JPS60231654A - 色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステル及びその製造法並びにこれらの化合物を用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬及び分析方法 - Google Patents

色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステル及びその製造法並びにこれらの化合物を用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬及び分析方法

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JPS60231654A JP60070162A JP7016285A JPS60231654A JP S60231654 A JPS60231654 A JP S60231654A JP 60070162 A JP60070162 A JP 60070162A JP 7016285 A JP7016285 A JP 7016285A JP S60231654 A JPS60231654 A JP S60231654A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規色原体であるヒドロキシイソキノリン及
びヒドロキシキノリンのアミノ酸エステル及びペプチド
エステル、その製造方法並びに適当な方法で試験試薬中
に、特に試験ストリップ中に該エステルを配合して、例
えば体液中のエステル化分解及び／又は蛋白分解酵素を
分析的に検出するための基質としての新規エステルの用
途に関する。新規エステルは、特に尿中の白血球の検出
に好適に使用される。
体液、特に尿中の白血球の検出は、腎臓及び尿生殖路の
病気の診断に極めて重要である。この検出は、元来、非
遠心分離尿又は尿沈積物中の白血球を計数することによ
って実施された。両方の方法において、完全な白血球だ
けを記録することができる。しかしながら、白血球分解
速度が尿媒体に応じて広範に変動することは公知である
。例えば、強アルカリ性尿中では、白血球の半減期はわ
ずか６０分である。このことは、測定される白血球数が
低すぎることを意味する。この溶解誤差を別にして、遠
心分離していない均質化尿中の白血球の定量的顕微鏡測
定は、計数室中で極めて正確な数値を与える。それにも
かかわらず、この方法は煩雑で、時間がかかり、熟練者
を要するので、実際にはほとんど使用されていない。
従って、医療実務において、尿中の白血球の好ましい測
定方法は、尿沈積物中のいわゆる視野法であった。この
方法には、まず、試料（沈積物）を遠心分離によって得
なければならない。しかし、尿の他の成分もそれによっ
て濃縮され、他の成分、例えば塩及び上皮細胞が白血球
の顕微鏡計数を著しく困難にする。沈積物含有量の変動
、不均一な沈積物及び光学的設計の異なる顕微鏡により
、白血球数に比較的大きい誤差（数百％まで）が生じた
。
これらの困難を回避するには、白血球は広い酵素スペク
トルを有するので、種々の体液中の白血球の検出原理と
して、酵素反応を使用する試みが既になされていた。
例えば、体液中の白血球の検出試薬は西ドイツ特許出願
公開第２８２６９６５号及び同第２８３６６４４号公報
から公知であり、これらの公報では、白血球中に存在す
るエステル化分解及び／又は蛋白分解活性が分析に利用
されている。スルホンフタレインエステル又はアゾ色素
エステルは、白血球エステラーゼ及び／又はプロテアー
ゼ用基質として使用されている。酵素反応において放出
される色素を次に、公知方法で測定する。しかしながら
、これらの公報に記載されている試薬は、白血球濃度が
低い場合に、反応時間が長すぎるので、なお実用するに
は鋭敏でない。
プロテアーゼ及びエステラーゼを検出する種々の方法は
、組織化学的及び細胞化学的酵素学からも知られている
〔例えば、ピアース（Ａ、Ｇ、Ｅ。
Ｐｅａｒｓｅ）著、ヒストケミストリイ、セオレティヵ
ル・アンド・アプライド（ｉ　。
月胆犯Ｉぢ盃ａｌ　ａｎ旦］よｌｌ８−）、第３版、チ
ャーチル・リヒングストーン（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌ
ｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　）発行、ニブインバラ−ロンド
ン−ニューヨーク１９６８年参照〕。一般に、無色又は
ねずかに着色したエステルを検出に使用するが、これら
は酵素によって無色の酸と同様に無色のアルコール（フ
エ／−ル）成分に分解される。次に、フェノール成分を
その後の反応で、例えばジアゾニウム塩とカップリング
させるか、又は酸化によって無色の生成物に変える。例
えば、エフ・シュマルッ（Ｆ、　Ｓｃｈｍａｌｚｌ　）
及びエイチ・ブラウンシュタイナー（ＨｏＢｒａｕｎｓ
ｔｅｉｎｅｒ　）は〜クリソ・ヴシュル（Ｋｌｉｎ、　
Ｗｓｃｈｒ、）第４６巻、６４２頁（１９６８年）に、
基質としてナフトール−Ａｓ−Ｄ−クロロアセテート及
び遊離されるナフトールと共に着色アゾ化合物を形成す
るジアゾニウム塩を用いる特殊な細胞化学的白血球エス
テラーゼ検出法を記載している。
しかし、この種の２成分系は、極めて感度が低い（白血
球５０００／μβを含む試料でも、まだ、反応しない）
ので、体液、例えば尿中での白血球の迅速かつ簡単な検
出には不適当であることが判った。
英国特許第Ａ−１，１２８，３７１号及びヨーロッパ特
許第Ａ−１２．９５７号は、体液中の加水分解酵素を検
出するため色原体基質としてインドキシル及びチオイン
ドキシルエステルを使用することを記載している。基質
が酵素分解されると、遊離−インドキシルが形成され、
これをその後、酸化して、容易に検出しうる青色色素イ
ンジゴにする。ヨーロッパ特許第Ａ−１２，９５７号に
基づく市販の試験手段は、Ｎ−トシルーＬ−アラニンＬ
−インドキシルエステルを含浸した１紙ストリップから
成る。試験ストリップを白血球を含む尿試料中に浸漬す
ると、ストリップは青色に変わる。しかしながら、最終
的呈色を達成し、試験を評価できるようになるまでの長
い待ち時間が、この製品の顕著な欠点である。
ヨーロッパ特許第＾−１４，９２９号は、酵素分解反応
のため種々の促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾール誘
導体、アルカリ土類金属錯体）について記載している。
しかしながら、インドキシルが完全に酸化されるまでに
比較的長い時間を要し、試験開度が低いこと（検出限界
：数千白血球／μβ）が、なお欠点である。同じことは
、ヨーロッパ特許第Ａ−３４、３２３号により白血球酵
素の基質としてロイコ−インドアニリンのエステルを使
用する場合にも当てはまる。
ヨーロッパ特許第八−３９，８８０号明１［１１はヨー
ロッパ特許第Ａ−１２，９５７号及び同第１４，９２９
号による基質と、前記のジアゾニウム塩とカップリング
させる検出原理との組み合わせを提供している。この方
法で白血球の検出限界を著しく低減することができるが
、実際に使用するのに望まれる１５〜２０白血球／μｌ
の検出感度はまだ達成されない。
従って、本発明の目的は、高い検出感度と白血球酵素に
よる迅速な分解及びジアゾニウム塩との迅速かつ強い呈
色反応とを合わせもつ、エステル分解酵素の新規色原体
基質を見いだすことであった。この目的は、本発明によ
るエステルによって達成される。
本発明は、一般式（Ｉ）： 〔式中Ｘ１及びＸ２はＮ又はＣＨを表すが、それぞれの
場合に、Ｘ、又はＸ２のいずれかはＮを表し、ＲＩ　、
Ｒ２及びＲ３は同−又は異なり、水素、炭素原子数１〜
６のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基、炭
素原子数１〜６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメ
チル基、ニトロ基、Ｓ　０３　Ｈ、シアノ基、炭素原子
数１〜８のアシルアミノ基、炭素原子数１〜６のジアル
キルアミノ基又は炭素原子数６〜１０のアリール基を表
し、これらは更に、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭
素原子数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ基、
ニトロ基、トリフルオロメチル基、５Ｏ３Ｈ１炭素原子
数１〜６のアシル基又は炭素原子数１〜６のジアルキル
アミノ基で置換されていてよいか、又はＲ２及びＲ３が
一緒に縮合芳香環、好ましくはベンゼン環を形成し、こ
の環は１個又は２個の基Ｒ１で置換されていてよ（、Ａ
はアミノ酸基又はペプチド基を表し、Ｇは水素又は好ま
しくはペプチド化学に常用の窒素保護基を表すか又はこ
のような基から誘導される〕の化合物に関する。
本発明は、更に、一般式（■）： 〔式中Ｘ７、Ｘ２、Ｒ４、Ｒ２及びＲ３は前記のものを
表す〕のフェノールを一般式（■）：（、−Ａ−ＯＨ（
Ｉ［［） 〔式中Ｇ及びＡは前記のものを表す〕のアミノ酸若しく
はペプチド又はその適当な反応性誘導体とペプチド化学
に常用の方法で反応させることを特徴とする本発明のエ
ステルの製造法に関する。
適当な反応性誘導体は、例えば酸クロリド及びペプチド
合成に常用の混成無水物、例えばクロロギ酸エチルとの
無水物、又は活性エステル、例えばペンタクロロフェニ
ルエステル又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエス
テルである。
本発明は、更に（ａ）色原体酵素基質、（ｂ）ジアゾニ
ウム塩、必要に応じて（Ｃ）緩衝剤及び必要に応じて（
ｄ）担体及び／又は常用の添加剤を含むエステル分解及
び／又は蛋白分解酵素の検出試薬において、色原体酵素
基質が一般式（１）の化合物であることを特徴とするエ
ステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬に関する
。
最後に、本発明はまた、試料を本発明による試薬と接触
させ、起こった呈色反応を測定することを特徴とする液
体試料、殊に体液中のエステル分解酵素及び／又は蛋白
分解酵素の検出方法に関する。
本発明において好ましい一般式（１）の化合物は、Ｘｌ
がＣＨを表し、Ｘｌが窒素を表す化合物である。更に好
ましい化合物は、Ｒｓ　、Ｒ２及びＲ３が同−又は異な
り、水素、炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子数
１〜４のアルコキシ基、アシルアミノ基（酸基は炭素原
子数１〜６の脂肪族又は芳香族の基であってよい）、炭
素原子数１〜４のジアルキルアミノ基、ニトロ基、シア
ノ基、ハロゲン又はアリール基（場合により炭素原子数
１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ基
又はハロゲンで一置換されている）を表す化合物である
。
ＲＩ、Ｒ２及びＲ３は同−又は異なり、水素、炭素原子
数１〜４のアルキル基、フェニル基又はハロゲンを表す
のが特に好ましい。
本発明による化合物において、エステル基は（イソ）キ
ノリン環系の３位、４位又は８位に存在するのが好まし
い。
最後に一１Ｇ−Ａ−は、一般式（■）：〔式中Ｒ４は水
素、又は場合により分岐したアルキル基、シクロアルキ
ル基、アルアルキル基を表し、これらの基は１〜１５個
、好ましくは１〜９個の炭素原子を有し、場合により１
個のヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、
アミノ基又はグアニド基≠−−日−ｉで置換されており
、Ｒ５は水素又は好ましくは−ＣＯＣチーキル基、−Ｃ
Ｏ−アルアルキル基、〜ＣＯＣチーール基、−３０２−
アルキル基又は−３０２−アリール基を表し、アルキル
基は１〜９個の炭素原子、絆ましくは１〜６個の炭素原
子を有する直鎖又は分枝鎖の基であり、アリール基は、
６〜１２１１１ｉ１の炭素原子、好ましくは６個の炭素
原子を含み、場合により炭素原子数１〜４のアルキル基
、炭素原子数１〜４のアルコキシ基又はハロゲンで置換
されている〕の基を表すのが好ましい。
Ｇ−Ａ−は、特に好ましくは、天然に存在するアミノ酸
又はこのような酸２〜８個のペプチドの、常用の窒素保
護基を有する基を表す。
アミノ酸基は、そのＬ−又はＤ−形又はそのラセミ形で
存在しうる。特に好ましい基は、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及
びチロシンの基であり、それぞれの場合にＬ−形が特に
好ましい。存在する遊離ヒドロキシル基をアシル化、好
ましくはアセチル化することができる。
Ａの定義におけるペプチド基は、例えばジー、トリー、
テトラ−及びペンタ−ペプチド、好ましくはジー及びト
リペプチドを表し、好ましい可能なアミノ酸成分は前記
のアミノ酸である。
Ｇの定義における窒素保護基としては、例えばペプチド
化学に常用のものであり、自体公知のアルキル−及びア
ルアルキル−オキシカルボニル基、アルキル−及びアル
アルキル−オキシチオカルボニル基、スルホニル基、ス
ルフェニル基、ビニルオキシカルボニル基、シクロヘキ
セニルオキシカルボニル基、ホスホリル基又はカルバモ
イル基が挙げられる。
一般式（］ｉ）のフェノール類は、自体公知であるか、
又は公知方法で製造される。
一般式（Ｉ［）のフェノール類の製造方法は、例えば下
記の参照文献に記載されている：ケイ・ジエンカー（Ｌ
　５ｃｈｅｎｋｅｒ）著、ヘルプ（ｌｌｅｌｖ、　）第
５１巻４１３頁（１９６８年）、エイ・ウルリフヒ（Ａ
、υ１ｒｉｃｈｕ）著、ヘル（Ｂｅｒ、　）第３７巻１
６８５頁（１９０４年）及びザ・ケミストリイ・オブ・
ヘテロ号イクリソク・コンパウンダ（’Ｉｔ咀」ミリ１
ｓｔｒ　ｏｆ　Ｈｅｔ虹立り立１ｉｃ　Ｃ店曵現１ムー
）第３２巻キノリン第１部及びｎ部、ガーノス・ジョー
ンズ（Ｇｕｒｎｏｓ　Ｊｏｎｅｓ）　１１４゜本発明に
よる化合物は、一般式（ＩＩ）のフェノール類及び一般
式（１）のアミノ酸若しくはペプチド又はそれらの反応
性誘導体（特に酸ハライド又は活性エステル）から、ペ
プチド化学から自体公知の合成方法によって製造するこ
とができる。
この種の方法は、例えば、下記の刊行物（及び本明細書
に引用する文献）、即ち、ジャノッフ（Ｊａｎｏｆｆ）
ら著、ブロク・ツク・エクスペル・ビオル・メト（均１
Ｌ−違煕工」」狙ｒ、　Ｂ桟上、　Ｍｅｄユ）第１３６
巻、１０４５〜１０４９頁（１９７１年）；スィートマ
ン（Ｓｗｅｅｔｍａｎ）ら著、ジェイ・ヒスト・ツク（
Ｊ、　Ｈｉｓｔ、　Ｓｏｃ、　）第２２巻３２７〜３３
９頁；ヤクプケ（Ｊａｋｕｂｋｅ　）ら著、ベル（Ｂｅ
ｒ、）　１００．２３６７〜２３７２頁（１９６７年）
及び特に、ツーベン−ワイル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ
　）著、メソッド・オブ・オーガニック・ケミストリー
Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｏｒ　ａｎｉｓｃｈｅｎ　
Ｃｈｅｍｉｅ）　、第ＸＶ／１巻及びＸＶ／２巻に記載
されている。
本発明による、エステル化分解及び／又は蛋白分解酵素
の検出用試薬は、本発明による色原体基質の他に、一般
式（Ｖ）： 〔式中Ｒ’＋　は低級アルキル基、低級アルコキシ基、
低級アルキルメルカプト基、ヒドロキシル基、ニトロ基
、シアノ基、トリフルオロメチル基、炭素原子数１〜８
のアルキルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド
基、炭素原子数１〜８のアルキルスルホン基、アリール
スルホン基、スルホン酸又はカルボン酸、Ｎ−モルホリ
ノ基、Ｎ−チオモルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、場合
によりＮ“−アルキル化Ｎ−ピペラジノ基又はＮ−ピペ
リジノ基、ハロゲン又は水素を表し、Ｒ”３は低級アル
キル基、低級アルコキシ基、アリールオキシ基、低級ア
ルキルメルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキルア
ミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、炭素原
子数１〜８のアルキルスルホンアミド基、アリールスル
ホンアミド基、炭素原子数１〜８のアルキルスルホン基
、アリールスルホン基、スルホン酸又はカルボン酸、Ｎ
−モルホリノ基、Ｎ−チオモルホリノ基又はＮ〜ピロリ
ジノ基、場合によりＮ“−アルキル化Ｎ−ピペラジノ基
又はＮ−ピペリジノ基又はフェニルアミノ基、場合によ
り低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基で置換され
たフェニル基、ハロゲン又は水素を表し、Ｒ’２　、Ｒ
’４及びＲ’ｓは、同−又は異なり、それぞれ低級アル
キル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、炭素原子数１〜
８のアルキルスルホンアミド基、アリールスルホンアミ
ド基、炭素原子数１〜８のアルキルスルホン基、アリー
ルスルホン基、スルホン酸基又はカルボン酸基又は低級
アルキルメルカプト基、ハロゲン又は水素を表し、Ｘは
安定化陰イオンを表し、それぞれの場合に２個の隣接す
る基Ｒ’　＋　〜Ｒ′５が閉環して、場合により炭素原
子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキ
シ基又はニトロ基、ハロゲン、スルホン酸基又はカルボ
ン酸基で置換されたベンゼン環を形成することができ、
ナフタリン系のジアゾニウム塩を形成する〕のジアゾニ
ウム塩を含む。
一般式（Ｖ）において、好ましくは、Ｒ’＋　は炭素原
子数１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキ
シ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ハロゲン又は水素を
表し、Ｒ”ｓは炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原
子数１〜４のアルコキシ基、アリールオキシ基、炭素原
子数１〜４のアルキルアミノ基、炭素原子数１〜４のジ
アルキルアミノ基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のアル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基、炭
素原子数１〜４のアルキルスルホン基、アリールスルホ
ン基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、フェニル
アミノ基又はスルホン酸基又は水素を表し、Ｒ’２　、
Ｒ’４及びＲ′５は同−又は異なり、炭素原子数１〜４
のアルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ基、炭素
原子数１〜４のアルキルアミノ基、炭素原子数１〜４の
ジアルキルアミノ基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のア
ルキルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基又
はスルホン酸基、ハロゲン又は水素を表す。
それぞれの場合に、２個の隣接する基Ｒ’＋〜Ｒ’ｓは
場合によって閉環して、ベンゼン環を形成することがで
き、これは場合によりハロゲン又は炭素原子数１〜４の
アルキル基又は炭素原子数１〜４のアルコキシ基又はニ
トロ基又はスルホン酸基で置換されていてもよい。
一般式（Ｖ）において、アリール基はそれぞれ６〜１２
個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子を含む芳香族
基を表し、場合によりハロゲン又は炭素原子数１〜４の
アルキル基又は炭素原子数１〜４のアルコキシ基で置換
されている。
一般式（Ｖ）のジアゾニウム塩は、同様に自体公知であ
るか又は公知の方法によって合成することができる〔ツ
ーベン−ワイル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ　）著、メソ
ッド・オブ・オーガニック・ケミストリー　（Ｍｅｔｈ
ｏｄ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）
　、第Ｘ／３巻参照〕。
本発明による試薬は、検出すべき酵素による色原体基質
（Ｉ）の分解を促進する物質を含むのが好ましい。可能
な、このような促進剤は、例えばヨーロッパ特許第Ａ−
１４，９２９号に記載されている化合物であり、炭素原
子数８〜２５、好ましくは炭素原子数１０〜２０の脂肪
族アルコール（場合により不飽和であってもよい）が好
ましい。このような好ましい促進剤は、例えばｎ−デカ
ノール、ｎ−ドデカノール及び特にｎ−ウンデカノール
である。特に好ましい促進剤は、塩基性アミノ酸を含む
ホモポリアミノ酸又はコポリアミノ酸〔イー・カチアル
スキイ（Ｅ、　Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ　）著、アドバン
シイズ・オブ・プロティン・ケミストリー（Ｉヱ鮭旦亜
−バーむ旦切ｉｎ工ｈｌｂ±ロー）第１３巻、２４３〜
４９３頁（１９５８）ｉ及びシー・ビー・アンフィンゼ
ン（Ｃ，Ｂ、Ａｎｆｉｎｓｅｎ）　、エム・エル・アン
ソン（Ｍル、　Ａｎｓｏｎ）　、ジェイ・ティ・ニドサ
ル（Ｊ、Ｔ、　Ｅｄｓａｌｌ　）及びケイ・バイリイ　
（Ｋ。
Ｂａ１ｌｅｙ）　（編集者）；アカデミツク・プレス・
インコーホレイテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
、　Ｉｎｃ、）　−。
ニューヨーク州ニューヨーク市発行〕及び逐次ポリアミ
ノ酸である。可能な塩基性アミノ酸は、側鎖にアミノ基
又はグアニド基を有するアミノ酸である。これらは特に
、リジン及びオルニチン、並びにアルギニン、及び更に
天然に存在しない塩基性アミノ酸、例えばジアミノ酪酸
、ジアミノプロピオン酸又はジアミノピメリン酸である
。構成アミノ酸は、ポリアミノ酸中にラセミ形又は光学
活性り一又はＬ−形で存在することができる。ポリアミ
ノ酸の分子量（数平均）は１　、０００〜２，０００，
０００であり、好ましくは５，０００〜５００，０００
である。塩基性アミノ酸の含有率は、５〜１００モル％
、好ましくは２゛０〜１００モル％である。
促進剤は、下記の試験具を製造する際の含浸液の０．５
〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％の量で使用する
のが好ましい。
蛋白分解酵素及び特に白血球酵素の検出用の本発明の試
薬は、適当な緩衝剤系を含むのが好ましい。この目的で
可能な系は、例えば燐酸塩、硼酸塩、炭酸塩／重炭酸塩
、炭酸塩、バルビッール酸塩、トリス−（ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン（−トリス）、２−アミノ−２−
メチル−プロパン−１，３−ジオール（−アメジオール
）又はアミノ酸緩衝剤であり、ｐＩＩ値及び容量は原則
として測定溶液又は試験ストリップにおいてｐＨ値が６
〜ｌＯ１好ましくは７〜９になるように選択する。
本発明による試薬は、０体公知の洗浄剤を含んでいてよ
い。なぜならば、これにより一層均質な色素分布及び一
層強い呈色が達成されるからである。可能な洗浄剤は陽
イオン性及び陰イオン性洗浄剤、並びに両性及び非イオ
ン性洗浄剤である。
これらの洗浄剤としては、例えば、ベンジル−ジメチル
−テトラデシルアンモニウムクロリド、ドデシル硫酸ナ
トリウム、ゼフィロール、ポリビニルピロリドン、活性
剤として前記のポリアミノ酸、ヘパリノイド及びこれら
の化合物の混合物が挙げられる。
本発明の試薬において、前記の試薬を自体公知の不活性
担体に組み込むのが好ましく、特に好ましい担体マトリ
ックスは多孔性物質二側ｆば特に２紙、及びプラスチッ
ク製膜、ガラス繊維マント（米国特許第３，８４６，２
４７号明細書）、多孔性セラミックストリップ、合成不
織布、スポンジ状物質（米国特許第３，５５２，９２８
号明細書）、フェルト、繊維、木材、セルロース又はシ
リカゲルである。
この目的で、前記の担体を、容易に除去しうる適当な溶
剤、例えば水、メタノール、°エタノール、アセトン、
ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド中の前
記試薬の溶液で含浸する。これは２つの別工程で行うの
が好ましい。即ち、まず、材料を緩衝剤及び他の水溶性
添加剤を含む水溶液で含浸する。次いで、これを一般式
（Ｖ）の色原体酵素基質及び活性剤の溶液で含浸する。
しかしながら、含浸を別の順序で又は組成の異なる２種
の含浸溶液を用いて実施することもできる。含浸溶液又
は試験すべき液体が本発明による化合物及びジアゾニウ
ム塩を１０−４〜１０−１モル／１．特に１０−３〜１
Ｏ−１モル／ｌの濃度で含むのが好ましい。
２紙をマトリックスとして使用する場合には、完成試験
紙をそのまま使用するか、又は自体公知の方法で把手に
接着させるか、又は好ましくは例えば西ドイツ特許出願
公開第２１１８４５５号公報によりプラスチックと微細
なメソシュ網との間に封入することができる。
フィルムを被覆した試験ストリップを製造するため、好
ましくはすべての試薬をフィルム形成物質、例えばポリ
ビニルエステル又はポリアミドの溶液又は分散液中に入
れ、均質に混合する。この混合物をプラスチック製担体
上に薄い層を形成するようにブラシで塗布し、乾燥する
。乾燥後、こうして製造したフィルムを被覆した試験ス
トリップを切断し、そのまま使用するか、又は自体公知
の方法で把手に接着させるか、又は例えば西ドイツ特許
出願公開第２１１８４５５号公報によりプラスチックと
微細なメソシュ網との間に封入することができる。
エステル分解及び／又は蛋白分解酵素、特に白血球酵素
を検出するための本発明の診断剤は、試験試薬の前記成
分に常用の薬品添加剤を添加し、混合物を造粒すること
によって粉末混合物又は試薬錠剤の形で製造することが
できる。この種の添加剤は、例えば炭水化物（例えば単
糖類、オリゴ糖性しくは多糖類）、又は糖アルコール（
例えばマンニット、ソルビット若しくはキシリット）、
又は他の可溶性不活性化合物、例えばポリエチレングリ
コール若しくはポリビニルピロリドンである。粉末混合
物又は試薬錠剤は、例えば、約５０〜２００■、好まし
くは５０〜８０■の最終重量を有する。
それぞれの場合に、約５〜２０■、好ましくは約１０■
の合計重量を有する凍結乾燥物を製造するには、試験に
必要なすべての試薬の他に、常用の構造形成剤、例えば
ポリビニルピロリドン及び必要に応じて他の充填剤、例
えばマンニット、ソルビット若しくはキシリジドを含む
溶液を凍結乾燥する。
溶液の形の本発明による診断剤は、試験に必要なすべて
の試薬を含むのが好ましい。可能な溶剤は、水及び水と
水溶性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセ
トン若しくはジメチルホルムアミドとの混合物である。
貯蔵上の理由では、試験に必要な試薬を２以上の溶液に
分割し、これを実際の試験の間に一緒にするのが有利で
ある。
こうして製造した診断剤は、試験すべき体液中に浸漬す
るか又は試験すべき体液に添加した後、エステル分解及
び／又は蛋白分解酵素、特に白血球酵素の存在を、発色
により迅速かつ簡単に検出することができ、その発色は
肉眼又は分光光度計で、例えば反射測光法で、すなわち
キュベツト中で測定することができる。−細胞毎の白血
球酵素の活性シよほぼ一定のパラメータと見なされるの
で、試験する体液の白血球濃度を発色の強度から測定す
ることができる。これにより、本発明による診断剤を用
いて完全な白血球及び溶解した白血球を記録した。それ
というのは白血球酵素の活性は、白血球の溶解後でも完
全に保有されるからである。
従って、溶解現象による誤差は生じない。
下記の実施例は本発明を説明するためのものである。特
に断らない限り、量は重量部又は重量％を表すものとす
る。
実施例１ ぺ−シル−Ｌ−−ニルエスール　１゛ このエステルは、それぞれの場合に、例えばＮ−トシル
−Ｌ−アラニルクロリドを無水メチルエチルケトン又は
無水トルエン中で粉末炭酸カリウムの存在下でフェノー
ル類と反応させることによって製造した。約５５°Ｃで
６〜１２時間攪拌した後、４０〜７０％のフェノールが
反応していた。
フエ／　−）Ｌ’　：　Ｋ２　Ｃ０３：酸クロリドのモ
ル比は、通常１　：　１．５　：　１．５であった。ｐ
Ｈ値は、全反応期間を通じて約７であった。後処理のた
め、炭酸カリウムを５０℃でｒ去し、次に溶剤を真空中
で蒸発させた。生成物をシリカゲル−溶離剤（例えば石
油エーテル：アセトン−約９＝１）を用いてカラムクロ
マトグラフィーし、その後、再結晶させることによって
精製した。
一トシルーＬ−アラニン 文献：イー・フィッシャー（Ｅ、　Ｆｉｓｃｈｅｒ）及
びダブリュー・リップシソツ（瞳、Ｌｉｐｓｃｈｉｔｚ
）著、ビー　（Ｂ、　）第４８巻、３６２頁（１９１５
年）Ｌ−アラニン８３．７　ｇ　（０，９３モル）を約
２Ｎの水酸化ナトリウム溶液４６５ｍ１に熔かす。この
溶液にｐ−）ルエンスルホニルクロリド１８６ｇ（０，
９７６モル）を７０〜７２℃で２０分かけて少量ずつ添
加する。スルホニルクロリドの添加の間、自動滴定装置
を用いて約２Ｎの水酸化ナトリウム溶液で反応混合物を
ｐＨ１’ｏに保持する。ここにおいて、２Ｎ水酸化ナト
リウム溶液５６０ｍ１が消費される。反応混合物のｐＨ
がもはや変化しなくなったら、混合物を１５〜５℃に冷
却し、３７％強度の塩酸でｐＨ３にする。分離した生成
物を吸引−過し、湿ったフィルターケーキを水２３５０
ｍｌから再結晶させる。
収量：融点１３２〜１３５℃のＬ−ｐ−）ジルアラニン
１８５．５ｇ（理論量の８２％）。
且：　シル−し一アーニルクロ百　 ｐ−）シル−し一アラニン１５８．１　ｇ　（０，６５
モル）を４０℃の塩化チオニル３５０ｍ１中で、澄明な
溶液が形成するまで、攪拌する。過剰の塩化チオニルを
水流ポンプの真空下に情夫する。フラスコ内の残渣を黒
部したトルエン３００ｍ１に取る。
得られる澄明で、わずかに黄色の溶液を、攪拌したりグ
ロイン９００ｍ’ｌ中に注ぐ。酸クロリドが沈澱する。
翌日、吸引−過し、軽質ガソリンで洗浄し、真空デシケ
ータ中で塩化カルシウム／水酸化カリウム上で乾燥する
。
収量：融点８１〜８３℃のほとんど無色の結晶１５５ｇ
　（理論量の９１％）。
−Ｎ−ルエンー　″−スル７、ニル　−一アラニルオキ
シ〕−３−メチル−イソキノリン４−ヒドロキシ−３−
メチル−イソキノリン１．６ｇを４０℃で無水ピリジン
２．４ｇと共に塩化メチレン１００ｍ１中に溶かす。無
水塩化メチレン１００ｍ１に溶かした、合計６ｇのＮ−
）シルーＬ−アラニルクロリドを４０℃で６時間かけて
、満願する。混合物をその後、更に２時間４０℃で攪拌
する。冷却後、塩化メチレン溶液を２％強度のクエン酸
溶液を毎回１００ｍ１用いて３回洗浄する。
塩化メチレン相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、乾燥剤を
ｔ去した後、蒸発させる。残渣をシリカゲル上でカラム
クロマトグラフィーによって精製する。溶離剤；石油エ
ーテル：アセトン８：２゜溶剤を蒸発させた後、所望の
フラクションである、０．８ｇの４−　（Ｎ−（）ルエ
ンー４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−３−
メチル−イソキノリンが得られる。
同様の方法で、一般式（ｎ）の対応するヒドロキシイソ
キノリン及びヒドロキシキノリンを特定のＮ−保護アミ
ノ酸又は反応性アミノ酸誘導体と反応させることによっ
て下記の基質が得られる：４−　（Ｎ−（１−ルエンー
４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−３−フェ
ニル−イソキノリン、５７（Ｎ−（１−ルエンー４１−
スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−イソキノリン、
４−（Ｎ−（）ルエンー４１−スルホニル）−Ｌ−アラ
ニルオキシ〕−イソキノリン、４−　（Ｎ−（を−ブチ
ルオキシカルボニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−３−メ
チル−イソキノリン、４−〔Ｎ−ヘンシルオキシカルボ
ニル−し−アラニルオキシツー３−フェニル−イソキノ
リン、４−〔Ｎ−メチルスルホニル−し−リジルオキシ
フ−３−メチル−イソキノリン、４−〔Ｎ−ヘンシルオ
キシカルボニル−〇−アセチルーＬ−チロシル〕−３−
メチル−イソキノリン、８−　（Ｎ−（）ルエンー４　
Ｉ＋−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−イソキ／
ＩＪ：／、４−［Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｌ−’フェ
ニルアラニルオキシフ−３−メチル　−　キノリン、４
−　（Ｎ−（）ルエンー４”−スルホニル）へＬ−アラ
ニルオキシ〕−７−クロロ−キノリン、７−　〔Ｎ−（
）ルエンー４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシゴ
ーキノリン、８−（Ｎ−（トルエン−４１１−スルホニ
ル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−６−メチル−キノリン、
８−　（Ｎ−（）ルエンー４″′−スルホニル）−Ｌ−
アラニルオキシゴーキノリン、８−　（Ｎ−（）ルエン
ー４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−４−メ
チル−キノリン、８−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル
−し−アラニルオキシ〕−６−エトキシーキノリン、６
−（Ｎ−（）ルエンー４″−スルホニル）−Ｌ−アラニ
ルオキシゴー８−ジエチルアミノ−キノリン、８−　（
Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−アラニルオ
キシラー２−メチル−４−アセチルアミノ−キノリン、
７−（Ｎ−（）ルエンー４″−スルホニル）−Ｌ−アラ
ニルオキシ〕−４−メチル−キノリン、８−（Ｎ−ベン
ジルオキシカルボニル−し−アラニルオキシ−５−ベン
ゾイルアミノ−キノリン、３−（Ｎ−（）ルエンー４１
′−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシゴーキノリン及
び３−（Ｎ−（＋−ルエンー４″−スルホニル）−Ｌ−
フェニルアラニルオキシフ−キノリン。
実施例２ １紙〔例えばイートン・アンド・ダイクマン（Ｅａｔｏ
ｎ　ａｎｄ　Ｄｉｋｅｍａｎ　）　２０５　）を下記の
溶液で順次含浸し、次いで６０℃で乾燥した。
釡墓土 ０．１モルのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン緩衝液（ｐＨ８，４）　、３％のポリビニルピロリ
ドン及び２．５％のポリーＬ−アルギニン。
溶剤：水 産直Ｉ ７．５Ｘ１０−３モル／ｌの４−　（Ｎ−（）ルエンー
４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシフ−３−メチ
ル−イソキノリン及びｌＸｌ０−２モル／１０）２−ヒ
ドロキシ３−ニトロ−５−スルホーヘンゼンジアゾニウ
ムテトラフルオポレート、溶剤：無水アセトン 淡黄色試験紙が得られ、この試験紙は白血球を含む尿中
に浸漬したときに青色に変色する。
実施例３ ４−　（Ｎ−（）ルエンー４″−スルホニル）−Ｌ−ア
ラニルオキシフ−３−フェニル−イソキノリン５■、２
−ヒドロキシ−３−ニトロ−５−スルホーベンゼンジア
ゾニウムテトラフルオボレート５■、燐酸二水素カリウ
ム４■、燐酸水素二ナトリウム２水和物８０■、ポリー
Ｌ−リジン６■及びマンニット１１０■を含む錠剤を、
白血球を含む尿５．ａｌと惹合−１゜尿試料は、青色に
変色する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）一般式； 〔式中ｘ１及びＸｌはＮ又はＣＨを表すが、それぞれの
    場合に、Ｘｌ又はＸｌのいずれかはＮを表し、Ｒ１、Ｒ
    ２及びＲ３は同−又は異なり、水素、炭素原子数１〜６
    のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基、炭素
    原子数１に６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメチ
    ル基、ニトロ基、３０３　Ｈ、シアノ基、炭素原子数１
    〜８のアシルアミノ基、炭素原子数１〜６のジアルキル
    アミノ基又は炭素原子数６〜１０のアリール基を表し、
    これらの基は更に、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭
    素原子数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ基、
    ニトロ基、トリフルオロメチル基、Ｓ　Ｏｘ　Ｈ１炭素
    原子数１〜６の７シル基又は炭素原子数１〜６のジアル
    キルアミノ基で置換されていてよいか、又はＲ２及びＲ
    ３が一緒に縮合芳香環、好ましくはベンゼン環を形成し
    、この環は１個又は２個の基Ｒ１で置換されていてよく
    、Ａはアミノ酸基又はペプチド基を表し、Ｇは水素又は
    好ましくはペプチド化学に常用の窒素保護基を表すか又
    はこのような基から誘導される〕の化合物。 （’２）Ｘ＋がＣＨを表し、Ｘｌが窒素を表す特許請求
    の範囲第１項記載の化合物。 （３）Ｒ＋　、Ｒ２及びＲ３が同−又は異なり、水素、
    炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４のア
    ルコキシ基、アシルアミノ基（酸基は炭素原子数１〜６
    の脂肪族又は芳香族基であってよい）、炭素原子数１〜
    ４のジアルキルアミノ基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲ
    ン又は場合により炭素原子数１〜−４のアルキル基、炭
    素原子数１〜４のアルコキシ基若しくはハロゲンで置換
    されたアリール基を表す特許請求の範囲第１項又は第２
    項に記載の化合物。 （４）Ｒ＋　、Ｒ２及びＲ３が同−又は異なり、水素、
    炭素原子数１〜４のアルキル基、フェニル基又はハロゲ
    ンを表す特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項
    に記載の化合物。 （５）Ｒ２及びＲ３が水素を表すか又は−緒に縮合ベン
    ゼン環を形成する特許請求の範囲第１項〜第４項のいず
    れか１項に記載の化合物。 （６）エステル基が３位、４位又は８位に存在する特許
    請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の化合
    物。 （７）Ａが天然に存在するアミノ酸又は２〜８個の天然
    に存在するアミノ酸のペプチドの基を表す特許請求の範
    囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の化合物。 （８）一般式： 〔式中Ｘ１及びＸｌはＮ又はＣＨを表すが、それぞれの
    場合に、Ｘｌ又はＸｌのいずれかはＮを表し、Ｒ１、Ｒ
    ２及びＲ３は同−又は異なり、水素、炭素原子数１〜６
    のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基、炭素
    原子数１〜６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメチ
    ル基、ニトロ基、＼ ３０３　Ｈ、シアノ基、炭素原子数１〜８のアシルアミ
    ノ基、炭素原子数１〜６のジアルキルアミノ基又は炭素
    原子数６〜１０のアリール基を表し、これらは更に、炭
    素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６のアル
    コキシ基、ハロゲン、シアノ基、ニトロ基、トリフルオ
    ロメチル基、Ｓ　０３　Ｈ。 炭素原子数１〜６のアシル基又は炭素原子数１〜６のジ
    アルキルアミノ基で置換されていてよいか、又はＲ２及
    びＲ３が一緒に縮合芳香環、好ましくはベンゼン環を形
    成し、この環は１個又は２個の基Ｒ＋で置換されていて
    よく、Ａはアミノ酸基又はペプチド基を表し、Ｇは水素
    又は好ましくはペプチド化学に常用の窒素保護基を表す
    か又はこのような基から誘導される〕の化合物を製造す
    るため、一般式： 〔式中Ｘ＋　、Ｘｌ　、Ｒ＋　、Ｒ２及びＲ３は前記の
    ものを表す〕のフェノールを一般式： ％式％ 〔式中Ｇ及びＡは前記のものを表す〕のアミノ酸若しく
    はペプチド又はその適当な反応性誘導体とペプチド化学
    に常用の方法で反応させることを特徴とするアミノ酸エ
    ステル及びペプチドエステルの製造方法。 （９）（ａ）色原体酵素基質、（ｂ）ジアゾニウム塩、
    必要に応じて（Ｃ）緩衝剤及び必要に応じて（ｄ）担体
    及び／又は常用の添加剤を含むエステル分解及び／又は
    蛋白分解酵素の検出試薬において、色原体酵素基質が特
    許請求の範囲第１項〜第７項に記載した化合物であるこ
    とを特徴とするエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の
    検出試薬。 （１０）液体試料、殊に体液中のエステル分解及び／又
    は蛋白分解酵素を検出する分析方法において、試料を特
    許請求の範囲第９項記載の試薬と接触させることを特徴
    とするエステル分解及び／又は蛋白分解酵素を検出する
    分析方法。
JP60070162A 1984-04-06 1985-04-04 色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステル及びその製造法並びにこれらの化合物を用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬及び分析方法 Expired - Lifetime JPH0610200B2 (ja)

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