JPH04103568A

JPH04103568A - チオフェノールエステル及びこれを用いた加水分解酵素の測定器具

Info

Publication number: JPH04103568A
Application number: JP2218986A
Authority: JP
Inventors: Tetsuaki Kawanishi; 徹朗川西; Hiroyuki Asai; 裕之浅井; Hiroshi Suzuki; 宏鈴木
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-08-22
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1992-04-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、チオフェノールエステル並びにこれを用いた
溶液中のエステラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素
を検出するための測定片及び測定器具に関する。

〔従来の技術〕

尿中に出現する白血球の量は、腎・尿路感染症の診断の
指針となる。さらに腹膜透析液中の白血球のモニタリン
グは、腹膜炎の早期発見の指標となる。これらの白血球
の検出は従来鏡検によって行われていたか、この方法は
高価な機器を必要とする、長い測定時間を必要とする、
複雑な測定操作を必要とする等の欠点を有している。こ
のような問題点を解決するため、白血球中のエステラー
ゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を指標とした診断法
か拡大してきた。この方法では、容品な操作でしかも短
時間で結果が得られる。また、酵素活性を指標とするた
め崩壊した白血球も検出可能である。すでに（Ａ）酵素
基質としてフェノキシアミノ酸エステルを、顕色剤とし
てジアゾニウム塩を含有する、蛋白質分解酵素の検出法
（特公昭６ｌ−４５９８２）　（Ｂ）インドキシル−ア
ミノ酸エステル及びペプチドエステルを色原体として含
有する、エステル及び蛋白質分解酵素の検出法（特公昭
５９−３４７５）　　（Ｃ）　５−フェニルピロールエ
ステルを用いた加水分解対象物の検出法（特公昭６２４
１７１０）が知られている。しかしながらこれらの方法
においても、使用する試薬が高価である、呈色安定性に
欠ける、感度が悪い等の問題点を有している。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明の目的は、新規な加水分解酵素の測定方
法を提供することにある。すなわち、被検出物である加
水分解酵素を、特別なあるいは高価な装置を必要とせず
、容易な操作で迅速かつ高感度で測定するための、酵素
基質並びにこれを用いた測定片及び測定器具を提供する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、一般式Ｉ芳香環を形成していてもよい。）で表されるチオフェノ
ールエステルを基質として使用することによって達成さ
れる。また、該チオフェノールエステル、及びチオール
基検出指示薬を吸着性担体に保持してなることを特徴と
する溶液中の加水分解酵素の測定片によって達成される
。さらに、チオール基検出指示薬が一般弐ＩＩで表され
る該測定片により達成される。

〔ただし、式中人はアミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜
５からなるペプチド基、Ｂはアミノ基の保護基、Ｒ１−
Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキ
シ基、水酸基、アリール基、アシル基、ニトロ基、チオ
アルキル基及びアルキルアミノ基よりなる群より選ばれ
た少なくとも１種であり、それぞれ隣接する２個の置換
分は縮合Ｈ〔ただし、式中Ｘは、同−又は異なって、アルキルアミ
ノ基、アルケニルアミノ基、アリールアミノ基、スルホ
ン酸基及びヒドロキシ基の中から選ばれる基を示す。式
中Ｒは、水素又は置換されていてもよい芳香族置換基を
示す。〕また、吸着性担体が濾紙又は布帛である測定片
によって達成される。また被検出物質である加水分解酵
素の反応に適するｐＨを有する緩衝剤を配合してなる該
測定片によって達成される。さらに、界面活性剤又は湿
潤剤を更に配合してなる該測定片によって達成される。

また、チオール基検出指示薬と極大吸収波長が異なり、
かつ加水分解酵素の検出に必要な反応によって、その色
調が変化することが無い色素を配合してなる該測定片に
より達成される。さらに、該測定片を支持体に固定して
なる溶液中の加水分解酵素の測定器具によって達成され
る。

〔作　　用〕

本発明によれば、一般式Ｉで示されるチオフェノールエ
ステルを有する基質は、エステラーゼ、プロテアーゼ等
の加水分解酵素、特にヒト好中球に存在するものに特異
性が高く、次式に示すごとくチオエステル結合が分解さ
れて一般式■で示される遊離のチオールを生じる。

この遊離のチオールの検出は、次式に示すごとく、一般
式ＩＩで示されるベンツヒトロールを用いて行うことが
できる。すなわち、ベンツヒトロール（ＩＩ）は測定系
に存在する酸によってカチオン（ＩＶ）となり、極大吸
収波長６０６ｎＩｌｌの青色を示す。

これに、加水分解酵素の作用によって生じた遊離のチオ
ール（ｍ）が反応して複合体（Ｖ）を形成する。この複
合体は無色のため、６０Ｂｎｍの吸光度の減少を測定す
ることによって、チオールを定量することが可能である
。

（ｍ）Ｈ（ＩＩ）（ＩＶ）ＳＲ’ （Ｖ）この検出試薬は可視領域での呈色変化を有するため、本
発明の測定器具は目視による読み取りで半定量ができる
。また、分光光度計による反射吸光度の測定によって正
確な加水分解酵素の定量が可能である。

なお、一般式Ｉにおいて、Ａは、アミノ酸残基又はアミ
ノ酸２〜５個よりなるペプチド基であり、該当するもの
として、Ｌ−アラニル、Ｌ〜バリル、Ｌ−ロイシニル、
Ｌ−イソロイシニル、Ｌ−フェニルアラニル等、もしく
はこれらのアミノ酸よりなるペプチド基がある。Ｂはア
ミノ基の保護基を示し、アセチル、プロピオニル、ブチ
ロイル、ベンゾイルのようなアシル基、オキシカルボニ
ル基、スルホニル基、カルバモイル基等がある。

Ｒ１−Ｒ５の定義において、アルキルは好ましくは炭素
原子数１〜４を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルキルで
あり、その例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、
１ｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、１ｓｏ−ブチル、ｔｅ
ｒｔ−ブチル等があげられる。ハロゲン原子の例として
は塩素、臭素等があげられる。アリール基の例としては
、フェニル、ナフチル等があげられ、アシル基の例とし
ては、アセチル、プロピオニル、ｎ−ブチロイル、ｔｅ
ｒｔ−ブチロイル、ベンゾイル等があげられる。Ｒ，−
Ｒ５の隣接する２個の基が結合して芳香環を形成する場
合の例としては、ベンゼン環、ナフタレン環等があげら
れる。一般式ｌて示されるチオフェノールエステル化合
物の具体例を示すと、次の通りである。

■　（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーし一アラニルチオ
）ベンゼン ■　４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニル
チオ）トルエン ■　４−（Ｎ−ｐ−１’ルエンスルホニルーし一アラニ
ルチオ）クロロベンゼン ■　４−（Ｎ−１）−トルエンスルホニル−し−アラニ
ルチオ）アニソール ■　４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニル
チオ）ニトロベンゼン ■　３，４−ジクロロ−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニル
ーし一アラニルチオ）ベンゼン ■　４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニル
チオ）メチルチオベンゼン ■　４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニル
チオ）ジメチルアミノベンゼン ■　２−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニル
チオ）ナフタレン一般式■において、Ｘは同−又は異なってアルキルアミ
ノ基、アルケニルアミノ基、アリールアミノ基、スルホ
ン酸基またはヒドロキシ基を示す。

アルキルアミノ基としては、ジメチルアミ八ジエチルア
ミノ、ジー１ｓｏ−プロピルアミノのようなジ（低級）
アルキルアミノ基が好ましい。アルケニルアミノ基とし
てはジビニルアミノ基のようなジ（低級）アルケニルア
ミノ基が好ましい。

般式ＩＩで示されるチオール基検出指示薬の具体例を示
すと次の通りである。

■　４．４′−ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒトロー
ル ■　４．４′−ビス（ジエチルアミノ）ベンツヒトロー
ル ■　３−　　（４，４′−ビス（ジメチルアミノ）ジフ
ェニルヒト側キシメチル〕　−４−ヒドロキシベンゼン
スルホン酸 ■　４．４′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル−（
２，７−シヒドロキシナフチル）メタノール■　４，４
′−ビス（ジベンジルアミノ）ジフェニル〜　（２−ヒ
ドロキシフェニル）メタノール被検出物質である加水分
解酵素の反応に適するｐＨを持つ緩衝剤としては、ホウ
酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、クエン酸緩衝
剤等があげられ、その濃度は０．０２〜０．４ｔｘＭ　
（好ましくは０．１〜０．３−Ｍ）で、ｐＨは５〜９（
好ましくはｐＨ６〜７）で使用する。

界面活性剤、湿潤剤としては、トリトン、アルキル硫酸
ナトリウム、スパン、トウィーン、ポリエチレングリコ
ール、高級アルコール類、エーテルアルコール類等があ
げられ、好ましくは炭素数８〜工２の直鎖のアルコール
、炭素数８〜１５のエーテル結合を含む直鎖のアルコー
ルが用いられる。

濃度は含浸液に対して、０．１〜４．０％（好ましくは
１．θ〜２，０％）で使用する。

さらに、試験片にチオール検出試薬と異なる波長を有す
る色素を予め添加しておくことによって、チオール検出
試薬の呈色変化が目視でとらえ易くなる。例えば、４．
４′−ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒトロールを検出
試薬に用いた場合は、呈色変化が色素無添加時には青色
から無色であるが、黄色色素を添加することによって緑
色から黄色への変化となり、目視での定量が容易となる
。添加色素としては、赤色系でベーシックレッド２９、
アシッドレッド９７、黄色系では、タートラジン、アン
ラドイエロー２９等があげられ、含浸液に対して０．０
１〜０．５％の濃度で添加するのが好ましい。

以上の成分を濾紙又は布帛等の担体に保持させるために
は、それぞれの成分を適当な溶媒に溶解せしめ、担体を
含浸後、乾燥することによって溶媒を除去して得ること
ができる。このようにして得られた試験片は適当な大き
さ（例えば５ｘ’Ｂ＋ｗ角）に切断し、ポリスチレンシ
ート等の支持体に、両面テープ等の接着剤を用いて固定
することによって、尿検体等への浸漬が容易となる。

〔実施例１〕下記製造法にて本発明のチオフェノールエステルを得た
。

■　（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニルチオ
）ベンゼンの合成チオフェノールＬＯｇ　（９，０８ｗｕａｏｌ）　、Ｎ
　−ｐ　−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニン２．４４
［（１０，Ｏｍｍｏｌ）　、１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール６７６１ｇ（５，０＋ｕ＋ｏｌ）をテトラヒド
ロフラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しながらＤ　Ｃ
Ｃ２，１７ｇ　（１０，５ｍｍｏｌ）を加える。０℃で
１時間攪拌後、室温にてさらに３時間攪拌を続ける。反
応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加え、
吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再び減
圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル３　／　
ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシュ
クロマトグラフに供し、目的物２．８１ｇ　（収率９２
．３％）を得た。

■　（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニルチオ
）トルエンの合成ｐ−チオクレゾール１．１３ｇ　（９，０９ｍｇｏｌ）
　、Ｎ　−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン２．
４４ｇ（１０，Ｏｍｍｏｌ）　、１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール６７８ｍｇ（５，０＋ｕｏｌ）をテトラヒ
ドロフラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しなからＤＣ
Ｃ２，１７ｇ　（１０，５＋ａ＋ａｏｌ）を加える。０
℃で１時間攪拌後、室温にてさらに３時間攪拌を続ける
。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加
え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再
び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル３／
ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシュ
クロマトグラフに供し、目的物３．ＯＯｇ（収率９４．
５％）を得た。

■４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルチ
オ）クロロベンゼンの合成ｐ−クロロチオフェノールＩＪ１ｇ　（９，０９ｍｍｏ
ｌ）、Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニン２，
４４ｇ　（１０，Ｏｍｍｏｌ）　、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール６７６ｍｇ（５，０ａ＋ｇ＋ｏｌ）をテ
トラヒドロフラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しなが
らＤＣＣ２，１７ｇ（ｌｏ、５寵ｍｏｌ）を加える。０
℃で１時間攪拌後、室温にてさらに３時間攪拌を続ける
。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加
え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再
び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル２／
ｎ−ヘキサン８を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシュ
クロマトグラフに供し、目的物３．０３ｇ（収率９０．
２９６）を得た。

■４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルチ
オ）アニソールの合成ｐ−メトキシチオフェノール１．２７　ｇ　（９，０９
＋ｕ＋ｏｌ）、Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーし一アラ
ニン２．４４ｇ　（１０，Ｏｍｍｏｌ）　、１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール６７８■（５，０ｇａ＋ｏｌ）
をテトラヒドロフラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌し
ながらＤ　ＣＣ２，１７゜（１０，４＋５ｓｏｌ）を加
える。０℃で１時間攪拌後、室温にてさらに３時間攪拌
を続ける。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エ
チルを加え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、
濾液を再び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エ
チル２／ｎ−ヘキサン８を溶出溶媒とするシリカゲルフ
ラッシュクロマトグラフに供し、目的物２．８３ｇ（収
率８５．２％）を得た。

■４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルチ
オ）ニトロベンゼンの合成ｐ−ニトロチオフェノール１．４１ｇ　（９，０９ｇｍ
ｏｌ）、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン２
．４４ｇ　（１０，Ｏｍａ＋ｏｌ）　、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール６７８ＩＩｇ（５，Ｏｍｍｏｌ）を
テトラヒドロフラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しな
がらＤ　ＣＣ２，１７ｇ（１０，５ｗ＊ｏりを加える。

０℃で１時間攪拌後、室温にてさらに２時間攪拌を続け
る。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを
加え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を
再び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル３
／ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシ
ュクロマトグラフに供し、目的物２．８２ｇ（収率８１
．６％）を得た。

■３．４−’）クロロ＝　（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニ
ル−Ｌ−アラニルチオ）ベンゼンの合成３．４−ジクロ
ロチオフェノール１．８３ｇ　（９，０９ｓ＋１０１）
、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン２．４４
ｇ　（１０，０ｔｓｏｌ）　、ｌ−ヒドロキシベンゾト
リアゾール６７６■（５，０＋ｎｏｌ）をテトラヒドロ
フラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しながらＤ　ＣＣ
２，Ｌｒｔｒ（１０，５ｉ■ｏｆ）を加える。０℃で１
時間攪拌後、室温にてさらに３時間攪拌を続ける。反応
混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加え、吸
引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再び減圧
濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル２／ｎ−ヘ
キサン８を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシュクロマ
トグラフに供し、目的物２．６９ｇ（収率７３，３％）
を得た。

■４−（Ｎ−ｐ−）−ルエンスルホニル−し一アラニル
チオ）メチルチオベンゼンの合成４−　（メチルチオ）
チオフェノール１．４２ｇ（９，０９ｇ＋ｓ＋ｏｌ）、
Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニン２．４４ｇ
　（１０，０ｔｓｏｌ）　、１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール６７６■（５，０■■ｏｌ）をテトラヒドロフ
ラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しながらＤ　ＣＣ２
，１７ｇ　（１０，５ｔｓｏｌ）を加える。０℃で１時
間攪拌後、室温にてさらに４時間攪拌を続ける。

反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加え
、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再び
減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル２　／
　ｎ−ヘキサン８を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシ
ュクロマトグラフに供し、目的物３．０３ｇ　（収率８
７．５％）を得た。

■４−（Ｎ、ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニルチ
オ）ジメチルアミノベンゼンの合成４−　（ジメチルア
ミノ）チオフェノール１．３９ｇ（９，０９ｍ１ｏｌ）
、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニン２．４４
ｇ　（１０，０＋＋１ｌｅｏｌ）　、１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール８７６ｍｇ（５，０＋＊ａ＋ｏｌ）を
テトラヒドロフラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しな
がらＤＣＣ２，１７ｇ　（１０，５ｇｍｏｌ）を加える
。０℃で１時間攪拌後、室温にてさらに６時間攪拌を続
ける。

反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加え
、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再び
減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル２／ｎ
−ヘキサン８を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシュク
ロマトグラフに供し、目的物２．２１ｇ　（収率６４．
１％）を得た。

■２−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルチ
オ）ナフタレンの合成２−ナフタレンチオール１．４６ｇ　（９，０９ｓｉｏ
ｌ）、Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーし一アラニン２．
４４ｇ　（１０，０＋ｎｏｌ）　、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール８７８Ｋ（５，０ｔｓｏｌ）をテトラヒ
ドロフラン２５ｍ１に溶解し、０℃で攪拌しながらＤＣ
Ｃ２，１７゜（１０，５ｇｍｏｌ）を加える。０℃で１
時間攪拌後、室温にてさらに６時間攪拌を続ける。反応
混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加え、吸
引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再び減圧
濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル２　／　ｎ
−へキサン８を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシュク
ロマトグラフに供し、目的物２．８２゜（収率７６．９
％）を得た。

〔実施例２〕下記製造法にて本発明のチオール検出試薬を得た。

■３−［４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル
ヒドロキシメチル〕　−４−ヒドロキシベンゼンスルホ
ン酸４．４′〜ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒトロール２
．０ｇ　（７，４０ｓｉｏｌ）　、４−ヒドロキシベン
ゼンスルホン酸ＩＪｇ　（７，４８ｓｉｏｌ）を５０％
硫酸に溶解し、１００’Ｃで５時間加熱した。反応混合
物を冷却後、氷水中に投入し、１０％水酸化ナトリウム
溶液を加えて弱酸性とした後、目的物を濾過し乾燥した
。収ｉｋＬ７ｇ ■　４．４′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル−（
２，７−シヒドロキシナフチル）メタノール４．４′−
ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒトロール２．Ｏｇ　（
７，４０＋ｎｏｌ）、２，７−シヒドロキシナフタレン
１．２ｇ　（７，４９ｓｉｏｌ）を５０％硫酸に溶解し
、１００℃で５時間加熱した。反応混合物を冷却後、氷
水中に投入し、１０％水酸化ナトリウム溶液を加えて弱
酸性とした後、目的物を濾過し乾燥した。

収量１．８ｇ ■　４．４′−ビス（ジベンジルアミノ）ジフェニル＝
（２−ヒドロキシフェニル）メタノールサリチルアルデ
ヒドフエニルジベンジルアミン５．０ｇ　（１ｇ．ｌＩＩｍ
ｏｌ）を、濃硫酸に加え、１００℃で４８時間加熱した
。反応混合物を冷却後、氷水中に投入し、目的物を濾過
し乾燥した。収量２．４ｇ。

〔実施例３〕濾紙（アトバンチツクＮｏ．５１４Ａ　）を、タートラ
ジン０４０５％を含有する２００ｇＭボラックスー塩酸
緩衝液（ｐＨ−６．０）に含浸し、６０℃で５０分通風
乾燥した。更にこの濾紙を、２．０ｇＭ基質、０．３＋
ｓＭ　４．４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒトロ
ール、２％エチレングリコールモノヘキシルエーテルを
含有するアセトン溶液に含浸し、４０℃で２０分通風乾
燥した。これを５×５龍角に切断し、検体を滴下して１
分後の呈色変化を試験紙表面の６０８ｎ■の反射吸光度
を測定することにより観察した。検体としては、ヒト末
梢血より常法で単離した顆粒球画分のＰＢＳ懸濁液を用
いた。測定は太線電子製のＭＣＰＤ−２００を用いて測
定した。種々の基質を用いて行った測定結果を表１に示
す。また、基質として（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルチオ）ベンゼンを用い、各種濃度の検体を
測定して得られた検量線を第１図に、白血球１００／ポ
を検体として用いた時の反射吸光度の経時変化を第２図
に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の基質を用いて検体中の白血球の濃度を
測定した場合の白血球濃度と反射吸光度の関係を示すグ
ラフである。第２図は白血球１００個／ｄを検体として用いたときの
反射吸光度の経時変化を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ただし、式中Ａはアミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜
５からなるペプチド基、Ｂはアミノ基の保護基、Ｒ＿１
〜Ｒ＿５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アル
コキシ基、水酸基、アリール基、アシル基、ニトロ基、
チオアルキル基及びアルキルアミノ基よりなる群より選
ばれた少なくとも１種であり、それぞれ隣接する２個の
置換分は縮合芳香環を形成していてもよい。〕で表され
るチオフェノールエステル。
（２）請求項１に記載のチオフェノールエステルとチオ
ール基検出指示薬とを吸着性担体にに保持してなること
を特徴とする溶液中の加水分解酵素の測定片。
（３）チオール基検出指示薬が一般式IIで表される請求
項２に記載の測定片 ▲数式、化学式、表等があります▼（II）〔ただし、式中Ｘは、同一又は異なって、アルキルアミ
ノ基、アルケニルアミノ基、アリールアミノ基、スルホ
ン酸基及びヒドロキシ基の中から選ばれる基を示す。式
中Ｒは、水素又は置換されていてもよい芳香族置換基を
示す。〕
（４）吸着性担体が濾紙又は布帛である請求項２〜３の
いずれかの項に記載の測定片。
（５）被検出物質である加水分解酵素の反応に適するｐ
Ｈを有する緩衝剤を配合してなる請求項２〜４のいずれ
かの項に記載の測定片。
（６）界面活性剤又は湿潤剤を更に配合してなる請求項
２〜５のいずれかの項に記載の測定片。
（７）チオール基検出指示薬と極大吸収波長が異なり、
かつ加水分解酵素の検出のための諸反応によって、その
呈色波長が変化しない色素を配合してなる請求項２〜６
のいずれかの項に記載の測定片。
（８）請求項２〜７のいずれかの項に記載の測定片を支
持体に固定してなる溶液中の加水分解酵素の測定器具。