のエステ
ル。
【請求項１６】試験試料中の白血球細胞、エステラー
ゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を測定するための組
成物であって、（ａ）下記式：【化６】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；そしてＢ−Ｏ
−は、Ｂ−ＯＨ化合物の残基であって、かつこの乳酸エ
ステルが加水分解してＢ−ＯＨ化合物を生成する時に検
出可能な応答を与える）で示される構造を有する乳酸エ
ステル；（ｂ）緩衝剤；（ｃ）場合により促進化合物（accelerator compoun
d）；及び（ｄ）場合によりジアゾニウム塩カップリング剤を含む
ことを特徴とする組成物。
【請求項１７】促進化合物及びジアゾニウム塩カップ
リング剤を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】検出可能な応答が、発色性、蛍光性、
反射率変化、ｐＨ変化、化学発光性、比色法的、又は分
光測光法的応答である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】Ｂが、ピロール類、チオフェン類、フ
ラン類、アゾレゾルシン類、フェノール類、ロイコイン
ドフェノール類、アゾ色素類、５−（４−ヒドロキシ−
３，５−ジメトキシフェニルメチレン）−２−チオキソ
チアゾリン−３−酢酸、２−置換−６−ヒドロキシ−ベ
ンゾチアゾール誘導体類、ω−ニトロスチリルエステル
類、レソルフィン（resorufin ）類、アクリジノン類、
メロシアニン類、８−ヒドロキシ−２Ｈ−ジベンズ
（ｂ，ｆ）アゼピン−２−オン類、ジベンゾアゼピノン
類、ジベンゾチアゼピノン類、クマリンエステル類、及
びそれらの混合物よりなる群から選択される化合物の残
基である、請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】Ａが、下記式：【化７】（式中、Ｒ³ は、３〜約２２個の炭素原子を有する置換
又は非置換アルキル基であるか、或はＲ³ は、置換又は
非置換アリール基である）で示される構造を有する、請
求項１６記載の組成物。
【請求項２１】Ａが、下記式：【化８】（式中、Ｒ³ は、３〜約２２個の炭素原子を有する置換
又は非置換アルキル基であるか、或はＲ³ は、置換又は
非置換アリール基である）で示される構造を有する、請
求項１６記載の組成物。
【請求項２２】Ａが、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−
プロピルスルホニル、ベンゾイル、カルボメトキシエタ
ンスルホニル、及びチオフェンスルホニルよりなる群か
ら選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項２３】乳酸エステルが、下記式：【化９】（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ² であり；Ｒは、アリー
ル又は低級アルキルであり；Ｒ¹ は、水素又は低級アル
キルであり；そしてＲ² は、水素、低級アルキル又はア
リールである）で示される構造を有する、請求項１６記
載の組成物。
【請求項２４】Ｘが、ＮＲ² である、請求項２３記載
の組成物。
【請求項２５】Ｒ¹ 及びＲ² が、水素であり、そして
Ｒが、フェニルである、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】Ａが、ｐ−トルエンスルホニル又はｎ
−プロピルスルホニルである、請求項２５記載の組成
物。
【請求項２７】乳酸エステルが、約０．５〜約２mMの
濃度で存在する、請求項１６記載の組成物。
【請求項２８】緩衝剤が、約７以上のｐＨを与える、
請求項１６記載の組成物。
【請求項２９】緩衝剤が、約７〜約１０のｐＨを与え
る、請求項１６記載の組成物。
【請求項３０】緩衝剤が、約２００〜約６００mMの濃
度で存在する、請求項１６記載の組成物。
【請求項３１】促進化合物が、該組成物の０〜約４％
（v/v ）の量で存在する、請求項１６記載の組成物。
【請求項３２】促進化合物が、３〜約１５個の炭素原
子を有するアルコールを含む、請求項１６記載の組成
物。
【請求項３３】ジアゾニウム塩が、０〜約２mMの濃度
で存在する、請求項１６記載の組成物。
【請求項３４】ジアゾニウム塩が、約０．１〜約１mM
の濃度で存在し、かつ促進化合物が、該組成物の約０．
１％〜約２％（v/v ）の量で存在する、請求項１７記載
の組成物。
【請求項３５】ジアゾニウム塩が、下記式：【化１０】（式中、Ｒ⁴ は、同一又は異なって、水素、低級アルキ
ル又はアリールであるか、或は２つの隣接するＲ⁴ 基
は、一緒になって縮合環系を形成し（但し、いずれの場
合もＲ⁴ の１つは、−Ｎ⁺ ≡Ｎである）；Ｙは、Ｎ又は
ＣＲ⁵ （ここで、Ｒ⁵ は、水素又は低級アルキルであ
る）であり；そしてＤ^- は、陰イオンである）で示され
る構造を有する、請求項１６記載の組成物。
【請求項３６】ジアゾニウム塩が、下記式：【化１１】（式中、Ｆは、水素、低級アルキル又はヒドロキシであ
り；Ｄ^- は、共有結合した陰イオンであり；Ｇは、同一
又は異なって、水素、低級アルキル又はアリールである
か、或は両方のＧ基は、一緒になって縮合環系を形成す
る）で示される構造を有する、請求項１６記載の組成
物。
【請求項３７】ジアゾニウム塩が、１−ジアゾ−２−
ナフトール−４−スルホナート、１−ジアゾフェニル−
３−カルボナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−１−
ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−
７−ニトロ−１−ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−
３−ヒドロキシ−１，７−ナフチルジスルホナート、２
−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリニル）ベンゼンジアゾ
ニウムクロリド、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ブ
ロモ−１−ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−３−ヒ
ドロキシ−７−シアノ−１−ナフチルスルホナート、４
−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−〔１−オキソプロピ
ル〕−１−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物
よりなる群から選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項３８】乳酸エステルが、下記式：【化１２】（式中、Ａは、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−プロピル
スルホニル、ベンゾイル、カルボメトキシエタンスルホ
ニル、及びチオフェンスルホニルよりなる群から選択さ
れる）で示される構造を有する、請求項１７記載の組成
物。
【請求項３９】促進化合物が、約８〜約１５個の炭素
原子を有するアルコールを含み、かつジアゾニウム塩カ
ップリング剤が、１−ジアゾ−２−ナフトール−４−ス
ルホナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ニトロ
−１−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物より
なる群から選択される、請求項３６記載の組成物。
【請求項４０】０重量％〜約４重量％の重合体、０重
量％〜約０．４重量％の表面活性剤、又はそれらの混合
物を更に含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項４１】試験試料に接触した時に、試験試料中
の白血球細胞の存在又は濃度を示すのに充分な色転移を
示すことのできる組成物であって、（ａ）約０．５〜約１．５mMの下記式：【化１３】（式中、Ａは、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−プロピル
スルホニル、ベンゾイル、カルボメトキシエタンスルホ
ニル、及びチオフェンスルホニルよりなる群から選択さ
れる）で示される構造を有する発色性乳酸エステル；（ｂ）約７〜約１０のｐＨを与えることのできる緩衝
剤；（ｃ）約０．１％〜約２％（v/v ）の、約８〜約１５個
の炭素原子を有するアルコール；及び（ｄ）約０．１〜約１mMの、１−ジアゾ−２−ナフトー
ル−４−スルホナート、１−ジアゾフェニル−３−カル
ボナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−１−ナフチル
スルホナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ニト
ロ−１−ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−３−ヒド
ロキシ−１，７−ナフチルジスルホナート、２−メトキ
シ−４−（Ｎ−モルホリニル）ベンゼンジアゾニウムク
ロリド、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ブロモ−１
−ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ
−７−シアノ−１−ナフチルスルホナート、及び４−ジ
アゾ−３−ヒドロキシ−７−〔１−オキソプロピル〕−
１−ナフチルスルホナート、並びにそれらの混合物より
なる群から選択されるジアゾニウム塩カップリング剤を
含むことを特徴とする組成物。
【請求項４２】白血球細胞、エステラーゼ又はプロテ
アーゼの存在又は濃度について液体試料を測定する方法
であって、（ａ）液体試料を、（ｉ）下記式：【化１４】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；そしてＢ−Ｏ
−は、Ｂ−ＯＨ化合物の残基であって、かつこの乳酸エ
ステルが加水分解してＢ−ＯＨ化合物を生成する時に検
出可能な応答を与える）で示される構造を有する乳酸エ
ステル、（ii）緩衝剤、（iii ）場合により促進化合
物、及び（iv）場合によりジアゾニウム塩カップリング
剤を含む試薬組成物に接触させる工程；及び（ｂ）検出可能な応答について試薬組成物を試験する工
程；を含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】試験試料が、完全な及び溶解した白血
球細胞について測定される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】エステラーゼ又はプロテアーゼの存在
又は濃度が、溶解した及び完全な白血球細胞の存在又は
濃度に相関する、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】エステラーゼが、ヒト白血球エラスタ
ーゼである、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】液体試験試料が、尿である、請求項４
２記載の方法。
【請求項４７】検出可能な応答が、発色性、蛍光性、
反射率変化、ｐＨ変化、化学発光性、比色法的、又は分
光測光法的応答である、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】検出可能な応答が、発色性応答であ
る、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】試薬組成物が、検出可能な応答につい
て視覚的に又は機械的に試験される、請求項４２記載の
方法。
【請求項５０】試薬組成物が、試験試料１ml当たり約
５〜約５００ngのエステラーゼ又はプロテアーゼ濃度を
検出及び測定できる、請求項４２記載の方法。
【請求項５１】試薬組成物が、試験試料１μl 当たり
約２〜約１７５細胞の白血球細胞濃度を検出及び測定で
きる、請求項４２記載の方法。
【請求項５２】試薬組成物が、試験試料との接触の約
１分後に応答について試験される、請求項４２記載の方
法。
【請求項５３】試薬組成物が、促進化合物及びジアゾ
ニウム塩カップリング剤を含む、請求項４２記載の方
法。
【請求項５４】乳酸エステルが、下記式：【化１５】（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ² であり；Ｒは、アリー
ル又は低級アルキルであり；Ｒ¹ は、水素又は低級アル
キルであり；そしてＲ² は、水素、低級アルキル又はア
リールである）で示される構造を有する、請求項５３記
載の方法。
【請求項５５】乳酸エステルが、下記式：【化１６】（式中、Ａは、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−プロピル
スルホニル、ベンゾイル、カルボメトキシエタンスルホ
ニル、及びチオフェンスルホニルよりなる群から選択さ
れる）で示される構造を有する、請求項５４記載の方
法。
【請求項５６】促進化合物が、約８〜約１５個の炭素
原子を有するアルコールを含み、かつジアゾニウム塩カ
ップリング剤が、１−ジアゾ−２−ナフトール−４−ス
ルホナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ニトロ
−１−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物より
なる群から選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】白血球細胞、エステラーゼ又はプロテ
アーゼの存在又は濃度の測定が、乾燥相（dry phase ）
測定である、請求項４２記載の方法。
【請求項５８】試験試料中の白血球細胞、エステラー
ゼ又はプロテアーゼの存在又は濃度を測定するための試
験具であって、（ａ）下記式：【化１７】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；そしてＢ−Ｏ
−は、Ｂ−ＯＨ化合物の残基であって、かつこの乳酸エ
ステルが加水分解してＢ−ＯＨ化合物を生成する時に検
出可能な応答を与える）で示される構造を有する乳酸エ
ステル；（ｂ）緩衝剤；（ｃ）場合により促進化合物；及び（ｄ）場合によりジアゾニウム塩カップリング剤を含む
試薬組成物を、その中に均一に組み込んだ担体マトリッ
クスを含む試験パッドを含むことを特徴とする試験具。
【請求項５９】試薬組成物が、促進化合物及びジアゾ
ニウム塩カップリング剤を含む、請求項５８記載の試験
具。
【請求項６０】乳酸エステルが、下記式：【化１８】（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ² であり；Ｒは、アリー
ル又は低級アルキルであり；Ｒ¹ は、水素又は低級アル
キルであり；そしてＲ² は、水素、低級アルキル又はア
リールである）で示される構造を有する、請求項５９記
載の試験具。
【請求項６１】乳酸エステルが、下記式：【化１９】（式中、Ａは、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−プロピル
スルホニル、ベンゾイル、メトキシスクシニルスルホニ
ル、及びチオフェンスルホニルよりなる群から選択され
る）で示される構造を有する、請求項６０記載の試験
具。
【請求項６２】促進化合物が、約８〜約１５個の炭素
原子を有するアルコールを含み、かつジアゾニウム塩カ
ップリング剤が、１−ジアゾ−２−ナフトール−４−ス
ルホナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ニトロ
−１−ナフチルスルホナート、及びそれらの混合物より
なる群から選択される、請求項６１記載の試験具。
【請求項６３】液体試験試料中のヒト白血球エラスタ
ーゼ又は白血球細胞の存在又は濃度を測定するための被
検体検出具であって、支持ストリップ；支持ストリップ
に固着した試薬試験パッド；及び試薬試験パッドに組み
込まれた、（ａ）下記式：【化２０】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；そしてＢ−Ｏ
−は、Ｂ−ＯＨ化合物の残基であって、かつこの乳酸エ
ステルが加水分解してＢ−ＯＨ化合物を生成する時に検
出可能な応答を与える）で示される構造を有する乳酸エ
ステル；（ｂ）緩衝剤；（ｃ）場合により促進化合物；及び（ｄ）場合によりジアゾニウム塩カップリング剤を含む
試薬組成物；よりなることを特徴とする被検体検出具。
【請求項６４】乳酸エステルが、下記式：【化２１】（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ² であり；Ｒは、アリー
ル又は低級アルキルであり；Ｒ¹ は、水素又は低級アル
キルであり；そしてＲ² は、水素、低級アルキル又はア
リールである）で示される構造を有する、請求項６３記
載の被検体検出具。
【請求項６５】乳酸エステルが、下記式：【化２２】（式中、Ａは、ｐ−トルエンスルホニル、ｎ−プロピル
スルホニル、ベンゾイル、メトキシスクシニルスルホニ
ル、及びチオフェンスルホニルよりなる群から選択され
る）で示される構造を有する、請求項６３記載の被検体
検出具。
【請求項６６】試薬組成物が、促進化合物及びジアゾ
ニウム塩カップリング剤を含む、請求項６３記載の被検
体検出具。