JPH0610200B2 - 色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステル及びその製造法並びにこれらの化合物を用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬及び分析方法 - Google Patents

色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステル及びその製造法並びにこれらの化合物を用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬及び分析方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規色原体であるヒドロキシイソキノリン及
びヒドロキシキノリンのアミノ酸エステル及びペプチド
エステル、その製造方法並びに適当な方法で試験試薬中
に、特に試験ストリップ中に該エステルを配合して、例
えば体液中のエステル化分解及び／又は蛋白分解酵素を
分析的に検出するための基質としての新規エステルの用
途に関する。新規エステルは、特に尿中の白血球の検出
に好適に使用される。
体液、特に尿中の白血球の検出は、腎臓及び尿生殖路の
病気の診断に極めて重要である。この検出は、元来、非
遠心分離尿又は尿沈積物中の白血球を計数することによ
って実施された。両方の方法において、完全な白血球だ
けを記録することができる。しかしながら、白血球分解
速度が尿媒体に応じて広範に変動することは公知であ
る。例えば、強アルカリ性尿中では、白血球の半減期は
わずか６０分である。このことは、測定される白血球数
が低すぎることを意味する。この溶解誤差を別にして、
遠心分離していない均質化尿中の白血球の定量的顕微鏡
測定は、計数室中で極めて正確な数値を与える。それに
もかかわらず、この方法は煩雑で、時間がかかり、熟練
者を要するので、実際にはほとんど使用されていない。
従って、医療実務において、尿中の白血球の好ましい測
定方法は、尿沈積物中のいわゆる視野法であった。この
方法には、まず、試料（沈積物）を遠心分離によって得
なければならない。しかし、尿の他の成分もそれによっ
て濃縮され、他の成分、例えば塩及び上皮細胞が白血球
の顕微鏡計数を著しく困難にする。沈積物含有量の変
動、不均一な沈積物及び光学的設計の異なる顕微鏡によ
り、白血球数に比較的大きい誤差（数百％まで）が生じ
た。
これらの困難を回避するには、白血球は広い酵素スペク
トルを有するので、種々の体液中の白血球の検出原理と
して、酵素反応を使用する試みが既になされていた。
例えば、体液中の白血球の検出試薬は西ドイツ特許出願
公開第2826965号及び同第2836644号公報から公知であ
り、これらの公報では、白血球中に存在するエステル化
分解及び／又は蛋白分解活性が分析に利用されている。
スルホンフタレインエステル又はアゾ色素エステルは、
白血球エステラーゼ及び／又はプロテアーゼ用基質とし
て使用されている。酵素反応において放出される色素を
次に、公知方法で測定する。しかしながら、これらの公
報に記載されている試薬は、白血球濃度が低い場合に、
反応時間が長すぎるので、なお実用するには鋭敏でな
い。
エロテアーゼ及びエステラーゼを検出する種々の方法
は、組織化学的及び細胞化学的酵素学からも知られてい
る〔例えば、ピアース(A.G.E.Pearse)著、ヒストケミス
トリィ，セオレティカル・アンド・アプライド(Hestoch
emictry,Theoretical and Applied)、第３版、チャーチ
ル・リビングストーン(Churchill Livingstone)発行、
エディンバラ−ロンドン−ニューヨーク １９６８年参
照〕。一般に、無色又はわずかに着色したエステルを検
出に使用するが、これらは酵素によって無色の酸と同様
に無色のアルコール（フェノール）成分に分解される。
次に、フェノール成分をその後の反応で、例えばジアゾ
ニウム塩とカップリングさせるか、又は酸化によって無
色の生成物に変える。例えば、エフ・シュマルツ(F.Sch
malzl)及びエイチ・ブラウンシュタイナー(H.Braunstei
ner)は、クリン・ヴシュル(Klin.Wschr.)第４６巻、６
４２頁（１９６８年）に、基質としてナフトール−ＡＳ
−Ｄ−クロロアセテート及び遊離されるナフトールと共
に着色アゾ化合物を形成するジアゾニウム塩を用いる特
殊な細胞化学的白血球エステラーゼ検出法を記載してい
る。
しかし、この種の２成分系は、極めて感度が低い（白血
球５０００／μを含む試料でも、まだ、反応しない）
ので、体液、例えば尿中での白血球の迅速かつ簡単な検
出には不適当であることが判った。
英国特許第A-1,128,371号及びヨーロッパ特許第A-12,95
7号は、体液中の加水分解酵素を検出するため色原体基
質としてインドキシル及びチオインドキシルエステルを
使用することを記載している。基質が酵素分解される
と、遊離インドキシルが形成され、これをその後、酸化
して、容易に検出しうる青色色素インジゴにする。ヨー
ロッパ特許第A-12,957号に基づく市販の試験手段は、Ｎ
−トシル−Ｌ−アラニンＬ−インドキシルエステルを含
浸した紙ストリップから成る。試験ストリップを白血
球を含む尿試料中に浸漬すると、ストリップは青色に変
わる。しかしながら、最終的呈色を達成し、試験を評価
できるようになるまでの長い待ち時間が、この製品の顕
著な欠点である。
ヨーロッパ特許第A-14,929号は、酵素分解反応のため種
々の促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾール誘導体、ア
ルコール類、金属錯体）について記載している。しかし
ながら、インドキシルが完全に酸化されるまでに比較的
長い時間を要し、試験感度が低いこと（検出限界：数千
白血球／μ）が、なお欠点である。同じことは、ヨー
ロッパ特許第A-34,323号により白血球酵素の基質として
ロイコ−インドアニリンのエステルを使用する場合にも
当てはまる。
ヨーロッパ特許第A-39,880号明細書はヨーロッパ特許第
A-12,957号及び同第14,929号による基質と、前記のジア
ゾニウム塩とカップリングさせる検出原理との組み合わ
せを提供している。この方法で白血球の検出限界を著し
く低減することができるが、実際に使用するのに望まれ
る１５〜２０白血球／μの検出感度はまだ達成されな
い。
従って、本発明の目的は、高い検出感度と白血球酵素に
よる迅速を分解及びジアゾニウム塩との迅速かつ強い呈
色反応とを合わせもつ、エステル分解酵素の新規色原体
基質を見いだすことであった。この目的は、本発明によ
るエステルによって達成される。
本発明は、一般式（Ｉ）： 〔式中Ｘ１及びＸ２はＮ又はＣＨを表すが、それぞれの
場合に、Ｘ１又はＸ２のいずれかはＮを表し、Ｒ１、Ｒ
２及びＲ３は同一又は異なり、水素、炭素原子数１〜６
のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基、炭素
原子数１〜６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメチ
ル基、ニトロ基、ＳＯ３Ｈ、シアノ基、炭素原子数１〜
８のアシルアミノ基、炭素原子数１〜６のジアルキルア
ミノ基又は炭素原子数６〜１０のアリール基を表し、こ
れらは更に、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子
数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ基、ニトロ
基、トリフルオロメチル基、ＳＯ３Ｈ、炭素原子数１〜
６のアシル基又は炭素原子数１〜６のジアルキルアミノ
基で置換されていてよいか、又はＲ２及びＲ３が一緒に
縮合芳香環、好ましくはベンゼン環を形成し、この環は
１個又は２個の基Ｒ１で置換されていてよく、Ａはアミ
ノ酸基又はペプチド基を表し、Ｇは水素又は好ましくは
ペプチド化学に常用の窒素保護基を表すか又はこのよう
な基から誘導される〕の化合物に関する。
［式中Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記のものを
表す］のフェノールを、一般式（III）： Ｇ−Ａ−ＯＨ （III） 〔式中Ｇ及びＡは前記のものを表す］のアミノ酸若しく
はペプチド又はその適当な反応性誘導体とペプチド化学
に常用の方法で反応させることを特徴とする本発明のエ
ステルの製造法に関する。
適当な反応性誘導体は、例えば酸クロリド及びペプチド
合成に常用の混成無水物、例えばクロロギ酸エチルとの
無水物、又は活性エステル、例えばペンタクロロフェニ
ルエステル又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエス
テルである。
本発明は、更に（ａ）色原体酵素基質、（ｂ）ジアゾニ
ウム塩、必要に応じて（ｃ）緩衝剤及び必要に応じて
（ｄ）担体及び／又は常用の添加剤を含むエステル分解
及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬において、色原体酵
素基質が一般式（Ｉ）の化合物であることを特徴とする
エステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬に関す
る。
最後に、本発明はまた、試料を本発明による試薬と接触
させ、起こった呈色反応を測定することを特徴とする液
体試料、殊に体液中のエステル分解酵素及び／又は蛋白
分解酵素の検出方法に関する。
本発明において好ましい一般式（Ｉ）の化合物は、Ｘ１
がＣＨを表し、Ｘ２が窒素を表す化合物である。更に好
ましい化合物は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が同一又は異な
り、水素、炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子数
１〜４のアルコキシ基、アシルアミノ基（酸基は炭素原
子数１〜６の脂肪族又は芳香族の基であってよい）、炭
素原子数１〜４のジアルキルアミノ基、ニトロ基、シア
ノ基、ハロゲン又はアリール基（場合により炭素原子数
１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ基
又はハロゲンで置換されている）を表す化合物である。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なり、水素、炭素原子
数１〜４のアルキル基、フェニル基又はハロゲンを表す
のが特に好ましい。
本発明による化合物において、エステル基は（イソ）キ
ノリン環系の３位、４位又は８位に存在するのが好まし
い。
最後に、Ｇ−Ａ−は、一般式（IV）： 〔式中Ｒ４は水素、又は場合により分岐したアルキル
基、シクロアルキル基、アルアルキル基を表し、これら
の基は１〜１５個、好ましくは１〜９個の炭素原子を有
し、場合により１個のヒドロキシル基、メルカプト基、
カルボキシル基、アミノ基又はグアニド基で置換されて
おり、Ｒ５は水素又は好ましくは−ＣＯ−アルキル基、
−ＣＯ−アルアルキル基、−ＣＯ−アリール基、−ＳＯ
２−アルキル基又は−ＳＯ２−アリール基を表し、アル
キル基は１〜９個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭
素原子を有する直鎖又は分枝鎖の基であり、アリール基
は、６〜１２個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子
を含み、場合により炭素原子数１〜４のアルキル基、炭
素原子数１〜４のアルコキシ基又はハロゲンで置換され
ている〕の基を表するのが好ましい。
Ｇ−Ａ−は、特に好ましくは、天然に存在するアミノ酸
又はこのような酸２〜８個のペプチドの、常用の窒素保
護基を有する基を表す。
アミノ酸基は、そのＬ−又はＤ−形又はそのラセミ形で
存在しうる。特に好ましい基は、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及
びチロシンの基であり、それぞれの場合にＬ−形が特に
好ましい。存在する遊離ヒドロキシル基をアシル化、好
ましくはアセチル化することができる。
Ａの定義におけるペプチド基は、例えばジ−、トリ−、
テトラ−及びペンタ−ペプチド、好ましくはジ−及びト
リペプチドを表し、好ましい可能なアミノ酸成分は前記
のアミノ酸である。
Ｇの定義における窒素保護基としては、例えばペプチド
化学に常用のものであり、自体公知のアルキル−及びア
ルアルキル−オキシカルボニル基、アルキル−及びアル
アルキル−オキシチオカルボニル基、スルホニル基、ス
ルフェニル基、ビニルオキシカルボニル基、シクロヘキ
セニルオキシカルボニル基、ホスホリル基又はカルバモ
イル基が挙げられる。
一般式（II）のフェノール類は、自体公知であるか、又
は公知方法で製造される。
一般式（II）のフェノール類の製造方法は、例えば下記
の参照文献に記載されている：ケイ・シェンカー（K.Sc
henker）著、ヘルブ（Helv.）第５１巻４１３頁（１９
６８年）、エイ・ウイリッヒ（A.Ulrichu）著、ベル（B
er.）第３７巻１６８５頁（１９０４年）及びザ・ケミ
ストリイ・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンズ
（The Chemistry of Heterocyclic Compounds）第３２
巻キノリン第Ｉ部及びII部、ガーノス・ジョーンズ（Gu
rnos Jones）編。
本発明による化合物は、一般式（II）のフェノール類及
び一般式（III）のアミノ酸若しくはペプチド又はそれ
らの反応性誘導体（特に酸ハライド又は活性エステル）
から、ペプチド化学から自体公知の合成方法によって製
造することができる。この種の方法は、例えば、下記の
刊行物（及び本明細書に引用する文献）、即ち、ジャノ
ッフ（Janoff）ら著、プロク・ソク・エクスペル・ビオ
ル・メド（Proc.Soc.Fxper.Biol.Med.）第１３６巻、１
０４５〜１０４９頁（１９７１年）；スイートマン（Sw
eerman）ら著、ジェイ・ヒスト・ソク（J.Hist.Soc.）
第２２巻３２７〜３３９頁；ヤクプケ（Jakubke）ら
著、ベル（Ber.）１００、２３６８〜２３７２頁（1967
年）及び特に、フーベン−ワイル（Houben-Weyl）著、
メソッド・オブ・オーガニック・ケミストリー（Method
en der organischen Chemie）、第ＸＶ／１巻及びＸＶ
／２巻に記載されている。
本発明による、エステル化分解及び／又は蛋白分解酵素
の検出用試薬は、本発明による色原体基質の他に、一般
式（Ｖ）： 〔式中Ｒ′１は低級アルキル基、低級アルコキシ基、低
級アルキルメルカプト基、ヒドロキシル基、ニトロ基、
シアノ基、トリフルオロメチル基、炭酸原子数１〜８の
アルキルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド
基、炭素原子数１〜８のアルキルスルホン基、アリール
スルホン基、スルホン酸又はカルボン酸、Ｎ−モルホリ
ノ基、Ｎ−チオモルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、場合
によりＮ′−アルキル化Ｎ−ピペラジノ基又はＮ−ピペ
リジノ基、ハロゲン又は水素を表し、Ｒ′３は低級アル
キル基、低級アルコキシ基、アリールオキシ基、低級ア
ルキルメルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキルア
ミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、炭素原
子数１〜８のアルキルスルホンアミド基、アリールスル
ホンアミド基、炭素原子数１〜８のアルキルスルホン
基、アリールスルホン基、スルホン酸又はカルボン酸、
Ｎ−モリホリノ基、Ｎ−チオモルホリノ基又はＮ−ピロ
リジノ基、場合によりＮ′−アルキル化Ｎ−ピペラジノ
基又はＮ−ピペリジノ基又はフエニルアミノ基、場合に
より低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基で置換さ
れたフェニル基、ハロゲン又は水素を表し、Ｒ′２、
Ｒ′４及びＲ′５は、同一又は異なり、それぞれ低級ア
ルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、炭素原子数１
〜８のアルキルスルホンアミド基、アリールスルホンア
ミド基、炭素原子数１〜８のアルキルスルホン基、アリ
ールスルホン基、スルホン酸基又はカルボン酸基又は低
級アルキルメルカプト基、ハロゲン又は水素を表し、Ｘ
は安定化陰イオンを表し、それぞれの場合に２個の隣設
する基Ｒ′１〜Ｒ′５が閉環して、場合により炭素原子
数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ
基又はニトロ基、ハロゲン、スルホン酸基又はカルボン
酸基で置換されたベンゼン環を形成することができ、ナ
フタリン系のジアゾニウム塩を形成する〕のジアゾニウ
ム塩を含む。
一般式（Ｖ）において、好ましくは、Ｒ′１は炭素原子
数１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ
基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ハロゲン又は水素を表
し、Ｒ′３は炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子
数１〜４のアルコキシ基、アリールオキシ基、炭素原子
数１〜４のアルキルアミノ基、炭素原子数１〜４のジア
ルキルアミノ基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のアルキ
ルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基、炭素
原子数１〜４のアルキルスルホン基、アリールスルホン
基、Ｎ−モリホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、フェニルア
ミノ基又はスルホン酸基又は水素を表し、Ｒ′２、Ｒ′
４及びＲ′５は同一又は異なり、炭素原子数１〜４のア
ルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ基、炭素原子
数１〜４のアルキルアミノ基、炭素原子数１〜４のジア
ルキルアミノ基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のアルキ
ルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基又はス
ルホン酸基、ハロゲン又は水素を表す。
それぞれの場合に、２個の隣設する基Ｒ′１〜Ｒ′５は
場合によって閉環して、ベンゼン環を形成することがで
き、これは場合によりハロゲン又は炭素原子数１〜４の
アルキル基又は炭素原子数１〜４のアルコキシ基又はニ
トロ基又はスルホン酸基で置換されていてもよい。
一般式（Ｖ）において、アリール基はそれぞれ６〜１２
個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子を含む芳香族
基を表し、場合によりハロゲン又は炭素原子数１〜４の
アルキル基又は炭素原子数１〜４のアルコキシ基で置換
されている。
一般式（Ｖ）のジアゾニウム塩は、同様に自体公知であ
るか又は公知の方法によって合成することができる〔フ
ーベン−ワイル（Houben-Weyl）著、メソッド・オブ・
オーガニック・ケミストリー（Method of Organic Chem
istry）、第Ｘ／３巻参照〕。
本発明による試薬は、検出すべき酵素による色原体基質
（Ｉ）の分解を促進する物質を含むのが好ましい。可能
な、このような促進剤は、例えばヨーロッパ特許第A-1
4,929号に記載されている化合物であり、炭素原子数８
〜２５、好ましくは炭素原子数１０〜２０の脂肪族アル
コール（場合により不飽和であってもよい）が好まし
い。このような好ましい促進剤は、例えばｎ−デカノー
ル、ｎ−ドデカノール及び特にｎ−ウンデカノールであ
る。特に好ましい促進剤は、塩基性アミノ酸を含むホモ
ポリアミノ酸又はコポリアミノ酸〔イー・カチァルスキ
イ（E.Katchalski）著、アドバンシィズ・オブ・プロテ
イン・ケミストリィ（Advances of Protein Chemistr
y）第１３巻、２４３〜４９３頁（１９５８）；及びシ
ー・ビー・アンフィンゼン（C.B.Anfinsen）、エム・エ
ル・アンソン（M.L.Anson）、ジェイ・ティ・エドサル
（J.T.Edsall）及びケイ・バイリイ（K.Bailey）（編集
者）；アカデミック・プレス・インコーポレイテッド
（Academic press.Inc.）、ニューヨーク州ニューヨー
ク市発行〕及び逐次ポリアミノ酸である。可能な塩基性
アミノ酸は、側鎖にアミノ基又はグアニド基を有するア
ミノ酸である。これらは特に、リジン及びオルニチン、
並びにアルギニン、及び更に天然に存在しない塩基性ア
ミノ酸、例えばジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸又
はジアミノピメリン酸である。構成アミノ酸は、ポリア
ミノ酸中にラセミ形又は光学活性Ｄ−又はＬ−形で存在
することができる。ポリアミノ酸の分子量（数平均）は
1,000〜2,000,000であり、好ましくは5,000〜500,000で
ある。塩基性アミノ酸の含有率は、５〜１００モル％、
好ましくは２０〜１００モル％である。
促進剤は、下記の試験具を製造する際の含浸液の0.5〜
１０重量％、好ましくは１〜５重量％の量で使用するの
が好ましい。
蛋白分解酵素及び特に白血球酵素の検出用の本発明の試
薬は、適当な緩衝剤系を含むのが好ましい。この目的で
可能な系は、例えば燐酸塩、硼酸塩、炭酸塩／重炭酸
塩、炭酸塩、バルビツール酸塩、トリス−（ヒドロキシ
メチル）−アミノメタン（＝トリス）、２−アミノ−２
−メチル−プロパン−１，３−ジオール（＝アメジオー
ル）又はアミノ酸緩衝剤であり、pH値及び容量は減速と
して測定溶液又は試験ストリップにおいてpH値が６〜１
０、好ましくは７〜９になるように選択する。
本発明による試薬は、自体公知の洗浄剤を含んでいてよ
い。なぜならば、これにより一掃均質な色素分布及び一
層強い呈色が達成されるからである。可能な洗浄剤は陽
イオン性及び陰イオン性洗浄剤、並びに両性及び非イオ
ン性洗浄剤である。これらの洗浄剤としては、例えば、
ベンジル−ジメチル−テトラデシルアンモニウムクロリ
ド、ドデシル硫酸ナトリウム、ゼフィロール、ポリビニ
ルピロリドン、活性剤として前記のポリアミノ酸、ヘパ
リノイド及びこれらの化合物の混合物が挙げられる。
本発明の試薬において、前記の試薬を自体公知の不活性
担体に組み込むのが好ましく、特に好ましい担体マトリ
ックスは多孔性物質、例えば特に紙、及びプラスチッ
ク製膜、ガラス繊維マット米国特許第3,846,247号明細
書）、多孔性セラミックストリップ、合成不織布、スポ
ンジ状物質（米国特許第3,552,928号明細書）、フェル
ト、繊維、木材、セルロース又はシリカゲルである。
この目的で、前記の担体を、容易に除去しうる適当な溶
剤、例えば水、メタノール、エタノール、アセトン、ジ
メチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド中の前記
試薬の溶液で含浸する。これには２つの別行程で行うの
が好ましい。即ち、まず、材料を緩衝剤及び他の水溶性
添加剤を含む水溶液で含浸する。次いで、これを一般式
（Ｖ）の色原体酵素基質及び活性剤の溶液で含浸する。
しかしながら、含浸を別の順序で又は組成の異なる２種
の含浸溶液を用いて実施することもできる。含浸溶液又
は試験すべき液体が本発明による化合物及びジアゾニウ
ム塩を１０-4〜１０-1モル／、特に１０-3〜１０-1モ
ル／の濃度で含むのが好ましい。
紙をマトリックスとして使用する場合には、慣性試験
紙をそのまま使用するか、又は自体公知の方法で把手に
接着させるか、又は好ましくは例えば西ドイツ特許出願
公開第2118455号公報によりプラスチックと微細なメッ
シュ網との間に封入することができる。
フィルムを被覆した試験ストリップを製造するため、好
ましくはすべての試薬をフィルム形成物質、例えばポリ
ビニルエステル又はポリアミドの溶液又は分散液中に入
れ、均質に混合する。この混合物をプラスチック製担体
上に薄い層を形成するようにブラシで塗布し、乾燥す
る。乾燥後、こうして製造したフィルムを被覆した試験
ストリップを切断し、そのまま使用するか、又は自体公
知の方法で把手に接着させるか、又は例えば西ドイツ特
許出願公開第2118455号公報によりプラスチックと微細
なメッシュ網との間に封入することができる。
エステル分解及び／又は蛋白分解酵素、特に白血球酵素
を検出するための本発明の診断剤は、試験試薬の前記成
分に常用の薬品添加剤を添加し、混合物を造粒すること
によって粉末混合物又は試薬錠剤の形で製造することが
できる。この種の添加剤は、例えば炭水化物（例えば単
糖類、オリゴ糖若しくは多糖類）、又は糖アルコール
（例えばマンニット、ソルビット若しくはキシリッ
ト）、又は他の可溶性不活性化合物、例えばポリエチレ
ングリコール若しくはポリビニルピロリドンである。粉
末混合物又は試薬錠剤は、例えば、約５０〜２００mg、
好ましくは５０〜８０mgの最終重量を有する。
それぞれの場合に、約５〜２０mg、好ましくは約１０mg
の合計重量を有する凍結乾燥物を製造するには、試験に
必要なすべての試薬の他に、常用の構造形成剤、例えば
ポリビニルピロリドン及び必要に応じて他の充填剤、例
えばマンニット、ソルビット若しくはキシリットを含む
溶液を凍結乾燥する。
溶液の形の本発明による診断剤は、試験に必要なすべて
の試薬を含むのが好ましい。可能な溶剤は、水及び水と
水溶性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセ
トン若しくはジメチルホルムアミドとの混合物である。
貯蔵上の理由では、試験に必要な試薬を２以上の溶液に
分割し、これを実際の試験の間に一緒にするのが有利で
ある。
こうして製造した診断剤は、試験すべき体液中に浸漬す
るか又は試験すべき体液に添加した後、エステル分解及
び／又は蛋白分解酵素、特に白血球酵素の存在を、発色
により迅速かつ簡単に検出することができ、その発色は
肉眼又は分光光度計で、例えば反射測光法で、すなわち
キュベット中で測定することができる。一細胞毎の白血
球酵素の活性はほぼ一定のパラメータと見なされるの
で、試験する体液の白血球濃度を発色の強度から測定す
ることができる。これにより、本発明による診断剤を用
いて完全な白血球及び溶解した白血球を記録した。それ
というのは白血球酵素の活性は、白血球の溶解後でも完
全に保有されるからである。従って、溶解現象による誤
差は生じない。
下記の実施例は本発明を説明するためのものである。特
に断らない限り、量は重量部又は重量％を表すものとす
る。
実施例１ Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルエステルの製造 このエステルは、それぞれの場合に、例えばＮ−トシル
−Ｌ−アラニルクロリドを無水メチルエチルケトン又は
無水トルエン中で粉末炭酸カリウムの存在下でフェノー
ル類と反応させることによって製造した。約５５℃で６
〜１２時間攪拌した後、４０〜７０％のフェノールが反
応していた。フェノール：Ｋ２ＣＯ３：酸クロリドのモ
ル比は、通常１：1.5：1.5であった。pH値は、全反応期
間を通じて約７であった。後処理のため、炭酸カリウム
を５０℃で去し、次に溶剤を真空中で蒸発させた。生
成物をシリカゲル−溶離剤（例えば石油エーテル：アセ
トン＝約９：１）を用いてカラムクロマトグラフィー
し、その後、再結晶させることによって精製した。
ｐ−トシル−Ｌ−アラニン 文献：イー・フィッシャー（E.Fischer）及びダブリュ
ー・リップシッツ（W.Lipschitz）著、ビー（Ｂ．）第
４８巻、３６２頁（１９１５年） Ｌ−アラニン８3.７
ｇ（0.９３モル）を約２Ｎの水酸化ナトリウム溶液４６
５mlに解かす。この溶液にｐ−トルエンスルホニルクロ
リド１８６ｇ（0.９７６モル）を７０〜７２℃で２０分
かけて少量ずつ添加する。スルホニルクロリドの添加の
間、自動滴定装置を用いて約２Ｎの水酸化ナトリウム溶
液で反応混合物をpH１０に保持する。ここにおいて、２
Ｎ水酸化ナトリウム溶液５６０mlが消費される。反応混
合物のpHがもはや変化しなくなったら、混合物を１５〜
５℃に冷却し、３７％強度の塩酸でpH３にする。分離し
た生成物を吸引過し、湿ったフィルターケーキを水２
３５０mlから再結晶させる。
収量：融点１３２〜１３５℃のＬ−ｐ−トシルアラニン
１８5.５ｇ（理論量の８２％）。
ｐ−トシル−Ｌ−アラニルクロリド ｐ−トシル−Ｌ−アラニン１５8.１ｇ（0.６５モル）を
４０℃の塩化チオニル３５０ml中で、澄明な溶液が形成
するまで、攪拌する。過剰の塩化チオニルを水流ポンプ
の真空下に溜去する。フラスコ内の残渣を蒸溜したトル
エン３００mlに取る。得られる澄明で、わずかに黄色の
溶液を、攪拌したリグロイン９００ml中に注ぐ、酸クロ
リドが沈澱する。翌日、吸引過し、軽質ガソリンで洗
浄し、真空デシケータ中で塩化カルシウム／水酸化カリ
ウム上で乾燥する。
収量：融点８１〜８３℃のほとんど無色の結晶１５５ｇ
（理論量の９１％）。
４−〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−アラ
ニルオキシ〕−３−メチル−イソキノリン ４−ヒドロキシ−３−メチル−イソキノリン1.６ｇを４
０℃で無水ピリジン2.４ｇと共に塩化メチレン１００ml
中に溶かす。無水塩化メチレン１００mlに溶かした、合
計６ｇのＮ−トシル−Ｌ−アラニルクロリドを４０℃で
６時間かけて、滴加する。混合物をその後、更に２時間
４０℃で攪拌する。冷却後、塩化メチレン溶液を２％強
度のクエン酸溶液を毎回１００ml用いて３回洗浄する。
塩化メチレン相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、乾燥剤を
去した後、蒸発させる。残渣をシリカゲル上でカラム
クロマトグラフィーによって精製する。溶離剤：石油エ
ーテル：アセトン８：２。溶剤を蒸発させた後、所望の
フラクションである、0.８ｇの４−〔Ｎ−（トルエン−
４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−３−メチ
ル−イソキノリンが得られる。
同様の方法で、一般式（II）の対応するヒドロキシイソ
キノリン及びヒドロキシキノリンを特定のＮ−保護アミ
ノ酸又は反応性アミノ酸誘導体と反応させることによっ
て下記の基質が得られる：４−〔Ｎ−（トルエン−４″
−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−３−フエニル
−イソキノリン、５−〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホ
ニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−イソキノリン、４−
〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−アラニル
オキシ〕−イソキノリン、４−〔Ｎ−（ｔ−ブチルオキ
シカルボニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−３−メチル−
イソキノリン、４−〔Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−
Ｌ−アラニルオキシ〕−３−フェニル−イソキノリン、
４−〔Ｎ−メチルスルホニル−Ｌ−リジルオキシ〕−３
−メチル−イソキノリン、４−〔Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｏ−アセチル−Ｌ−チロシル〕−３−メチル
−イソキノリン、８−〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホ
ニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−イソキノリン、４−
〔Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｌ−フェニルアラニルオキ
シ〕−３−メチル−キノリン、４−〔Ｎ−（トルエン−
４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−７−クロ
ロ、キノリン、７−〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホニ
ル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−キノリン、８−〔Ｎ−
（トルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキ
シ〕−６−メチル−キノリン、８−〔Ｎ−（トルエン−
４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−キノリ
ン、８−〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−
アラニルオキシ〕−４−メチル−キノリン、８−〔Ｎ−
（ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニルオキシ〕−
６−エトキシ−キノリン、６−〔Ｎ−（トルエン−４″
−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−８−ジエチル
アミノ−キノリン、８−〔Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカル
ボニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−２−メチル−４−ア
セチルアミノ−キノリン、７−〔Ｎ−（トルエン−４″
−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−４−メチル−
キノリン、８−〔Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニルオキシ−５−ベンゾイルアミノ−キノリン、３
−〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−アラニ
ルオキシ〕−キノリン及び３−〔Ｎ−（トルエン−４″
−スルホニル）−Ｌ−フェニルアラニルオキシ〕−キノ
リン。
実施例２ 紙〔例えばイートン・アンド・ダイクマン（Eaton an
d Dikeman）２０５〕を下記の溶液で順次含浸し、次い
で６０℃で乾燥した。
溶液１ 0.１モルのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン緩衝液（pH8.４）、３％のポリビニルピロリドン及び
2.５％のポリ−Ｌ−アルギニン．溶剤：水 溶液２ 7.５×１０-3モル／の４−〔Ｎ−（トルエン−４″−
スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−３−メチル−イ
ソキノリン及び１×１０-2モル／の２−ヒドロキシ３
−ニトロ−５−スルホ−ベンゼンジアゾニウムテトラフ
ルオボレート．溶剤：無水アセトン 淡黄色試験紙が得られ、この試験紙は白血球を含む尿中
に浸漬したときに青色に変色する。
実施例３ ４−〔Ｎ−（トルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−アラ
ニルオキシ〕−３−フェニル−イソキノリン５mg、２−
ヒドロキシ−３−ニトロ−５−スルホ−ベンゼンジアゾ
ニウムテトラフルオボレート５mg、燐酸二水素カリウム
４mg、燐酸水素二ナトリウム２水和物８０mg、ポリ−Ｌ
−リジン６mg及びマンニット１１０mgを含む錠剤を、白
血球を含む尿５mlと混合する。尿試料は、青色に変色す
る。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式： ［式中Ｘ１及びＸ２はＮ又はＣＨを表すが、それぞれの
    場合に、Ｘ１又はＸ２のいずれかはＮを表し、Ｒ１、Ｒ
    ２及びＲ３は同一又は異なり、水素、炭素原子数１〜６
    のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基、炭素
    原子数１〜６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメチ
    ル基、ニトロ基、ＳＯ３Ｈ、シアノ基、炭素原子数１〜
    ８のアシルアミノ基、炭素原子数１〜６のジアルキルア
    ミノ基又は炭素原子数６〜１０のアリール基を表し、こ
    れらの基は更に、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素
    原子数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ基、ニ
    トロ基、トリフルオロメチル基、ＳＯ３Ｈ、炭素原子数
    １〜６のアシル基又は炭素原子数１〜６のジアルキルア
    ミノ基で置換されていてよく、又はＲ２及びＲ３が一緒
    になって縮合する芳香環を形成し、この環は１個又は２
    個の基Ｒ１で置換されていてよく、Ａはアミノ酸基又は
    ペプチド基を表し、Ｇは水素又はペプチド化学で常用の
    窒素保護基を表すか又はこのような基から誘導される
    基］の化合物。
  2. 【請求項２】Ｘ１がＣＨを表し、Ｘ２が窒素を表す特許
    請求の範囲第１項記載の化合物。
  3. 【請求項３】Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が同一又は異なり、水
    素、炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４
    のアルコキシ基、アシルアミノ基（酸基は炭素原子数１
    〜６の脂肪族又は芳香族基であってよい）、炭素原子数
    １〜４のジアルキルアミノ基、ニトロ基、シアノ基、ハ
    ロゲン又は場合により炭素原子数１〜４のアルキル基、
    炭素原子数１〜４のアルコキシ基若しくはハロゲンで置
    換されたアリール基を表す特許請求の範囲第１項又は第
    ２項に記載の化合物。
  4. 【請求項４】Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が同一又は異なり、水
    素、炭素原子数１〜４のアルキル基、フェニル基又はハ
    ロゲンを表す特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
    １項に記載の化合物。
  5. 【請求項５】Ｒ２及びＲ３が水素を表すか又は一緒にな
    って縮合するベンゼン環を形成する特許請求の範囲第１
    項〜第４項のいずれか１項に記載の化合物。
  6. 【請求項６】エステル基が３位、４位又は８位に存在す
    る特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載
    の化合物。
  7. 【請求項７】Ａが天然に存在するアミノ酸又は２〜８個
    の天然に存在するアミノ酸のペプチド基を表す特許請求
    の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の化合物。
  8. 【請求項８】一般式： ［式中Ｘ１及びＸ２はＮ又はＣＨを表すが、それぞれの
    場合に、Ｘ１又はＸ２のいずれかはＮを表し、Ｒ１、Ｒ
    ２及びＲ３は同一又は異なり、水素、炭素原子数１〜６
    のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基、炭素
    原子数１〜６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメチ
    ル基、ニトロ基、ＳＯ３Ｈ、シアノ基、炭素原子数１〜
    ８のアシルアミノ基、炭素原子数１〜６のジアルキルア
    ミノ基又は炭素原子数６〜１０のアリール基を表し、こ
    れらは更に、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子
    数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ基、ニトロ
    基、トリフルオロメチル基、ＳＯ３Ｈ、炭素原子数１〜
    ６のアシル基又は炭素原子数１〜６のジアルキルアミノ
    基で置換されていてよく、又はＲ２及びＲ３が一緒にな
    って縮合する芳香環を形成し、この環は１個又は２個の
    基Ｒ１で置換されていてよく、Ａはアミノ酸基又はペプ
    チド基を表し、Ｇは水素又はペプチド化学で常用の窒素
    保護基を表すか又はこのような基から誘導される基］の
    化合物を製造するため、一般式： ［式中Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記のものを
    表す］のフェノールを、一般式： Ｇ−Ａ−ＯＨ ［式中Ｇ及びＡは前記のものを表す］のアミノ酸若しく
    はペプチド又はその適当な反応性誘導体とペプチド化学
    で常用の方法で反応させることを特徴とするアミノ酸エ
    ステル及びペプチドエステルの製造方法。
  9. 【請求項９】（ａ）一般式： ［式中Ｘ１及びＸ２はＮ又はＣＨを表すが、それぞれの
    場合に、Ｘ１又はＸ２のいずれかはＮを表し、Ｒ１、Ｒ
    ２及びＲ３は同一又は異なり、水素、炭素原子数１〜６
    のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基、炭素
    原子数１〜６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメチ
    ル基、ニトロ基、ＳＯ３Ｈ、シアノ基、炭素原子数１〜
    ８のアシルアミノ基、炭素原子数１〜６のジアルキルア
    ミノ基又は炭素原子数６〜１０のアリール基を表し、こ
    れらの基は更に、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素
    原子数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ基、ニ
    トロ基、トリフルオロメチル基、ＳＯ３Ｈ、炭素原子数
    １〜６のアシル基又は炭素原子数１〜６のジアルキルア
    ミノ基で置換されていてよく、又はＲ２及びＲ３が一緒
    になって縮合する芳香環を形成し、この環は１個又は２
    個の基Ｒ１で置換されていてよく、Ａはアミノ酸基又は
    ペプチド基を表し、Ｇは水素又はペプチド化学で常用の
    窒素保護基を表すか又はこのような基から誘導される
    基］の化合物からなる色原体酵素基質、（ｂ）ジアゾニ
    ウム塩、必要に応じて（ｃ）緩衝剤、及び必要に応じて
    （ｄ）担体及び／又は常用の添加剤を含む、エステル分
    解酵素及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬。
JP60070162A 1984-04-06 1985-04-04 色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステル及びその製造法並びにこれらの化合物を用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬及び分析方法 Expired - Lifetime JPH0610200B2 (ja)

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